מאמר שיטה

יצירת אורגנואידים מעור מישוריים נושאי שיער שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים באמצעות מערכת תרבית ממשק אוויר-נוזל

3.8K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/69088

⸱

17 באוקטובר 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Anatomy and Embryology, Leiden University Medical Center, 2The Novo Nordisk Foundation Center for Stem Cell Medicine (reNEW), Leiden University Medical Center, 3CEA, Inserm, IRIG, UA13 BGE, Biomics, University of Grenoble Alpes

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר שיטה לייצור אורגנואידים בעור המכילים זקיקי שיער מתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם באמצעות מערכת תרבית ממשק אוויר-נוזל מישורית רלוונטית מבחינה פיזיולוגית כדי לשכפל את הארכיטקטורה והתפקוד של העור.

תקציר

אורגנואידים עוריים (SOs) שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hiPSC) המכילים זקיקי שיער מספקים מודל מתוחכם במבחנה לחקירת אינטראקציות בין-תאיות בתוך מיקרו-סביבת העור. פותח בתחילה בתצורה ציסטית הפוכה, שבה הדרמיס חשוף לסביבה והאפידרמיס פונה פנימה לכיוון מרכז האורגנואידים, ניתן לאחר מכן להעביר SOs לתצורה מישורית במערכת תרבית ממשק אוויר-נוזל (ALI), הדומה יותר לפיזיולוגיה של עור האדם. כתב יד זה מציג פרוטוקול מקיף ליצירה ובחירה של SOs ציסטיים שניתן לנתח ל-SOs מישוריים ולפתח עוד יותר במערכת תרבית ALI. הפרוטוקול כולל נקודות ביקורת מוגדרות להערכה איכותית מקרוסקופית בשלבים קריטיים של התפתחות אורגנואידים, מפרט את השלבים הטכניים הנדרשים להשטחת SOs ציסטיים לעור מישורי, מפרט תנאים אופטימליים לתרבית ALI ומדגים תוצאות באמצעות ניתוח מולקולרי. ביום ה-27, צביעה אימונופלואורסצנטית עם סמנים ספציפיים לשושלת חשפה אפיתל פיגמנטי מרובה עם נספחי עור, כולל זקיקי שיער ומבנים דמויי בלוטות חלב. פרוטוקול זה מספק שיטה חזקה ליצירת SOs מישוריים עם נספחים, המציע מודל מבחנה רלוונטי מבחינה פיזיולוגית. מערכת זו תומכת ביישומים מגוונים בחקר העור וכבר שימשה בהצלחה למידול זיהום פתוגני, נזק לרקמות הנגרם על ידי קרינה אולטרה סגולה ותגובות לתרופות.

מבוא

העור מהווה מחסום מגן חיוני בין אורגניזמים לסביבתם, תוך ויסות טמפרטורת הגוף, מאזן המים והקלט החושי. הוא מורכב משלוש שכבות עיקריות: האפידרמיס, אפיתל קרטינוציט מרובד עם משטח קרניפי; הדרמיס, רקמת חיבור עשירה במטריצה חוץ-תאית, פיברובלסטים, עצבים, כלי דם ותאי חיסון; וההיפודרמיס, המורכב בעיקר מאדיפוציטים תת עוריים. תפקוד עור האדם תלוי גם בנספחים מיוחדים כגון זקיקי שיער (HFs), בלוטות חלב ובלוטות זיעה1.

הפרעות עור הן בין המצבים הרפואיים השכיחים ביותר בעולם 2,3. מבחינה היסטורית, רוב המחקרים המתמקדים בעור נערכו באמצעות מודלים של בעלי חיים4, המשכפלים את המורכבות הפיזיולוגית של האיבר בהקשר מערכתי. עם זאת, הבדלים משמעותיים בין מינים, יחד עם חששות אתיים גוברים, הניעו את הפיתוח של מודלים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית של עור אנושי.

מודלים קונבנציונליים של עור אנושי מתחלקים לשתי קטגוריות: אפידרמיס אנושי משוחזר, המורכב מקרטינוציטים מרובדים, ועור אנושי משוחזר, המשלב בנוסף תא עורי בסיסי המורכב מפיברובלסטים המשובצים במטריצת קולגן5. למרות ששני סוגי המודלים קידמו משמעותית את הבנתנו את הפיזיולוגיה של העור, הם חסרים את הנאמנות הארכיטקטונית המלאה והמגוון התאי של עור האדם הילידי. מגבלה עיקרית של מודלים אלה היא היעדר נספחי עור כגון HFs, מה שהופך אותם לבלתי מתאימים למחקר ובדיקות תרופות הקשורות להפרעות עור הכוללות צמיחת שיער והתחדשות6. בעוד שדווח על מערכות מתקדמות יותר המשלבות HFs, הן לא מצליחות לסכם באופן מלא את המורכבות של מבנה HF ומיקרו-סביבה או מסתמכות על טכנולוגיות מורכבות כגון הדפסה ביולוגית או מיקרו-יציקה 7,8,9,10.

מודל עור חדשני הנותן מענה לכמה מהאתגרים הללו הוא אורגנואיד העור (SO), שנוצר מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים (hiPSCs)11. מחקה התפתחות עוברית, ניתן לכוון את ה-hiPSCs לעבר אקטודרם פני הגולגולת ושושלות הפסגה העצבית של הגולגולת, תוך התארגנות עצמית למבנים ציסטיים הדומים מאוד לעור האדם. SOs אלה מכילים כמעט את כל סוגי תאי העור שאינם חיסוניים, המאורגנים באפידרמיס מרובד ודרמיס עשיר במטריקס חוץ-תאי. חשוב לציין, SOs תומכים בהתפתחות נספחי עור: HFs ובלוטות חלב. בהתחשב ביכולת ההרחבה הכמעט בלתי מוגבלת של hiPSCs, SOs מאפשרים הנדסה גנטית מתוחכמת ופיתוח כלים פונקציונליים חדשים. ככזה, SOs מייצגים התקדמות משמעותית בתחום וטומנים בחובם הבטחה ליישומים בביולוגיה התפתחותית, מודלים של מחלות, בדיקות תרופות ורפואה רגנרטיבית.

