מאמר שיטה

התניה מוקדמת תרמית במהלך זלוף ריאות ex-vivo לשיקום שתלי ריאה פגומים לפני ההשתלה

697 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/69084

⸱

31 באוקטובר 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Service of Thoracic Surgery, Department of Surgery and Anesthesiology Services, Lausanne University Hospital and Faculty of Biology and Medicine, Lausanne University, 2Service of Adult Intensive Care Medicine, Department of Interdisciplinary Centers and Logistics, Lausanne University Hospital and Faculty of Biology and Medicine, Lausanne University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מציג מודל זלוף ריאות ex-vivo של חולדה המשלב חשיפה חולפת למתח תרמי מכויל, ומקדם מנגנוני הגנה אנדוגניים לשיפוץ טיפולי של שתלי ריאות פגומים. הגישה ניתנת להרחבה ולשחזור ותומכת בפיתוח טיפולים לא תרופתיים לשיפור הצלחת השתלת ריאות.

תקציר

זלוף ריאות Ex-vivo (EVLP) התגלה כפריצת דרך בהשתלת ריאות, המאפשר הן הערכה תפקודית של ריאות התורם והן התערבויות טיפוליות לשיקום שתלים שוליים. אסטרטגיות שיקום כוללות גישות פרמקולוגיות ולא תרופתיות. בין האחרונים, הראינו כי מתח חום חולף ומבוקר ("מיזוג תרמי מוקדם", TP) הוא אמצעי יעיל לשיקום ריאות פגועות על ידי גרימת תגובת הלם חום מגן אנדוגנית. כאן, אנו מציגים פרוטוקול שלב אחר שלב למודל EVLP של חולדות המשלב TP לשיקום ריאות הנתונות לאיסכמיה חמה, המדמה תרומה לאחר מוות במחזור הדם (DCD). הפרוטוקול מפרט הכנת ריאות, קנולציה, זלוף ואינדוקציה של תגובת הלם חום. TP מורכב מעלייה של 30 דקות בטמפרטורת הפרפוזה ל-41.5 מעלות צלזיוס בשלב מוקדם של EVLP, ואחריה חזרה מהירה ל-37 מעלות צלזיוס למשך שארית הזילוף. במודל EVLP של 6 שעות, ריאות שטופלו ב-TP (n = 30) הראו ביטוי מוגבר של חלבון הלם חום 70, שיפור בהיענות ריאתית סטטית, בצקת מופחתת, שחרור נמוך יותר של גורם פון ווילברנד (סמן ביולוגי לפגיעה באנדותל), ונזק היסטולוגי מוחלש בהשוואה לביקורת (n = 30). הפרוטוקול מאפשר ניטור בזמן אמת של התנגדות כלי הדם, לחצים בדרכי הנשימה, תאימות ריאתית וחמצון, ותומך בניתוחים מולקולריים ומורפולוגיים הן בפרפוזה והן ברקמות. פרוטוקול ניתן לשחזור וניתן להרחבה זה ניתן להתאמה למערכות EVLP גדולות יותר של בעלי חיים או בני אדם, ומספק פלטפורמה תרגומית מעשית לחקר התערבויות לא תרופתיות שמטרתן לשפר את תוצאות ההשתלה.

מבוא

זלוף ריאות ex-vivo (EVLP) ייצג התקדמות משמעותית בתחום השתלות הריאות. השפעתו העיקרית טמונה בהרחבת מאגר השתלות הריאות הזמינות מתורם על ידי מתן אפשרות להערכה תפקודית של ריאות שוליות כדי לאפשר שימוש באיברים שאחרת היו מושלכים להשתלה 1,2. ריאות תורם שוליות (או מורחבות) מתייחסות לאחד או יותר מהקריטריונים הבאים: גיל התורם מעל 55, PaO2/FiO2 של פחות מ-300, זמן איסכמיה של יותר מ-6 שעות, מיקרוביולוגיה חיובית של כיח, רדיוגרפיה לא תקינה3. בנוסף להערכה פיזיולוגית, EVLP עשוי לשמש פלטפורמה ליישום התערבויות טיפוליות שונות שמטרתן לשפר את איכות השתל לפני ההשתלה (מושג של שיפוץ טיפולי)4. ככזה, EVLP מספק הזדמנות ייחודית לשקם ריאות פגועות (שוליות) ולהפחית את הסיכון לתפקוד לקוי של השתל הראשוני (PGD), סיבוך מרכזי המשפיע על תוצאות מוקדמות וארוכות טווח לאחר השתלת ריאות 5,6. PGD הוא הביטוי הקליני של תהליך הפגיעה באיסכמיה-רפרפוזיה (IRI), שהפתופיזיולוגיה שלו מסתמכת על מתח חמצוני, דלקת, הפעלת מפלי המשלים והקרישה, ואינדוקציה של תהליכי מוות תאי 7,8,9. בסופו של דבר, מנגנונים אלה תורמים לשיבוש התפקודים התקינים של אנדותל הריאות והאפיתל, מה שמוביל לבצקת ריאות לא קרדיוגנית עם יכולת חמצון מופחתת, שני סימני ההיכר העיקריים של PGD 6,10,11,12.

מספר הולך וגדל של מחקרים ניסיוניים, פרה-קליניים וקליניים, הוכיחו את יעילותן של אסטרטגיות טיפוליות שונות ex-vivo להקלה על IRI במהלך השתלת ריאות. דוגמאות כוללות חומרים פרמקולוגיים המכוונים למחמצנים ורדיקלים חופשיים, מסלולי מוות תאי, מתווכים דלקתיים, כמו גם טיפולים מבוססי תאים וגנים, אם להזכיר רק כמה 13,14,15,16,17,18,19,20. מעבר לגישות טיפוליות כאלה, EVLP עשוי לשמש גם כפלטפורמה ליישום לחץ פיזיולוגי ישירות על שתל הריאה, כדי לעורר מנגנוני הגנה מהותיים המספקים סובלנות אדפטיבית לעלבונות פתופיזיולוגיים עוקבים. אסטרטגיה אחת כזו כוללת יישום של מתח חום חולף ולא קטלני על שתל הריאה במהלך EVLP. ואכן, ידוע מזה זמן רב שתנאים של עומס חום מקדמים תגובת הלם חום אדפטיבית, הנובעת מביטוי של סדרה של חלבוני הלם חום (HSPs) הפועלים כמלווים מולקולריים ומעניקים עמידות לחשיפה נוספת לגירויים מלחיצים שונים21. מלבד השראת HSP, זוהו כמה התאמות תאיות נוספות בעקבות חשיפה לחום, כולל (א) המסלול נוגד החמצון והציטו-פרוטקטיבי הקשור ל-NF-E2 (NRF2), שהפעלתו בעת עקת חום מווסתת באופן משמעותי את הגן הציטו-פרוטקטיבי heme oxygenase22,23; (ב) תגובת החלבון הפרושה (UPR), המתמודדת עם מתח פרוטאוטוקסי ברטיקולום האנדופלזמי (מתח ER), והפעלתו על ידי חום עשויה להיות מגנה או מזיקה, בהתאם לעוצמת הלחץ התרמי 24,25,26; (ג) אוטופגיה, תהליך ציטו-פרוטקטיבי המקדם פירוק ליזוזומלי של אברונים ומקרומולקולות פגומים, שיכולים להיות מופעלים או מעוכבים על ידי חום באופן תלוי טמפרטורה וזמן27,28.

הראינו כי "התניה תרמית מוקדמת" כזו מספקת יתרונות משמעותיים במונחים של הפחתת מתח חמצוני, דלקת, מוות תאים ותפקוד לקוי של האנדותל, מה שמוביל להגנה משמעותית מפני IRI ריאות. לכן, הצענו כי התניה מוקדמת תרמית עשויה לייצג שיטה חדשה ולא תרופתית לשיקום טיפולי ex-vivo של שתלי ריאה פגומים לפני ההשתלה 29,30,31. התניה מוקדמת תרמית עשויה להציע מספר יתרונות על פני אסטרטגיות פרמקולוגיות ולא פרמקולוגיות קיימות. על ידי יצירת תגובה אנדוגנית תאית משולבת, היא עשויה לספק בו זמנית הגנה מפני מסלולים פתופיזיולוגיים מובהקים הקשורים ל-IRI, בעוד שאסטרטגיות אחרות מכוונות בדרך כלל למסלול יחיד. יתר על כן, זה מונע את הסיכון לתופעות לוואי פוטנציאליות הקשורות לשימוש בתרכובות פרמקולוגיות. מטרת המאמר הנוכחי היא להציג פרוטוקול מפורט שלב אחר שלב של התניה תרמית מוקדמת במהלך זלוף ריאות ex-vivo של ריאות חולדות פגועות, שניתן ליישם בסביבות מגוונות, במיוחד על מודלים גדולים יותר של בעלי חיים או ריאות אנושיות למטרות מחקר.

אנו משתמשים במערכת הריאות המבודדת של חולדה IPL-2 עבור EVLP. ההתקנה מתוארת באיור 1 וכוללת את הדברים הבאים: מאגר פרפוזה (איור 1-1); שתי משאבות רולר, לזרימת פרפוזה (איור 1-2A) ודגימת פרפוזה (איור 1-2B); אמבט מים תרמוסטטי (איור 1-3) לשמירה על טמפרטורת הפרפוזה; מחליף גז ממברנה (איור 1-4) המחובר למיכל גז (לא מוצג) המכיל תערובת של 6% O2, 10% CO2 ו-84% N2 כדי לחמצן ולקרבוקסילאט את הזרימה הנכנסת; שני חיישני לחץ (איור 1-5) לניטור לחצים בפרוזדורים שמאליים (LA) ובעורק הריאה (PA) (חיישן לחץ PA אינו נראה באיור); תא מחומם ואטום (איור 1-6) המאכלס את גוש הלב-ריאה עם חיבורים ייעודיים עבור צינוריות PA, LA וקנה הנשימה; מכונת הנשמה (איור 1-7) המחוברת לצינורית קנה הנשימה לאוורור ריאות ולמדידת לחץ דרכי הנשימה ותאימות ריאות סטטיות; מדחום אלקטרוני (איור 1-8) להצגת טמפרטורת הפרפוזה ברמת זרימת הרשות הפלסטינית. פלטפורמת חיבור (איור 1-9) שהאלמנטים שלה מוצגים בפירוט באיור 2: חיבור עבור ה-PA (איור 2-1), ה-LA (איור 2-2) וקנה הנשימה (איור 2-3); חיבור למודול משקל (איור 2-4) לניטור רציף של משקל בלוק הלב-ריאה; חיישן טמפרטורה (איור 2-5) לניטור טמפרטורת הפרפוזה בזרימת הרשות הפלסטינית. תיאור סכמטי מפורט של המעגל ניתן למצוא במקום אחר18.

