הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

ניתוח אוטומטי של תמונות פלואורסצנטיות של C. elegans באמצעות SegElegans

1.1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/69094

⸱

10 באוקטובר 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Basic Sciences, Faculty of Medicine, University of Crete, 2Institute of Molecular Biology and Biotechnology, Foundation for Research and Technology-Hellas, 3Instituto de Automática e Informática Industrial, Universitat Politècnica de València

במאמר זה

סיכום

כאן אנו מספקים הוראות לשימוש יעיל ב-SegElegans, מערכת למידה עמוקה שפיתחנו לפילוח אוטומטי של תולעים בודדות בתמונות מיקרוסקופיה רחבות, לשימוש מאוחר יותר בתוכנות ניתוח תמונות כגון ImageJ. אנו מספקים דרכים להשתמש במערכת הן באופן מקוון והן באופן לא מקוון.

תקציר

מיקרוסקופיה, במיוחד מהסוג הפלואורסצנטי, היא כלי נפוץ במחקר C. elegans . עם זאת, ניתוח נתונים מניסויי מיקרוסקופיה יכול להיות מייגע למדי וגוזל זמן. לפיכך, אוטומציה רצויה. פיתחנו את SegElegans, מערכת רשת עצבית קונבולוציונית מבוססת U-net דו-ראשית שתוכננה במיוחד לפילוח אוטומטי של תולעים, אפילו בתמונות עם מספר רב של אנשים נוגעים או חופפים. החלק הראשון של SegElegans מורכב ממקודד אחד ושני מפענחים. המקודד, המבוסס על מודל SmaAt AT, מחיל שכבות קונבולוציה כפולות ואחריהן מודול קשב בלוק קונבולוציוני (CBAM). שני המפענחים משתמשים ב-LSTMs קונבולוציוניים: האחד מבצע פילוח סמנטי של תמונות תולעת (גוף, קצה, רקע או חפיפה), בעוד השני מחלץ שלד ליניארי לאורך כל תולעת. החלק השני הוא אלגוריתם לאחר עיבוד המשלב את הפלטים של שני המפענחים ומשתמש בהם כדי ליצור פילוח מופעים מדויק. לאחר מכן ניתן להזין את הפילוח הזה ל-ImageJ או לכלי ניתוח תמונה מתאימים אחרים. כאן אנו מציגים הוראות כיצד לגשת למערכת זו ולהפעיל אותה. אנו מספקים יישום מקוון מבוסס מחשוב ענן וכן שתי שיטות לשימוש במודלים של SegElegans במצב לא מקוון, על מכונה מקומית, במידה והחומרה הנדרשת זמינה.

מבוא

Caenorhabditis elegans הוא אורגניזם מודל אוקריוטי עם שימוש נרחב בתחומי הביולוגיה התאית והמולקולרית 1,2,3. זוהי תולעת נמטודה קטנה (~1 מ"מ לבוגרים מסוג בר) שחיה באדמה עם מחזור חיים מהיר (~שלושה שבועות), ומספר רב של צאצאים (בדרך כלל זהים גנטית להורה הרמפרודיטה המפרה את עצמה). למרות פשטותו היחסית, החיה היא עדיין אורגניזם רב-תאי מורכב בעל רקמות ואיברים מוגדרים ומובחנים, שבזכות גודלו הקטן ושקיפותו, ניתן לחקור אותו in vivo ללא כל צורך בקיבוע או בטיפולים פולשניים אחרים4. ניתן להגביר עוד יותר את יכולתה של התולעת למחקר in vivo באמצעות מיקרוסקופיה באמצעות מדווחים פלואורסצנטיים, המאפשרים הבחנה קלה בין תאים בודדים או אפילו הדמיה ישירה של אברונים/רכיבים תת-תאיים כגון מיטוכונדריה, טיפות שומנים או אגרגטים של חלבונים, ושל תהליכים כגון העברת אותות, ביטוי גנים, איחוי שלפוחית, אוטופגיה, פוטנציאל פעולה עצבי ושרירים וכו '5,6,7,8,9,10,11. בנוסף, הנמטודה גם נוחה מאוד למניפולציה גנטית באמצעות מוטגנזה12, טרנסגנזה באמצעות מיקרו-הזרקה או הפצצת מיקרו-חלקיקים13, עריכת CRISPR14, והכי חשוב, בכל הנוגע לבדיקה גנטית קלה וחסכונית, RNAi15. מניפולציה זו מאפשרת מחקר נרחב של גנים ותפקידם בנמטודה עצמה, ובמקביל, הודות להומולוגיה הגנטית המשמעותית ש-C. elegans מציג לאורגניזמים מודלים אחרים, ומגלה תגליות יסוד עם רלוונטיות כל הדרך לבני אדם16,17. לבסוף, הומולוגיה/שימור זה גם הופך את התולעת לשדה ניסוי ראשוני אידיאלי לתרופות וחומרים כימיים, ומאפשר הבהרת מנגנוני הפעילות התרופתית, זיהוי וריאציות גנטיות פוטנציאליות משנות פעילות, וגילוי אינטראקציות לא רצויות פוטנציאליות והשפעות מחוץ למטרה 18,19,20.