עם זאת, נותרה מגבלה ניכרת: SOs יוצרים מבנים ציסטיים הפוכים בהם האפידרמיס ממוקם בתוך הציסטה העורית, מוגן מפני כוחות מכניים ושקוע במדיום מימי. תצורה זו לא רק שאינה מדויקת מבחינה פיזיולוגית אלא גם מונעת הקמת ממשק אוויר-נוזל (ALI). כתוצאה מכך, ל-SOs ציסטיים יש יישום מוגבל למחקרים הכוללים את מחסום האפידרמיס, כוחות מכניים או טיפולים אפיקליים ישירים. כדי לטפל בבעיה זו, מוצגת להלן שיטה הניתנת לשחזור לשיטוח מכני של SOs ציסטיים ולאחר מכן לתרבית אותם כעור מישורי במצב ALI. גישה זו, שדווחה במקור על ידי Jung et al., מארגנת מחדש את ארכיטקטורת הרקמה כך שהאפידרמיס האפיקלי נחשף לאוויר, ובכך מקדמת ריבוד נוסף ותפקוד מחסום12. האורגנואידים המישוריים נושאי השיער המתקבלים שומרים על הארכיטקטורה המורכבת של עור האדם תוך שהם משקפים כיוון רקמות מדויק מבחינה פיזיולוגית, ומאפשרים גישה ניסיונית למשטח האפיקלי. למרות שההליך ארוך (~100 ימים) וכולל כמה שלבים מאתגרים מבחינה טכנית, במיוחד כאשר מנתחים SOs ציסטיים ל-SOs מישוריים, הוא עשוי לעניין במיוחד חוקרים שכבר עובדים עם SOs או מקבילים אחרים לעור אנושי שרוצים להגביר את הרלוונטיות הפיזיולוגית של מערכות המודל שלהם.

פרוטוקול

איור 1 מציג את זרימת העבודה ליצירת SOs מישוריים באמצעות מערכת תרבית ALI. החלק הראשון מתאר את היצירה של SOs ציסטיים מ-hiPSCs בהתבסס על המתודולוגיה שפותחה על ידי קארל ר. קוהלר11, עם שינויים קלים (איור 2). החלק השני מפרט את ההליך להמשך פיתוח SOs ציסטיים ל-SOs מישוריים באמצעות מערכת תרבית ALI כפי שתואר קודם לכן12, עם שינויים (איור 3). כל הכימיקלים והחומרים מופיעים בטבלת החומרים. שלושה קווי hiPSC שתוארו בעבר (LUMCi001-A, LUMCi004-A ו-WT2) שימשו ליצירת SOs (https://hpscreg.eu/)13.

1. יצירת SOs ציסטיים

איור 2 מציג מורפולוגיות צפויות וחריגות בשלבים מרכזיים.

