מאמר שיטה

תהליך עבודה סטנדרטי של SDS-PAGE לפרופיל קורונה של חלבונים מותאם אישית בגילוי סרטן מוקדם

1.1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/69090

⸱

19 בדצמבר 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1NanoDelivery Lab, Department of Molecular Medicine, Sapienza University of Rome

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מאחד את ניתוח SDS-PAGE לפרופיל קורונה חלבוני מותאם אישית על ננו-חלקיקים, ומאפשר גילוי שכפול, ניתן להרחבה ובעלות נמוכה של חתימות ספציפיות לסרטן. התוכנית נועדה לאבחון מוקדם של אדנוקרצינומה בצינור הלבלב, ומציעה אלטרנטיבה מעשית, המותאמת ל-REASWARDED, לשיטות פרוטאומיות מורכבות הן במחקר והן בקליניות.

תקציר

היווצרות קורונה חלבונית מותאמת אישית (PC) על ננו-חלקיקים (NPs) בחשיפה לנוזלים ביולוגיים הפכה לאסטרטגיה מבטיחה ומינימלית פולשנית לגילוי מוקדם של סרטן. מחקר זה מציג פרוטוקול סטנדרטי לפרופיל של קורונה חלבון באמצעות אלקטרופורזה ג'ל סודרן דודציל סולפט פוליאקרילאמיד (SDS-PAGE), מותאם להבטחת עמידות, שחזוריות ואוטומציה. השיטה אומתה בקפדנות במגוון פלטפורמות ננו-חלקיקים (NP), מקורות פלזמה ותנאים ניסיוניים, והדגימה פרופילים ניתנים לשחזור עקבי עם שונות מינימלית התלויה באופרטור. בהשוואה לטכניקות פרוטאומיקה קונבנציונליות, גישה זו מציעה פתרון מהיר וחסכוני יותר העומד בקריטריונים של ארגון הבריאות העולמי לאבחון. כאשר הוחל על אדנוקרצינומה של צינור הלבלב (PDAC), ממאירות אגרסיבית מאוד עם סמנים ביולוגיים מוקדמים מוגבלים, זרימת עבודה זו השיגה דיוק סיווג של עד 90%, אפילו בחולים בשלבים מוקדמים. פלטפורמה סטנדרטית זו מסמנת התקדמות משמעותית לעבר כלים אבחנתיים ניתנים להרחבה, תרגום קלינית ובמחיר נגיש לבדיקות סרטן.

מבוא

קורונה חלבון ננו-חלקיקים (NP-PC)

האפיון של ה-PC שנוצר על פני השטח של NPs לאחר חשיפתם לנוזלים ביולוגיים הפך לאסטרטגיה עוצמתית לאבחון מחלות ורפואה מותאמת אישית1. שכבה זו של חלבונים נספגים, דינמיים וספציפיים למחלה בהרכבם, משנה את הזהות הסינתטית של NPs ומניעה את האינטראקציות הביולוגיות שלהן2. הרכב ה-PC אינו אקראי אך תלוי מאוד הן בתכונות הפיזיקוכימיות של ה-NPs והן בסביבה הביולוגית אליה הם מוכנסים3. גורמים כמו גודל, צורה, מטען פני השטח וההרכב של NP יכולים להשפיע משמעותית על הזיקה, הקינטיקה וסידור המבנה של חלבונים נספגים. באופן דומה, הנוזל הביולוגי, מקורו, מורכבותו ומצב המחלה ממלאים תפקיד מרכזי בקביעת ההרכב הסופי של הקורונה 4,5,6.

האופי הדינמי של הקורונה מסבך עוד יותר את הניתוח שלה, כאשר המבנה שלה משתנה עם הזמן משכבה חיצונית רכה וקשורה ברפיון לליבה פנימית יציבה וספוגה היטביותר 7,8. הארכיטקטורה המתפתחת הזו, הנובעת מאירועי ספיחת חלבונים תחרותיים, דורשת גישות מפותחות וסטנדרטיות לאפיין משמעותי9. למרות המורכבות הזו, כיום מוכר באופן נרחב שה-PC אינו רק פריט, אלא שכבה ביולוגית אינפורמטיבית המסוגלת ללכוד שינויים מערכתיים של מחלות באופן לא פולשני. מטרת השיטה המתוארת במאמר זה היא לתקן את השימוש ב-SDS-PAGE לפרופיל חזק, שכפול ונגיש של המחשב המותאם אישית, במיוחד לגילוי מוקדם של סרטן באמצעות גישות ביופסיה נוזלית10.

