בידוד RNA מאפיתל עדשת עין של עכבר ומסות בתפזורת של תאי סיבים

עדשת העין היא איבר שקוף הממקד את האור בעדינות על הרשתית כדי לייצר תמונה ברורה. העדשה מורכבת משני סוגי תאים עיקריים: שכבה אחת של תאי אפיתל שמכסים את חצי הכדור הקדמי ותאי סיבים שמרכיבים את המסה העיקרית של הרקמה (איור 1). העדשה עטופה בקרום בסיס קולגני המכונה קפסולת העדשה, שאליה דבוקים היטב תאי אפיתל. ככל שהעדשה גדלה, תאי אפיתל בקו המשווה מתרבים ומתמיינים לקליפות מתפתחות של תאי סיבים המונחים על העדשה בצורה קונצנטרית ^1,2,3. צמיחת עדשות לכל החיים תלויה בריבוי מתמשך של אוכלוסייה קטנה זו של תאי אפיתל משווניים המרכיבים את אזור הנביטה⁴. כאשר תאי הסיבים מתבגרים, כל אברוני התא מתפרקים כדי לחסל אובייקטים המפזרים אור 5,6,7,8,9,10,11 ולשמור על שקיפות הרקמה, ותאי הסיבים הפנימיים ביותר נדחסים בסופו של דבר, וכתוצאה מכך מרכז עדשה קשיח ^9,12. בשל קפסולת העדשה שמסביב, אין תחלופת תאים בעדשה, וסיבי הזרע נשארים במרכז העדשה לאורך כל החיים כאשר סיבים חדשים מתווספים בפריפריה של הרקמה או בקליפת המוח. לתאי הסיבים של העדשה יש תכונות אופטיות שונות בהתאם לגילם ויכולים לספק תמונת מצב זמנית של המאפיינים הביולוגיים המשתנים בכל שלב^{נתון 13}.

למרות האפשרויות הניתוחיות הזמינות, קטרקט, המוגדר כאטימות כלשהי בעדשה השקופה בדרך כלל, נותר הגורם המוביל לעיוורון בעולם¹⁴. קטרקט יכול להתבטא באפיתל העדשה, בקליפת המוח או בגרעין עם פתופיזיולוגיות שונות¹⁵. עם זאת, המנגנונים התאיים והמולקולריים של היווצרות קטרקט נותרו לא ברורים^16,17. כדי להבין טוב יותר כיצד למנוע סוגים שונים אלה של קטרקט ולפתח חלופות לניתוח, עלינו להבין טוב יותר כיצד סוגי התאים השונים האלה שומרים על ההומאוסטזיס שלהם בעדשה.

תאי האפיתל והסיבים ממלאים תפקידים פיזיולוגיים שונים בעדשה. התפשטות התאים, למשל, מוגבלת לאפיתל העדשה¹⁸. בינתיים, סיבי העדשה מהווים את המסה העיקרית של העדשה, ומספקים מבנה ותכונות שבירה לעדשה⁹. כדי לקבל פרספקטיבה ניואנסית יותר של התהליכים הביולוגיים המעורבים בתאים השונים של העדשה, יש לחקור בנפרד תאי אפיתל וסיבים. כאן, אנו מציגים שיטה לבודד את האפיתל ממסת התפזורת של תא הסיבים, לחלץ mRNA מכל שבר, ולנתח את התעתיקים הללו באמצעות תגובת שרשרת פולימראז כמותית של שעתוק הפוך (RT-qPCR).