  1. צבירת תאים (יום -2)
    1. תרבית hiPSCs בצלחת סטנדרטית של 6 בארות עד שהם מגיעים למפגש של 70-80%.
    2. שטפו את התאים עם 1 מ"ל של תמיסת מלח פוספט (DPBS) של Dulbecco. הוסף 1 מ"ל של מגיב דיסוציאציה תאית (CDR) ודגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2 למשך ~6 דקות כדי לשחרר את ה-hiPSCs מבלי לנתק אותם מהמטריצה (הימנע מעיכול יתר).
    3. שאפו את ה-CDR והוסיפו 1 מ"ל של מדיום תחזוקה hiPSC (hiMM) המכיל מעכב ROCK של 10 מיקרומטר. נתק בעדינות את התאים על ידי פיפטה למעלה ולמטה עם פיפטה P1000 והכין תרחיף תאים ב-3.5 × 103 תאים/מ"ל.
    4. הוצא 100 מיקרוליטר של מתלה התא לכל באר של צלחת חיבור נמוכה במיוחד עם תחתית U של 96 בארות באמצעות פיפטה רב-ערוצית. צנטריפוגה את הצלחת ב-110 × גרם למשך 6 דקות בטמפרטורת החדר ודגירה ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2.
  2. דילול מעכב ROCK (יום -1)
    1. הכינו את hiMM המכיל 100 מיקרוגרם/מ"ל של תוסף אנטיביוטי-אנטי-פטרייתי (AAS).
    2. יש להוציא 100 מיקרוליטר לבאר ולדגור ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2.
  3. אינדוקציה של אקטודרם פני השטח (יום 0)
    1. הפשירו את הנפח המתאים של מטריצת קרום המרתף על קרח לפני שתמשיכו לשלב הבא. הכן מדיום מינימלי hiPSC (hiMinM) בתוספת מטריצת ממברנת הבסיס (2%), BMP4 (2.5 ננוגרם/מ"ל), SB431542 (10 מיקרומטר) ו-bFGF (4 ננוגרם/מ"ל) (המכונה hiMinM+SFB) על קרח.
      הערה: ייתכן שיהיה צורך להתאים את ריכוז ה-BMP4 בהתאם לקו התאים המשמש (ראה דיון).
    2. אסוף אגרגטים של תאים לצינור תחתון עגול של 2 מ"ל באמצעות קצה פיפטה P200 רחב פתח.
      הערה: השתמש בטיפים רחבים הזמינים מסחרית. בחר פתח בקוטר פנימי של לפחות 2 מ"מ כדי למזער את הנזק לאגרגטים. לחלופין, מחממים אזמל עם מעקר לולאה אינפרא אדום ומשתמשים בו ליצירת פתח רחב מקצה פיפטה קונבנציונאלי.
    3. אפשר לאגרגטים להתיישב בתחתית הצינור. שואבים בזהירות את המדיום ומוסיפים 2 מ"ל hiMinM כדי לשטוף את האגרגטים. חזור על הכביסה בסך הכל פי 3.
    4. העבירו את אגרגטי התאים ב-hiMinM+SFB קר לבאר של צלחת מקוררת מראש של 6 בארות באמצעות קצה פיפטה P1000 בעל פתח רחב. לאחר מכן, העבירו כל אגרגט ב-100 מיקרוליטר של hiMinM+SFB לצלחת חיבור אולטרה-נמוכה עם תחתית U של 96 בארות באמצעות קצה פיפטה P200 רחב פתח. החזר את הצלחת לחממה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2.
      הערה: השתמש בסטריאומיקרוסקופ הממוקם מתחת למכסה מנוע זרימת אוויר למינרית (LAF) לשלב זה.
  4. אינדוקציה של אוכלוסיות תאים שאינם אפיתל (יום 3)
    1. הכן hiMinM המכיל LDN193189 (1 מיקרומטר), bFGF (250 ננוגרם/מ"ל) ו-AAS (100 מיקרוגרם/מ"ל). מוציאים 25 מיקרוליטר לכל באר באמצעות פיפטה רב-ערוצית.
    2. מערבבים בעדינות את הצלחת כדי להבטיח פיזור אחיד של המדיום. החזר את הצלחת לחממה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2.
  5. אספקת חומרים מזינים (יום 6)
    1. הכן hiMinM המכיל AAS (100 מיקרוגרם/מ"ל). מוציאים 75 מיקרוליטר לכל באר באמצעות פיפטה רב-ערוצית.
    2. מערבבים בעדינות את הצלחת כדי להבטיח פיזור אחיד של המדיום. החזר את הצלחת לחממה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2.
  6. כיבוד בינוני (יום 8 ויום 10)
    1. הכן hiMinM המכיל AAS (100 מיקרוגרם/מ"ל). הסר בזהירות 100 מיקרוליטר מדיום מכל באר באמצעות פיפטה רב ערוצית. מוציאים 100 מיקרוליטר של מדיום טרי לכל באר באמצעות פיפטה רב-ערוצית.
    2. מערבבים בעדינות את הצלחת כדי להבטיח פיזור אחיד של המדיום. החזר את הצלחת לחממה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2.
  7. מעבר לצלחות 24 בארות בעלות חיבור נמוך (יום 12)
    1. הפשירו את הנפח המתאים של מטריצת קרום המרתף על קרח לפני שתמשיכו לשלב הבא. הכן מדיום התבגרות אורגנואיד (OMM) באמצעות מדיום מתקדם (49% v/v), מדיום בסיסי עצבי (49% v/v), תוסף גלוטמין (1x), תוסף B-27 פחות ויטמין A (0.5x), תוסף N2 (0.5x), 2-Mercaptoethanol (0.1 מ"מ) ו-AAS (100 מיקרוגרם/מ"ל). הכן את הנפח המתאים של OMM קר המכיל 1% מטריצת ממברנת בסיס (OMM1%M) ושמור על קרח.
      הערה: השתמש בציוד מגן אישי ועבוד באזור מאוורר היטב בעת מניפולציה של 2-מרקפטואתנול.
    2. אסוף אגרגטים של תאים לצינור תחתון עגול של 2 מ"ל באמצעות קצה פיפטה P1000 רחב פתח.
    3. אפשר לאגרגטים להתיישב בתחתית הצינור. שאפו בזהירות את המדיום. הוסף 1.5 מ"ל של מדיום מתקדם כדי לשטוף את האגרגטים. חזור על הכביסה בסך הכל פי 3.
    4. העבירו את אגרגטי התאים ב-OMM1%M קר לבאר של צלחת מקוררת מראש של 6 בארות באמצעות קצה פיפטה P1000 רחב פתח. לאחר מכן, העבירו כל אגרגט ב-500 מיקרוליטר של OMM1%M לצלחת חיבור נמוכה של 24 בארות באמצעות קצה פיפטה P1000 בעל פתח רחב. החזר את הצלחת לחממה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2.
      הערה: השתמש בסטריאומיקרוסקופ המונח מתחת למכסה המנוע של LAF עבור שלב זה.
  8. כיבוד בינוני (יום 15)
    1. הפשירו את הנפח המתאים של מטריצת קרום המרתף על קרח לפני שתמשיכו לשלב הבא. הכן את הנפח המתאים של OMM1% M. שמור על קרח.
    2. בעזרת טיפים P1000, הסר בזהירות 250 מיקרוליטר של מדיום מכל באר. לאחר מכן, הוסף 250 מיקרוליטר של OMM1%M לכל באר. הנח את הצלחת בחזרה בחממה ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2 על שייקר אורביטלי המוגדר ב-65 סל"ד.
  9. בין היום ה-18 ליום ה-45, בצע שינוי חצי בינוני (250 מיקרוליטר) עם OMM בימים שני, רביעי ושישי.
  10. בין היום ה-45 ליום ה-90, בצע שינוי חצי בינוני (250 מיקרוליטר) עם OMM בימי שני ורביעי ושינוי בינוני מלא בימי שישי.

2. מעבר מ-SOs ציסטיים ל-SOs מישוריים

הערה: SOs ציסטיים מציגים מורפולוגיה הפוכה, כאשר האפידרמיס פונה פנימה לכיוון מרכז האורגנואיד והדרמיס במגע עם הסביבה החיצונית. בין היום ה-70 ליום ה-90, בהתאם לקו התאים וליעילות ההתמיינות, התמיינות על-בסיסית מוקדמת של האפידרמיס מתקדמת היטב, ומתפתחות יתדות שיער. זהו השלב שבו ה-SOs הציסטיים מועברים למערכת תרבית ALI כדי להשיג רקמה הדומה יותר לעור אנושי מקומי.