המחשב האישי והרלוונטיות שלו בגילוי סרטן

הבסיס המדעי לשיטה זו טמון במושג המחשב האישי האישי. בעת דגירה עם פלזמת המטופל, NPs סופגים טביעת אצבע ייחודית של חלבונים המשקפת את המצב הפיזיולוגי או הפתולוגי של הפרט11,12. רעיון זה אושר על ידי מחקרים שהראו שינויים משמעותיים בהרכב ה-PC בנוכחות מחלה, כולל אדנוקרצינומה של צינור הלבלב (PDAC), סרטן ריאות13, מנינגיומה14, וגליובלסטומה מולטיפורמה15. בפרט, ב-PDAC, PCs שמקורם בפלזמה של מטופל שונים באופן מהותי מאלו של תורמים בריאים. הבדלים אלו נוצלו במודלים מסווגים שמגיעים לדיוק אבחוני של עד 90%. ה-PC משמש אפוא כמרכז ננומטרטור של אותות ספציפיים למחלה16.

מחקרים עדכניים הראו כי PCs של חולי סרטן מועשרים בחלבונים המעורבים בדלקת, קרישה, הפעלת משלים והובלת ווסיקולות חוץ-תאיות, מסלולים ביולוגיים הידועים כבלתי מוסדרים בממאירות17. דפוסי החלבון הללו ניתנים לשחזור רב בתוך קבוצות מטופלים בודדות, אך מובחנים בבירור בין מצבי מחלה שונים, מה שמרמז שהקורונה יכולה לפעול לא רק כחיישן מחלה כללי אלא גם כמסווג ספציפי למחלה. בהקשר של PDAC, אחת מהמאירויות הקטלניות והמסוכנות ביותר, הקבוצה שלנו הייתה חלוצה בבדיקות דם (NEB) מבוססות על אפיון PC 18,19,20. גישה זעיר-פולשנית זו מנצלת את היכולת של NPs להעשיר באופן סלקטיבי חלבוני פלזמה בעלי שכיחות נמוכה ובעלי שינוי מחלות, ולהפוך אותם לניתנים לזיהוי באמצעות הפרדה אלקטרופורטית פשוטה על הספסל.

יתרונות על פני טכניקות פרוטאומיות קונבנציונליות

ההיגיון בפיתוח גישה זו נובע מהמגבלות של טכניקות פרוטאומיקה קונבנציונליות כמו ספקטרומטריית מסה (MS), אשר למרות שמציעות כיסוי עמוק לפרוטאום, הן יקרות, גוזלות זמן ואינן מתאימות לסינון מהיר או לאבחון בנקודת טיפול21. אתגר מרכזי נוסף טמון במורכבות הפנימית של טרשת נפוצה, שבה שינויים בהכנת דגימה, כיול מכשירים, פרמטרי רכישה ותהליכי עבודה של ניתוח נתונים תורמים להבדלים משמעותיים בין מעבדות בהרכב PC22 המדווח. לעומת זאת, ניתוח SDS-PAGE של ה-PC מציע אמצעי מהיר וחסכוני ללכוד דפוסי פרוטאומיים הקשורים למחלות. חשוב לציין שקריאת SDS-PAGE אינה תלויה בזיהוי מוחלט של סמנים ביולוגיים בודדים, אלא בזיהוי שינויים שיטתיים בפרופיל החלבון הגלובלי, שניתן לנתח באמצעות צפיפות וסטטיסטיקה רב-משתנית.

בניגוד לבדיקות מבוססות נוגדנים, שמוגבלות למטרות ידועות ונוטות לתגובתיות צולבת, SDS-PAGE מציע מבט בלתי מוטה על נוף החלבונים, שומר על שלמות הדגימה המקורית ומאפשר אינטגרציה במורד הזרם עם פלטפורמות משלימות כמו LC-MS/MS לזיהוי חלבונים. יתרה מזאת, מאחר ש-SDS-PAGE אינו דורש שלבי פירוק או דלדול דגימות, הוא מתאים במיוחד לניתוח דגימות ביולוגיות בנפח נמוך, תכונה חיונית ליישומים הכוללים אבחון מוקדם או סינון של אוכלוסיות שבריריות23. מסיבות אלו, פרוטוקול זה תואם מספר קריטריונים של ארגון הבריאות העולמי (חיבור בזמן אמת, קלות איסוף דגימות, נגיש, ספציפי, ידידותי למשתמש, עמיד, ללא ציוד וניתן לתוצר), מה שהופך אותו לכלי מעשי לאבחון מדרגתי24. בהתבסס על ראיות אלו, הועלתה השערה כי NPs שדגרו עם הפלזמה של המטופל סופגות מערכת PC, ייחודית למחלה שניתן לפרופיל באופן שיטתי באמצעות SDS-PAGE. אנו מציעים בנוסף כי ניתוח אלקטרופורטי סטנדרטי של קורונות מותאמים אישית אלו יכול להבדיל בין חולי סרטן לאנשים בריאים, ובכך לספק כלי אבחוני חזק וניתן לתרגום קליני.