איור 1: דיאגרמת אנטומיה של עדשה. העדשה מורכבת משני סוגי תאים, תאי אפיתל חד-שכבתיים (כחול וכתום) המכסים את חצי הכדור הקדמי ומסה גדולה של סיבי עדשה (לבן). הרקמה מוקפת בקרום קולגני דק, המכונה קפסולת העדשה (שזוף). תאי אפיתל קדמיים (כחול) שקטים בעוד שתאי אפיתל משווניים (כתום) מתרבים, מתמיינים ומתארכים והופכים לשכבות חדשות של תאי סיבים (לבנים) בהיקף העדשה. דורות חדשים של תאי סיבים מונחים על דורות קודמים של סיבים בקליפות קונצנטריות. תאי סיבי העדשה העתיקים ביותר נדחסים למרכז הרקמה. נתון זה שונה מ-Cheng (2024)³⁸. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

כל הניסויים בבעלי חיים נערכו בהתאם ל"מדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה" של המכונים הלאומיים לבריאות ופרוטוקול מאושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של אוניברסיטת אינדיאנה.

1. הכנת אזור עבודה, ציוד וריאגנטים

1. קצות פיפטות חיטוי לפני השימוש וייעדו קופסאות של טיפים חיטוי לניסויי RNA כדי למנוע זיהום RNase.
2. טפל בשטח פני העבודה במכסה האדים ובעלי הומוגניזציה של רקמות בתמיסת טיהור RNase, שטוף היטב במים נטולי יונים וייבש.
3. יש להשרות כלי חיתוך (מלקחיים מעוקלים, מלקחיים ישרים ומספריים מיקרו-דיסקציה) באתנול 70% למשך 5 דקות ולייבש עם מגבון עדין לפני השימוש.
4. השתמש במגשי חיתוך וצלחות פטרי חדשים לגמרי לשלבי חיתוך ובידוד רקמות.
5. Aliquot 400 מיקרוליטר של מגיב חומצה טריזול-גואנידיניום-פנול קר לתוך צינורות מיקרו-צנטריפוגה נטולי DNA ו-RNAse בנפח 1.5 מ"ל במכסה האדים.

2. חיתוך עדשות עכבר

1. המתת חסד של עכברים בוגרים באמצעות מנת יתר של CO₂ ואחריה פריקת צוואר הרחם כאמצעי משני.
2. הסר את העיניים באמצעות מלקחיים מעוקלים.
   1. לחץ בעדינות על הרקמה המקיפה את העין בעזרת המלקחיים, מה שגורם לעין לבלוט מהשקע. סגור את המלקחיים מתחת לעין והסר על ידי משיכה יציבה כלפי מעלה.
   2. העבירו את העיניים לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל עם 750-1000 מיקרוליטר של תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS).
3. לדיסקציה, העבירו את העיניים לבארות במגש חיתוך עם 1x PBS טרי.
4. תחת מיקרוסקופ דיסקציה, השתמש במלקחיים ישרים כדי להחזיק את בסיס עצב הראייה וחתוך את העצב קרוב ככל האפשר לעין בעזרת מספריים חדים של מיקרודיסקציה.
5. הכנס בזהירות מלקחיים ישרים עדינים לתוך הפתח שבו היה מחובר עצב הראייה, וצבט כדי להחזיק את הרקמה במקומה.
6. הכנס את קצה המספריים המיקרו-דיסקציה לאותו פתח וחתוך בזהירות מהקוטב האחורי של העין לכיוון צומת הקרנית-סקלרלית. אל תכניס את המכשירים עמוק מדי כדי למנוע נזק לעדשה.
   הערה: עדשת המכרסמים תופסת נפח גדול בעין, ולכן מומלץ לבצע חתכים רדודים כדי למנוע ניקוב של העדשה.
7. חותכים לאורך צומת הקרנית-סקלרלית בעזרת מספריים מיקרו-דיסקציה, ומפרידים לפחות מחצית מהיקף העין.
8. השתמש במלקחיים הישרים כדי להפוך בעדינות את רקמות העין תוך כדי לחיצה על הקרנית, והוציא את העדשה דרך חתך הקרנית-סקלרלית.
9. הסר בזהירות את כל הרקמות הגדולות המחוברות מהעדשה באמצעות מלקחיים ישרים עדינים.
10. במידת הצורך, גלגלו בעדינות את העדשה על מגבון נקי ועדין באמצעות מלקחיים מעוקלים כדי להסיר את כל הרקמה החיצונית שנותרה דביקה.
    הערה: גלגל את הרקמה במהירות על פני מגבון המשימה, ואל תאפשר ייבוש יתר של הרקמה. ייתכנו אטימות קטנה על פני העדשה עקב כתמים יבשים על קפסולת העדשה. אטימות זו בדרך כלל הפיכה כאשר העדשה מוחזרת ל-1x PBS ולא תשפיע על השלבים הבאים.
11. העבירו את העדשה הנקייה לצלחת פטרי בגודל 6 ס"מ עם 1x PBS.
12. בעזרת מלקחיים ישרים עדינים, נקבו את קפסולת העדשה בסמוך לקו המשווה וקלפו בעדינות את קפסולת העדשה הרחק ממסת הסיבים. תאי האפיתל של העדשה יישארו מחוברים לקפסולה. הסר בעדינות את כל חלקי הסיבים הגדולים מהקפסולה שאולי ירדו עם הסרת הקפסולה.
13. אחזו בעדינות בקפסולה עם מלקחיים ישרים עדינים וסובבו את ה-PBS 1x כדי להסיר את כל הסיבים שנותרו. כל תאי סיב המחוברים באופן רופף יתנתקו מהקפסולה ומתאי האפיתל.