  1. בחירת SOs ציסטיים בין היום ה-70 ליום ה-90 למעבר ל-SOs מישוריים
    1. בחר SOs ציסטיים בקוטר של לפחות 5 מ"מ ותכולת תוצר לוואי מינימלית (תאים מזנכימליים המצטברים בקוטב אחד של הציסטה ועשויים להכיל גם סחוס). השתמש בנוכחות של פלאקודים/יתדות שיער כאינדיקטור איכות להתפתחות האורגנואידים בעור (איור 1A ואיור 2B).
      הערה: משטחים 2-4 SOs מישוריים מכל SO, בהתאם לגודלם.
  2. הכנת תוספת מצופה קולגן (פורמט 12 בארות)
    1. הכן תמיסת NaOH (1 M) על ידי המסת הכמות המתאימה של כדורי NaOH במים מזוקקים. עקר את תמיסת ה-NaOH באמצעות מסנן ממברנה בגודל נקבוביות של 0.2 מיקרומטר.
      הערה: השתמש בציוד מגן אישי ועבוד באזור מאוורר היטב בעת מניפולציה של תמיסת NaOH (1 מ').
    2. על קרח, יש לדלל את תמיסת הקולגן מסוג I לריכוז סופי של 2 מ"ג/מ"ל באמצעות 10x PBS (לריכוז סופי של פי 1), NaOH (5 מ"מ) ומים מזוקקים כדי להתאים את הנפח הסופי. מחלקים 150 מיקרוליטר מתמיסת הקולגן לכל תוספת המונחת בצלחת סטנדרטית של 12 בארות. דגרו את הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות כדי לאפשר לג'ל הקולגן להתפלמר.
  3. השטחה של SO ציסטי (איור 3)
    הערה: השתמש בסטריאומיקרוסקופ המונח מתחת למכסה המנוע של LAF עבור שלב זה.
    1. הניחו את ה- SO הציסטי שנבחר עם כמות קטנה של מדיום על מכסה צלחת פטרי בגודל 10 ס"מ באמצעות פיפטה P1000 בעלת פתח רחב. יש להוציא בזהירות את תוצרי הלוואי של ה-SO באמצעות אזמל סטרילי. השתמשו במלקחיים סטריליים בצד הנגדי כדי לייצב את האורגנואיד במהלך הכריתה (איור 3A).
      הערה: בשלב זה, ה-SO הציסטי דומה לבלון מנופח עם שתי שכבות עור הממוקמות זו על גבי זו.
    2. כרתו כ-1 מ"מ מקצות האורגנואיד הסמוכים לחתך הראשון באמצעות אזמל (איור 3B,F). פרשו בעדינות את שכבת העור העליונה באמצעות מלקחיים סטריליים (איור 3C,G).
    3. חותכים את חתיכת הרקמה ל 2-4 חתיכות בהתאם לגודל. העבירו בעדינות כל פיסת רקמה והניחו אותה לתוספת מצופה קולגן כשהאפידרמיס פונה כלפי מעלה, באמצעות מלקחיים סטריליים (איור 3D,H).
      הערה: העריכו את היתדות תחת סטריאומיקרוסקופ כדי להבטיח כיוון נכון של האפידרמיס.
    4. העבר את התוספת בחזרה לצלחת סטנדרטית של 12 בארות המכילה 600 מיקרוליטר OMM. הנח את הצלחת בחזרה בחממה ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2 (איור 3E).
  4. תחזוקה ארוכת טווח של תרבות ממשק אוויר-נוזל
    1. בין יום 1 ליום 21 לאחר השיטוח, בצע שינוי בינוני מלא (600 מיקרוליטר) עם OMM בימים שני, רביעי ושישי. החזר את הצלחת לחממה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2 ו-95% לחות יחסית.
    2. בין היום ה-21 ליום ה-27 לאחר השיטוח, יש להניח את הצלחת באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5%CO2 ללא לחות לחיזוק מחסום העור. בצע החלפה בינונית מלאה (800 מיקרוליטר) עם OMM מדי יום.

תוצאות

האופטימיזציה ונקודות הביקורת ליצירת SOs ציסטיים תוארו בהרחבה14. השיטה המוצגת כאן, אם כן, מתמקדת בנקודות הביקורת העיקריות שיש להעריך במהלך ההתפתחות של אורגנואידים ציסטיים (איור 2A), בבחירת אלה המתאימים למעבר ל-SOs מישוריים (איור 2B), ובקריטריונים המשמשים להערכת איכות ה-SOs המישוריים המתקבלים (איור 1B-D ואיור 4).

צעד המפתח הראשון בהתפתחות של SOs ציסטיים הוא היווצרות של אגרגט תאי יחיד וצפוף המשלב את רוב התאים שנמצאים בבאר ביום 0 (איור 2A). זה מושג באמצעות טיפול זהיר ומהיר ב-hiPSCs, בשילוב עם צנטריפוגה יעילה, וכתוצאה מכך פיזור הומוגני של תאים במרכז הבאר (איור 2A, יום -2). אינדוקציה נכונה של אקטודרם פני השטח מובילה להיווצרות אפיתל דק וברור על השכבה החיצונית ביותר של האגרגט עד היום השלישי (איור 2A), אשר מתפתח לאחר מכן, לאחר השראת תאים מזנכימליים, לאגרגטים ציסטיים שקופים המכילים ליבה כהה של תאים מזנכימליים עד היום השמיני. בין היום ה-12 ל-20, ציסטת האפיתל מתכסה בשכבה דקה של תאים מזנכימליים המצטברים בקוטב אחד של הציסטה (איור 2A, יום 12). אינדוקציה משותפת מוצלחת של תאי אפיתל ומזנכימלים מביאה בסופו של דבר לאפיתל מרובד, המאפשר היווצרות של פלאקודים ויתדות שיער, שהופכים לגלויים בין הימים 50 ל-80 (איור 2A,B). על ידי בחירת SOs מתאימים על סמך נקודות ביקורת התפתחותיות אלה, ניתן למזער את השונות המורפולוגית והגודל בזמן המעבר ל-SOs מישוריים.

נוכחותם של לוחות שיער או יתדות היא קריטריון ההכללה העיקרי לבחירת SOs ציסטיים להמשך פיתוח ל-SOs מישוריים. היעדר פלאקודים גלויים נובע בדרך כלל מפגם בריבוד האפידרמיס, שנראה דק מאוד (איור 2B, יום 50, פאנל אמצעי). לצורך שיטוח משתמשים רק בציסטות גדולות (בקוטר של לפחות 5 מ"מ) עם תוצרי לוואי מרוכזים בקוטב אחד ותוצרי לוואי מינימליים בסך הכל, בעוד שאלו עם תוצרי לוואי לא מקוטבים אינם נכללים (איור 2B).