פרוטוקול

הערה: חולדות Sprague-Dawley זכרים בוגרים שימשו למחקר זה (n = 60; גיל, 8-11 שבועות; משקל, 300-450 גרם). בעלי חיים שוכנו (2 חולדות / כלוב) במתקן החיות המקומי שלנו, מתוחזק תחת מחזור אור של 12 שעות אור / 12 שעות חושך עם גישה בלתי מוגבלת למזון ומים. כל בעלי החיים טופלו בהתאם ל"הנחיות לטיפול ושימוש בחיות מעבדה" (פרסום NIH מס' 96-23), וכל הניסויים בוצעו בהתאם לפרוטוקול הניסוי שאושר על ידי הוועדה המקומית לטיפול בבעלי חיים (Direction Générale de l'Agriculture, la Viticulture et Affaires Vétérinaires de l'Etat de Vaud (אישורים 3456a ו-3456x1). הגודל והמשקל של החיות נבחרו על סמך המחקרים הקודמים שלנו במודל EVLP של חולדות ומטעמי נוחות אנטומית (גודל הריאות וכלי הדם). הזן Sprague-Dawley נבחר, בהתחשב בכך שזנים אחרים (בעיקר חולדות Wistar) עשויים להפגין תגובות רגישות יתר לתמיסת הדקסטרן הקיימת בתמיסת הפרפוזה 1,32.

1. תיאור כללי של מעגל EVLP

הערה: ההגדרה מתוארת באיור 1, והאלמנטים של פלטפורמת החיבור (איור 1-9) מוצגים בפירוט באיור 2. תיאור סכמטי מפורט של המעגל תואר קודם לכן18.

  1. השתמש בתמיסה חוץ-תאית חוצצת תאית לזלוף ex-vivo . ודא שהפרפוזה זורם מהמאגר דרך מחליף הגז ומופנה דרך צינורית הרשות הפלסטינית לזלוף ריאות ולאחר מכן יוצא דרך צינורית LA בחזרה למאגר. עקוב באופן רציף אחר לחצי הזרימה (PA) והזרימה היוצאת (LA).
  2. חבר את כל המתמרים (לחץ PA, לחץ LA, משקל ריאות, מהירות משאבה) לקופסת הממיר האנלוגי/דיגיטלי (איור 3). פתח את התוכנה הבסיסית לרכישת נתונים (BDAS). כיול אותות לחץ באמצעות כיול דו-נקודתי (0; 10 ס"מ H2O) באמצעות עמוד מים. כייל את מודול המשקל באמצעות כיול דו-נקודתי (0 גרם ו-1 גרם). כיול את מהירות המשאבה באמצעות דגימת פרפוזה של דקה אחת ב-10 מ"ל לדקה. שלוט באיכות האותות על ידי הפעלת לחצים ידועים ומהירות משאבה והערכת הלימות התוצאות (פרוטוקול מפורט ווידאו לכיול אותות ניתן למצוא בחומרים משלימים).
  3. רשום את כל הפרמטרים העיקריים (לחצים PA, LA, משקל ריאות וזרימה) בזמן אמת על ידי תוכנת המערכת וצפה בתצוגה החזותית שלהם במחשב האישי.
    הערה: אותות פיזיולוגיים שנקלטו על-ידי ה-BDAS מיוצאים לקובץ טקסט באמצעות הפקודה File export בשורת התפריטים. נתונים שחולצו בנקודות זמן נבחרות (כל 60 דקות) מועברים לגיליון אלקטרוני ולאחר מכן מעתיקים/מדביקים לתוכנה לצורך ניתוח סטטיסטי.
  4. חשב את התנגדות כלי הדם הריאתיים (PVR) באמצעות משוואה (1):
    figure-protocol-1(1)
  5. השג דגימות (1-2 מ"ל) של הפרפוזה בנקודות זמן ייעודיות למדידות של סמנים ביולוגיים שונים.

2. יישום מיזוג מוקדם תרמי

  1. חבר אמבט מים תרמוסטטי (איור 4-1) כדי להבטיח טמפרטורת מים קבועה, מדויקת ומתכווננת עבור חימום פרפוזה. השתמש במשאבת מנוע משולבת בתוך אמבט המים כדי להזרים את המים המחוממים.
  2. השתמש במיכל זכוכית בעל דופן כפולה כמאגר (איור 4-2) כדי לשמור על טמפרטורת הפרפוזה על ידי זרימת מים מחוממים בין דפנות המיכל.
  3. השתמש בסליל חימום עם צינורות סרפנטין בתוך מיכל מים מחומם (איור 4-3) כדי להניע את הפרפוזה, מה שמאפשר חילופי חום מהמים לפרפוזה מיד לפני שהוא נכנס לתכשיר הריאות ex-vivo.
  4. אכסנו את גוש הלב-ריאה בתא האיברים (איור 4-4), מיכל בעל דופן כפולה מלא במים שזורמים מאמבט המים התרמוסטטי כדי לשמור על סביבה חמה.
  5. עבור חיישן הטמפרטורה והמדחום (איור 2-5 ואיור 4-5), יש להחיל בצורה מאובטחת ויציבה חיישן אוויר/משטח חרוז מסוג K כנגד צינורית הזרימה לניטור רציף של טמפרטורת הפרפוזה בפועל הנכנסת לעורק הריאה (PA). הטמפרטורה מוצגת על מדחום דיגיטלי.
  6. כדי לשמור על טמפרטורת הזרימה על 37 מעלות צלזיוס, הגדר את אמבט המים ל-38-38.5 מעלות צלזיוס.
    הערה: כדי לפצות על הפסדי חום מהפרפוזה לאורך מסלולו בצינור, קבענו בתנאים שלנו שיש להגדיר את טמפרטורת אמבט המים על 38-38.5 מעלות צלזיוס כדי לשמור על 37 מעלות צלזיוס בזרימה. בהתאם לאובדן החום מהפרפוסט, ייתכן שיהיה צורך להתאים הגדרות אלה כדי להבטיח את הטמפרטורה הרצויה בזרימה.
  7. התחל את פרוטוקול החימום ex-vivo לאחר 60 דקות של EVLP על ידי הגדלת טמפרטורת אמבט המים עד 43 מעלות צלזיוס כדי להגיע לטמפרטורת זרימה של 41.5 מעלות צלזיוס, המתקבלת במשך 5 דקות ונשמרת מעל 30 דקות.
    הערה: בעבודה הקודמת שלנו29, קבענו את הטמפרטורה האופטימלית עבור מיזוג מקדים תרמי (TP), תוך שימוש בטווח טמפרטורות מ-40 מעלות צלזיוס עד 43.5 מעלות צלזיוס ופרוטוקול EVLP של 3 שעות, כפי שמתואר באיור 5. טמפרטורת החימום המספקת הגנה אופטימלית ללא כל השפעות מזיקות (כפי שמסוכם באיור 5B) נמצאה כ-41.5 מעלות צלזיוס. לכן נעשה שימוש בטמפרטורה זו בכל הניסויים הבאים שלנו, עם משכי EVLP של עד 6 שעות29,30,31.
  8. לאחר חימום חולף זה, הוסף קרח לאמבט המים כדי להפחית במהירות (תוך 5 דקות) את טמפרטורת אמבט המים בחזרה ל-38 מעלות צלזיוס כדי להחזיר את טמפרטורת הפרפוזה בצינורית הזרימה ל-37 מעלות צלזיוס ולשמור על טמפרטורה זו עד סוף פרוטוקול EVLP.
  9. לקבוע משתנים פיזיולוגיים (תאימות ריאות), היווצרות בצקת ונקודות קצה מולקולריות (ביטוי של חלבוני הלם חום, אנזימים נוגדי חמצון, ציטוקינים דלקתיים וסמנים ביולוגיים של אפופטוזיס, אוטופגיה, מתח רשתית אנדופלזמית ונזק לתאי אנדותל).