3. בידוד RNA

הערה: זרימת עבודה מסוכמת לבידוד RNA מוצגת באיור 2.

1. הפקידו 2 כמוסות עדשות או 2 מסות סיבים בתפזורת לתוך צינורות מיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל בהתאמה המכילים 400 מיקרוליטר של מגיב TRIzol קר.
   הערה: יש להעביר מסות סיבים מהצלחת לצינור באמצעות מלקחיים מעוקלים כדי לגרוף את הרקמה.
2. מכסים היטב והעבירו את הצינורות למכסה אדים כימי לשלבים הבאים.
3. הומוגניזציה עדינה של המוני סיבי העדשה בתפזורת באמצעות עלי גלולה נקי.
   הערה: הקפד לפרק את מסת הסיבים לחלוטין.
4. דגירה של דגימות (כמוסות עדשות או מסות סיבים בתפזורת הומוגניות) ב-TRIzol למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר במכסה האדים.
5. במכסה האדים, הוסף 200 מיקרוליטר כלורופורם לכל 400 מיקרוליטר של מגיב TRIzol לכל צינור. סגור את הצינורות בחוזקה ונער במרץ ביד למשך 15 שניות, תוך שמירה על האגודל בתחתית הצינור והאצבע המורה על המכסה.
   הערה: נעשה שימוש בצינורות המיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל המצוינים ברשימת החומרים בשל האיטום ההדוק. אם אתה משתמש במותגים אחרים של צינורות מיקרוצנטריפוגה, בדוק את סגירת הצינור ואטום לפני הטלטול, מכיוון שתמיסת TRIzol וכלורופורם עלולה לדלוף מתחת למכסה של צינורות שאין להם אטימה הדוקה.
6. דגירה של דגימות למשך 10-15 דקות בטמפרטורת החדר כדי לאפשר הפרדת פאזות.
   הערה: צריכה להיות שכבת ריאגנט ורודה של TRIzol בתחתית הצינור המכילה שומנים וחלבון, שכבה לבנה בין שלבים המכילים DNA, ושלב מימי ברור בחלקו העליון המכיל RNA. ייתכן שקשה יותר לראות את שכבת ה-DNA הלבנה בדגימות תאי האפיתל.
7. דגימות צנטריפוגות ב-14,000 x גרם למשך 15 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
   הערה: העבר בזהירות צינורות לתוך הצנטריפוגה והחוצה ממנה, הקפד לא להפריע לשלבי ההעברה.
8. הרכיבו צינורות וריאגנטים מערכת RNA Clean ו-Concentrator. צינורות עמוד ספין מותקנים בצינור איסוף מהערכה.
9. במכסה האדים, העבירו בזהירות את השלב המימי השקוף (השכבה העליונה) לצינור מיקרו-צנטריפוגה נקי של 1.5 מ"ל, תוך שימת לב לנפח.
   הערה: הימנע מהפרעה, נגיעה או ציור של שכבת ה-DNA הלבנה מתחת לשלב הימי. הטה את הצינור בעת העברת השלב המימי כדי למנוע הפרעה לשכבה הלבנה. עדיף להשאיר כמות קטנה מהשלב המימי בצינור ולא לזהם את הדגימה. בדרך כלל, עבור 200 מיקרוליטר של תוספת כלורופורם, ניתן לשחזר 180-190 מיקרוליטר של פאזה מימית.
10. הוסף אתנול 200 הוכחה לשלב המימי ביחס נפחי של 1:1.
    הערה: ניתן להוסיף מאגר קשירת RNA מערכת הריכוז ביחס נפחי של 2:1 לשלב המימי לפני הוספת אתנול. מדלגים על שלב זה כדי להגדיל את תפוקת ה-RNA ומכיוון של-RNA יש טוהר מספיק לאחר הבידוד.