ברגע שהם בתצורה המישורית שלהם, בדיקת האיכות העיקרית של SOs מסתמכת על ניטור מקרוסקופי של צמיחת HF תחת סטריאומיקרוסקופ. HFs מתארכים בהדרגה לאורך 27 הימים של תרבית ALI, כאשר בלוטות החלב נראות בסביבות היום ה-14 והפיגמנטציה גדלה בהדרגה עם הזמן (איור 1B,C). בשל אילוצים מרחביים שנכפים על ידי קרום ההכנסה שנמצא ממש מתחת לג'ל הקולגן הדק, רק HFs הממוקמים בפריפריה של ה-SO המישורי יכולים לגדול במלואם, והם עושים זאת בכיוון מקביל לתוספת (איור 1C). יש לציין כי ציר השיער בולט לעתים רחוקות מעבר לפני העור. כדי להעריך עוד יותר את איכות ה-SOs המישוריים שפותחו, ניתן להטמיע אותם בפרפין או OCT, לחתוך אותם ולצבוע אותם כדי לבחון את ההרכב והמורפולוגיה שלהם. צביעת H&E מגלה שהמבנה שלהם דומה מאוד לזה של עור אנושי (איור 4A), עם אפיתל מרובד לחלוטין ודרמיס המופרדים על ידי קרום בסיס. צביעה אימונופלואורסצנטית באמצעות סמנים ספציפיים עבור שכבות האפידרמיס השונות, בלוטות החלב והמלנוציטים מאשרת עוד יותר את ארכיטקטורת הרקמה דמוית העור האנושית של ה-SOs המישוריים (איור 1D ואיור 4B).

figure-results-1
איור 1: זרימת עבודה ליצירת SOs מישוריים המכילים HFs מ-hiPSCs באמצעות מערכת תרבית ALI. מוצג ייצוג סכמטי ותמונות מייצגות של שלבי מפתח. (A) יצירת SOs ציסטיים, בעצם כפי שתואר קודם לכן10, עד שנוצרים פלאקודים/יתדות שיער גלויים בסביבות היום ה-80. (B) SOs ציסטיים נחתכים ומשוטחים, כאשר צד האפידרמיס פונה כלפי מעלה, על תוספת תרבית תאים מצופה קולגן מסוג I. תרביות ALI נשמרות במשך 21 יום בתנאי לחות, ולאחר מכן 6 ימים בתנאים יבשים. (C) מבט בהגדלה גבוהה של אזור שמוצג ב-(B), שממחיש צמיחת זקיקי שיער, התפתחות מבנה דמוי בלוטת חלב (ראשי חץ) ופיגמנטציה מתקדמת לאורך זמן. (D) תמונות קונפוקליות של חתכי SO מישוריים ביום ה-27 לאחר השיטוח, מסומנים בנוגדני קולגן אנטי-סוג IV יחד עם אדום הנילוס, המסמן מבנים דמויי בלוטות חלב, או נוגדן אנטי-PMEL, שמכתים מלנוציטים. גרעינים מוכתמים ב-DAPI. פסי קנה מידה: 200 מיקרומטר (A); 500 מיקרומטר (B,C); 50 מיקרומטר (D). קיצורים: SOs = אורגנואידים של העור; HFs = זקיקי שיער; hiPSCs = תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם; ALI = ממשק אוויר-נוזל; Col IV = קולגן מסוג IV; PMEL = חלבון פרה-מלנזום; DAPI = 4',6-דיאמידינו-2-פנילינדול. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: תמונות מייצגות של מורפולוגיה מצטברת של תאים בשלבי מפתח במהלך ייצור SO. (A) תמונות מייצגות של SOs ציסטיות עם מורפולוגיות מתאימות (פאנלים שמאליים) ולא מספקות (פאנלים אמצעיים וימניים) בשלבים שונים. ביום -2, אגרגטים של תאים צריכים להציג פיזור אחיד (פאנל שמאלי), בעוד שטיפול לא נכון בצלחת לאחר צנטריפוגה עלול לשבש את חלוקת התאים (פאנל ימין). ביום 0, אגרגטים מעוצבים היטב מופיעים כאשכולות תאים קומפקטיים וצפופים (פאנל שמאלי), בעוד שכדאיות תאים נמוכה גורמת למוות תאים נרחב ולאובדן המבנים התלת-ממדיים הקומפקטיים (פאנל ימין). ביום השלישי, שכבת אפיתל חיצונית מובהקת נראית לעין (פאנל שמאלי), היעדרה עשוי להצביע על כך שריכוז BMP4 זקוק לאופטימיזציה (פאנל ימין). ביום 12, תאים מזנכימליים מצטברים בקוטב אחד ונודדים לעטוף את ציסטת האפיתל (הפאנל השמאלי), בעוד שבידול אפיתל מוגזם (פאנל אמצעי) או מזנכימלי (פאנל ימין) מעכב ריבוד אפיתל תקין. ביום ה-50, SOs מציגים מורפולוגיה דו-קוטבית, עם עור ציסטי בצד אחד ותוצרי לוואי, בעיקר סחוס, בצד השני (פאנל שמאלי). התמיינות מוגזמת של אפיתל (פאנל אמצעי) או מזנכימלי (פאנל ימני) מעכבת התפתחות תקינה של העור. (B) תמונות מייצגות של SOs ציסטיות עם יתדות שיער גלויות בסביבות היום ה-80. שימו לב לפרופורציה המשתנה של תוצרי הלוואי (משמאל לעקומה המקווקו) ביחס לעור. שלושת הפאנלים השמאליים ביותר מאפשרים יצירת 2-4 SOs מישוריים, בעוד שהפאנל הימני ביותר מציג SO באיכות לא מספקת לריטוח. פסי קנה מידה: 500 מיקרומטר ליום -2, יום 50 ויום 80; 200 מיקרומטר ליום 0, יום 3 ויום 12. קיצור: SO = אורגנואיד עור. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: ייצוג סכמטי של השלבים הטכניים לייצור SOs מישוריים. בצע השטחה של SOs ציסטיים תחת סטריאומיקרוסקופ בתוך מכסה המנוע של LAF. (A) כרתו את הקוטב שמצטבר תוצרי לוואי מה-SO הציסטי באמצעות אזמל סטרילי. (B) חתוך את הגפיים העליונות והתחתונות של ה-SO כדי להקל על התפתחות הרקמה. (C) חותכים את הרקמה המישורית ל-2-4 חלקים. מעבירים ומשטחים כל חתיכה, כשצד האפידרמיס כלפי מעלה, על גבי תוספת מצופה קולגן באמצעות מלקחיים סטריליים. (ד) הנח את תוספת התרבית המכילה את הרקמה המשוטחת בצלחת סטנדרטית של 12 בארות המכילה 600 מיקרוליטר של מדיום. (E) דגרו את הצלחת ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2. (F) מבט רוחבי סכמטי של אורגנואיד העור המתואר ב-(B). (G) מבט רוחבי סכמטי של האורגנואיד של העור המתואר ב-(C). (H) תמונה של SO מישורי שמונח על ג'ל קולגן מסוג I שנשפך על תרבית תאים שממוקמת בצלחת של 12 בארות שמכילה 600 מיקרוליטר של מדיום. קיצורים: SO = אורגנואיד עור; LAF = זרימת אוויר למינרית. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
איור 4: אפיון של SOs מישוריים שמקורם ב-hiPSC. (A) תמונות מייצגות של שדה בהיר של SO מישורי מוכתם ב-H&E בימים 1 ו-27 לאחר השיטוח. ביום ה-27, ה-SOs המישוריים מראים התבגרות עור עם אפידרמיס פלוריסטי ו-HFs המכילים מבנים דמויי בלוטת חלב (ראשי חץ). (B) תמונות קונפוקליות של קטעי SO מישוריים מוכתמים באינטגרין אנטי-β4 ונוגדנים אנטי-קרטין 10 או אנטי-לוריקרין מראים התמיינות על-בסיסית מוקדמת (תאי KRT10+ ) ביום הראשון והתמיינות מאוחרת (שכבת LOR+ ) ביום ה-27. גרעינים מוכתמים ב-DAPI. פסי קנה מידה: 50 מיקרומטר (A); 100 מיקרומטר (B). קיצורים: SO = אורגנואיד עור; hiPSC = תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים על ידי בני אדם; H&E = המטוקסילין ואאוזין; β4 = B4 אינטגרין; KRT10 = קרטין 10; LOR = לוריקרין; DAPI = 4',6-דיאמידינו-2-פנילינדול. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