כל היתרונות שהוזכרו לעיל הפכו את C. elegans למודל אטרקטיבי למחקרי ביולוגיה תאית ומולקולרית, במיוחד עבור מדענים המתעניינים בניטור in vivo ולעתים קרובות בזמן אמת של תהליכים באמצעות מיקרוסקופיה. מחקרים כאלה כוללים בדרך כלל כמות משמעותית של ניתוח תמונות באמצעות תוכנה מיוחדת, כאשר האפשרות הנפוצה ביותר היא ImageJ 21,22,23. מאפיין נפוץ של הניתוח באמצעות תוכנה כזו הוא הצורך של המשתמש/החוקר לציין אזורי עניין (ROIs) לניתוח באמצעות שימוש בכלי בחירה. לעתים קרובות, כל תולעת בודדת בתמונה תיבחר כ-ROI משלה, במטרה להשיג מידע לכל תולעת על מאפיינים מורפולוגיים פשוטים (כגון ממדי גוף) או קריאות ניסיוניות "מתקדמות" יותר כגון רמות הביטוי של גן (נמדד באמצעות מדווח פלואורסצנטי), קריאת מדווח רציומטרי, מספר וגודל טיפות השומנים, היווצרות אגרגטים של חלבונים, המורפולוגיה של אברונים בודדים והרשתות שלהם וכו'.5,8,10,24,25,26,27. בחירות אלה לכל תולעת נעשות בדרך כלל באופן ידני, מכיוון ששיטות בחירה אוטומטיות המבוססות על אלגוריתמים סטנדרטיים לעיבוד תמונה בדרך כלל אינן מסוגלות מספיק כדי להבחין בין הצורות והתכונות של התולעת, במיוחד בתמונות שדה כהה שבהן קווי המתאר של התולעים אינם נראים בבירור או בתמונות שדה בהיר עם מספר משמעותי של בעלי חיים הנוגעים וחופפים. עם זאת, התהליך הידני הוא איטי (20 שניות עד דקה אחת לכל תולעת בהתאם לדיוק הדרוש ולניסיון המשתמש), מייגע ונתון להטיות ושגיאות של המשתמש.

גישה חלופית והרבה יותר חזקה ליצירת החזר ROI בודד של C. elegans (משימה המכונה בדרך כלל סגמנטציה בתחום הראייה הממוחשבת) היא להפוך אותה לאוטומטית בעזרת טכניקות למידה עמוקה/רשת עצבית. רשתות עצביות קונבולוציוניות המבוססות בעיקר על ארכיטקטורות Mask R-CNN28 ו-U-net29 הניבו תוצאות ראויות במשימות פילוח במערכות מודלים ביולוגיים שונות 30,31,32 כולל ב-C. elegans 33,34,35,36,37,38,39 אך אף אחד מהם לא סיפק פתרון מספק לבעיה של יצירת סגמנטציות גוף מלאות המבחינות נכון בין בעלי חיים בודדים (פילוח מופעים) בתמונות ברזולוציה גבוהה עם מספר רב של תולעים נוגעות או חופפות לחלוטין., על מנת לענות על צורך זה, פיתחנו את SegElegans, מודל למידה עמוקה שתוכנן ומותאם במיוחד למשימה זו40.