זרימת עבודה ויישום קליני

פרוטוקול פרופיל הקורונה המבוסס SDS-PAGE מסדר כל שלב: מהכנת NPs ודגירה עם פלזמה מדוללת, ועד בידוד קורונה, אלקטרופורזה ג'ל וניתוח צפיפות כמותי (איור 1). פרמטרים מרכזיים כמו זמן הדגירה, דילול הפלזמה ו-NP סוג25 מכוונים בקפידה כדי להבטיח לכידת חלבון אופטימלית ורזולוציית תמונת ג'ל. הפרוטוקול גם מתמודד עם שיקולים מעשיים כמו קצב העברת דגימה, יציבות אחסון ועקביות בין אצווהלאצווה 26. יתרה מזאת, מאחר שמדובר בטכניקה שאינה הרסנית, ניתן לשלב את SDS-PAGE בצורה חלקה עם גישות פרוטאומיות משלימות כגון טרשת נפוצה כדי לזהות את הרכב המולקולרי של רצועות חלבון בודדות15. זרימת העבודה מותאמת לשחזור גבוה בין מפעילים, כולל תאימות לפלטפורמות פיפטינג ידניות ואוטומטיות, והיא עמידה בכימיות NP וריכוזי פלזמה שונים. תכונות אלו מבטיחות שניתן ליישם את השיטה בסביבות מעבדתיות מגוונות, מה שהופך אותה לנוחה הן למרכזי אבחון מרכזיים והן למעבדות מחקר מבוזרות. לכן, טכניקה זו מתאימה במיוחד לחוקרים וקלינאים העוסקים באבחון מוקדם, גילוי סמנים ביולוגיים וננו-רפואה תרגומית. הוא רלוונטי למגוון רחב של פתולוגיות וניתן להסתגלות לנוזלים ביולוגיים מגוונים מעבר לפלזמה, כולל רוק או שתן. הגמישות והעמידות של פרוטוקול זה הופכות אותו למועמדת חזקה לשילוב בצנרת אימות קלינית, מחקרי סקר רחבי היקף ופלטפורמות בנקודות טיפול.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

פרוטוקול זה מספק תהליך עבודה מפורט וסטנדרטי להכנה, דגירה עם פלזמה אנושית (HP), בידוד וניתוח ה-PC שנוצר על סוגים שונים של NPs. איור 2 מציג ייצוג גרפי של כל הפרוטוקול, ומתאר את השלבים הניסיוניים הסדרתיים מסינתזת NP ועד ניתוח SDS-PAGE רב-משתני של פרופילי חלבונים. חשוב לציין, שהמתודולוגיה הוסגנה על ידי הקבוצה שלנו, כפי שהודגם בעבודות קודמות18,26, מה שמבטיח שחזוריות ואמינות של התוצאות. החומרים והציוד בהם משתמשים מופיעים בטבלת החומרים.

1. הכנה ואפיון של NPs

  1. גיליונות ננו-GO
    1. מדלל תמיסה של 4 מ"ג/מ"ל במים אולטרה-טהורים לריכוז הרצוי. סוניקט למשך 2 דקות בעוצמה של 28% (פולס: 0.8/0.6 שניות) כדי להבטיח פיזור תקין.
    2. כימות ריכוז באמצעות ספקטרוסקופיית UV-Vis
    3. מדדו גודל הידרודינמי ופוטנציאל זטה באמצעות פיזור אור דינמי (DLS) באמצעות לייזר He-Ne בקוטר 633 ננומטר. הכינו דגימות על ידי דילול במים אולטרה-טהורים בהתבסס על מגבלות גילוי קווט (למשל, דילול של 1:100 עבור 1 מ"ל קובטים). ממוצע רשומה ± סטיית תקן (SD) משלושה שכפולים.
  2. עמדות לאומיות זהב
    1. השתמש ב-NPs זהב 100 ננומטר מיוצבים בציטראט (ריכוז מהמלאי: 3.8E+9 חלקיקים למ"ל) ללא שינוי נוסף.
    2. מדדו גודל הידרודינמי ופוטנציאל זטה באמצעות פיזור אור דינמי (DLS) באמצעות לייזר He-Ne בקוטר 633 ננומטר. הכינו דגימות על ידי דילול במים אולטרה-טהורים בהתבסס על מגבלות גילוי קווט (למשל, דילול של 1:100 עבור 1 מ"ל קובטים). ממוצע רשומה ± SD משלושה שכפולים.
  3. ליפוזומי DOTAP
    1. המיס אבקת 1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane (DOTAP) בכלורופורם בתוך מכסה אדים כימי מוסמך, תוך לבישת ציוד מגן מתאים (חלוק מעבדה, כפפות, משקפי מגן מקדמים). התאדה בוואקום למשך שעתיים, החזיר את שכבת השומנים במים אולטרה-טהורים כדי להגיע לריכוז סופי של 1 מ"ג/מ"ל, והידרציה ללילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. לבסוף, יש להוציא את תמיסת הליפוזום 20 פעמים דרך פילטר פוליקרבונט של 0.1 מיקרון.
    2. מדדו גודל הידרודינמי ופוטנציאל זטה באמצעות פיזור אור דינמי (DLS) באמצעות לייזר He-Ne בקוטר 633 ננומטר. הכינו דגימות על ידי דילול במים אולטרה-טהורים בהתבסס על מגבלות גילוי קווט (למשל, דילול של 1:100 עבור 1 מ"ל קובטים). ממוצע רשומה ± SD משלושה שכפולים.
      אזהרה: לטפל בכלורופורם במכסה אדים עם ציוד מגן מלא. השלכת פסולת ממס אורגנית בהתאם לנהלי בטיחות כימית מוסדיים.
      הערה: ל-GO עם התפלגות גודל שממוקדת בערך ב-300 ננומטר, סוניקט ל-10 דקות ב-125 וואט, צנטריפוגה ב-7,700 x גרם ל-30 דקות ב-4 מעלות צלזיוס, איסוף סופרנטנט, צנטריפוגה שוב ב-18,620 x g למשך 30 דקות, והשיה מחדש את הכדור. ל-GO עם התפלגות גודל שממוקדת בערך ב-100 ננומטר, סוניקט 3 × 180 דקות ב-4 מעלות צלזיוס, צנטריפוגה ב-10,000 x g למשך 30 דקות, ב-4 מעלות צלזיוס לאחר כל סבב, ואיסוף הסופרנאנט הסופי.

2. הכנת פלזמה אנושית

  1. פלזמה אנושית מסחרית (HP)
    1. לדלל פלזמה מסחרית בליופילית במים אולטרה-טהורים לפי הצורך.
    2. צנטריפוגה את הפלזמה המחודשת ב-18620 x גרם למשך 15 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, איסוף הסופרנטנט ואחסן בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
  2. HP שמקורו במטופלים
    1. דגימות דם בצנטריפוגה בעוצמה של 1216 x גרם למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ואספו את הסופרנטנט להפרדת הפלזמה.
    2. Aliquot דגימות פלזמה של 450 מיקרוליטר בצינורות חלבון במשקל 0.5 מ"ל ומאוחסנים בטמפרטורה של -80°C עד לשימוש.
      הערה: כל דגימות הפלזמה האנושית נאספות בהתאם להנחיות אתיות מוסדיות, והתקבלה הסכמה מדעת מכל המשתתפים.
      אזהרה: פלזמה אנושית היא מסוכנת ביולוגית. לטפל בתוך ארון בטיחות ביולוגית (BSC) באמצעות כפפות, חלוק מעבדה ומשקפי מגן. להשליך את כל החומרים המכילים פלזמה בהתאם לתקנות הבטיחות הביולוגית והשלכת פסולת מוסדיות.