דיון

הפרוטוקול המתואר כאן מתגבר על מגבלה מרכזית של מערכת ה-SO הציסטית על ידי שחזור כיוון הרקמה והסביבה המקורית באמצעות השטחת רקמות וחשיפה של האפידרמיס האפיקלי לאוויר. שיטה זו משמרת את המורכבות התאית והמבנית הפנימית של האורגנואיד, מקדמת ארגון רלוונטי מבחינה פיזיולוגית ומספקת גישה ישירה למשטח האפידרמיס הרב פלוריסטי למניפולציה ניסיונית.

מספר שלבים בפרוטוקול הם קריטיים להשגת SOs מישוריים באיכות גבוהה, החל מיצירת SOs ציסטיים באיכות גבוהה. בדיקות בקרת איכות מרכזיות ונקודות שינוי פרוטוקול פוטנציאליות תוארו בהרחבה לפני12. בקצרה, נקודת ההתחלה צריכה להיות תרביות hiPSC מתוחזקות היטב ולא מובחנות במפגש של 70-80%, המציגות תאים ארוזים היטב עם יחס גרעיני לציטופלזמי גבוה. יצירת SOs ציסטיים דורש אפנון מדויק של איתות BMP4 במהלך אינדוקציה של אקטודרם פני השטח12. מכיוון שרגישות BMP4 יכולה להשתנות בין קווי hiPSC, ייתכן שיהיה צורך בטיטרציה לקבלת תוצאות מיטביות. מומלץ לבדוק ריכוזי BMP4 בין 2.5 ל-15 ננוגרם/מ"ל, מכיוון שלא דווח על מקרים מוצלחים מחוץ לטווח זה. עקביות במקור המגיב חשובה גם היא; לכן, יש להכין ולאחסן מלאי בתפזורת מספק יחיד בתנאים המומלצים ולהשתמש בהם לפני תאריך התפוגה שלהם כדי להבטיח פעילות ביולוגית מלאה ולמזער את השונות.

בחירת SOs ציסטיים עם מורפולוגיה וגודל מתאימים היא חיונית להשטחת SO מוצלחת. ההתבגרות של SOs ציסטיים וכתוצאה מכך היווצרות יתדות ולוחות שיער - עשויים להשתנות בין קווי hiPSC, לכן, תזמון ההשטחה יכול לנוע בין יום 70 ליום 90. ניתן לשקול תוספת של CHIR99021, מעכב GSK3 ואגוניסט איתות WNT, ביום השלישי להיווצרות SO ציסטית, שכן הוכח שהוא מגדיל את גודל האורגנואידים ומפחית את היווצרות הסחוס על ידי קידום התפשטות ועיכוב נדידת הפסגה העצבית12. למרות שזה מבטיח, לא ראינו תוצאות עקביות עם שינוי זה בתרבויות שלנו.

תהליך ההשטחה דורש מיומנות ידנית והיכרות עם הרקמה. יש לציין כי במהלך העברת שבר העור אל התוספת המצופה, יש להקפיד על כיוון נכון של הרקמה. מומלץ לאמת את הכיוון באמצעות מלקחיים עדינים תחת סטריאומיקרוסקופ ולהתאים בעדינות את הרקמה עד שהצד האפיקלי פונה כלפי מעלה. כאשר הם ממוקמים כראוי, יתדות/לוחות שיער צריכים לפנות כלפי מטה. לאחר העברת SOs מישוריים לתרבית ALI, ה-HFs מתחילים בדרך כלל להראות צמיחה ניכרת ופיגמנטציה של פיר השיער תוך מספר ימים.

המגבלות העיקריות של המודל המתואר הן הזמן ורמת התחזוקה הגבוהה הנדרשת, וחוסר הבשלות של הדגם. הפיתוח של SOs ציסטיים שניחנו ביתדות שיער לוקח בין 70 ל-90 יום ולאחריו 4 שבועות של תרבית ALI. ציר הזמן הממושך הזה, בשילוב עם הליך שיטוח מייגע, הופך את המערכת לפחות מתאימה ליישומים בעלי תפוקה גבוהה, במיוחד בהשוואה למקבילות עור אנושי זמינות מסחרית. בעוד שאופטימיזציות קלות עשויות להפחית מעט את זמן התרבית, הפחתה משמעותית אינה סבירה. המגוון התאי והמבני הגבוה של העור תלוי ברצף מורכב של אינטראקציות אפיתל-מזנכימליות ורמזים מכניים, שככל הנראה לא ניתן להאיץ על ידי הוספת גורמים אקסוגניים במבחנה 15,16,17,18. היווצרות SOs ציסטיים והתקדמותם לצורה המישורית דורשים רמת תחזוקה גבוהה. אחת התקופות האינטנסיביות ביותר - מלבד 18 הימים הראשונים של תרבית ציסטית - מתרחשת כאשר SOs מישוריים נשמרים באטמוספירה של לחות נמוכה ודורשים חידוש בינוני יומי. בדומה למודלים אחרים שמקורם ב-hiPSC, SOs שומרים על פנוטיפ דמוי עובר במבחנה. יתר על כן, בלוטות הזיעה ושרירי הפילי האחוריים נעדרים במידה רבה ב-SOs14, ככל הנראה בשל היעדר כלי דם, תאים חיסוניים וכוחות מכניים כגון מתח גזירה, מתיחות וחיכוך - כולם חיוניים להתבגרות תקינה 15,16,17,18,19 . ניתן לטפל בחלק מהמגבלות הללו על ידי הגדלת מורכבות המודל. תרבית משותפת עם מקרופאגים אוטולוגיים שמקורם ב-hiPSC17, שילוב של מערכת זלוף9, או יישום של מתיחה מכנית17 עשויים לסייע בקידום בשלות המודל20,21.