SegElegans מורכב משני חלקים עיקריים (איור 1). החלק הראשון הוא רשת עצבית קונבולוציונית דו-ראשית של U-net. הוא מורכב מגוש מקודד אחד ושני בלוקים מפענחים. בלוק המקודד מבוסס על דגם SmaAt AT41 ומשתמש בבלוקים של קונבולוציה כפולה עבור כל שכבה המוזנת לתוך מודול תשומת לב בלוק קונבולוציוני (CBAM)42. שני בלוקי המפענח מבוססים על רשת הזיכרון לטווח קצר קונבולוציוני (LSTM)43. מפענח אחד אחראי לסווג כל פיקסל של התמונות כחלק מהגוף הראשי של תולעת, חלק מקצה התולעת, חלק מהרקע או חלק מאזור שבו תולעים חופפות (זה מכונה בדרך כלל סגמנטציה סמנטית). המפענח השני אחראי על ציור "שלד" ליניארי לאורך כל תולעת. החלק השני הוא אלגוריתם לאחר עיבוד המשלב את הפלטים של שני המפענחים ומשתמש בהם כדי ליצור פילוח מופעים מדויק. בתחילה הוא מזהה את מקטעי החפיפה האמיתית על ידי השוואת פלט הפילוח הסמנטי לזה של השלד. לאחר מכן הוא מוציא את פילוח המופע ישירות עבור תולעים ללא חפיפות או על ידי הרכבתו ממקטעים עבור תולעים חופפות40. פילוחים אלה נשמרים כמסכות בינאריות כמו גם החזר ROI תואם ImageJ.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הסעיפים הבאים כוללים הוראות מפורטות כיצד לעשות שימוש יעיל ב-SegElegans (איור 2). הם כוללים הוראות על רכישת תמונות הכנה (סעיף 1), כיצד להפעיל את המודל באופן מקוון (סעיף 2) או לא מקוון (סעיפים 3-5), וייבוא החזר ROI ל-ImageJ או לכלים אחרים (סעיף 6). מכיוון שהערכת תמונות באמצעות המודל דורשת מחשב עם יחידת עיבוד גרפי (GPU) תואמת CUDA שיש לו לפחות 6 ג'יגה-בייט (באופן אידיאלי יותר) של זיכרון גישה אקראית של וידאו (VRAM), מומלץ לרוב המשתמשים (בתנאי שיש להם גישה לשירותי גוגל) להשתמש בגרסה המקוונת של המודל העונה על דרישות החומרה הללו ועולה עליהן באמצעות מחשוב ענן (סעיף 1 > סעיף 2 > סעיף 6). לחלופין, משתמשים שיש להם גישה לחומרה חזקה כראוי והבנה בסיסית של שימוש בשורת פקודה/מסוף (או משתמשים שאין להם גישה לאפשרויות מחשוב הענן שהוזכרו לעיל) עשויים למצוא את הפעלת המודל באופן מקומי נוחה יותר (סעיף 1 > סעיף 3 > סעיף 4 או 5 > סעיף 6).