11. מערבבים בעדינות על ידי היפוך הצינור מספר פעמים או על ידי פיפטינג של התמיסה למעלה ולמטה. העבירו את התמיסה המעורבת לעמודת סיבוב RNA באמצעות פיפטטור.
    הערה: היזהר לא לגעת במסנן עם קצה הפיפטה.
12. עמודות סיבוב צנטריפוגות ב-16,000 x g למשך 30 שניות ב-4 מעלות צלזיוס.
    הערה: מומלץ לתייג את מכסה העמוד ואת הצד של צינור האיסוף כדי לשמור על קבוצות הצינורות מסודרות ובמקרה שהמכסה יתנתק בשלב הצנטריפוגה שלאחר מכן.
13. השלך את הזרימה והוסף 400 מיקרוליטר של מאגר הכנת RNA לעמודת הסיבוב.
14. עמודות סיבוב צנטריפוגות ב-16,000 x g למשך 30 שניות ב-4 מעלות צלזיוס.
15. השלך את הזרימה והוסף 700 מיקרוליטר של מאגר שטיפת RNA לעמודת הסיבוב.
16. עמודות סיבוב צנטריפוגות ב-16,000 x g למשך 30 שניות ב-4 מעלות צלזיוס.
17. השלך את הזרימה והוסף 400 מיקרוליטר של מאגר שטיפת RNA לעמודת הסיבוב.
18. עמודות סיבוב צנטריפוגות ב-16,000 x גרם למשך דקה אחת ב-4 מעלות צלזיוס.
19. השלך את הזרימה והצנטריפוגה פעם נוספת ב-16,000 x g למשך 30 שניות ב-4 מעלות צלזיוס כדי להבטיח שעמודת הסיבוב יבשה.
20. העבר את עמוד הסיבוב לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש המסומן בנפח 1.5 מ"ל.
21. הוסף 15 מיקרוליטר מים ללא RNase על מסנן הממברנה. דוגרים למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר.
    הערה: היזהר לא לגעת במסנן עם קצה הפיפטה.
22. צנטריפוגה את עמוד הסיבוב ב-16,000 x g למשך 30 שניות ב-4 מעלות צלזיוס כדי לחסל את ה-RNA המטוהר.
    הערה: המכסה של צינור המיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל יישאר פתוח במהלך הצנטריפוגה. הנח בזהירות את עמודי הסיבוב וצינורות המיקרו-צנטריפוגה כך שהכובעים הפתוחים מונחים על מכסה הרוטור כך שהוא לא יתנדנד ויישבר במהלך הצנטריפוגה. המכסים צריכים לגרור את כיוון סיבוב הרוטור.
23. הסר והשליך את עמודות הסיבוב. ה-RNA יהיה בנוזל שנאסף בצינורות המיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל.
24. סגור היטב את צינורות המיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל ודגר דגימות RNA בטמפרטורה של 55-65 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות כדי לקדם מסיסות מחדש.
25. הניחו מיד דגימות על קרח לאחר שלב החימום.
26. אחסן דגימות בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס או תמלול הפוך ל-cDNA לאחסון לטווח ארוך.
    הערה: דגימות RNA אוחסנו עד 3 חודשים ללא אובדן ריכוז מורגש. Aliquot דגימות RNA לנפחים קטנים יותר לאחסון כדי למזער מחזורי הקפאה-הפשרה ולמנוע השפלה.