יש לציין שפורמט הכנסת הטרנסוול מגביל מעט את הצמיחה כלפי מטה של HFs ב-SOs המישוריים. כתוצאה מכך, HFs נוטים להתפשט לרוחב ועלולים להיחשף לאוויר. מכיוון ש-HFs מוגנים בדרך כלל בתוך העור in vivo, יש לקחת זאת בחשבון בעת תכנון ניסויים. שינוי ציפוי התוספת על ידי מריחת שכבת הידרוג'ל עבה יותר עשוי לסייע בהפחתת בעיה זו. בנוסף, פירי שיער לעתים רחוקות בולטים מעבר לפני העור בדגם זה. התצפיות שלנו מצביעות על כך ש-HFs ב-SOs מישוריים נשארים באנאגן, שלב הגידול הפעיל, עד היום ה-27 של תרבית ALI. בהתחשב במשך הזמן הממושך של אנאגן ב-HFs אנושיים, זה לא לגמרי בלתי צפוי. למרות שתרבית ארוכת טווח עשויה בסופו של דבר לתמוך במעבר פאזה, זה לא סביר בהיעדר רמזים מערכתיים. זיהוי והשלמה של האותות המולקולריים הנדרשים למחזור זקיקים עשויים לאפשר אינדוקציה מלאכותית של שלבי הקטגן והטלוגן.

לסיכום, הפרוטוקול ליצירת SOs מישוריים מאפשר מגוון רחב של גישות ניסיוניות שאינן אפשריות או רלוונטיות ב-SOs ציסטיות. SOs מישוריים כבר שימשו בהצלחה למידול זיהומים חיידקיים11 וויראליים22, נזק לרקמות הנגרם על ידי קרינה אולטרה סגולה22, ותגובות תרופתיות נלוות 12,22,23. היכולת לגשת למשטח האפיקלי של מקבילה מורכבת ורלוונטית מבחינה פיזיולוגית מייצגת התקדמות משמעותית לתחום ופותחת את הדלת למגוון יישומים חדשניים בחקר העור.

גילויים

למחברים אין ניגודי אינטרסים להצהיר עליהם.

תודות

אנו מודים לעמיתינו במלון hiPSC, המרכז הרפואי של אוניברסיטת ליידן, על אספקת קווי hiPSC. עבודה זו נתמכה על ידי המרכז לרפואת תאי גזע של קרן נובו נורדיסק הנתמך על ידי קרן נובו נורדיסק, דנמרק (מענק מספר NNF21CC0073729) ל-K.R. K.R. הוא הממונה על המחקר במכון הלאומי לבריאות ומחקר רפואי (INSERM).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
DMEM/F12 מתקדםתרמו פישר סיינטיפיק#12634010בטקסט נקרא מדיום מתקדם.
ALK5, עיכוב. TGFb סוג 1, SB431542Tocris Bioscience#1614Aliquot, חנות ב--20 > C and  תשמור על 4 & דרגה C למקסימום 7 ימים 
נוגדן 439-9B לשיבוט מונוקלונלי עכברוש Anti-CD104BD ביוסיינסס#555719נה
נוגדן פוליקלונלי אנטי-קולגן סוג IVמרקמיליפורה#Ab769נה
אנטי-ציטוקרטין 10 נוגדן פוליקלונלי ארנבביולג'נד#905401נה
נוגדן פוליקלונלי לארנב אנטי-לוריקריןביולג'נד#905101נה
נוגדן מונוקלונלי לעכברים נגד PMELNovus Biologicals#NBP2-29407 נה
תוסף B-27, ללא ויטמין Aתרמו פישר סיינטיפיק#12587010Aliquot, חנות ב--20 > C 
תוספות תרבית תאיםגריינר ביו-וואן#66564112-וול, גודל נקבובית 0.4 ומיקרו; m; שקוף (48 תוספות/קופסה); https://shop.gbo.com/en/row/products/bioscience/3d-cell-culture/thincert/3d-thincert-cell-culture-inserts/665641.html
קולגן סוג Iקורנינג#354249שמור על תמיסת המלאי בטמפרטורה של 4 ומעלה; C
סכין סטרילית חד-פעמית 0507 מס' 21סוואן מורטון#0507נה
דולבקו' s מלח מפוזר-פוספט (DPBS)תרמו פישר סיינטיפיק#14190094נה
Essential 6 (E6) בינוניתרמו פישר סיינטיפיק#A1516401המכונה hiPSC medium מינימלי (hiMinM)  בטקסט.
פאסודילמעבדות LC#F-4660Aliquot הוא פתרון מלאי של 1000x ואחסן בטמפרטורה של -20 &°C. לאחר הפשרה, שמור על 4 ומעלה; C למקסימום 14 ימים 
ניתוק תאים עדין  מגיבטכנולוגיות תאי גזע#100-0485נה
תוסף GlutaMAXתרמו פישר סיינטיפיק#35050038נה
דרגת פרניום בסיסית של FGF-2 אנושימילטני ביוטק#130-093-842Aliquot, חנות ב--80 ° C and  תשמור על 4 & דרגה C למקסימום 7 ימים 
LDN 193189 דיהידרוכלורידטוקריס#6053Aliquot, רגיש לאור, אחסון ב--20 ו-deg; C 
מטריצת ממברנת בסיס מופחתת בגורם גדילה של מטריגלקורנינג#354230Aliquot, חנות ב--20 > C and  תשמור על 4 & דרגה C למקסימום 7 ימים 
2-מרקפטואנולתרמו פישר סיינטיפיק#21985023חומר מסוכן, רעיל, קורוזיבי, מגרה, סיכון בריאותי וסביבתי.
NaOHמרק#567530-250MGחומר מסוכן, קורוזיבי ומגרה. הכינו פתרון באופן ספונטני.
מדיום נוירובסיסיתרמו פישר סיינטיפיק#21103049המכונה מדיום בסיסי עצבי  בטקסט.
נורמוצין 50 מ"ג/מ"לאינויווגן#ant-nr-1בבדיקה נקרא תוסף אנטיביוטיקה-אנטימיקוטי. Aliquot, חנות ב--20 > C and  תשמור על 4 & דרגה C למקסימום 14 ימים 
מיקרופלטת נונקלון ספרה 96-WellU-Bottomתרמו פישר סיינטיפיק#174929נה
נונקלון ספרה 174930 רב-צלחת עם 24 בארותתרמו פישר סיינטיפיק#174930נה
תוספת N2תרמו פישר סיינטיפיק#17502048Aliquot, חנות ב--20 > C 
מתנער מסלוליתרמו פישר סיינטיפיק#88881102נה
פניצילין-סטרפטומיציןתרמו פישר סיינטיפיק#15070063נה
חלבון BMP4 האנושי רקומביננטיR& D Systems#314-BP-010Aliquot, חנות ב--80 ° C and  תשמור על 4 & דרגה C למקסימום 7 ימים 
מדיום StemFlex (SF)תרמו פישר סיינטיפיק#A3349401מכונה אמצעי תחזוקה hiPSC (hiMM)  בטקסט.
SteriMax smart - סטריליזר לולאת אינפרא-אדוםWLD-TEC#4.002.000 אופציונלי
פינצטהמרק#T4537-1EAסגנון 5; פלדת אל-חלד חדה ואנטי-מגנטית
ויטרונקטיןטכנולוגיות תאי גזע#07180נה