3. הקמת ה-PC

  1. טיפול ידני בנוזלים
    1. קבעו את יחס NP:פלזמה אופטימלי על ידי כימות ריכוז החלבון באמצעות בדיקת חומצה ביצינכונינית (BCA) לכוונון דילול הפלזמה.
    2. הוסף 100 מיקרוליטר של NP suspension ל-100 מיקרו-ליטר פלזמה כדי להגיע לריכוזי הפלזמה הרצויים.
    3. דגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה.
      הערה: לבדיקת BCA, מערבבים תגובות A ו-B (50:1), הכינו דילול סטנדרטי של BSA, הוסיפו 10-25 מיקרוליטר דגימה/תגובת סטנדרטית + 200 מיקרוליטר, דגרו 30 דקות ב-37 מעלות צלזיוס, ומדדו ספיגה ב-562 ננומטר. ריכוזי הפלזמה בדרך כלל מותאמים בין 0.5% ל-50% v/v יחסית לנפח NP, בהתאם לסוג ה-NP. ל-GO, יש להשתמש בריכוזים נמוכים יותר (מומלץ בין 0.5% ל-5%); ל-DOTAP/NPs זהב, השתמש בריכוזים גבוהים יותר (עד 50%). השתמשו בחצוצרות חלבון 1.5 מ"ל עם חיבור נמוך.
  2. פרוטוקול אינקובציה אוטומטית
    1. טעין את פרוטוקול התוכנה לטיפול בנוזלים על פלטפורמת הפיפטרינג האוטומטית (ראשי 20 מיקרוליטר + 200 מיקרוליטר)
    2. חלק 100 מיקרוליטר מכל סוג NP לצינורות 1.5 מ"ל עם חיבור נמוך.
    3. הוסף פלזמה משוחזרת שהוכנה כפי שהיה ב-2.1 ו-2.2, לפי הנוסחה הבאה:
      כאשר VNP הוא נפח המתלים של NP. עבור 100 מיקרוליטר של NP:
      figure-protocol-1
      5%: 5.3 מיקרוליטר HP
      20%: 25 מיקרוליטר HP
      50%: 100 מיקרוליטר HP
    4. הוסף מים אולטרה-טהורים כדי להגיע ל-200 מיקרוליטר:
      5%: 94.7 מיקרוליטר
      20%: 75 מיקרוליטר
      50%: אין
    5. דגימות מיקס:
      5%: 15 מיקרוליטר מחזורים
      20%: 50 מיקרוליטר מחזורים
      50%: 100 מיקרוליטר מחזורים 3.2.6. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה
      הערה: איור משלים 1 ממחיש את הממשק הגרפי של ההגדרה האוטומטית המשמשת להכנת תערובות NP-HP בשלושה ריכוזי פלזמה סופיים (5%, 20% ו-50% v/v), כל אחד בשלושה עותקים. פריסת הסיפון כוללת מדפי טיפים, מאגר פסולת, ומתקן צינורות נמוך בגודל 3 × 4 המכיל מתלים NP (GO, ננו-כדורי זהב וליפוזום DOTAP) (NP), HP ומים אולטרה-טהורים (H2O). השתמש בחצוצרות חלבון עם חיבור נמוך.

4. ניתוח PC על ידי SDS-PAGE

  1. בידוד מחשב אישי
    1. צנטריפוגה את דגימות ה-NP-HP בטמפרטורה של 18,620 x גרם, 4 מעלות צלזיוס, למשך 15 דקות. כדור גלוי נראה צריך להיות בתחתית הצינור. השליכו בזהירות את הסופרנטנט, שצריך להיראות ברור לפני המשך (ראו איור משלים 2).
    2. שטוף את הכדור עם 200 מיקרוליטר מים אולטרה-טהורים, תלה אותו מחדש, ובצנטריפוגה שוב. חזור על השלב פעמיים. לאחר השטיפה הסופית, גלולה קומפקטית אמורה להישאר נראית, מה שמאשר בידוד מוצלח של קומפלקסים של חלבוני NP (ראו איור משלים 2).
    3. הכנת בופר טעינה (LB):
    4. חשב את נפח ה-LB הכולל בהתבסס על תנאי הפלזמה וערבב חומר מפחית (1:10), חלבוני בופר דנטור של דגימת SDS (1:2), ומים.
    5. החזירו את הכדור בנפח מתאים של 1x LB ורתחו ב-100 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
    6. צנטריפוגה ב-18,620 x g, 4 °C, למשך 15 דקות. אסוף את הסופרנטנט.
  2. טעינת דגימות SDS-PAGE
    1. הכינו את הסולם על ידי דילול תקן משקל המולרי (MW) עם בופר העומס.
    2. מדלל 10 פעמים Tris/Glycine/SDS עם בופר ל-1x.
    3. הרכיבו את תא האלקטרופורזה עם ג'ל ללא גרדיאנט ללא כתמים ב-4%-20% והוסיפו בופר רץ עד שהוא מגיע לרמה המומלצת שצוין על ידי היצרן.
    4. העמיסו דגימות של 10 מיקרוליטר וסולם של 7 מיקרוליטר בכל באר. הרץ ג'ל ב-150 וולט למשך ~90 דקות בטמפרטורת החדר.
      הערה: נפח ה-LB צריך להיות מחושב על פי ריכוז הפלזמה שנבחר ב-3.1.1 כדי להבטיח הדמיה אופטימלית של חלבונים בתמונת הג'ל (בדרך כלל 10 מיקרוגרם חלבונים ב-20 מיקרוליטר LB).
      אזהרה: לשחזור מיטבי, בצע ניתוח SDS-PAGE באמצעות דגימות NP-פלזמה שהוכנו לאחרונה. אחסון כדורים שנשטפו בטמפרטורה של מינוס 80°C למשך 24 שעות גרם לשינויים ניתנים לזיהוי הן בתכונות פיזיקוכימיות (לאחר השעיה מחדש ומדידות פוטנציאל DLS/זטה) והן בטביעות אצבע של קורונה חלבונית (כאשר הכדורים עובדו החל משלב 4.3.1 של הפרוטוקול; ראו איור משלים 3).

5. ניתוח דפוסי חלבון

  1. עיבוד תמונה
    1. ג'לים של תמונות באמצעות מדמה כימילומינסציה.
    2. עבדו את תמונת הג'ל כך:
      1. ייבא את תמונת הג'ל ושמור אותה כקובץ TIFF, תקן אותה לתופעות לא רצויות, למשל עיוותים באלכסון שמשפיע במיוחד על נתיבים פריפריאליים. לזהות את כל נתיבי הג'ל. החסיר את אות הרקע מהתמונה.
      2. כיול ההזזות האנכיות על ידי המרת יחידות פיקסל ליחידות משקל מולקולרי, בהתבסס על התאמה אקספוננציאלית דו-מונחית של נתיב הסימן. יצירת פלטים גרפיים כדי להמחיש פרופילי עוצמה והתפלגויות אותות ספציפיות לנתיב.
    3. ייצוא את הנתונים המעובדים, כלומר הפרופילים החד-ממדיים המחושבים.
    4. חשב את התפלגות המשקל המולקולרי על ידי נרמול הפרופילים, וחשב שטחים אינטגרליים על פני טווחי MW הרצויים לכל נתיב.
    5. ייצוא את נתוני הפלט, כלומר האזורים האינטגרליים בתוך טווחי המשקל המולקולרי שנקבעו.
  2. ניתוח רב-משתני לאבחון
    1. יש ליישם ניתוח ליניארי דיסקרימיננטי (LDA) או שיטות רב-משתניות אחרות לניתוח סיווג.
    2. חשב דיוק, רגישות, ספציפיות, וביצוע ניתוח ROC.
      הערה: הסקריפטים המשמשים לעיבוד תמונה, נרמול פרופילים, התאמה וסיווג זמיניםמ-27, שם מסופק גם מדריך המשתמש המתאים.
      אזהרה: פעלו לפי נהלי בטיחות ביולוגית בעת טיפול בפלזמה אנושית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

אחד האתגרים המרכזיים בסטנדרטיזציה של ניסויי PC הוא במזעור שונות טכנית ותלויות אופרטור, כפי שהודגש בעבר במחקרזה 26. שאלות פתוחות עדיין קיימות לגבי השפעת משתנים ניסיוניים כגון הטיית אופרטור והשפעת כלים אוטומטיים על השחזוריות 18,28.

ראשית, מחקר זה מציג הערכה שיטתית של עמידות ושחזור הפרוטוקול המוצע. מטרת המחקר הייתה כ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

רב-גוניות ויכולת שחזור של שיטות בין סוגי NP

הפרוטוקול המוצג כאן מספק זרימת עבודה סטנדרטית וניתנת לשחזור לבידוד ואפיון המחשב שנוצר על NP בעת דגירה עם HP. כפי שהודגם במחקרים קודמים ועכשוויים33, השיטה מאפשרת יצירת טביעות אצבע מולקולריות מבוססות SDS-PAGE שתופסות תכונות ביולוגיות ואבחנתיות רלוונטיות של המחשב המותאם אישית. העקביות שנצפתה בין תהליכי עבודה ידניים ואוטומטיים מתמודדת עם אתגר מרכזי במחקר מחשבים אישיים: מזעור שונות...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

תודות

המחקר מומן בחלקו על ידי MUR, התוכנית הלאומית להשקעות משלימות ל-NRRP, במימון האיחוד האירופי-NextGenerationEU, פרויקט "D3 4 HEALTH-דיאגנוסטיקות, פרוגנוסטיקות וטיפולים מונעות דיגיטלית לבריאות בר-קיימא". PNC0000001, Spoke 3 Linea tematica 2, missione 4, componente 2 CUP: B53C22006120001. עבודה זו נתמכה גם על ידי קרן AIRC במסגרת פרויקט IG 2020-ID. 24521, P.I. Pozzi Daniela.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צינור LoBind חלבוני 1.5MLאפנדורף22431081
10x Tris/Glycine/SDSביוראד1610732
צנטריפוגהLabortechnikZ 216 MK הרמלהשתמשו ב-18,620 RCF למשך 20 דקות ב-4 מעלות ומעלות גבוה; C
מערכת ההדמיה ChemiDocביו-ראד12003153משמש לרכישת תמונות ג'ל
כלורופורםסיגמא אולדריץ'C2432-1Lממס ל-DOTAP
קורנינג 1-200 ומיקרו; טיפים של פיפט ארוז בכמות גדולה של Universal Fitקורנינג4845
ג'לים מוכנים ללא כתמים של Criterion TGXביוראד5678095
מים מזוקקים 6 x 1 ליטרתרמו פישר15230001
DOTAP (1,2-דיולואיל-3-טרימתיל למוניום-פרופאן)ליפידים פולריים של Avanti890890P-200mgמשמש להכנת ליפוזומים קטיוניים; מומס בכלורופורם, התאדה, הושפע ומוצא
ספק כוח Enduro 300V  Labnet E0303-230V
קורא מיקרופלט GloMax DiscoverפרומגהGM3000
ננו-חלקיקי זהב (מיוצבים בציטרטים)סיגמא-אלדריץ'742031-25MLמשמש כננומטריה; בשימוש ללא טיהור נוסף
ג'ל פוליאקרילאמיד גרדיאנט (4– 20% TGX)ביו-ראד5678095משמש ל-SDS– דף
גרנט אינסטרומנט   תרמושייקר HC24N (מיקרוצינורות בגודל 24 x 1.5 מ"ל)פישר סיינטיPHMT-PSC24N
תמיסת תחמוצת גרפן (GO)גרפנאהGO-4-1000משמש כננומטריה; מדולל ל-0.25 מ"ג/מ"ל וסוניקי
פלזמה אנושית (HP)סיגמא-אלדריץ'P9523-5MLמשמש לדגירה של ננו-חלקיקים
תוכנת ImageLabביו-רד. גרסה 6.1.0.07/משמש לייצוא תמונת ג'ל כקבצי tiff
מאגר טעינה Laemmli 2xביוראד1610737משמש להשעיית כדורים
MATLABMathWorks. גרסה R2022a/משמש לעיבוד תמונה, ניתוח נתונים וחישוב פרופילים
מיני-אקסטרודרליפידים פולריים של Avanti610020משמש להכנת ליפוזום
סוכן מפחית דגימות NuPAGE (10X)תרמו-סיינטיפיקNP004
בופר מלח פוספטקורנינג 21-031 ס"ממשמש לדגימות DOTAP-HP
ערכת בדיקת חלבון Pierce BCA, ערכה אחת (1 ליטר)תרמופישר23225
טיפים של פיפט שקוף: 0.5-10 אולטראקסיגןT-300-STK
PIPETMAN L P10L, 0.5-10 ומיקרו; L, פולט מתכתגילסוןFA10002M
PIPETMAN P20, 2-20 ומיקרו; L, פולט מתכתגילסוןF144056M
PIPETMAN P200, 20-200 ומיקרו; L, פולט מתכתגילסוןF144058M
מערכת פיפטינג אוטומטית PIPETMAXגילסוןGSYS0021משמש לטיפול אוטומטי בדגימות
מסנן פוליקרבונט (0.1 ומיקרו; m)ליפידים פולריים של Avanti610005-1EAמשמש לאקסטרוזיה של ליפוזום
תקני חלבון Precision Plus All Blue Prestained Proteinביוראד1610373
תקני חלבון לא מוכתים של Precision Plus ביוראד1610363EDU
סוניקטור Vibra Cell VC505סוניקס וחומרים בע"מ.VC505
ZetaSizerמלברןZS90משמש למדידות פיזור אור דינמי (DLS) ומיקרואלקטרופורזה (ME)