1. רכישת תמונות לדוגמא ומדריך

  1. השתמש ב-SegElegans כדי לרכוש סגמנטציות של תולעים בוגרות מכל זן תולעים, ללא קשר לאילו מדווחים פלואורסצנטיים הם עשויים לבטא או לא. אם הפנוטיפ/ים/הנתונים המעניינים נמדדים בתמונות שדה בהיר, רכוש אותם כרגיל באמצעות מיקרוסקופ שדה רחב ותוכנה תואמת, באמצעות עדשת אובייקטיבית 4x או דומה.
    הערה: SegElegans יכולה לנתח תמונות עם מגוון רחב של בהירות וניגודיות, אם כי עדיף שלא יהיו פיקסלים בהירים או כהים רוויים. בכל הנוגע למידות, המערכת הוכשרה עם תמונות בגודל 1328x1048 אך אמורה לעבוד עם כל תמונה בגודל 512x512 לפחות.
  2. אם הפנוטיפ/ים/הנתונים המעניינים נמדדים בתמונות שדה כהה (אופייני בעת שימוש במדווח פלואורסצנטי או צבע טרנסגני אחד או יותר), רכוש תמונות שדה בהיר לצד הנתונים שישמשו כתמונות מנחות (כפי שהוסבר בשלב 1.1). ודא שתמונות ההנחיה תואמות בצורה מושלמת לתמונות השדה הכהה של ערוץ הקרינה מרחבית וקרוב ככל האפשר בזמן, באופן אידיאלי על ידי שימוש באפשרויות הרכישה הרב-ערוציות המסופקות על ידי תוכנת ההפעלה של המיקרוסקופ. שמור את תמונות ההנחיה בתיקייה נפרדת מתמונות נתוני השדה הכהה המתאימות, תוך שימוש באותו שם לשתיהן.