4. מדידת ריכוז RNA באמצעות ספקטרופוטומטר UV-Vis

1. שמור את דגימות ה-RNA על קרח, הפעל את ה-NanoDrop (ספקטרופוטומטר UV-Vis), ואפשר למכשיר לאתחל.
2. תחת תפריט חומצות גרעין , בחר את מודול כימות ה-RNA.
3. רוקן את הספקטרופוטומטר UV-Vis על ידי פיפטינג של 2.0 מיקרוליטר של חומר נוזל ממדרגת ריכוז ה-RNA על הכן, במקרה זה, מים בדרגה מולקולרית. הורד את זרוע המכשיר וקרא את הדגימה הריקה.
4. הרם את זרוע המכשיר, נקה את כן החיישן באמצעות מגבון משימה עדין נקי ויבש, ולאחר מכן ניגוב נוסף רטוב במים נטולי יונים, ואחריו שוב ניגוב יבש.
5. אם תרצה, הזן פרטים לדוגמה בממשק הספקטרופוטומטר UV-Vis.
6. טען 2.0 מיקרוליטר של דגימת ה-RNA על הכן, הורד את הזרוע וכמת.
7. חזור על שלבים 4.4 עד 4.6 כדי לנקות את הכן בין דגימות.
8. בסיום, שמור וייצא את הניסוי לכימות נוסף במידת הצורך.

5. תמלול הפוך

1. באמצעות טרנסקריפטאז הפוך מעובד ויציב בחום, תמלל הפוך 2.0 מיקרוגרם של RNA סיבי עדשה וכל ה-RNA האפיתל המופק באמצעות הפרוטוקול המומלץ של היצרן. מערבבים ריאגנטים ו-RNA עבור כל דגימה בצינור PCR נקי. שמור את כל התמיסות ודגימות ה-RNA על קרח.
   הערה: טרנסקריפטאז זה יכול לתמלל לאחור עד 2.5 מיקרוגרם של RNA לכל תגובה. מניחים המרה מלאה מ-RNA ל-cDNA, ולכן ריכוז ההתחלה של ה-RNA משמש כריכוז ה-cDNA המשוער.
2. הפעל את התגובה במחזור התרמי באמצעות התנאים המפורטים בטבלה 1.
3. אחסן cDNA מתומלל הפוך ב-80 מעלות צלזיוס או המשך לשלב qPCR.
   הערה: דגימות cDNA אוחסנו עד 4 חודשים ללא השפלה ניכרת, מכיוון ש-cDNA יציב יותר מ-RNA. סביר להניח שניתן לאחסן דגימות למשך זמן רב יותר, בתנאי שמחזורי ההקפאה-הפשרה ממוזערים.

טבלה 1: תנאי תרמו-ציקלר לשעתוק הפוך. תנאים אלה מכווננים לטרנסקריפטאז הפוך ספציפי, מעובד מאוד ויציב בחום. תנאי הריצה עשויים להשתנות בהתאם לאנזים ולערכה בה נעשה שימוש.