מקורות

  1. Kolarsick, P. A. J., Kolarsick, M. A., Goodwin, C. Anatomy and physiology of the skin. J Dermatol Nurses Assoc. 3 (4), 203-213 (2011).
  2. Karimkhani, C., et al. Global skin disease morbidity and mortality: An update from the Global Burden of Disease Study 2013. JAMA Dermatol. 153 (5), 406(2017).
  3. Seth, D., et al. Global burden of skin disease: Inequities and innovations. Curr Dermatol Rep. 6 (3), 204-210 (2017).
  4. Grada, A., Mervis, J., Falanga, V. Research techniques made simple: Animal models of wound healing. J Invest Dermatol. 138 (10), 2095-2105.e1 (2018).
  5. Zomer, H. D., Trentin, A. G. Skin wound healing in humans and mice: Challenges in translational research. J Dermatol Sci. 90 (1), 3-12 (2018).
  6. Vig, K., et al. Advances in skin regeneration using tissue engineering. Int J Mol Sci. 18 (4), 789(2017).
  7. Chu, X., et al. Functional regeneration strategies of hair follicles: Advances and challenges. Stem Cell Res Ther. 16 (1), 77(2025).
  8. Motter Catarino, C., Cigaran Schuck, D., Dechiario, L., Karande, P. Incorporation of hair follicles in 3D bioprinted models of human skin. Sci Adv. 9 (41), eadg0297(2023).
  9. Kageyama, T., Miyata, H., Seo, J., Nanmo, A., Fukuda, J. In vitro hair follicle growth model for drug testing. Sci Rep. 13 (1), 4847(2023).
  10. Abaci, H. E., et al. Tissue engineering of human hair follicles using a biomimetic developmental approach. Nat Commun. 9 (1), 5301(2018).
  11. Lee, J., et al. Hair-bearing human skin generated entirely from pluripotent stem cells. Nature. 582 (7812), 399-404 (2020).
  12. Jung, S., et al. Wnt-activating human skin organoid model of atopic dermatitis induced by Staphylococcus aureus and its protective effects by Cutibacterium acnes. iScience. 25 (10), 105150(2022).
  13. Zhang, M., et al. Recessive cardiac phenotypes in induced pluripotent stem cell models of Jervell and Lange-Nielsen syndrome: Disease mechanisms and pharmacological rescue. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (5), E5383-E5392 (2014).
  14. Lee, J., et al. Generation and characterization of hair-bearing skin organoids from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 17 (5), 1266-1305 (2022).
  15. Hu, M. S., et al. Embryonic skin development and repair. Organogenesis. 14 (1), 46-63 (2018).
  16. Li, K. N., Tumbar, T. Hair follicle stem cells as a skin-organizing signaling center during adult homeostasis. EMBO J. 40 (11), e107135(2021).
  17. Biggs, L. C., Kim, C. S., Miroshnikova, Y. A., Wickström, S. A. Mechanical forces in the skin: Roles in tissue architecture, stability, and function. J Invest Dermatol. 140 (2), 284-290 (2020).
  18. Gopee, N. H., et al. A prenatal skin atlas reveals immune regulation of human skin morphogenesis. Nature. 635 (8039), 679-689 (2024).
  19. Tokuyama, E., Nagai, Y., Takahashi, K., Kimata, Y., Naruse, K. Mechanical stretch on human skin equivalents increases the epidermal thickness and develops the basement membrane. PLoS One. 10 (11), e0141989(2015).
  20. Bai, X., et al. Organoid research: Theory, technology, and therapeutics. Organoid Res. 1 (1), 025040007(2025).
  21. Wang, Y., et al. Organoid research breakthroughs in 2024: A review. Organoid Res. 1 (2), 025040005(2025).
  22. Li, P., et al. Mpox virus infection and drug treatment modelled in human skin organoids. Nat Microbiol. 8 (11), 2067-2079 (2023).
  23. Kim, M. J., Ahn, H. J., Kong, D., Lee, S., Kim, D. H., Kang, K. S. Modeling of solar UV-induced photodamage on the hair follicles in human skin organoids. J Tissue Eng. 15, 20417314241248753(2024).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים