הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

בידוד RNA מאפיתל עדשת עין של עכבר ומסות בתפזורת של תאי סיבים

914 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/69079

⸱

10 באוקטובר 2025

 ,  , 
1School of Optometry and Vision Science Program, Indiana University

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מפרט את ההפרדה של אפיתל עדשת העין של העכבר ומסת התפזורת של תאי הסיבים, ואחריו בידוד RNA וניתוח qPCR. שיטה זו מאפשרת הפרדת תאי עדשה לניתוח מפורט יותר של הטרנסקריפטום והתהליכים הביולוגיים בתאי אפיתל לעומת תאי סיבים מובחנים.

תקציר

העדשה היא רקמה מיוחדת ושקופה בחדר הקדמי של העין המורכבת משני סוגי תאים עיקריים, תאי אפיתל ותאי סיבים. שכבה אחת של תאי אפיתל עדשה מכסה את ההמיספרה הקדמית של העדשה, בעוד שרוב העדשה מורכבת ממסה של תאי סיבי עדשה. קרום בסיס קולגני, המכונה הקפסולה, מקיף ועוטף את כל הרקמה. תאי אפיתל עדשה נצמדים חזק לקפסולת העדשה וניתן להפריד אותם בקלות ממסת הסיבים בתפזורת על ידי קילוף הקפסולה הרחק מהרקמה. קשיים בהשגת ריכוז RNA מספיק מהמספר הנמוך של תאי אפיתל בחד-שכבת העדשה עיכבו בעבר את המחקר של תאי אפיתל לעומת תאי סיבים. פרוטוקול זה מציג שיטה להפרדה ובידוד נקי של תאי האפיתל והסיבים ושלבי ריכוז ה-RNA כדי לאפשר ניסויים טרנסקריפטומיים עוקבים על דגימות תאי אפיתל מזוג בודד של עדשות עכבר. היכולת לחקור את סוגי התאים העיקריים של העדשה בנפרד מסייעת בחקירת מנגנונים ביולוגיים של תחזוקה וחוסר ויסות של עדשות, ומאפשרת אפיון של הפרעות ספציפיות לסוג התא האחראיות לפתולוגיות עדשות הקשורות לגיל.

מבוא

עדשת העין היא איבר שקוף הממקד את האור בעדינות על הרשתית כדי לייצר תמונה ברורה. העדשה מורכבת משני סוגי תאים עיקריים: שכבה אחת של תאי אפיתל שמכסים את חצי הכדור הקדמי ותאי סיבים שמרכיבים את המסה העיקרית של הרקמה (איור 1). העדשה עטופה בקרום בסיס קולגני המכונה קפסולת העדשה, שאליה דבוקים היטב תאי אפיתל. ככל שהעדשה גדלה, תאי אפיתל בקו המשווה מתרבים ומתמיינים לקליפות מתפתחות של תאי סיבים המונחים על העדשה בצורה קונצנטרית 1,2,3. צמיחת עדשות לכל החיים תלויה בריבוי מתמשך של אוכלוסייה קטנה זו של תאי אפיתל משווניים המרכיבים את אזור הנביטה4. כאשר תאי הסיבים מתבגרים, כל אברוני התא מתפרקים כדי לחסל אובייקטים המפזרים אור 5,6,7,8,9,10,11 ולשמור על שקיפות הרקמה, ותאי הסיבים הפנימיים ביותר נדחסים בסופו של דבר, וכתוצאה מכך מרכז עדשה קשיח 9,12. בשל קפסולת העדשה שמסביב, אין תחלופת תאים בעדשה, וסיבי הזרע נשארים במרכז העדשה לאורך כל החיים כאשר סיבים חדשים מתווספים בפריפריה של הרקמה או בקליפת המוח. לתאי הסיבים של העדשה יש תכונות אופטיות שונות בהתאם לגילם ויכולים לספק תמונת מצב זמנית של המאפיינים הביולוגיים המשתנים בכל שלבנתון 13.

למרות האפשרויות הניתוחיות הזמינות, קטרקט, המוגדר כאטימות כלשהי בעדשה השקופה בדרך כלל, נותר הגורם המוביל לעיוורון בעולם14. קטרקט יכול להתבטא באפיתל העדשה, בקליפת המוח או בגרעין עם פתופיזיולוגיות שונות15. עם זאת, המנגנונים התאיים והמולקולריים של היווצרות קטרקט נותרו לא ברורים16,17. כדי להבין טוב יותר כיצד למנוע סוגים שונים אלה של קטרקט ולפתח חלופות לניתוח, עלינו להבין טוב יותר כיצד סוגי התאים השונים האלה שומרים על ההומאוסטזיס שלהם בעדשה.