6. PCR כמותי בזמן אמת

1. לפני תחילת התגובות, הכינו תמיסות מלאי cDNA לריכוז הרצוי על ידי דילול במים בדרגה מולקולרית. בניסויים אלה, 1 מיקרוליטר של cDNA ישמש ב-5 ננוגרם/מיקרוליטר עבור תגובות של 5 ננוגרם/באר. שמור את כל התמיסות ודגימות ה-cDNA על הקרח.
   הערה: לוחות מערך TaqMan (פורמט 0.1 מ"ל) מומלצים כדי להתאים לתגובות של 5-50 ננוגרם cDNA לבאר. ביצוע ציטוטים של cDNA שימושי כדי להגביל את מחזורי ההקפאה-הפשרה. במחקר זה, הדגימות הוגבלו למקסימום של 5 מחזורי הקפאה-הפשרה.
2. הכן מיקס מאסטר עובד המורכב מתקדם מאסטר מיקס ובדיקות להמלצות מסחריות. ראה סעיף 7 לדוגמא הכנה. שמור את כל התמיסות ודגימות ה-cDNA על הקרח.
   הערה: בדרך כלל משתמשים בזוג בדיקות עם שני צבעים שונים לכל באר. לדוגמה, במחקר זה, Crygs-FAM-MGB שימש כבדיקה של הגן המעניין, ו-Ppia-VIC-MGB כבקרה פנימית. ההמלצות המסחריות לריכוזי בדיקה ופריימר סופיים הן 250 ננומטר ו-900 ננומטר, בהתאמה. אם מטרה באה לידי ביטוי גבוה מאוד, ייתכן שיהיה צורך בבדיקה מוגבלת בפריימר כדי למנוע דלדול של ריאגנטים לתגובה.
3. טען את מלאי ה-cDNA (1 מיקרוליטר) לבארות מתאימות על צלחת ה-qPCR, ואחריו תערובת המאסטר העובדת (9 מיקרוליטר). מערבבים פתרונות על ידי פיפטינג למעלה ולמטה לאט תוך הוספת תערובת המאסטר. ודא שטיפת ה-cDNA מעורבבת בתמיסה והימנע מבועות.
   הערה: בהתאם לרגישות המטרה, ייתכן שיהיה צורך להעמיס את הצלחת על קרח.
4. אטום את לוחית ה-qPCR על ידי מריחה בזהירות של מכסה דבק אופטי. השתמש באפליקטור סרט דבק כדי להחליק את המכסה ולהבטיח אטימה הדוקה סביב כל באר.
5. צלחות מערבולת ב 1000 סל"ד למשך 10 שניות לערבב.
6. צלחות צנטריפוגה ב-1000 x גרם למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר כדי להבטיח שאין בועות אוויר בתחתית הבארות.
7. טען את הצלחת למחזור תרמי PCR כמותי והפעל באמצעות המחזורים המפורטים בטבלה 2.
   הערה: פרוטוקולי qPCR קונבנציונליים מוגבלים בדרך כלל ל-40 מחזורים. הגדלת ספירת המחזורים לא צפויה להניב תוצאות משמעותיות, שכן ב-40 מחזורים, עותק מטרה יחיד יכול תיאורטית להניב כטריליון אמפליקונים¹⁹.

טבלה 2: תנאי תרמו-ציקלר לתגובת שרשרת פולימראז כמותית. תנאים אלה מותאמים לסדרה ספציפית של מבחני ביטוי גנים מסחריים. נעשה שימוש בפרמטרי ברירת מחדל, למעט הגדלת מחזורי ההגברה מ-40 ל-45.

7. דוגמה לחישוב נפח עבור qPCR

הערה: קוד מקור R עבור מחשבון נפח עבור המשוואות המתוארות להלן זמין בקובץ משלים 1. מחשבון זה מיועד לבדיקות Taqman ותערובת המאסטר המפורטות בטבלת החומרים.