3. פרוטוקול EVLP מפורט למיזוג מוקדם תרמי

  1. הכנת בעלי חיים
    1. הכינו את החומרים הנדרשים, כולל צינוריות ומכשירים כירורגיים (איור 6A,B וטבלת החומרים).
    2. שקלו את החיה כדי לחשב את המינונים המתאימים לכל החומרים הניתנים, זרימת הפרפוזה ופרמטרי האוורור.
    3. מכינים את תערובת ההרדמה: 80 מ"ג/ק"ג קטמין ו-8 מ"ג/ק"ג קסילזין באותו מזרק.
      הערה: יש לאחסן את חומרי ההרדמה בארון מאובטח.
    4. הכן הפרין, 1.7 U/g משקל גוף בתמיסת מלח איזוטונית (מזרק 1 מ"ל).
    5. להרדים את החיה, באמצעות איזופלורן 5% (מתאדה בתא אינדוקציה ייעודי), ואחריו הזרקה תוך צפקית של תערובת ההרדמה המוכנה. שמור על ההרדמה עם 1-2% איזופלורן באמצעות מסכת פנים.
      הערה: חשוב לשמור על הרדמה עמוקה כדי למנוע התנשמות במהלך הוצאה.
      השתמש בהתקנה עם מערכת מיצוי איזופלורן כדי להגן על המפעיל.
      השליכו את כל המחטים והמזרקים במיכלי פסולת ביולוגיים מתאימים ופסולת חדה. מיכלים אטומים חדים ומסוכנים ביולוגית מושלכים לאחר מכן דרך זרמי פסולת ייעודיים.
    6. גלח את החיה מהגרון לאזור הפין והסר את כל הפרווה שנותרה באמצעות נייר לח וחם.
    7. ודא את עומק ההרדמה על ידי צביטה בכפה האחורית; הגדל את ריכוז האיזופלורן אם קיימים רפלקסים.
    8. הנח את החיה במצב שכיבה ואבטח את כל ארבעת הגפיים באמצעות סרט דבק.
  2. מיצוי בלוק לב-ריאה ל-EVLP
    הערה: ההליך דורש הכשרה אינטנסיבית לביצוע השלבים השונים בזמן, א-טראומטי וניתן לשחזור מאוד. השלב העדין ביותר הוא קנולציה של עורק הריאה, אותה יש לבצע בהגדלה באמצעות מיקרוסקופ ניתוחי ספקולרי לקבלת התוצאות הטובות ביותר. ההליך המלא יכול להתבצע על ידי חוקר יחיד מיומן היטב. כדי להשיג עצמאות ניסויית כזו, נדרשים מינימום של 15 הליכים מלאים בפיקוח חוקר מנוסה.
    1. הרם בעדינות את העור בקו האמצע של הגרון ובצע חתך אורך של 5 ס"מ לאורך ציר הזנב עד הצפאלי בעזרת מספריים קטנים.
    2. הפרד את אונות בלוטת הרוק ונתח בזהירות את הפאשיה מעל שרירי הסטרנוהיואיד באמצעות מלקחיים מעוקלים עד שהגרון וקנה הנשימה נחשפים בבירור.
    3. העבירו תפר משי 4-0 מתחת לקנה הנשימה והכינו קשר קשור, והשאירו את המלקחיים במקומם מתחת לקנה הנשימה.
    4. חשב את נפח הגאות (Vt) עבור אוורור in-vivo ורכש ריאות באמצעות נוסחת Stahl33:
      figure-protocol-2× figure-protocol-3
    5. הגדר את מכונת ההנשמה הייעודית לאוורור in-vivo ורכש ריאות (ראה טבלת החומרים) לנפח הגאות המחושב עם קצב נשימה של 70 נשימות לדקה, חלק השראה של חמצן (FiO2) של 0.5, ולחץ נשיפה חיובי (PEEP) של 3 ס"מ H2O.
      הערה: כדי להגדיר את ה-PEEP ל-3 ס"מ H2O, חבר את זרוע הנשיפה של המאוורר לצינור סיליקון מרפא פלטינה המוחדר 3 ס"מ מתחת לפני השטח של מיכל מלא במים.
    6. צור חתך רוחבי בין שתי טבעות סחוסיות, הכנס צינורית בקוטר חיצוני של 2 מ"מ (אורך 14 מ"מ, צינורית אוורור EVLP, איור 6B) לאוורור ואבטח אותה על ידי הידוק התפר.
    7. חבר את הצינורית למאוורר ואשר אוורור יעיל על ידי נוכחות בועות במיכל המלא במים המחובר לזרוע הנשיפה של המאוורר.
    8. בעזרת מספריים קהים, חתכו את העור לאורך הבטן והיכנסו לחלל הצפק, המשיכו בחיתוך שרירי דופן הבטן בקו האמצע עד לסרעפת.
    9. הזיזו בעדינות את המעיים הצידה באמצעות צמר גפן כדי לחשוף את הווריד הנבוב התחתון.
    10. הזריקו את תמיסת הפרין המוכנה לווריד והניחו לה להסתובב במשך 5 דקות. לאחר מכן, חצו את הווריד הנבוב ואבי העורקים להוצאה.
    11. לאחר שהחיה הוצאה לחלוטין ואושרה מתה, הפסק את האוורור ונתק את מכונת ההנשמה מצינורית קנה הנשימה כדי לאפשר לריאות להתרוקן, ולסמן את הופעת האיסכמיה החמה. שמור על הזמן האיסכמי החם הכולל (WIT) לשעה אחת.
      הערה: למרות שה-WIT החציוני המדווח בתרומת ריאות DCD קלינית הוא 33 דקות, לא דווח על השפעות מזיקות של משך WIT של עד 60 דקות על הישרדות של שנה אחת. לכן, רוב המרכזים מסכימים כיום על 60-90 דקות כגבול עליון מקובל של WIT34. כפי שפורט קודם לכן, השימוש ב-1 h WIT במודל החולדה שלנו רלוונטי אפוא לתרחיש הקליני35.
    12. חמש עשרה דקות לפני תום הזמן האיסכמי החם הכולל של שעה (כלומר, לאחר 45 דקות של איסכמיה חמה), מלאו מזרק של 60 מ"ל (קבוע על מחזיק) בתמיסת שימור קרה (4 מעלות צלזיוס, מאוחסן במקרר) (ראה הרכב בטבלה 1).
      הערה: החלק התחתון של המזרק מוגדר בגובה 20 ס"מ מעל החיה. חבר את המזרק לצינורית PA, באמצעות צינורות סיליקון שקועים במים קרים (איור 6C).
    13. בצע סטרנוטומיה חציונית באמצעות מספריים ליסטר קהים כדי למנוע נזק לרקמה ולמשוך בזהירות את דופן בית החזה באמצעות מחזירים קהים המחוברים לרצועות אלסטיות והמוסטט מיקרו-יתוש המחובר לסרעפת כדי לחשוף את הריאות. הימנע מכל מגע ישיר עם פרנכימת הריאות.
      הערה: משלב זה, כדי למנוע ייבוש רקמות, יש למרוח כמות קטנה של מי מלח פיזיולוגיים על פני הריאה בעת הצורך.
    14. בצע חתך "X" בקודקוד החדר השמאלי של הלב והחלק את המספריים בתוך הלב עד לאטריום השמאלי כדי להקל על החדרה מאוחרת יותר של צינורית LA.
    15. העבירו תפר משי 5-0 מתחת ל-PA הראשי והכינו קשר כפול קשור מראש והחזיקו את התפר בצד אחד עם מחזיק תוצרת בית (איור 6D ואיור 7A).
    16. הכן תפר נוסף סביב הלב לאבטחה מאוחרת יותר של צינורית LA (איור 7B).
    17. בצע חתך קטן ברשות הראשית והכנס את צינורית הרשות, וודא שלא תוכנס בועת אוויר.
    18. הזרמת מיד לריאות עם 25 מ"ל של תמיסת השימור הקר דרך צינורית PA, והתחלת זמן איסכמיה קרה.
      הערה: השתמש בלחץ פסיבי מגובה המזרק על המחזיק שתואר לעיל עבור זלוף זה.
    19. אבטח את הצינורית במקומה בעזרת התפר הקשור מראש.
    20. מיד לאחר צינורית PA, חבר מחדש את צינורית קנה הנשימה למכונת ההנשמה והמשך את האוורור עם ההגדרות הראשוניות, תוך הפחתת קצב הנשימה ל-25 נשימות לדקה.
    21. הכנס את צינורית LA דרך החתך בחדר השמאלי לתוך הפרוזדור השמאלי.
    22. אבטח את הצינורית עם התפר השני הקשור מראש (סביב הלב), הקפד למנוע הפרעה לזרימה מהאטריום השמאלי ולאפשר לכל נפח 25 מ"ל של תמיסת שימור קר לעבור דרכו (לוקח ~15 דקות).
    23. בסוף הזלוף של תמיסת השימור, מהדקים את צינורית ה-PA עם מהדק בולדוג (איור 7C, עיגול כחול) ומנתקים אותה מהצינור.
    24. נתח בזהירות את קנה הנשימה והרקמות שמסביב כדי לגייס את הריאות.
    25. מהדקים את קנה הנשימה באמצעות קליפ מפרצת (איור 7C, עיגול אדום), בזמן שהריאות מנופחות לחלוטין (נפח גאות אחד).
    26. נתח את אבי העורקים היורד וכלי תמיכה אחרים כדי לשחרר את גוש הלב-ריאה, והרם אותו על ידי אחיזה עדינה בקנה הנשימה.
    27. מניחים את גוש הלב-ריאה בכלי המכיל תמיסת שימור במצב נוטה ומאחסנים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס לזמן איסכמיה קרה כולל של שעה.
      הערה: בתום הניתוח, יש להניח שרידים ביולוגיים בשקיות לסילוק פסולת לצורך סילוק נוסף על ידי השירות הייעודי.
  3. Ex-vivo זלוף ריאות ומיזוג מקדים תרמי
    הערה: עיין בתרשים הזרימה המתאר את השלבים העיקריים להנחיית ההתקדמות בשלבים השונים של הפרוטוקול (איור 8).
    1. הנח דלי קרח באמבט המים התרמוסטטי כדי להפחית את טמפרטורת הפרפוזה ל-15 מעלות צלזיוס.
    2. מלאו את המאגר ב -100 מ"ל פרפוזה ואפשרו לו להסתובב דרך המערכת. השתמש בתמיסת הזלוף המבוססת על אלבומין אנושי (ראה הרכב בטבלה 1) כפתרון חוץ-תאי חוצץ א-תאי לזלוף ex-vivo .
    3. מדוד את ה-pH של הפרפוזה ושמור עליו ברמה פיזיולוגית (7.35-7.45), הוסף מאגר טריס (הידרוקסימתיל) אמינומתאן (THAM) בהתאם.
    4. שקלו את בלוק הלב-ריאה והרכיבו אותו על מערכת EVLP, החל מצינורית האוורור תוך שמירה על קליפ המפרצת במקומו על קנה הנשימה.
    5. חבר את צינורית הרשות הפלסטינית, הימנע בזהירות מהכנסת בועות אוויר לכלי הדם של הריאות (ודא שמלכודת הבועות מלאה).
    6. אפשר לכמה טיפות של תמיסת זלוף לצאת ולחבר את צינורית LA.
    7. הגדר את לחץ הפרוזדורים השמאלי על 3 מ"מ כספית על ידי התאמת גובה קו היציאה המחובר למעגל הניקוז.
    8. אפס את מודול המשקל ועקוב אחר השינוי במשקל של בלוק ריאות הלב לאורך EVLP.
    9. חשב את תפוקת הלב התיאורטית (CO) באמצעות הנוסחה שפותחה על ידי לינדשטדט ושייפר:
      figure-protocol-4
    10. התחל זלוף (2% מה-CO התיאורטי) והגדל בהדרגה את זרימת הפרפוזה (7.5% מה-CO התיאורטי) ואת הטמפרטורה בהתאם לפרמטרים שצוינו, כמתואר בטבלה 2.
      הערה: במהלך EVLP, זרימת הפרפוזה מוגדרת בין 2% ל-7.5% מה-CO התיאורטי המחושב. זרימת פרפוזה נמוכה זו מאפשרת לשמור על לחץ עורקי הריאות בטווחים נורמליים ולהפחית את הסיכון לבצקת ריאות מוקדמת, במיוחד בריאות פגועות איסכמיות חמות. זה מאפשר למשתמשים לשמור על ההכנה לפרקי זמן ממושכים. חוקרים אחרים השתמשו בזרימות דומות ל-EVLP של חולדות, בעוד שאחרים השתמשו בזרימות של עד 20% מה-CO38 התיאורטי.
    11. התאם את טמפרטורת הפרפוזה על ידי העלאה הדרגתית של טמפרטורת אמבט המים.
      הערה: הקפד לשמור על ידיים נקיות מכל ציוד החימום כדי למנוע פציעות אפשריות.
    12. לאחר שטמפרטורת הפרפוזה מגיעה ל-35 מעלות צלזיוס, התחל אוורור מכני על ידי הסרת קליפ המפרצת מקנה הנשימה והפעלת מכונת ההנשמה הייעודית לאוורור ex-vivo (ראה טבלת חומרים).
      הערה: כיול לחץ מתבצע כל 14 יום באמצעות כיול דו-נקודתי (0 ו-30 ס"מ H2O). כיול הצינור מתבצע בכל שימוש על פי פרוטוקול מתוכנת, לתיקון גורמים חיצוניים הקשורים להתנגדות הצינורות והצינוריות.
      1. השתמש בתוכנה המוזכרת להגדרות מכונת הנשמה ורכישת נתונים, מכיוון שהיא מספקת הקלטות רציפות של אותות נשימה ותאימות ריאות בנקודות זמן ייעודיות (ראה תרשים זרימה, איור 8), על פי פרוטוקול מתוכנת של הגדלה הדרגתית של נפח הריאות עם מדידה מקבילה של לחץ דרכי הנשימה.
      2. לאחר מכן התאימות מחושבת אוטומטית על ידי משוואה המותאמת לאיבר הדפלציה של לולאת נפח הלחץ (משוואת סלזאר-נואלס).
      3. הצג את כל נתוני ההנשמה, אחסן אותם במחשב אישי ייעודי וייצא אותם לגיליון אלקטרוני. חלץ נתונים בנקודות זמן נבחרות, העבר אותם לגיליון אלקטרוני אחר ולאחר מכן העתק/הדבק אותם בתוכנת הניתוח הסטטיסטי.
    13. הגדר את קצב הנשימה ונפח הגאות ל-7 פעימות לדקה ו-3 מ"ל/ק"ג, בהתאמה, למשך 10 דקות, ולאחר מכן הגדל ל-15 פעימות לדקה ו-6 מ"ל/ק"ג למשך 10 דקות ולבסוף, 30 פעימות לדקה ו-6 מ"ל/ק"ג עד סוף EVLP. הגדר את לחץ הנשיפה החיובי (PEEP) ל-3 ס"מ H2O לאורך EVLP (טבלה 2).
    14. הפעל תמרון גיוס כל 30 דקות של EVLP כדי למנוע אטלקטזיס על ידי הגדרת לחץ דרכי הנשימה ב-15 ס"מ H2O למשך 6 שניות.
    15. ב-1 שעות, 2 שעות, 3 שעות, 4.5 שעות ו-6 שעות EVLP, יש להפעיל ניפוח ריאות מדורג עד לנפח ריאות כולל של 10 מ"ל/ק"ג משקל גוף כדי לקבוע את תאימות הריאות ולחץ השאיבה השיא (Pmax).
      הערה: מדידות תאימות מבוצעות לאחר תמרון גיוס שתואר לעיל.
    16. הגדל את טמפרטורת הפרפוזה כדי להגיע ל-37 מעלות צלזיוס בצינורית PA הנכנסת לאחר 60 דקות EVLP.
    17. הפעל את פרוטוקול החימום ex-vivo לאחר 60 דקות של EVLP.
    18. הגדל את טמפרטורת אמבט המים עד 43 מעלות צלזיוס כדי להגיע ל-41.5 מעלות צלזיוס בצינורית ה-PA הנכנסת (זה לוקח ~ 5 דקות), כפי שמוצג באיור 2, איור 3 ואיור 4-5.
    19. שמור על טמפרטורה זו בין 60 דקות ל-90 דקות EVLP (סה"כ 30 דקות).
      הערה: בעבודה הקודמת שלנו, הראינו ש-41.5 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לא קידמו פגיעה תרמית ברמה של כל הריאה29. לא ביצענו מבחני כדאיות ספציפיים של תאים במבחנה כדי לבדוק פגיעה תרמית בתנאים כאלה.
    20. לאחר 30 דקות של חימום, הוסף קרח לאמבט המים כדי להגדיר במהירות (5 דקות) את הטמפרטורה בצינורית הזרימה בחזרה ל-37 מעלות צלזיוס.
      הערה: בקבוצת הביקורת, טמפרטורת הפרפוזה נשמרת על 37 מעלות צלזיוס לאורך EVLP, ללא יישום מיזוג מוקדם תרמי (ראה טבלה 2). אנו לא משלבים קבוצת "חימום מזויף" (למשל, על ידי התאמת חום אמבט מים ללא עליית טמפרטורה).
    21. שמור על טמפרטורת הפרפוזה על 37 מעלות צלזיוס בצינורית הזרימה של PA עד סוף ה-EVLP.
    22. אסוף דגימות של תמיסת פרפוזה ב-1 שעה, 2 שעות, 3 שעות, 4.5 שעות (1-2 מ"ל בכל נקודת זמן) ו-6 שעות (10 מ"ל) של EVLP, מאחת מיציאות הדגימה המחוברות למעגל (במעלה הזרם או במורד הזרם של הכנת הריאות), כפי שמוצג באיור 1-2B. השתמש בדגימות באופן מיידי לניתוחי גזים (מדידת pH, PCO2 ו-PO2, באמצעות מחסנית CG4+). למדידות ביוכימיות נוספות, צנטריפוגה את הדגימות (500 × גרם, 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס) ושמור את הסופרנטנט השקוף ב-80 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
    23. לאחר 6 שעות EVLP, יש למרוח מחדש את קליפ המפרצת על קנה הנשימה (לאחר שהריאה מנופחת במלואה) ולהדק את צינורית הרשות הפלסטינית עם מהדק בולדוג.
    24. שקלו את גוש הלב-ריאה כדי לקבל את משקלו הסופי.
      הערה: ניתן להעריך את העלייה במשקל במהלך EVLP כהפרש בין המשקל הסופי למשקל ההתחלתי או שניתן לנטר אותה ברציפות במהלך EVLP עם מודול המשקל שתואר לעיל.
    25. מנתחים בזהירות את הריאות, מפרידים בין האונות האישיות.
    26. שימור הרקמה ליישומים במורד הזרם: הקפאה מהירה בחנקן נוזלי ואחסון בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס לניתוחים ביוכימיים או קיבוע בפרפורמלדהיד (PFA) להערכה היסטולוגית. ניתן לשמור את הריאה השמאלית ולהכין אותה להשתלת ריאות.

4. סטטיסטיקה

  1. הקצו בעלי חיים לקבוצות טיפול ספציפיות (בקרה לעומת התניה תרמית, n = 5/קבוצה עבור כל נקודת סיום ניסויית).
    הערה: איננו מקצים בעלי חיים באופן אקראי לקבוצה זו או אחרת, אך הקבוצות מתחלפות מדי יום. לא ניתן לבצע את הפרוטוקול (חום לעומת בקרה) בצורה עיוורת, בשל הצורך לדעת בקפדנות את טמפרטורת הפרפוזה במהלך הניסויים. לעומת זאת, ניתוחים ביולוגיים והיסטולוגיים נעשים בצורה עיוורת, ללא זיהוי של קבוצת הטיפול שהוקצתה.
  2. נתח את הנתונים.
  3. בטא תוצאות כאמצעי ± SEM.
  4. אמת התפלגות תקינה של הנתונים באמצעות מבחן קולמוגורוב-סמירנוב.
  5. עבור ניסויים בנקודת זמן, העריכו את ההשפעות של זמן והקצאת קבוצות באמצעות ANOVA דו-כיווני, ואחריו מבחן הפוסט-הוק של סידק להשפעות קבוצתיות ותיקון בונפרוני להשפעות זמן, תוך שימוש ב-1 שעה כהתייחסות. שקול ערך p < 0.05 כמובהק סטטיסטית. שקול טרנספורמציה של הנתונים במקרה של התפלגות לא נורמלית לפני החלת ANOVA.
  6. עבור ניתוחים היסטולוגיים, קבע (בצורה עיוורת) את ציון פגיעת הריאות של כל דגימה, על ידי כימות בצקת סביב כלי הדם ב-10 שדות/חתך.
    1. השתמש במספר היחסי של כלי דם עם בצקת סביב כלי הדם (A): 0: נעדר; 1: קל (<25%); 2: בינוני (25-50%); 3: חמור (>50%).
    2. השתמש בעובי הבצקת הפריוסקולרית (B), המחושב כאחוז מקוטר הכלי הפנימי (0: ללא בצקת; 1: <25%; 2: 25-50%; 3: >50%).
    3. השתמש בסכום A+B ב-10 הסעיפים שנבדקו כדי לחשב את הציון31.
    4. בצע השוואות סטטיסטיות באמצעות מבחן מאן-וויטני הלא פרמטרי (עקב התפלגות לא נורמלית של הנתונים), עם מובהקות שהוקצתה ל-p < 0.05.