2. הפעלת הגרסה המקוונת של SegElegans

  1. היכנס לחשבון Google בדפדפן אינטרנט. מומלץ ליצור חשבון מעבדה ייעודי חדש למטרה זו.
  2. היכנס ל- Google Drive (https://drive.google.com) והעלה את התיקיה עם תמונות השדה הבהיר (נתונים או מדריך). כפי שהוזכר קודם לכן, אם נעשה שימוש בתמונות מדריכות ליצירת החזר ROI עבור תמונות שדה כהה, אל תכלול תמונות נתוני שדה כהה בתיקיה זו.
  3. עבור אל https://github.com/KonstantinosKounakis/SegElegansOnline/tree/v1.0 ולחץ על הקובץ SegElegans Body Prediction Interface.ipynb . לחץ על כפתור פתח ב-Colab בחלק העליון של הקובץ שנפתח. המחברת/ממשק Jupyter עבור SegElegans ייפתח ב-Google Colab.
  4. הפעל את בלוק הקוד 1 על ידי לחיצה על כפתור ההפעלה (figure-protocol-1) מתחת לכותרת. הענק את הרשאת זמן הריצה להריץ את הקוד ולצפות בפלט לאחר סיום הביצוע (סימן ביקורת ירוק מופיע ליד כפתור ההפעלה). Colab אמור להריץ אוטומטית את זמן הריצה הנכון ותואם CUDA ולהציג טבלת פלט NVIDIA-SMI. אחרת, כפה את השימוש בזמן ריצה של T4 GPU דרך התפריט זמן ריצה > שנה סוג זמן ריצה .
  5. הפעל את בלוק הקוד 2 כדי לטעון את התוכן של Google Drive לזמן הריצה. קבל את כל תיבות הדו-שיח של האישור והענק את כל ההרשאות המבוקשות.
  6. הפעל בלוקי קוד 3 ולאחר מכן 4. בלוק 3 ייקח כמה דקות לסיים, אז ודא שסימן הביקורת הירוק הופיע לפני שתמשיך ל-4.
  7. פתח את הסמל עם לשונית התיקיה משמאל לממשק Colab. פעולה זו תציג את הקבצים שנטענים בזמן הריצה, כולל התוכן המיובא של Drive כ -/content/drive/MyDrive. לחץ לחיצה ימנית על התיקיה עם התמונות, העתק את הנתיב והדבק אותו בצורת הקלט test_images של בלוק קוד 5. ודא שהוא נראה כך: /content/drive/MyDrive/Imagefolder. באופן דומה, ציין נתיב עבור פלט הניתוח (למשל, /content/drive/MyDrive/Imagefolder/Output). שים לב שנתיבים בסביבה זו משתמשים בקו נטוי כדי להפריד בין תיקיות (/).
  8. הפעל בלוק קוד 5.
  9. ציין את ההרחבה המדויקת של התמונות שינותחו על ידי המודל בצורה המסופקת של בלוק קוד 6. לצורך קלט זה ".tif", ". TIF" ו- ".tiff" נחשבות להרחבות שונות.
  10. אל תתאים את קלט batch_crop_img בבלוק קוד 6 אם המערכת פועלת בזמן הריצה המוגדר כברירת מחדל של T4 GPU (המסופק בחינם לכל המשתמשים למספר מוגבל של שעות ביום, בהתאם לרמות השימוש). צמצם אותו אם זמן הריצה מעלה בעיות בזמינות הזיכרון.
  11. הפעל את בלוק הקוד 6. זה ייקח קצת זמן, אז ודא שסימן הביקורת הירוק הופיע לפני שתמשיך.
  12. הפעל את בלוק הקוד 7. אל תתאים את הכניסות שלו לזמן הריצה המוגדר כברירת מחדל של T4, אלא צמצם את מספר תהליכי המשנה או השבת לחלוטין את העיבוד המקביל אם מתעוררות בעיות זמינות זיכרון. זה גם ייקח זמן משמעותי.
  13. גש ל-Google Drive בחלון דפדפן או בכרטיסייה אחרת ונווט לתיקיית הפלט המיועדת ב-2.7.
    הערה: בשלב זה, SegElegans סיימה את ההערכה הראשונית והעיבוד שלאחר הפילוח ויצרה מספר תיקיות משנה עם פלטים. תוצאות 0_summary כוללות גרפים המסכמים את הפלט של כל תמונה, עם מספר אינדקס המוקצה לכל תולעת. 1_complete_mask מכיל את המסכות הבינאריות שנאספו עבור כל הפילוח שהאלגוריתם החליט שהן טובות לניתוח. 1_edge_small_mask מכיל מסכות בינאריות עבור כל הסגמנטציות שהאלגוריתם החליט לדחות מכיוון שבעלי החיים קטנים מדי או מוסתרים חלקית בקצה התמונה. 1_overlap_mask מכיל מסיכות בינאריות עבור כל הסגמנטציות של תולעים שהפגינו חפיפות אמיתיות, ואינן מתווספות כברירת מחדל לפלט שנאסף. 1_all_rois_results מכיל את הפילוח של כל 3 הסוגים, ללא קשר לאוצרות, בפורמט ImageJ (קבצי zip עם החזר ROI).
  14. בשלב זה, בחר אחת משלוש האפשרויות:
    1. השתמש בהחזר ה-ROI המסופק ב-1_all_rois_results ב-ImageJ ודחה החזר ROI לא רצוי לאחר הייבוא לשם (ראה סעיף פרוטוקול 6).
    2. קבל את המסכות הטובות שנאספו ללא כל תיקון ידני (וללא הכללת תולעים חופפות) (דלג ל-2.16).
    3. התאם ידנית את האוצרות על ידי בחירת התולעים (כולל החופפות) שייכללו בפלט (המשך ל-2.15).
  15. על מנת להתאים את האוצרות באופן ידני, השתמש בקוד בלוק 8. בדוק את תוצאות האוצר הראשוני מגרפי הסיכום בתיקיית התוצאות 0_summary . עבור כל תמונה שזקוקה לתיקון, הזן את השם המלא (עם סיומת) של תמונת הקלט המקורית בטופס "name_image_change" ואת מספרי המסכות שיש לשמור (מגרף הסיכום), מופרדים בפסיקים בטופס "index_images". הפעל את בלוק הקוד 8. חזור על שלב זה עבור כל תמונה אחרת הזקוקה לתיקון.
  16. לאחר התיקון או אם משתמשים בוחרים לקבל את האוצרות הראשונית ללא תיקונים (וללא התולעים החופפות), הפעל את בלוק הקוד 9. תיקיית משנה חדשה תיווצר בתיקיית הפלטים ב- Google Drive בשם 2_curated_rois_results. הוא כולל את כל הפילוח הסופי שנאסף בפורמט ImageJ (קבצי zip עם החזר ROI).
  17. על מנת לבצע את התהליך שוב עבור תיקיית תמונות אחרת, אפס את זמן הריצה דרך התפריט זמן ריצה > הפעלה מחדש והתחל מההתחלה.