תאי האפיתל והסיבים ממלאים תפקידים פיזיולוגיים שונים בעדשה. התפשטות התאים, למשל, מוגבלת לאפיתל העדשה18. בינתיים, סיבי העדשה מהווים את המסה העיקרית של העדשה, ומספקים מבנה ותכונות שבירה לעדשה9. כדי לקבל פרספקטיבה ניואנסית יותר של התהליכים הביולוגיים המעורבים בתאים השונים של העדשה, יש לחקור בנפרד תאי אפיתל וסיבים. כאן, אנו מציגים שיטה לבודד את האפיתל ממסת התפזורת של תא הסיבים, לחלץ mRNA מכל שבר, ולנתח את התעתיקים הללו באמצעות תגובת שרשרת פולימראז כמותית של שעתוק הפוך (RT-qPCR).

figure-introduction-1
איור 1: דיאגרמת אנטומיה של עדשה. העדשה מורכבת משני סוגי תאים, תאי אפיתל חד-שכבתיים (כחול וכתום) המכסים את חצי הכדור הקדמי ומסה גדולה של סיבי עדשה (לבן). הרקמה מוקפת בקרום קולגני דק, המכונה קפסולת העדשה (שזוף). תאי אפיתל קדמיים (כחול) שקטים בעוד שתאי אפיתל משווניים (כתום) מתרבים, מתמיינים ומתארכים והופכים לשכבות חדשות של תאי סיבים (לבנים) בהיקף העדשה. דורות חדשים של תאי סיבים מונחים על דורות קודמים של סיבים בקליפות קונצנטריות. תאי סיבי העדשה העתיקים ביותר נדחסים למרכז הרקמה. נתון זה שונה מ-Cheng (2024)38. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל הניסויים בבעלי חיים נערכו בהתאם ל"מדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה" של המכונים הלאומיים לבריאות ופרוטוקול מאושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של אוניברסיטת אינדיאנה.

1. הכנת אזור עבודה, ציוד וריאגנטים

  1. קצות פיפטות חיטוי לפני השימוש וייעדו קופסאות של טיפים חיטוי לניסויי RNA כדי למנוע זיהום RNase.
  2. טפל בשטח פני העבודה במכסה האדים ובעלי הומוגניזציה של רקמות בתמיסת טיהור RNase, שטוף היטב במים נטולי יונים וייבש.
  3. יש להשרות כלי חיתוך (מלקחיים מעוקלים, מלקחיים ישרים ומספריים מיקרו-דיסקציה) באתנול 70% למשך 5 דקות ולייבש עם מגבון עדין לפני השימוש.
  4. השתמש במגשי חיתוך וצלחות פטרי חדשים לגמרי לשלבי חיתוך ובידוד רקמות.
  5. Aliquot 400 מיקרוליטר של מגיב חומצה טריזול-גואנידיניום-פנול קר לתוך צינורות מיקרו-צנטריפוגה נטולי DNA ו-RNAse בנפח 1.5 מ"ל במכסה האדים.

2. חיתוך עדשות עכבר

  1. המתת חסד של עכברים בוגרים באמצעות מנת יתר של CO2 ואחריה פריקת צוואר הרחם כאמצעי משני.
  2. הסר את העיניים באמצעות מלקחיים מעוקלים.
    1. לחץ בעדינות על הרקמה המקיפה את העין בעזרת המלקחיים, מה שגורם לעין לבלוט מהשקע. סגור את המלקחיים מתחת לעין והסר על ידי משיכה יציבה כלפי מעלה.
    2. העבירו את העיניים לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל עם 750-1000 מיקרוליטר של תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS).
  3. לדיסקציה, העבירו את העיניים לבארות במגש חיתוך עם 1x PBS טרי.
  4. תחת מיקרוסקופ דיסקציה, השתמש במלקחיים ישרים כדי להחזיק את בסיס עצב הראייה וחתוך את העצב קרוב ככל האפשר לעין בעזרת מספריים חדים של מיקרודיסקציה.
  5. הכנס בזהירות מלקחיים ישרים עדינים לתוך הפתח שבו היה מחובר עצב הראייה, וצבט כדי להחזיק את הרקמה במקומה.
  6. הכנס את קצה המספריים המיקרו-דיסקציה לאותו פתח וחתוך בזהירות מהקוטב האחורי של העין לכיוון צומת הקרנית-סקלרלית. אל תכניס את המכשירים עמוק מדי כדי למנוע נזק לעדשה.
    הערה: עדשת המכרסמים תופסת נפח גדול בעין, ולכן מומלץ לבצע חתכים רדודים כדי למנוע ניקוב של העדשה.
  7. חותכים לאורך צומת הקרנית-סקלרלית בעזרת מספריים מיקרו-דיסקציה, ומפרידים לפחות מחצית מהיקף העין.
  8. השתמש במלקחיים הישרים כדי להפוך בעדינות את רקמות העין תוך כדי לחיצה על הקרנית, והוציא את העדשה דרך חתך הקרנית-סקלרלית.
  9. הסר בזהירות את כל הרקמות הגדולות המחוברות מהעדשה באמצעות מלקחיים ישרים עדינים.
  10. במידת הצורך, גלגלו בעדינות את העדשה על מגבון נקי ועדין באמצעות מלקחיים מעוקלים כדי להסיר את כל הרקמה החיצונית שנותרה דביקה.
    הערה: גלגל את הרקמה במהירות על פני מגבון המשימה, ואל תאפשר ייבוש יתר של הרקמה. ייתכנו אטימות קטנה על פני העדשה עקב כתמים יבשים על קפסולת העדשה. אטימות זו בדרך כלל הפיכה כאשר העדשה מוחזרת ל-1x PBS ולא תשפיע על השלבים הבאים.
  11. העבירו את העדשה הנקייה לצלחת פטרי בגודל 6 ס"מ עם 1x PBS.
  12. בעזרת מלקחיים ישרים עדינים, נקבו את קפסולת העדשה בסמוך לקו המשווה וקלפו בעדינות את קפסולת העדשה הרחק ממסת הסיבים. תאי האפיתל של העדשה יישארו מחוברים לקפסולה. הסר בעדינות את כל חלקי הסיבים הגדולים מהקפסולה שאולי ירדו עם הסרת הקפסולה.
  13. אחזו בעדינות בקפסולה עם מלקחיים ישרים עדינים וסובבו את ה-PBS 1x כדי להסיר את כל הסיבים שנותרו. כל תאי סיב המחוברים באופן רופף יתנתקו מהקפסולה ומתאי האפיתל.

3. בידוד RNA

הערה: זרימת עבודה מסוכמת לבידוד RNA מוצגת באיור 2.

  1. הפקידו 2 כמוסות עדשות או 2 מסות סיבים בתפזורת לתוך צינורות מיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל בהתאמה המכילים 400 מיקרוליטר של מגיב TRIzol קר.
    הערה: יש להעביר מסות סיבים מהצלחת לצינור באמצעות מלקחיים מעוקלים כדי לגרוף את הרקמה.
  2. מכסים היטב והעבירו את הצינורות למכסה אדים כימי לשלבים הבאים.
  3. הומוגניזציה עדינה של המוני סיבי העדשה בתפזורת באמצעות עלי גלולה נקי.
    הערה: הקפד לפרק את מסת הסיבים לחלוטין.
  4. דגירה של דגימות (כמוסות עדשות או מסות סיבים בתפזורת הומוגניות) ב-TRIzol למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר במכסה האדים.
  5. במכסה האדים, הוסף 200 מיקרוליטר כלורופורם לכל 400 מיקרוליטר של מגיב TRIzol לכל צינור. סגור את הצינורות בחוזקה ונער במרץ ביד למשך 15 שניות, תוך שמירה על האגודל בתחתית הצינור והאצבע המורה על המכסה.
    הערה: נעשה שימוש בצינורות המיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל המצוינים ברשימת החומרים בשל האיטום ההדוק. אם אתה משתמש במותגים אחרים של צינורות מיקרוצנטריפוגה, בדוק את סגירת הצינור ואטום לפני הטלטול, מכיוון שתמיסת TRIzol וכלורופורם עלולה לדלוף מתחת למכסה של צינורות שאין להם אטימה הדוקה.
  6. דגירה של דגימות למשך 10-15 דקות בטמפרטורת החדר כדי לאפשר הפרדת פאזות.
    הערה: צריכה להיות שכבת ריאגנט ורודה של TRIzol בתחתית הצינור המכילה שומנים וחלבון, שכבה לבנה בין שלבים המכילים DNA, ושלב מימי ברור בחלקו העליון המכיל RNA. ייתכן שקשה יותר לראות את שכבת ה-DNA הלבנה בדגימות תאי האפיתל.
  7. דגימות צנטריפוגות ב-14,000 x גרם למשך 15 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
    הערה: העבר בזהירות צינורות לתוך הצנטריפוגה והחוצה ממנה, הקפד לא להפריע לשלבי ההעברה.
  8. הרכיבו צינורות וריאגנטים מערכת RNA Clean ו-Concentrator. צינורות עמוד ספין מותקנים בצינור איסוף מהערכה.
  9. במכסה האדים, העבירו בזהירות את השלב המימי השקוף (השכבה העליונה) לצינור מיקרו-צנטריפוגה נקי של 1.5 מ"ל, תוך שימת לב לנפח.
    הערה: הימנע מהפרעה, נגיעה או ציור של שכבת ה-DNA הלבנה מתחת לשלב הימי. הטה את הצינור בעת העברת השלב המימי כדי למנוע הפרעה לשכבה הלבנה. עדיף להשאיר כמות קטנה מהשלב המימי בצינור ולא לזהם את הדגימה. בדרך כלל, עבור 200 מיקרוליטר של תוספת כלורופורם, ניתן לשחזר 180-190 מיקרוליטר של פאזה מימית.
  10. הוסף אתנול 200 הוכחה לשלב המימי ביחס נפחי של 1:1.
    הערה: ניתן להוסיף מאגר קשירת RNA מערכת הריכוז ביחס נפחי של 2:1 לשלב המימי לפני הוספת אתנול. מדלגים על שלב זה כדי להגדיל את תפוקת ה-RNA ומכיוון של-RNA יש טוהר מספיק לאחר הבידוד.
  11. מערבבים בעדינות על ידי היפוך הצינור מספר פעמים או על ידי פיפטינג של התמיסה למעלה ולמטה. העבירו את התמיסה המעורבת לעמודת סיבוב RNA באמצעות פיפטטור.
    הערה: היזהר לא לגעת במסנן עם קצה הפיפטה.
  12. עמודות סיבוב צנטריפוגות ב-16,000 x g למשך 30 שניות ב-4 מעלות צלזיוס.
    הערה: מומלץ לתייג את מכסה העמוד ואת הצד של צינור האיסוף כדי לשמור על קבוצות הצינורות מסודרות ובמקרה שהמכסה יתנתק בשלב הצנטריפוגה שלאחר מכן.
  13. השלך את הזרימה והוסף 400 מיקרוליטר של מאגר הכנת RNA לעמודת הסיבוב.
  14. עמודות סיבוב צנטריפוגות ב-16,000 x g למשך 30 שניות ב-4 מעלות צלזיוס.
  15. השלך את הזרימה והוסף 700 מיקרוליטר של מאגר שטיפת RNA לעמודת הסיבוב.
  16. עמודות סיבוב צנטריפוגות ב-16,000 x g למשך 30 שניות ב-4 מעלות צלזיוס.
  17. השלך את הזרימה והוסף 400 מיקרוליטר של מאגר שטיפת RNA לעמודת הסיבוב.
  18. עמודות סיבוב צנטריפוגות ב-16,000 x גרם למשך דקה אחת ב-4 מעלות צלזיוס.
  19. השלך את הזרימה והצנטריפוגה פעם נוספת ב-16,000 x g למשך 30 שניות ב-4 מעלות צלזיוס כדי להבטיח שעמודת הסיבוב יבשה.
  20. העבר את עמוד הסיבוב לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש המסומן בנפח 1.5 מ"ל.
  21. הוסף 15 מיקרוליטר מים ללא RNase על מסנן הממברנה. דוגרים למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר.
    הערה: היזהר לא לגעת במסנן עם קצה הפיפטה.
  22. צנטריפוגה את עמוד הסיבוב ב-16,000 x g למשך 30 שניות ב-4 מעלות צלזיוס כדי לחסל את ה-RNA המטוהר.
    הערה: המכסה של צינור המיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל יישאר פתוח במהלך הצנטריפוגה. הנח בזהירות את עמודי הסיבוב וצינורות המיקרו-צנטריפוגה כך שהכובעים הפתוחים מונחים על מכסה הרוטור כך שהוא לא יתנדנד ויישבר במהלך הצנטריפוגה. המכסים צריכים לגרור את כיוון סיבוב הרוטור.
  23. הסר והשליך את עמודות הסיבוב. ה-RNA יהיה בנוזל שנאסף בצינורות המיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל.
  24. סגור היטב את צינורות המיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל ודגר דגימות RNA בטמפרטורה של 55-65 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות כדי לקדם מסיסות מחדש.
  25. הניחו מיד דגימות על קרח לאחר שלב החימום.
  26. אחסן דגימות בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס או תמלול הפוך ל-cDNA לאחסון לטווח ארוך.
    הערה: דגימות RNA אוחסנו עד 3 חודשים ללא אובדן ריכוז מורגש. Aliquot דגימות RNA לנפחים קטנים יותר לאחסון כדי למזער מחזורי הקפאה-הפשרה ולמנוע השפלה.