תוצאות

משתנים פיזיולוגיים של הריאות מנוטרים באופן רציף לאורך כל ההליך, כולל לחץ עורק ריאתי (PAP), התנגדות כלי דם ריאתיים מחושבת ופרמטרים נשימתיים, כולל תאימות ריאתית סטטית (SPC) ולחץ שיא בדרכי הנשימה (Pmax). בנוסף, מודול המשקל מאפשר הערכה של היווצרות בצקת על ידי מתן מדד עקיף להצטברות נוזלים בריאה. היתרונות של התניה מוקדמת תרמית (TP) ביחס לריאות בקרה (Ctrl) כוללים שיפור של SPC (איור 9A, מבוטא כיחס של SPC בכל נקודת זמן לערך ה-SPC ההתחלתי, n = 5/קבוצה) והפחתה בעלייה במשקל הריאות (איור 9B, n = 5/קבוצה) במהלך EVLP. הנתונים מוצגים כאמצעים ± SEM.

ניתן לאבחן נוזל פרפוזה עבור סמנים ביולוגיים שונים. לדוגמה, התניה מוקדמת תרמית קשורה לשחרור מופחת משמעותית של von Willebrand (vWF), סמן ביולוגי של תאי אנדותל בסוף EVLP (איור 9C, n = 5/קבוצה, פירושו ± SEM).

ניתוחים מורפולוגיים של רקמת הריאה המתקבלים בסוף EVLP כוללים היסטולוגיה ואימונוהיסטוכימיה. דוגמאות לקטעים מוכתמים בהמטוקסילין ואאוזין (H & E) מוצגות באיור 9D, המראים נזק היסטולוגי מופחת בריאות שנחשפו להתניה תרמית, מבוטא כציון פגיעה ריאתית (איור 9E, n = 5/קבוצה). הציון נקבע על ידי כימות בצקת סביב כלי הדם ב-10 שדות/חתך (ראה שלבי פרוטוקול 4.6.1 ו-4.6.2). הסכום של A+B ב-10 הסעיפים שנבדקו שימש לחישוב הציון31.

ניתוחים מולקולריים ברקמת הריאה בסוף EVLP כוללים פרופיל ביטוי RNA או חלבון. כדוגמה, ניתן למדוד את רמות ביטוי החלבון של חלבון הלם החום המושרה HSP70 על ידי ELISA, כדי להראות את התפתחות תגובת הלם החום בריאות החשופות להתניה תרמית מוקדמת (איור 9F, המראה ניסוי מהלך זמן עם משכי זמן שונים של EVLP, n = 5/קבוצה בכל נקודת זמן). הביטוי של HSP70 בקבוצת TP הגיע לשיא לאחר 3 שעות EVLP, כלומר 90 דקות לאחר סיום ה-TP, ונשאר יציב לאחר מכן עד לסוף ה-EVLP. הנתונים מוצגים כאמצעים ± SEM.

figure-results-1
איור 1: תיאור פלטפורמת EVLP. (1) מאגר בעל דופן כפולה לפרפוזה. (2A) משאבת רולר לזרימת פרפוזה. (2ב) משאבת רולר לדיגום פרפוזה (מדידות ביוכימיות ואנליזות גזים). (3) אמבט מים תרמוסטטי. (4) מחליף גז ממברנה המחובר למיכל גז (לא מוצג). (5) חיישן לחץ פרוזדורים שמאלי. (6) תא מחומם ואטום. (7) מכונת הנשמה EVLP. (8) בדיקת טמפרטורה ומדחום. (9) פלטפורמת חיבור לחסימת לב-ריאה, שמרכיביה מפורטים באיור 2. (הערה: חיישן הלחץ של PA אינו גלוי). אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: פלטפורמת חיבור עבור בלוק לב-ריאה. (1) צינורית זרימה לעורק הריאה. (2) צינורית יציאה מהאטריום השמאלי. (3) חיבור לצינורית קנה הנשימה. (4) מודול משקל. (5) בדיקת טמפרטורה מעוצבת פנימית המחוברת היטב לצינורית הזרימה. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: מתמרי/מגברים אותות ותיבת ממירים אנלוגיים/דיגיטליים. (A). מתמר/מגבר לחץ עורק ריאה. (ב). בקר זרימת מהירות משאבה. (C). מתמר/מגבר לחץ פרוזדורים שמאליים. (ד). מודול משקל ריאות. (E). ממיר אנלוגי/דיגיטלי. (ו). מחשב אישי להצגת נתונים והקלטתם. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
איור 4: שמירה על טמפרטורה של הפרפוזה במהלך EVLP. (1) אמבט מים תרמוסטטי. (2) מאגר פרפוזה עם מיכל זכוכית בעל דופן כפולה שבו מסתובבים מים מאמבט המים התרמוסטטי. (3) צינורות סליל חימום בתוך מיכל מים מחומם המחובר לאמבט המים התרמוסטטי. (4) תא עוגב עם מיכל זכוכית בעל דופן כפולה לזרימת מים חמים מאמבט המים. (5) מדחום אלקטרוני ובדיקת טמפרטורה מעוצבת בתוך הבית מחוברים היטב כנגד צינורית הזרימה. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-5
איור 5: זיהוי הטמפרטורה האופטימלית עבור התניה תרמית-מוקדמת. (A) פרוטוקול EVLP להערכת טמפרטורות חימום שונות. מ-60 דקות ל-90 דקות של EVLP, טמפרטורת הפרפוזה הועלתה בטמפרטורות שצוינו. לאחר 90 דקות של EVLP, הטמפרטורה הוחזרה ל-37 מעלות צלזיוס למשך 90 דקות עד לסיום EVLP, שם בוצעו מדידות פיזיולוגיות ומולקולריות שונות. (B) סיכום תוצאות של ההשפעות של טמפרטורות החימום השונות על פרמטרים פיזיולוגיים ומולקולריים (ירוק מציין השפעות חיוביות; אדום מציין השפעות שליליות; וכתום מציין השפעות מעורבות). טמפרטורת החימום של 41.5 מעלות צלזיוס סיפקה את ההשפעות המגנות ביותר. קיצורים: EVLP = זלוף ריאות ex-vivo ; TP = מיזוג מוקדם תרמי. נתון זה שונה מ-Ojanguren et al.21. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-6
איור 6: חומר כירורגי. (A) מכשירים לחילוץ גוש הלב-ריאה: מחזיק קליפס מפרצת ומיקרוקליפ מפרצת (מערכת Yasargil), מהדק בולדוג, מספריים, מיקרומספריים, מחזירים שמחוברים לרצועות אלסטיות. (B) צינוריות EVLP עבור עורק הריאה (PA), הפרוזדור השמאלי (LA) וקנה הנשימה. (C) מערכת זלוף תוצרת בית לשטיפת פרפוזה קרה של הריאות. המרחק בין מפלס ה-PA בבעל החיים לתחתית המזרק נקבע על 20 ס"מ. (C) מחזיק תוצרת בית. (לא מוצג: מיקרוסקופ כירורגי, מכונת הנשמה ומערך הרדמה). אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-7
איור 7: תמונות מייצגות של התכשיר הניתוחי (A) קשר קשור מראש סביב עורק הריאה. (B) קשר קשור מראש סביב קצה הלב. (C) מהדק בולדוג (עיגול כחול) על צינורית PA וקליפס מפרצת (עיגול אדום) על קנה הנשימה. קיצור: PA = עורק ריאתי. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-8
איור 8: תרשים זרימה. שלבים עיקריים להנחיית ההתקדמות בשלבים השונים של הפרוטוקול. התקופה שבין שעה לשעה וחצי EVLP מוגדלת כדי לציין את פרוטוקול הטיפול בהתאם להקצאה הקבוצתית (בקרה לעומת התניה תרמית מוקדמת). קיצורים: CI = איסכמיה קרה; EVLP = זלוף ריאות ex-vivo ; PA = עורק ריאה; SPC = תאימות ריאתית סטטית; TP = מיזוג מוקדם תרמי; WI = איסכמיה חמה. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-9
איור 9: תוצאות מייצגות של ההשפעות של התניה תרמית מוקדמת בריאות חולדות פגועות. ריאות שנפגעו משעה אחת של איסכמיה חמה הוחדרו במערכת EVLP למשך 6 שעות. בין 60 ל-90 דקות של EVLP, קבוצת ריאות הייתה נתונה למיזוג תרמי מוקדם ב-41.5 מעלות צלזיוס (קבוצת TP). קבוצת ביקורת של ריאות נשמרה ב-37 מעלות צלזיוס לאורך כל ה-EVLP. (A) תאימות ריאתית סטטית (SPC), מבוטא כיחס בין הערך ההתחלתי, בבקרה (Ctrl, n = 5) וריאות TP (n = 5). SPC נשמר טוב יותר בריאות TP. (B) עלייה במשקל הריאות במהלך EVLP בבקרה (n = 5) וריאות TP (n = 5). חלה ירידה משמעותית בהיווצרות בצקת בקבוצת TP. (C) השחרור בפרפוזה של הסמן הביולוגי של תאי האנדותל פון ווילברנד פקטור דוכא בקבוצת TP (n = 5) בהשוואה לביקורת (n = 5). (D) הופעה מקרוסקופית ומיקרוסקופית של הריאות (צביעת המטוקסילין-אאוזין) בסוף EVLP בביקורת (n = 5) וריאות TP (n = 5). (E) ציון פגיעה ריאתית (לכימות הנזק ההיסטולוגי) היה נמוך יותר בקבוצת TP (n = 5) בהשוואה לקבוצת הביקורת (n = 5). (F) רמות החלבון של חלבון הלם החום המושרה HSP70 בתמציות רקמת ריאה שנמדדו לאחר 1, 2, 3, 4.5 ו-6 שעות EVLP בקבוצות ביקורת ו-TP (n = 5/קבוצה בכל נקודת זמן), המציגות תגובת הלם חום ניכרת בקבוצת TP. הביטוי של HSP70 בקבוצת TP הגיע לשיא לאחר 3 שעות EVLP (90 דקות לאחר סיום ה-TP) ונשאר יציב לאחר מכן עד סוף ה-EVLP.
כל הגרפים מראים פירושו ± SEM. עבור ניסויי מהלך זמן (A-C,F), השוואות סטטיסטיות בוצעו באמצעות ANOVA דו-כיווני ואחריו מבחן סידק לאפקט הקבוצתי והתאמות של בונפרוני להשפעת הזמן (עם זמן של שעה אחת כהתייחסות). עבור ציון פגיעת ריאות (E), השוואות סטטיסטיות נעשו באמצעות מבחן מאן-וויטני. * p < 0.05 (הבדלים בין קבוצות), † p < 0.05 לעומת EVLP של שעה אחת. קיצורים: Ctrl = שליטה; EVLP = זלוף ריאות ex-vivo; HSP70 = חלבון הלם חום 70; SPC = תאימות ריאתית סטטית; TP = מיזוג מוקדם תרמי. שונה מ-Parapanov et al.23. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה 1: הרכב הפתרונות המשמשים בפרוטוקול. אנא לחץ כאן להורדת טבלה זו.