מקורות

  1. Cai, R., Chen, C. The crown and the scepter: Roles of the protein corona in nanomedicine. Adv Mater. 31 (45), 1805740(2019).
  2. Caputo, D., et al. Nanotechnology meets oncology: A perspective on the role of the personalized nanoparticle-protein corona in the development of technologies for pancreatic cancer detection. Int J Mol Sci. 23 (18), 10591(2022).
  3. Lundqvist, M., et al. The evolution of the protein corona around nanoparticles: A test study. ACS Nano. 5 (9), 7503-7509 (2011).
  4. Hajipour, M. J., et al. Personalized protein coronas: A "key" factor at the nanobiointerface. Biomater Sci. 2 (9), 1210-1221 (2014).
  5. Quagliarini, E., et al. Protein corona-enabled serological tests for early-stage cancer detection. Sens Int. 1, 100025(2020).
  6. Caracciolo, G., et al. Size and charge of nanoparticles following incubation with human plasma of healthy and pancreatic cancer patients. Colloids Surf B Biointerfaces. 123, 673-678 (2014).
  7. Barrán-Berdón, A. L., et al. Time evolution of nanoparticle-protein corona in human plasma: Relevance for targeted drug delivery. Langmuir. 29 (21), 6485-6494 (2013).
  8. Yu, Y., Luan, Y., Dai, W. Dynamic process, mechanisms, influencing factors, and study methods of protein corona formation. Int J Biol Macromol. 205, 731-739 (2022).
  9. Hadjidemetriou, M., Kostarelos, K. Evolution of the nanoparticle corona. Nat Nanotechnol. 12 (4), 288-290 (2017).
  10. Caputo, D., et al. A protein corona-enabled blood test for early cancer detection. Nanoscale. 9 (1), 349-354 (2017).
  11. Pozzi, D., Caracciolo, G. Exploiting differences in personal nanoparticle corona profiles for cancer diagnostics. , Taylor & Francis. 431-433 (2025).
  12. Vence, M. G., et al. Potential clinical applications of the personalized, disease-specific protein corona on nanoparticles. Clin Chim Acta. 501, 102-111 (2020).
  13. Di Domenico, M., et al. Nanoparticle-biomolecular corona: A new approach for the early detection of non-small-cell lung cancer. J Cell Physiol. 234 (6), 9378-9386 (2019).
  14. Papi, M., et al. Exploitation of nanoparticle-protein interactions for early disease detection. Appl Phys Lett. 114 (16), 163702(2019).
  15. Di Santo, R., et al. Protein corona profile of graphene oxide allows detection of glioblastoma multiforme using a simple one-dimensional gel electrophoresis technique: A proof-of-concept study. Biomater Sci. 9 (13), 4671-4678 (2021).
  16. Caputo, D., et al. Synergistic analysis of protein corona and haemoglobin levels detects pancreatic cancer. Cancers. 13 (1), 93(2020).
  17. Colapicchioni, V., et al. Personalized liposome-protein corona in the blood of breast, gastric and pancreatic cancer patients. Int J Biochem Cell Biol. 75, 180-187 (2016).
  18. Di Santo, R., et al. Personalized graphene oxide-protein corona in the human plasma of pancreatic cancer patients. Front Bioeng Biotechnol. 8, 491(2020).
  19. Digiacomo, L., et al. Efficient pancreatic cancer detection through personalized protein corona of gold nanoparticles. Biointerphases. 16 (1), 011010(2021).
  20. Caputo, D., Caracciolo, G. Nanoparticle-enabled blood tests for early detection of pancreatic ductal adenocarcinoma. Cancer Lett. 470, 191-196 (2020).
  21. Caracciolo, G., et al. Challenges in molecular diagnostic research in cancer nanotechnology. Nano Today. 27, 6-10 (2019).
  22. Ashkarran, A. A., et al. Measurements of heterogeneity in proteomics analysis of the nanoparticle protein corona across core facilities. Nat Commun. 13 (1), 6610(2022).
  23. Pederzoli, F., et al. Protein corona and nanoparticles: How can we investigate on. Wiley Interdiscip Rev Nanomed Nanobiotechnol. 9 (6), e1467(2017).
  24. Otoo, J. A., Schlappi, T. S. REASSURED multiplex diagnostics: A critical review and forecast. Biosensors. 12 (2), 124(2022).
  25. Papi, M., Caracciolo, G. Principal component analysis of personalized biomolecular corona data for early disease detection. Nano Today. 21, 14-17 (2018).
  26. Giulimondi, F., et al. Reproducibility of biomolecular corona experiments: A primer for reliable results. Part Part Syst Charact. 40 (2), 2200169(2023).
  27. Renzi, S., et al. Structuring lipid nanoparticles, DNA, and protein corona into stealth bionanoarchitectures for in vivo gene delivery. Nat Commun. 15 (1), 9119(2024).
  28. Van Dorpe, S., et al. Integrating automated liquid handling in the separation workflow of extracellular vesicles enhances specificity and reproducibility. J Nanobiotechnology. 21 (1), 157(2023).
  29. Quagliarini, E., et al. The influence of protein corona on graphene oxide: Implications for biomedical theranostics. J Nanobiotechnology. 21 (1), 267(2023).
  30. Jiříčková, A., et al. Synthesis and applications of graphene oxide. Materials. 15 (3), 920(2022).
  31. Saorin, A., et al. A redefined protocol for protein corona analysis on graphene oxide. ACS Nanosci Au. , (2025).
  32. Digiacomo, L., et al. Nanoparticle-protein corona enhances accuracy of Ca-19.9-based pancreatic cancer classification. Nanoscale. 17 (12), 7066-7075 (2025).
  33. Caputo, D., et al. Improving the accuracy of pancreatic cancer clinical staging by exploitation of nanoparticle-blood interactions: A pilot study. Pancreatology. 18 (6), 661-665 (2018).
  34. Quagliarini, E., et al. A decade of the liposome-protein corona: Lessons learned and future breakthroughs in theranostics. Nano Today. 47, 101657(2022).
  35. Wu, S. Y., An, S. S. A., Hulme, J. Current applications of graphene oxide in nanomedicine. Int J Nanomedicine. 10 Suppl 1, 9-24 (2015).
  36. Caputo, D., et al. Multiplexed detection of pancreatic cancer by combining a nanoparticle-enabled blood test and plasma levels of acute-phase proteins. Cancers. 14 (19), 4658(2022).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

BCA

מאמרים קשורים