4. מדידת ריכוז RNA באמצעות ספקטרופוטומטר UV-Vis

  1. שמור את דגימות ה-RNA על קרח, הפעל את ה-NanoDrop (ספקטרופוטומטר UV-Vis), ואפשר למכשיר לאתחל.
  2. תחת תפריט חומצות גרעין , בחר את מודול כימות ה-RNA.
  3. רוקן את הספקטרופוטומטר UV-Vis על ידי פיפטינג של 2.0 מיקרוליטר של חומר נוזל ממדרגת ריכוז ה-RNA על הכן, במקרה זה, מים בדרגה מולקולרית. הורד את זרוע המכשיר וקרא את הדגימה הריקה.
  4. הרם את זרוע המכשיר, נקה את כן החיישן באמצעות מגבון משימה עדין נקי ויבש, ולאחר מכן ניגוב נוסף רטוב במים נטולי יונים, ואחריו שוב ניגוב יבש.
  5. אם תרצה, הזן פרטים לדוגמה בממשק הספקטרופוטומטר UV-Vis.
  6. טען 2.0 מיקרוליטר של דגימת ה-RNA על הכן, הורד את הזרוע וכמת.
  7. חזור על שלבים 4.4 עד 4.6 כדי לנקות את הכן בין דגימות.
  8. בסיום, שמור וייצא את הניסוי לכימות נוסף במידת הצורך.

5. תמלול הפוך

  1. באמצעות טרנסקריפטאז הפוך מעובד ויציב בחום, תמלל הפוך 2.0 מיקרוגרם של RNA סיבי עדשה וכל ה-RNA האפיתל המופק באמצעות הפרוטוקול המומלץ של היצרן. מערבבים ריאגנטים ו-RNA עבור כל דגימה בצינור PCR נקי. שמור את כל התמיסות ודגימות ה-RNA על קרח.
    הערה: טרנסקריפטאז זה יכול לתמלל לאחור עד 2.5 מיקרוגרם של RNA לכל תגובה. מניחים המרה מלאה מ-RNA ל-cDNA, ולכן ריכוז ההתחלה של ה-RNA משמש כריכוז ה-cDNA המשוער.
  2. הפעל את התגובה במחזור התרמי באמצעות התנאים המפורטים בטבלה 1.
  3. אחסן cDNA מתומלל הפוך ב-80 מעלות צלזיוס או המשך לשלב qPCR.
    הערה: דגימות cDNA אוחסנו עד 4 חודשים ללא השפלה ניכרת, מכיוון ש-cDNA יציב יותר מ-RNA. סביר להניח שניתן לאחסן דגימות למשך זמן רב יותר, בתנאי שמחזורי ההקפאה-הפשרה ממוזערים.
צעדטמפרטורה (°C)זמן (דקות)מחזורים
חישול25101
תמלול הפוך50101
השבתת אנזימים8551
אחז4∞1

טבלה 1: תנאי תרמו-ציקלר לשעתוק הפוך. תנאים אלה מכווננים לטרנסקריפטאז הפוך ספציפי, מעובד מאוד ויציב בחום. תנאי הריצה עשויים להשתנות בהתאם לאנזים ולערכה בה נעשה שימוש.

6. PCR כמותי בזמן אמת

  1. לפני תחילת התגובות, הכינו תמיסות מלאי cDNA לריכוז הרצוי על ידי דילול במים בדרגה מולקולרית. בניסויים אלה, 1 מיקרוליטר של cDNA ישמש ב-5 ננוגרם/מיקרוליטר עבור תגובות של 5 ננוגרם/באר. שמור את כל התמיסות ודגימות ה-cDNA על הקרח.
    הערה: לוחות מערך TaqMan (פורמט 0.1 מ"ל) מומלצים כדי להתאים לתגובות של 5-50 ננוגרם cDNA לבאר. ביצוע ציטוטים של cDNA שימושי כדי להגביל את מחזורי ההקפאה-הפשרה. במחקר זה, הדגימות הוגבלו למקסימום של 5 מחזורי הקפאה-הפשרה.
  2. הכן מיקס מאסטר עובד המורכב מתקדם מאסטר מיקס ובדיקות להמלצות מסחריות. ראה סעיף 7 לדוגמא הכנה. שמור את כל התמיסות ודגימות ה-cDNA על הקרח.
    הערה: בדרך כלל משתמשים בזוג בדיקות עם שני צבעים שונים לכל באר. לדוגמה, במחקר זה, Crygs-FAM-MGB שימש כבדיקה של הגן המעניין, ו-Ppia-VIC-MGB כבקרה פנימית. ההמלצות המסחריות לריכוזי בדיקה ופריימר סופיים הן 250 ננומטר ו-900 ננומטר, בהתאמה. אם מטרה באה לידי ביטוי גבוה מאוד, ייתכן שיהיה צורך בבדיקה מוגבלת בפריימר כדי למנוע דלדול של ריאגנטים לתגובה.
  3. טען את מלאי ה-cDNA (1 מיקרוליטר) לבארות מתאימות על צלחת ה-qPCR, ואחריו תערובת המאסטר העובדת (9 מיקרוליטר). מערבבים פתרונות על ידי פיפטינג למעלה ולמטה לאט תוך הוספת תערובת המאסטר. ודא שטיפת ה-cDNA מעורבבת בתמיסה והימנע מבועות.
    הערה: בהתאם לרגישות המטרה, ייתכן שיהיה צורך להעמיס את הצלחת על קרח.
  4. אטום את לוחית ה-qPCR על ידי מריחה בזהירות של מכסה דבק אופטי. השתמש באפליקטור סרט דבק כדי להחליק את המכסה ולהבטיח אטימה הדוקה סביב כל באר.
  5. צלחות מערבולת ב 1000 סל"ד למשך 10 שניות לערבב.
  6. צלחות צנטריפוגה ב-1000 x גרם למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר כדי להבטיח שאין בועות אוויר בתחתית הבארות.
  7. טען את הצלחת למחזור תרמי PCR כמותי והפעל באמצעות המחזורים המפורטים בטבלה 2.
    הערה: פרוטוקולי qPCR קונבנציונליים מוגבלים בדרך כלל ל-40 מחזורים. הגדלת ספירת המחזורים לא צפויה להניב תוצאות משמעותיות, שכן ב-40 מחזורים, עותק מטרה יחיד יכול תיאורטית להניב כטריליון אמפליקונים19.
צעדטמפרטורה (°C)זמנים (ים)מחזורים
השבתת אורציל-N-גליקוזילאז (UNG)501201
דנטורציה951201
דנטורציה95145
חישול6020
אחז4∞1

טבלה 2: תנאי תרמו-ציקלר לתגובת שרשרת פולימראז כמותית. תנאים אלה מותאמים לסדרה ספציפית של מבחני ביטוי גנים מסחריים. נעשה שימוש בפרמטרי ברירת מחדל, למעט הגדלת מחזורי ההגברה מ-40 ל-45.

7. דוגמה לחישוב נפח עבור qPCR

הערה: קוד מקור R עבור מחשבון נפח עבור המשוואות המתוארות להלן זמין בקובץ משלים 1. מחשבון זה מיועד לבדיקות Taqman ותערובת המאסטר המפורטות בטבלת החומרים.

  1. קבע את מספר הבארות שיש לזרוק ולחשב מינימום של 12.5% עודף. קבוע עודף זה (kעודף) מפצה על שגיאת פיפטינג ומבטיח שיש מספיק פתרון. לדוגמא זו, 96 בארות ישמשו כיעד להכנת דגימה.
    משוואה:
    figure-protocol-1
    דוגמה:
    figure-protocol-2
    הערה: אם עודף של 12.5% אינו מספר שלם, דרך קלה להבטיח מספרים "נחמדים" בשלבים הבאים היא לעגל כלפי מעלה לבאר הקרובה ביותר ולהתאים את kעודף בהתאם.
  2. חשב את נפח תערובת המאסטר העובד. בניסויים אלה משתמשים ב-1 מיקרוליטר של cDNA ו-9 מיקרוליטר של תערובת מאסטר עובדת לכל באר. ניתן לכוונן נפחי cDNA ותערובת מאסטר לפי הצורך.
    משוואה:
    figure-protocol-3
    דוגמה:
    figure-protocol-4
  3. חשב את משנה הריכוז (kConc). שינוי זה משמש ליצירת תערובת מאסטר עבודה מרוכזת יותר שתדלל ל-1x בערבוב עם cDNA.
    משוואה:
    figure-protocol-5
    דוגמה:
    figure-protocol-6
  4. חשב את נפח הגשושית (פי 20).
    משוואה:
    figure-protocol-7
    דוגמה:
    figure-protocol-8
  5. חשב נפח מלאי מיקס מאסטר (פי 2).
    משוואה:
    figure-protocol-9
    דוגמה:
    figure-protocol-10
  6. הביאו את תערובת המאסטר העובדת לנפח המחושב באמצעות H2O בדרגה מולקולרית.
    משוואה:
    figure-protocol-11
    figure-protocol-12
    figure-protocol-13
    figure-protocol-14
    figure-protocol-15
    דוגמה:
    figure-protocol-16
    figure-protocol-17
    figure-protocol-18
    figure-protocol-19
    figure-protocol-20

קובץ משלים 1: קוד מקור R עבור מחשבון נפח. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

אפיתל העדשה וסיבי העדשה בודדו מעכברים פראיים בני 6 עד 7 שבועות. שלושה עכברים שימשו לניסויים אלה, ו-2 קפסולות עדשות או 2 מסות תאי סיבים מכל עכבר נאספו יחד לשכפול ביולוגי אחד. כפי שמתואר בפרוטוקול, RNA חולץ באמצעות הפרדת פאזה של מגיב TRIzol. בממוצע, זוג אפיתל עדשה ומסות סיבים בתפזורת הניבו 0.8 מיקרוגרם (SD ± 0.2) ו-9.7 מיקרוגרם (SD ± 2.3) של RNA, בהתאמה. הריכוז הממוצע בפליטה של 15 מיקרוליטר היה 55.4 ננוגרם/מיקרוליטר (SD ± 16.3) ו-650.0 ננוגרם/מיקרוליטר (SD ± 152.2) עבור דגימות האפיתל והסיבים, בהתאמה. באמצעות תגובות של 5 ננ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

השלבים המוצגים כאן מדגימים את היכולת לבודד RNA מתאי עדשות נפרדים שניתן לתמלל בהצלחה ל-cDNA לשיטות ביולוגיה מולקולרית. בשל האופי הרגיש של שיטות הניתוח, חיוני שהעדשה תהיה נקייה מרקמות מחוברות בשלב הדיסקציה. זה עשוי לדרוש כמה איטרציות של גלגול העדשה על Kimwipe כדי להשיג ניקיון נאות. יש להקפיד לא לחדור עמוק מדי לעדשה תוך הפרדת הקפסולה הקולגנית מתא המסה הסיבי בתפזורת כדי למנוע זיהום דגימות תאי אפיתל בכמויות משמעותיות של תאי סיבים. תאי אפיתל העדשה נצמדים היטב לקפסולה, וההידבקות בין תאי האפיתל ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

עבודה זו מומנה על ידי מענק R01 EY032056 (ל-CC) מהמכון הלאומי לעיניים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צנטריפוגה ורוטורפישר סיינטיפיק14285554אחה"צ
כלורופורם, דרגת HPLCאלפא אסאר22920
אתנול (190 הוכחה)מעבדות דקון2801
אתנול (200 הוכחה)פישר ביו-ריאגנטיםBP2818
פישרברנד גלולה עליפישר סיינטיפיק12-141-363
מלקחיים, מעוקלים; פינצטה לסטודנטים #7מכשירי דיוק עולמיים501981
מלקחיים, ישר; דומונט #5כלים מדעיים עדינים11252-40
מלקחיים, ישר; פינצטה לסטודנטים #4מכשירי דיוק עולמיים501978
Kimwipes, קטןקימברלי-קלארק34155ניגוב משימות עדין
מוליך סרט דבק MicroAmpאפלייד ביוסיסטמס4333183
MicroAmp EnduraPlate אופטי 96 באר צלחת תגובה מהירה וברורה עם ברקודאפלייד ביוסיסטמס4483485
מיקרופיפטוריםאפנדורף  01-671-120
מיקרוסקופ, דיסקציהקרל זייסSteREO Discovery.V8
כיסוי דבק אופטי MiniAmpאפלייד ביוסיסטמס4360954
MiniAmp תרמי Cyclerאפלייד ביוסיסטמסא37834
מערבולת צלחות MixMateאפנדורף5353000529
מים בדרגה מולקולריתפישר סיינטיפיקBP28191
ספקטרופוטומטר Nanodrop One Microvolume UV-Visתרמו סיינטיפיקND-אחד-W
Nunc MicroWell MiniTraysפישר סיינטיפיק12-565-154מגש חיתוך
צינורות PCRVWR201007-012
צלחת פטרי, 60 מ"מ על 15 מ"מפישר סיינטיפיקFB0875713A
תמיסת מלח חומצה פוספט, 1x Dulbecco'sג'יבקו14190-136
קצות פיפטות, 10 ומיקרו; L בוגרארה"ב סיינטיפיק1161-3700
קצות פיפטה, 1250 ומיקרו; L XL בוגרארה"ב סיינטיפיק1161-1720
קצות פיפטה, 200 ומיקרו; L פרופיל בוגרארה"ב סיינטיפיק1163-1700
מערכת PCR בזמן אמת QuantStudio 3אפלייד ביוסיסטמסA28567
Reverse Transcriptase, SuperScript IV VILO Invitrogen11756050טרנסקריפטאז הפוך תהליכי ויציב בחום
ערכת RNA ניקוי ורכז 5זימוZR1013
מים ללא RNaseפישר ביו-ריאגנטיםBP2819
RNaseZapסיגמא₪2020פתרון טיהור RNase
צינורות מיקרוצנטריפוגה של SealRite 1.5 מ"לארה"ב סיינטיפיק1615-5500
SuperFine Vannas 8 ס"ממכשירי דיוק עולמיים501778מספריים
TaqMan FAST Advanced Master Mix עבור qPCRאפלייד ביוסיסטמס4444557
בדיקת ביטוי גנים של TaqMan (FAM) (MTO)תרמו-פישר סיינטיפיק4448892
טריזולInvitrogen15596026תמיסת חומצה-גואנידיניום-פנול
מערבל מערבולתתרמו סיינטיפיק88880017