טבלה 2: הגדרות EVLP לזרימת זלוף, טמפרטורת זרימה (בגובה צינורית עורק הריאה) ואוורור לאורך זמן. אנא לחץ כאן להורדת טבלה זו.

טבלה 3: פתרון בעיות. אנא לחץ כאן להורדת טבלה זו.

חומרים משלימים. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

דיון

הפיתוח של מודל EVLP של חולדות הניתן לשחזור ורלוונטי מבחינה פיזיולוגית מייצג צעד משמעותי קדימה במחקר השתלות ריאות. למרות הבדלים משמעותיים בין המינים בין החולדה לריאה האנושית (נסקר לאחרונהב-1), במיוחד הפגיעות הגדולה יותר של ריאת החולדה, מודל EVLP של חולדה מציע התערבויות פרמקולוגיות ולא תרופתיות עם יכולת שחזור גבוהה ועלות נמוכה. EVLP מציעה פלטפורמה ייחודית להערכת תפקוד הריאות של התורם, הדמיית תרחישי פגיעה קלינית כגון פגיעה באיסכמיה-רפרפוזיה, ויישום התערבויות טיפוליות לפני ההשתלה 2,39,40. בהקשר זה, מודל EVLP של חולדות מאפשר חקירות מכניסטיות בתפוקה גבוהה בתנאים מבוקרים היטב33. בשנים האחרונות, מספר קבוצות תרמו לשכלול טכניקות EVLP של חולדות. נלסון ואחרים סיפקו הדרכה פרוצדורלית בסיסית39. וואנג ועמיתיו הציעו מערך EVLP מודולרי המותאם לחיקוי תרומה לאחר מוות במחזור הדם (DCD) סימולציה41. Gouchoe et al. חקרו פורמולציות פרפוזה חדשות באמצעות נשאי חמצן מלאכותיים42 ואוליביירה ואחרים התמקדו בדלקת לאחר שימור איסכמיה קרה ארוכה38. בהתבסס על הידע הקיים, הפרוטוקול הנוכחי שלנו מציג אסטרטגיה חדשה ולא פרמקולוגית, כלומר התניה תרמית, שנועדה להפעיל מנגנוני הגנה אנדוגניים לשיקום שתלי ריאות של חולדות שנפגעו מאיסכמיה חמה. מודל הריאות הפגוע שלנו, המדמה מצבי DCD, בוצע בחולדות Sprague-Dawley זכרות33.

הקמת פרוטוקול זה דרשה תשומת לב קפדנית למספר צעדים תובעניים מבחינה טכנית המשפיעים באופן קריטי על כדאיות הריאות ויכולת השחזור. יש לבצע שאיבת ריאות עם מניפולציה מינימלית כדי למנוע פגיעה פרנכימלית. עומק ההרדמה הוא בעל חשיבות עליונה למניעת גודש ריאתי הנגרם על ידי התנשמות ואקסנגווינציה לקויה. הימנעות קפדנית מבועות אוויר במהלך קנולציה ותחול מעגלים היא חיונית, מכיוון שאפילו תסחיפים קטנים יכולים לזרז בצקת43. עצות ספציפיות לפתרון בעיות עבור אתגרי פרוטוקול נפוצים מצוינות בטבלה 3. בעוד שניתן להתאים את הגדרות האוורור והזלוף בגבולות בטוחים, יש לשמור על אסטרטגיות הגנה על הריאות כדי למנוע ברוטראומה או וולוטראומה44. ניתן להגדיל את זרימת הפרפוזה עד 20% מתפוקת הלב המשוערת בחולדות, בהשוואה ל-40% במודלים גדולים יותר כמו חזירים ובני אדם, אך יש לטטר אותה בזהירות45. בפרוטוקול שלנו, אנו משתמשים בזרימת פרפוזה נמוכה יותר (7.5% מתפוקת הלב התיאורטית), כדי למנוע עליות בלחץ עורק הריאה והתפתחות בצקת ריאות מוקדמת בריאות פגועות איסכמיות חמות, ובכך לאפשר הכנה ממושכת. למרות שחלק מהמעבדות נותנות קורטיקוסטרואידים במהלך הזלוף כדי להפחית את הדלקת, ההשפעות האנטי דלקתיות הידועות שלהם עלולות לבלבל כמה תוצאות ניסיוניות, ולכן איננו משתמשים בהם במודל שלנו כדי לשמר את היכולת לחקור פגיעות ריאות ותהליכים דלקתיים.

מיזוג תרמי דורש בקרת טמפרטורה מדויקת. מכיוון שהחום הולך לאיבוד לאורך הצינור מהמאגר לריאה, יש לעקוב אחר טמפרטורת הפרפוזה בצינורית הזרימה, והגדרת אמבט המים נשמרת מעט מעל טמפרטורת הזרימה הרצויה כדי להשיג את היעד בתוך ההכנה. חיישנים מכוילים מדי שנה באמצעות מדחום דיגיטלי PCE-T 1200 רב-ערוצי כדי להבטיח דיוק.

הממצאים שלנו מתייחסים גם למגבלות העיקריות של טיפול בחום קונבנציונלי. יישום חום מערכתי מוגבל על ידי ויסות טמפרטורה לא מדויק, תופעות לוואי מערכתיות וחוסר ספציפיות של איברים. EVLP עוקף את המחסומים הללו על ידי מתן סביבה מבוקרת ומקומית, המאפשרת אספקה מדויקת של מתח תרמי ישירות לרקמת הריאה29. שיטה זו מאפשרת אפנון קפדני הן של גודל הלחץ התרמי והן של משך המתח התרמי, שני פרמטרים קריטיים לאופטימיזציה של התגובה התאית המגנה מבלי לעורר פגיעה תרמית. יתר על כן, פלטפורמת ה-EVLP שלנו מאפשרת הערכות מרובות במורד הזרם, כולל ניתוחים מולקולריים, היסטולוגיים ופונקציונליים. חשוב לציין, ניתן גם להשתיל ריאות שעברו EVLP, מה שמאפשר הערכה ישירה של תפקוד השתל לאחר EVLP in vivo29. לפיכך, המודל תומך בהערכה הן ברמת האיבר המבודד והן ברמת ההשתלה. בהקשר זה, השילוב של התניה תרמית מוקדמת, חשיפה חולפת ל-41.5 מעלות צלזיוס במהלך EVLP, מתגלה כהתערבות מבטיחה. על ידי גירוי תגובת הלם חום ומסלולים אחרים המסתגלים ללחץ, שיטה זו משפרת את עמידות השתל ללא בלבול פרמקולוגי. התוצאות שלנו מראות כי התניה תרמית משפרת את הפיזיולוגיה של השתלת הריאות, מפחיתה היווצרות בצקת ושחרור מתווכים דלקתיים וסמנים ביולוגיים של פגיעה תאית (כפי שמודגם על ידי הרמות המופחתות של גורם פון וילברנד בפרפוזה EVLP של ריאות שטופלו בחום). ניתוחים מורפולוגיים תומכים עוד יותר באפקט המגן של התערבות זו, עם נזק מבני מופחת ושלמות רקמה נשמרת. רוב נתוני ה-EVLP של חולדות הניסוי נוצרו בזכרים, מה שמגביל את התובנה הספציפית למין; שני מחקרים דיווחו על תוצאות שונות בנשים - פגיעה מופחתת ברפרפוזיה באחד ודלקת מוגברת באחר,48,49. למרות שהמחקר שלנו השתמש בזכרים, ראינו בעבר יתרונות TP במודל EVLP חזירי באמצעות נקבות29, מה שמרמז על רלוונטיות בין המינים.

יש להדגיש אילוצים וחסרונות חשובים של השיטה שלנו. ראשית, כדי להבטיח שהריאות יהיו חדורות בטמפרטורה הרצויה בפועל, יש לנטר את האחרונה בצינורית הזרימה על ידי הפעלה חזקה של חיישן הטמפרטורה. שנית, חובה ששינויי הטמפרטורה יתקבלו תוך פרקי זמן קצרים מאוד, מה שמחייב שימוש באמבטיית מים תרמית עם תגובה מהירה לחימום והוספת קרח לאמבט המים לקירור מהיר. שלישית, התגובה הפיזיולוגית למתח חום עשויה להשתנות בהתאם למין המשמש ותלויה מאוד ברמת הלחץ ומשך הלחץ. לכן, חובה לבצע ניסויי פיילוט באמצעות טמפרטורות חימום שונות לפרקי זמן שונים במקרה שפרוטוקול זה מיושם על מינים שונים של בעלי חיים או ריאות אנושיות ולהעריך נקודות קצה ספציפיות הנוגעות הן להשפעות מגן והן להשפעות מזיקות פוטנציאליות של עומס החום המופעל. רביעית, בשל הביטוי הקינטי של גנים המגיבים לחום, ההשפעות של התניה מוקדמת תרמית תלויות בזמן ההתאוששות לאחר הפעלת מתח חום. נדרשים ניסויים המשתמשים במשכי זמן שונים לאחר מתח חום (כלומר, עם משכים שונים של EVLP) כדי להעריך השפעות תלויות זמן כאלה של יישום חום, כפי שמוצג בפרסום האחרון שלנו בנושאזה 30.