1. קבע את מספר הבארות שיש לזרוק ולחשב מינימום של 12.5% עודף. קבוע עודף זה (k_עודף) מפצה על שגיאת פיפטינג ומבטיח שיש מספיק פתרון. לדוגמא זו, 96 בארות ישמשו כיעד להכנת דגימה.
   משוואה:
   
   דוגמה:
   
   הערה: אם עודף של 12.5% אינו מספר שלם, דרך קלה להבטיח מספרים "נחמדים" בשלבים הבאים היא לעגל כלפי מעלה לבאר הקרובה ביותר ולהתאים את k_עודף בהתאם.
2. חשב את נפח תערובת המאסטר העובד. בניסויים אלה משתמשים ב-1 מיקרוליטר של cDNA ו-9 מיקרוליטר של תערובת מאסטר עובדת לכל באר. ניתן לכוונן נפחי cDNA ותערובת מאסטר לפי הצורך.
   משוואה:
   
   דוגמה:
   
3. חשב את משנה הריכוז (k_Conc). שינוי זה משמש ליצירת תערובת מאסטר עבודה מרוכזת יותר שתדלל ל-1x בערבוב עם cDNA.
   משוואה:
   
   דוגמה:
   
4. חשב את נפח הגשושית (פי 20).
   משוואה:
   
   דוגמה:
   
5. חשב נפח מלאי מיקס מאסטר (פי 2).
   משוואה:
   
   דוגמה:
   
6. הביאו את תערובת המאסטר העובדת לנפח המחושב באמצעות H₂O בדרגה מולקולרית.
   משוואה:
   
   
   
   
   
   דוגמה:
   
   
   
   
   

קובץ משלים 1: קוד מקור R עבור מחשבון נפח. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

אפיתל העדשה וסיבי העדשה בודדו מעכברים פראיים בני 6 עד 7 שבועות. שלושה עכברים שימשו לניסויים אלה, ו-2 קפסולות עדשות או 2 מסות תאי סיבים מכל עכבר נאספו יחד לשכפול ביולוגי אחד. כפי שמתואר בפרוטוקול, RNA חולץ באמצעות הפרדת פאזה של מגיב TRIzol. בממוצע, זוג אפיתל עדשה ומסות סיבים בתפזורת הניבו 0.8 מיקרוגרם (SD ± 0.2) ו-9.7 מיקרוגרם (SD ± 2.3) של RNA, בהתאמה. הריכוז הממוצע בפליטה של 15 מיקרוליטר היה 55.4 ננוגרם/מיקרוליטר (SD ± 16.3) ו-650.0 ננוגרם/מיקרוליטר (SD ± 152.2) עבור דגימות האפיתל והסיבים, בהתאמה. באמצעות תגובות של 5 ננוגרם/באר, זה מאפשר תיאורטית בממוצע 160 תגובות מזוג אפיתל עדשה בודד שבודד באמצעות פרוטוקול זה. טוהר ה-RNA הממוצע שנמדד על ידי יחסי A260/280 היה 1.92 (SD ± 0.05) עבור אפיתל ו-2.05 (SD ± 0.01) עבור סיבים, מה שמעיד על זיהום חלבון מינימלי. בדרך כלל, יחס A260/280 של ~2.0 נחשב טהור עבור RNA20. בסך הכל, בידוד זה הניב ריכוז מספיק של RNA טהור ביותר כדי לתמלל לאחור ל-cDNA ולבצע ניסויי qPCR חוזרים ונשנים.

ביצענו שעתוק הפוך ו-qPCR כמתואר בפרוטוקול. בחרנו 7 גנים עם ביטוי גבוה ידוע של תעתיקים או חלבונים בעדשה לניתוח qPCR בזמן אמת כדי לחשוף ביטוי דיפרנציאלי בין תאי רקמה 21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32. ביטוי יחסי מוצג כערכי 2-ΔΔCq, מנורמל לתאי אפיתל (איור 3). ביטוי יחסי ממוצע מוצג כאמצעים גיאומטריים עם סטיות תקן. בשל הביטוי הדיפרנציאלי הידוע, נעשה שימוש בקונקסינים לקביעת ההפרדה המוצלחת של תאי אפיתל וסיבים. קונקסין 43 (Cx43; חלבון צומת פער אלפא 1; Gja1) מתבטא בתאי אפיתל עדשה33, Cx46 (Gja3) מתבטא בתאי סיבי עדשה34, ו-Cx50 (Gja8) מתבטא הן בתאי אפיתל והן בתאי סיבים25,29. סיבי העדשה נצפים כמבטאים Gja1 ו-Gja8 ברמות נמוכות פי 200 ו-7.5 בערך מאפיתל העדשה, בהתאמה. בינתיים, Gja3 מתבטא בערך פי 1.5 יותר בסיבי העדשה, בהתאם לדיווחים קודמים28.