מקורות

  1. Lovicu, F. J., Robinson, M. L. Development of the Ocular Lens. , Cambridge University Press. (2004).
  2. Bassnett, S., Winzenburger, P. A. Morphometric analysis of fibre cell growth in the developing chicken lens. Exp Eye Res. 76 (3), 291-302 (2003).
  3. Kuszak, J. R. The ultrastructure of epithelial and fiber cells in the crystalline lens. Int Rev Cytol. 163, 305-350 (1995).
  4. Yamamoto, N., Majima, K., Marunouchi, T. A study of the proliferating activity in lens epithelium and the identification of tissue-type stem cells. Med Mol Morphol. 41 (2), 83-91 (2008).
  5. Bassnett, S. On the mechanism of organelle degradation in the vertebrate lens. Exp Eye Res. 88 (2), 133-139 (2009).
  6. Bassnett, S. The fate of the Golgi apparatus and the endoplasmic reticulum during lens fiber cell differentiation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 36 (9), 1793-1803 (1995).
  7. Bassnett, S. Lens organelle degradation. Exp Eye Res. 74 (1), 1-6 (2002).
  8. Bassnett, S., Beebe, D. C. Coincident loss of mitochondria and nuclei during lens fiber cell differentiation. Dev Dyn. 194 (2), 85-93 (1992).
  9. Bassnett, S., Shi, Y., Vrensen, G. F. Biological glass: Structural determinants of eye lens transparency. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 366 (1568), 1250-1264 (2011).
  10. Vrensen, G. F., Graw, J., De Wolf, A. Nuclear breakdown during terminal differentiation of primary lens fibres in mice: A transmission electron microscopic study. Exp Eye Res. 52 (6), 647-659 (1991).
  11. Counis, M. F., et al. Analysis of nuclear degradation during lens cell differentiation. Cell Death Differ. 5 (4), 251-261 (1998).
  12. Piatigorsky, J. Lens differentiation in vertebrates. A review of cellular and molecular features. Differentiation. 19 (3), 134-153 (1981).
  13. Al-Khudari, S., Donohue, S. T., Al-Ghoul, W. M., Al-Ghoul, K. J. Age-related compaction of lens fibers affects the structure and optical properties of rabbit lenses. BMC Ophthalmol. 7, 19(2007).
  14. World Report on Vision. , World Health Organization. Geneva. (2019).
  15. Hashemi, H., et al. Global and regional prevalence of age-related cataract: A comprehensive systematic review and meta-analysis. Eye (Lond). 34 (8), 1357-1370 (2020).
  16. Cheng, C., Gong, X. Diverse roles of eph/ephrin signaling in the mouse lens. PLoS One. 6 (11), e28147(2011).
  17. Ibaraki, N. A brighter future for cataract surgery. Nat Med. 3 (9), 958-960 (1997).
  18. Scullica, L., Grimes, P., Mcelvain, N. Further autoradiographic studies of the lens epithelium. Normal and x-irradiated rat eyes. Arch Ophthalmol. 70, 659-665 (1963).
  19. Caraguel, C. G., Stryhn, H., Gagne, N., Dohoo, I. R., Hammell, K. L. Selection of a cutoff value for real-time polymerase chain reaction results to fit a diagnostic purpose: Analytical and epidemiologic approaches. J Vet Diagn Invest. 23 (1), 2-15 (2011).
  20. 60/280 and 260/230 ratios. , Thermo Scientific. https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/CAD/Product-Bulletins/T123-NanoDrop-Lite-Interpretation-of-Nucleic-Acid-260-280-Ratios.pdf (2009).
  21. Beyer, E. C., Kistler, J., Paul, D. L., Goodenough, D. A. Antisera directed against connexin43 peptides react with a 43-kd protein localized to gap junctions in myocardium and other tissues. J Cell Biol. 108 (2), 595-605 (1989).
  22. Gong, X., Cheng, C., Xia, C. H. Connexins in lens development and cataractogenesis. J Membr Biol. 218 (1-3), 9-12 (2007).
  23. Leonard, M., Zhang, L., Bleaken, B. M., Menko, A. S. Distinct roles for n-cadherin linked c-src and fyn kinases in lens development. Dev Dyn. 242 (5), 469-484 (2013).
  24. Leonard, M., et al. Modulation of n-cadherin junctions and their role as epicenters of differentiation-specific actin regulation in the developing lens. Dev Biol. 349 (2), 363-377 (2011).
  25. Logan, C. M., et al. N-cadherin regulates signaling mechanisms required for lens fiber cell elongation and lens morphogenesis. Dev Biol. 428 (1), 118-134 (2017).
  26. Maddala, R., Nagendran, T., Lang, R. A., Morozov, A., Rao, P. V. Rap1 gtpase is required for mouse lens epithelial maintenance and morphogenesis. Dev Biol. 406 (1), 74-91 (2015).
  27. Parreno, J., et al. Methodologies to unlock the molecular expression and cellular structure of ocular lens epithelial cells. Front Cell Dev Biol. 10, 983178(2022).
  28. Paul, D. L., Ebihara, L., Takemoto, L. J., Swenson, K. I., Goodenough, D. A. Connexin46, a novel lens gap junction protein, induces voltage-gated currents in nonjunctional plasma membrane of xenopus oocytes. J Cell Biol. 115 (4), 1077-1089 (1991).
  29. Rong, P., et al. Disruption of gja8 (alpha8 connexin) in mice leads to microphthalmia associated with retardation of lens growth and lens fiber maturation. Development. 129 (1), 167-174 (2002).
  30. Terrell, A. M., et al. Molecular characterization of mouse lens epithelial cell lines and their suitability to study RNA granules and cataract associated genes. Exp Eye Res. 131, 42-55 (2015).
  31. White, T. W., Bruzzone, R., Goodenough, D. A., Paul, D. L. Mouse cx50, a functional member of the connexin family of gap junction proteins, is the lens fiber protein mp70. Molecular Biology of the Cell. 3 (7), 711-720 (1992).
  32. Xia, C. H., et al. Altered cell clusters and upregulated Aqp1 in connexin 50 knockout lens epithelium. Invest Ophthalmol Vis Sci. 65 (11), 27(2024).
  33. Beyer, E. C., Paul, D. L., Goodenough, D. A. Connexin43: A protein from rat heart homologous to a gap junction protein from liver. J Cell Biol. 105 (6 Pt 1), 2621-2629 (1987).
  34. Gong, X., et al. Disruption of Alpha3 connexin gene leads to proteolysis and cataractogenesis in mice. Cell. 91 (6), 833-843 (1997).
  35. Xu, L., Overbeek, P. A., Reneker, L. W. Systematic analysis of E-, N- and P-cadherin expression in mouse eye development. Exp Eye Res. 74 (6), 753-760 (2002).
  36. Nishina, S., et al. Pax6 expression in the developing human eye. Br J Ophthalmol. 83 (6), 723-727 (1999).
  37. Wistow, G., et al. Gamman-crystallin and the evolution of the betagamma-crystallin superfamily in vertebrates. FEBS J. 272 (9), 2276-2291 (2005).
  38. Cheng, C. Tissue, cellular, and molecular level determinants for eye lens stiffness and elasticity. Front Ophthalmol (Lausanne). 4, 1456474(2024).
  39. Huynh, P. N., Cheng, C. Spatial-temporal comparison of eph/ephrin gene expression in ocular lenses from aging and knockout mice. Front Ophthalmol (Lausanne). 4, 1410860(2024).
  40. Zelenka, P. S., Gao, C. Y., Saravanamuthu, S. S. Preparation and culture of rat lens epithelial explants for studying terminal differentiation. J Vis Exp. (31), e1519(2009).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

בידוד RNA מאפיתל עדשת עין של עכבר ומסות בתפזורת של תאי סיבים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.