בסך הכל, המחקר הנוכחי שלנו קובע פרוטוקול EVLP מפורט וניתן לשחזור של חולדות המשלב התניה מוקדמת תרמית כאסטרטגיה בת קיימא לשיפור איכות הריאות של התורם השולי. הפרוטוקול ניתן להרחבה וניתן להתאמה למערכות EVLP גדולות יותר של בעלי חיים או בני אדם, מה שמחזק את הרלוונטיות התרגומית שלו. על ידי מתן קפדנות מתודולוגית ונאמנות פיזיולוגית, מודל זה פותח דרכים חדשות לחקר התערבויות לא תרופתיות שמטרתן להפחית את הפגיעה באיסכמיה-רפרפוזיה ולשפר את תוצאות השתלת הריאות לאחר ההשתלה.

גילויים

למחברים אין ניגודי אינטרסים להצהיר עליהם.

תודות

נתמך על ידי מענק מהקרן הלאומית השוויצרית למדע (Nr 310030_212252) ל-TK ו-LL).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<ציוד חזק>כללי
קליפ מפרצת ב. בראוןFE762K
חיישן תרמי אוויר/פני שטחTES אלקטריק אלקטרוניק קורפ/דיסטרלק AGTP01/176-67-162
רטרקטורים קהיםכלי המדע המדויק18200-09
בולדוג סרפינסכלי המדע המדויק18051-50
Gaze Compresses פרו-מדיקל25404
ערכת חיבור להרדמההוגו זאקס אלקטרוניק - הרווארד אפרטוס73-3076
משטחי כותנהSA מיוחס6001109
ניתוח מספרייםב. בראון BC165R
מסכת פנים לעכברושטם סגהPFM0006
הפארין 5000 U/mLב. בראון3522430
תא השראה להרדמההוגו זאקס אלקטרוניק - הרווארד אפרטוס50-0116
מלקחיים ניתוחים בעיני הקשתית מעוקלים במלואםאסקולאפ  OC022R
איזופלורןפרובט AG2222
אדי איזופלורן 19.3רוטאצ'ר רפואהCV30-310 O2/Air
מחסנית iSTAT4אקסון לאב AG03P85-25
קטסול 100 (100 מ"ג/מ"ל)ד"ר א. גראוב AGQN01AX03
Lister Sissors  ב. בראוןBC876R
מספריים מיקרו, קהה/קהה מעוקליםAesculap FM011R
מלקחיים מיקרו-אדסוןכלי המדע המדויק11018-12
המוסטטים מיקרו-יתושיםכלי המדע המדויק13011-12
מיקרוסקופ OPMI MDUצייס267067
NaCl 0.9%  ב. בראון534534
מחט 23 G x 25 מ"מBD Microlance 4300800
מחט 25 גרם x 25 מ"מBD Microlance 3300400
Perfadex (פתרון שימור)Xvivo פרפוזיה AB19811
מזרק פרפוזיה 60 מ"ל מנעול לוארBD פלסטיק300865
רייזורAesculap GT-421
קנה מידהמטלר טולדוPB602-L
תפר משי 4-0ב. בראוןF1134035
תפר משי 5-0ב. בראוןF1134027
סטין (תמיסת פרפוזיה)Xvivo פרפוזיה AB19004
כפפות ניתוחאנסל93-843
מזרק 1 מ"ל, Omnifix-Fב. בראון9161406V
קלטתלויקופיקס02136-00
מדחוםTES אלקטריק אלקטרוניקה קורפ1303
שפופרות המכילות פורמול;ביוסיסטמס שווייץ AG87-0960-00-10113
מכונת הנשמה (EVLP) (הגדרת נפח הגאות לפי פרוטוקול EVLP)גמישFX3
מכונת הנשמה (רכש ריאות)  (קובע נפח גאות כ: 7.69*(משקל גוף (ק"ג))^1.04)הוגו זאקס אלקטרוניק - הרווארד אפרטוס683
רטרקטור WEITLANERב. בראוןBV073R
קסילאסול (1 מ"ג/מ"ל)ד"ר א. גראוב AGQN05CM92
מapplied יאסרגילב. בראוןFE502T
<מערכת EVLP חזקה>IPL-2
מתאם ללחץ חיוביהוגו זאקס אלקטרוניק - הרווארד אפרטוס73-3635
AME 14- צינור משאבת SC0062 (טייגון) עם צווארון 3 עצירות, מארז של 12הוגו זאקס אלקטרוניק - הרווארד אפרטוס73-0126
AME 24- צינור משאבת SC0072 (טייגון) צווארון 3 עצירות, מארז של 12הוגו זאקס אלקטרוניק - הרווארד אפרטוס73-0155
יחידה בסיסית לריאה המבודדת בגודל 2 (IPL-2) מסוג 829/2הוגו זאקס אלקטרוניק - הרווארד אפרטוס73-2266
ערכת חיבור לסיב חמצן D150הוגו זאקס אלקטרוניק - הרווארד אפרטוס73-3765
מודול איזון בצקת EBM (EBM) עם חיישןהוגו זאקס אלקטרוניק - הרווארד אפרטוס73-4626
חמצן סיב מסוג D150, חבילה של 5הוגו זאקס אלקטרוניק - הרווארד אפרטוס73-3762
מחזיק להידוק קנולה אאורטית או קנה הנשימה עבור טבלאות OP בגודל 5הוגו זאקס אלקטרוניק - הרווארד אפרטוס73-3855
מחזיק לחמצניםהוגו זאקס אלקטרוניק - הרווארד אפרטוס73-3061
מערכת מדידת משקל HSEהוגו זאקס אלקטרוניק - הרווארד אפרטוס73-4604
תוכנת רכישת נתונים בסיסית של HSE-BDAS עבור Windows 2000, XP, Windows 7הוגו זאקס אלקטרוניק - הרווארד אפרטוס73-1712
חומרת רכישת נתונים HSE-USB, קופסת USB עצמאית ל-Windows 10 או 11הוגו זאקס אלקטרוניק - הרווארד אפרטוס73-3330
ISM 827/230 V משאבת גלגל אנלוגית רגלו, 4 ערוצים, 0.003-35 מ"ל/דקה (2 פעמים)הוגו זאקס אלקטרוניק - הרווארד אפרטוס73-0114
קנולה אטריום שמאלית (DD 4.0 מ"מ)הוגו זאקס אלקטרוניק - הרווארד אפרטוס73-0712
אלקטרודת חמצן זרימה קטנה עם חיבורי 1/16" (אופציונלי)הוגו זאקס אלקטרוניק - הרווארד אפרטוס73-4189
ערכת הרכבה למחזיקי חמצן סיבים מסוג D150הוגו זאקס אלקטרוניק - הרווארד אפרטוס73-3759
תא עצירה חד-כיווני מסוג 9500 (אחד לפנסילבניה, אחד ללוס אנג'לס)הוגו זאקס אלקטרוניק - הרווארד אפרטוס73-0097
סוג מודול לחץ חלקי של OPPM plugsys עם חמצן 697  (אופציונלי)הוגו זאקס אלקטרוניק - הרווארד אפרטוס73-0210
סוג 603 של מקרה מערכת בסיסי של Plugsysהוגו זאקס אלקטרוניק - הרווארד אפרטוס73-0045
pO2 תמיסה אפס 20 חבילות של 20 ml  (אופציונלי)הוגו זאקס אלקטרוניק - הרווארד אפרטוס73-3812
מתמר לחץ P75 סוג 379/HSE, טווח -75 עד +75 מ"מ כספית (PA, LA)הוגו זאקס אלקטרוניק - הרווארד אפרטוס73-0020
קנולה של עורק ריאה (OD 2.0 מ"מ, קוטר ראש, 2.5 מ"מ)הוגו זאקס אלקטרוניק - הרווארד אפרטוס73-0711
מאגר (עם מעטפת) לפתרון בופרהוגו זאקס אלקטרוניק - הרווארד אפרטוס73-3496
בקר סרוו SCP plugsys עבור סוג פרפוזיה 704הוגו זאקס אלקטרוניק - הרווארד אפרטוס73-2806
מגן לחיישן pO2 או pCO2 מיני חיישן  (אופציונלי)הוגו זאקס אלקטרוניק - הרווארד אפרטוס73-4196
פלטת התקנה קטנה לחיישן O2 או CO2 יחיד  (אופציונלי)הוגו זאקס אלקטרוניק - הרווארד אפרטוס73-3000
מודול מגבר מתמר TAM-A מסוג 705/1 (אחד ל-PA, אחד ל-LA)הוגו זאקס אלקטרוניק - הרווארד אפרטוס73-0065
סירקולטור תרמוסטטי E 103 (3 ליטר)הוגו זאקס אלקטרוניק - הרווארד אפרטוס73-0125
סוג 9560 R עם תלת-כיווני (אחד לפנסילבניה ואחד ללוס אנג'לס)הוגו זאקס אלקטרוניק - הרווארד אפרטוס73-0096
סט צינורות למאגר בופר עם שסתומי סגירת צינור נוזלהוגו זאקס אלקטרוניק - הרווארד אפרטוס73-3456
קנולה אוורור (קנה נשימה) OD 2.0 מ"מ, L 14 מ"מהוגו זאקס אלקטרוניק - הרווארד אפרטוס73-3384
<חזק>תוכנות מחשב
תוכנת רכישת נתונים בסיסית של HSE-BDAS עבור Windows 2000, XP, Windows 7הוגו זאקס אלקטרוניק - הרווארד אפרטוסV2.0
אקסלמיקרוסופט2502, Microsoft 365
פלקסיוורScireq8
פריזמת GraphPadGraphPad Software בע"מ.10.0.1
עכברי ספרג-דולי  מעבדות שארל ריבר (סן-ז'רמן-נואל, צרפת) 