באופן דומה, ביטוי דיפרנציאלי נצפה עם קדרינים, כלומר E-cadherin (Cdh1) ו-N-cadherin (Cdh2). ביטוי חלבון E-cadherin מוגבל לאפיתל העדשה ואילו N-cadherin מתבטא הן באפיתל והן בסיבים35. כאן אנו מראים שהביטוי של Cdh1 ו-Cdh2 נמוך בערך פי 330 ופי 2.4 בסיבים בהשוואה לאפיתל.

שני סמני אפיתל ותאי סיבים נוספים, קופסה 6 זוגית (Pax6) ו-γS-crystallin (Crygs), בהתאמה, שימשו גם הם להדגמת הפרדה מוצלחת של תאי העדשות36,37. בהתאם לדפוסי הביטוי שנצפו בעבר, Pax6 מוגבל לתאי האפיתל, ומציג ביטוי נמוך פי 8 בסיבים. חלבוני גמא-קריסטלין מתבטאים בעיקר בתאי סיבי עדשה, ואנו רואים שקריגס גבוה בערך פי 3 בסיבים בהשוואה לאפיתל1. נתונים אלה מצביעים על הפרדה נקייה של אפיתל העדשה ומסת הסיבים, מה שמאפשר ניתוח טרנסקריפטומיקה של כל תא רקמה להשוואה.

איור 2: דיאגרמת זרימת עבודה של בידוד RNA צעד-אחר-צעד. (A) הפרדת פאזה: שלבים 3.1-3.11. שלבים אלה מתארים את תהליך ההומוגניזציה של רקמה ראשונית, מיצוי RNA ובידוד RNA באמצעות הפרדת פאזה של חומצה-גואנידיניום-פנול. (B) ריכוז RNA: שלבים 3.12-3.19. שלבים אלה מתארים את השטיפה והריכוז של RNA מבודד באמצעות עמודות נקיות ומרוכזות. (ג) פליטה: שלבים 3.20-3.26. שלבים אלה מתארים סילוק ה-RNA מעמודות הניקוי והרכז באמצעות מים וחימום ללא RNase כדי לקדם מסיסות. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: ביטוי גנים יחסי המשווה אפיתל עדשה מבודד למסת תפזורת של תא סיבים. רמות ה-RNA מנורמלות לתא האפיתל. סמני תאי אפיתל Gja1 [מקודדים לקונקסין 43 (Cx43)], Chd1 (מקודד ל-E-cadherin) ו-Pax6 (מקודד לגורם השעתוק Pax6) מראים ביטוי מוגבר בתאי אפיתל בהשוואה לתאי סיבים. סמני תאי סיבים Gja3 (מקודד ל-Cx46) ו-Crygs (מקודד γS-קריסטלין) מראים ביטוי מוגבר בהשוואה לאפיתל. סמנים המתבטאים הן בתאי אפיתל והן בתאי סיבים, Gja8 (מקודד ל-Cx50) ו-Chd2 (מקודד ל-N-cadherin), מראים אות הניתן לזיהוי בשני התאים. העלילות מציגות אמצעים גיאומטריים עם סטיות תקן בשיטת 2-ΔΔCq . המובהקות הסטטיסטית נקבעה באמצעות ANOVA דו-כיווני ואחריו מבחן ההשוואה המרובה Šidák. * עמ' ≤ 0.05; ** עמ≤ 0.01; עמ≤ 0.001; עמ≤ 0.0001. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

למחברים אין מה לחשוף.