מקורות

  1. Wang, A., Ali, A., Keshavjee, S., Liu, M., Cypel, M. Ex vivo lung perfusion for donor lung assessment and repair: A review of translational interspecies models. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 319 (6), L932-L940 (2020).
  2. Watanabe, T., Cypel, M., Keshavjee, S. Ex vivo lung perfusion. J Thorac Dis. 13 (11), 6602-6617 (2021).
  3. Kukreja, J., Chen, J., Brzezinski, M. Redefining marginality: Donor lung criteria. Curr Opin Organ Transplant. 25 (3), 280-284 (2020).
  4. Lyengar, A., Schiazza, A., Cantu, E. 3rd Ex-vivo lung perfusion therapies: Do they add value to organ donation. Curr Opin Organ Transplant. 27 (3), 204-210 (2022).
  5. Porteous, M. K., Diamond, J. M., Christie, J. D. Primary graft dysfunction: Lessons learned about the first 72 h after lung transplantation. Curr Opin Organ Transplant. 20 (5), 506-514 (2015).
  6. Shah, R. J., Diamond, J. M. Primary graft dysfunction (pgd) following lung transplantation. Semin Respir Crit Care Med. 39 (2), 148-154 (2018).
  7. Shepherd, H. M., et al. Innate immunity in lung transplantation. J Heart Lung Transplant. 40 (7), 562-568 (2021).
  8. Talaie, T., et al. Ischemia-reperfusion injury in the transplanted lung: A literature review. Transplant Direct. 7 (2), e652(2021).
  9. Capuzzimati, M., Hough, O., Liu, M. Cell death and ischemia-reperfusion injury in lung transplantation. J Heart Lung Transplant. 41 (8), 1003-1013 (2022).
  10. Cantu, E., et al. Gene set enrichment analysis identifies key innate immune pathways in primary graft dysfunction after lung transplantation. Am J Transplant. 13 (7), 1898-1904 (2013).
  11. Geraci, T. C., Chan, J. C. Y., Niroomand, A., Chang, S. H. Post lung transplant primary graft dysfunction. Semin Thorac Cardiovasc Surg. 37 (2), 192-198.e1 (2025).
  12. Ta, H. Q., Kuppusamy, M., Sonkusare, S. K., Roeser, M. E., Laubach, V. E. The endothelium: Gatekeeper to lung ischemia-reperfusion injury. Respir Res. 25 (1), 172(2024).
  13. Machuca, T. N., et al. Safety and efficacy of ex vivo donor lung adenoviral il-10 gene therapy in a large animal lung transplant survival model. Hum Gene Ther. 28 (9), 757-765 (2017).
  14. Nykanen, A. I., et al. Engineered mesenchymal stromal cell therapy during human lung ex vivo lung perfusion is compromised by acidic lung microenvironment. Mol Ther Methods Clin Dev. 23, 184-197 (2021).
  15. Yeung, J. C., et al. Ex vivo delivery of recombinant il-10 to human donor lungs. JHLT Open. 7, 100192(2025).
  16. Francioli, C., et al. Pyrrolidine dithiocarbamate administered during ex-vivo lung perfusion promotes rehabilitation of injured donor rat lungs obtained after prolonged warm ischemia. PLoS One. 12 (3), e0173916(2017).
  17. Wang, X., et al. Treatment with 3-aminobenzamide during ex vivo lung perfusion of damaged rat lungs reduces graft injury and dysfunction after transplantation. Am J Transplant. 20 (4), 967-976 (2020).
  18. Wang, X., et al. Pharmacological reconditioning of marginal donor rat lungs using inhibitors of peroxynitrite and poly (adp-ribose) polymerase during ex vivo lung perfusion. Transplantation. 100 (7), 1465-1473 (2016).
  19. Stone, M. L., et al. Ex vivo perfusion with adenosine a2a receptor agonist enhances rehabilitation of murine donor lungs after circulatory death. Transplantation. 99 (12), 2494-2503 (2015).
  20. Wong, A., et al. Potential therapeutic targets for lung repair during human ex vivo lung perfusion. Eur Respir J. 55 (4), 1902222(2020).
  21. Singh, M. K., et al. Heat shock response and heat shock proteins: Current understanding and future opportunities in human diseases. Int J Mol Sci. 25 (8), (2024).
  22. Ahmed, K., Zaidi, S. F., Mati Ur, R., Rehman, R., Kondo, T. Hyperthermia and protein homeostasis: Cytoprotection and cell death. J Therm Biol. 91, 102615(2020).
  23. Inouye, S., et al. Nrf2 and hsf1 coordinately regulate heme oxygenase-1 expression. Biochem Biophys Res Commun. 506 (1), 7-11 (2018).
  24. Park, S., et al. Modulation of protein synthesis by eif2alpha phosphorylation protects cell from heat stress-mediated apoptosis. Cells. 7 (12), 254(2018).
  25. Sharma, S., et al. Heat-induced endoplasmic reticulum stress in soleus and gastrocnemius muscles and differential response to upr pathway in rats. Cell Stress Chaperones. 26 (2), 323-339 (2021).
  26. Yang, Y., et al. Ursolic acid alleviates heat stress-induced lung injury by regulating endoplasmic reticulum stress signaling in mice. J Nutr Biochem. 89, 108557(2021).
  27. Mccormick, J. J., Dokladny, K., Moseley, P. L., Kenny, G. P. Autophagy and heat: A potential role for heat therapy to improve autophagic function in health and disease. J Appl Physiol (1985). 130 (1), 1-9 (2021).
  28. Mccormick, J. J., et al. Regulation of autophagy following ex vivo heating in peripheral blood mononuclear cells from young adults. J Therm Biol. 91, 102643(2020).
  29. Ojanguren, A., et al. Therapeutic reconditioning of damaged lungs by transient heat stress during ex vivo lung perfusion. Am J Transplant. 23 (8), 1130-1144 (2023).
  30. Parapanov, R., et al. Optimal duration of ex vivo lung perfusion for heat stress-mediated therapeutic reconditioning of damaged rat donor lungs. Eur J Cardiothorac Surg. 67 (2), ezaf027(2025).
  31. Parapanov, R., et al. Transient heat stress protects from severe endothelial damage and dysfunction during prolonged experimental ex-vivo lung perfusion. Front Immunol. 15, 1390026(2024).
  32. De Brito, F. B., Hanahoe, T. H., Shah, P., West, G. B. Delayed hypersensitivity reactions in rats and their response to clinical dextran. Int Arch Allergy Appl Immunol. 69 (2), 109-112 (1982).
  33. Stahl, W. R. Scaling of respiratory variables in mammals. J Appl Physiol. 22 (3), 453-460 (1967).
  34. Levvey, B., et al. Influence of lung donor agonal and warm ischemic times on early mortality: Analyses from the ishlt dcd lung transplant registry. J Heart Lung Transplant. 38 (1), 26-34 (2019).
  35. Parapanov, R., et al. Experimental models of ischemic lung damage for the study of therapeutic reconditioning during ex vivo lung perfusion. Transplant Direct. 8 (7), e1337(2022).
  36. Lindstedt, S. L., Schaeffer, P. J. Use of allometry in predicting anatomical and physiological parameters of mammals. Lab Anim. 36 (1), 1-19 (2002).
  37. Nelson, K., et al. Method of isolated ex vivo lung perfusion in a rat model: Lessons learned from developing a rat evlp program. J Vis Exp. (96), e52309(2015).
  38. Oliveira, P., Yamanashi, K., Wang, A., Cypel, M. Establishment of an ex vivo lung perfusion rat model for translational insights in lung transplantation. J Vis Exp. (199), e65981(2023).
  39. Nakata, K., Alderete, I. S., Hughes, B. A., Hartwig, M. G. Ex vivo lung perfusion: Recent advancements and future directions. Front Immunol. 16, 1513546(2025).
  40. Saddoughi, S. A., Cypel, M. Expanding the lung donor pool: Donation after circulatory death, ex-vivo lung perfusion and hepatitis c donors. Clin Chest Med. 44 (1), 77-83 (2023).
  41. Wang, Z., et al. Establishment of a novel ex vivo lung perfusion system for rat lungs after circulatory death. J Vis Exp. (212), e67168(2024).
  42. Gouchoe, D. A., et al. Exploring alternative perfusion solutions using next-generation polymerized hemoglobin-based oxygen carriers in a model of rat ex vivo lung perfusion. J Vis Exp. (208), e66702(2024).
  43. Bassani, G. A., et al. Ex vivo lung perfusion in the rat: Detailed procedure and videos. PLoS One. 11 (12), e0167898(2016).
  44. Braithwaite, S. A., Van Hooijdonk, E., Van Der Kaaij, N. P. Ventilation during ex vivo lung perfusion, a review. Transplant Rev (Orlando). 37 (2), 100762(2023).
  45. Iskender, I. Technical advances targeting multiday preservation of isolated ex vivo lung perfusion. Transplantation. 108 (6), 1319-1332 (2024).
  46. Noda, K., et al. Successful prolonged ex vivo lung perfusion for graft preservation in rats. Eur J Cardiothorac Surg. 45 (3), e54-e60 (2014).
  47. Ohsumi, A., et al. A method for translational rat ex vivo lung perfusion experimentation. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 319 (1), L61-L70 (2020).
  48. Mrazkova, H., Lischke, R., Herget, J. Influence of gender on ischemia-reperfusion injury in lungs in an animal model. Physiol Res. 65 (6), 953-958 (2016).
  49. Ricardo-Da-Silva, F. Y., et al. Male versus female inflammatory response after brain death model followed by ex vivo lung perfusion. Biol Sex Differ. 15 (1), 11(2024).

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

70
התניה מוקדמת תרמית במהלך זלוף ריאות ex-vivo לשיקום שתלי ריאה פגומים לפני ההשתלה
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.