3. הכנת הגרסה הלא מקוונת של SegElegans לפני השימוש הראשון

  1. כחלופה להפעלת SegElegans באופן מקוון ב-Colab, גרסה לא מקוונת של SegElegans זמינה למשתמשים שאינם יכולים או מעדיפים לא להשתמש בשירותי מחשוב הענן של גוגל. לשם כך נדרש מחשב אישי (Windows או Linux) עם GPU תואם CUDA (https://developer.nvidia.com/cuda-gpus) הכולל לפחות 6 GB של VRAM (אם כי מומלץ 16 אם הוא זמין ובמחיר סביר).
    הערה: ההוראות הבאות בסעיפים 3-5 מתמקדות ב-Windows, אך התוכנה יכולה לפעול גם במערכות מבוססות Linux עם כמה שינויים קטנים בפקודות שבהן נעשה שימוש.
  2. הורד את תוכנית ההתקנה של ערכת הכלים CUDA מ-https://developer.nvidia.com/cuda-downloads ביצוע ההוראות כדי לקבל את הגרסה המתאימה למכשיר שבו נעשה שימוש.
    הערה: SegElegans נבדקה עם גרסאות 12.9 ו-13.0 של ערכת הכלים ו-CUDA גרסה 11 ב-Windows, אולם גרסאות עתידיות צפויות לשמור על תאימות לאחור.
    1. התקן את ערכת הכלים, בהתאם להוראות המתקין עצמו. אין צורך ב- Visual Studio.
  3. הורד את הגרסה המתאימה של מתקין Python למכשיר מ-https://www.python.org/downloads/. התקן את Python, בהתאם להוראות המתקין עצמו, וודא python.exe נוסף ל-PATH.
    הערה: SegElegans נבנה ונבדק על Python 3.13, אך גרסאות עתידיות צפויות לשמור על תאימות לאחור.
  4. עבור אל https://github.com/KonstantinosKounakis/SegElegansOffline/releases/tag/v1 . לחץ על הקישור קוד מקור (zip) כדי להוריד את החבילה עם הקבצים הדרושים להגדרה והפעלה של SegElegans באופן מקומי.
  5. חלץ את קובץ ה-zip. מקם אותו בתיקיה גבוהה או אפילו ברמה העליונה, כגון C:\SegElegans. התוכן של קובץ ה- zip כבר נמצא בתוך תיקיית משנה SegElegansOffline-1.
  6. פתח את שורת הפקודה של Windows (cmd.exe). הקלד את הפקודה python -m venv "fullsegeleganspath" כאשר "fullsegeleganspath" הוא הנתיב המלא, במרכאות, לתיקיית המשנה SegElegansOffline-1 .
    הערה: לדוגמה, אם קובץ ה-zip חולץ ב-C:\SegElegans, הנתיב המלא הוא C:\SegElegans\SegElegansOffline-1 והפקודה תהיה python -m venv "C:\SegElegans\SegElegansOffline-1" . שים לב שנתיבים בסביבה זו משתמשים בקו נטוי הפוך כדי להפריד בין תיקיות ("\").
  7. בשורת הפקודה, השתמש בפקדים סטנדרטיים כדי לנווט בתוך התיקיה SegElegansOffline-1 ולבצע את הפקודה Scripts\activate. תווית (SegElegansOffline-1) אמורה להופיע לפני סמן ההנחיה הבא, המציינת שסביבת Python פעילה כעת.
  8. בתוך הסביבה הפעילה (SegElegansOffline-1), הפעל את הפקודה pip install -r requirements.txt . התהליך ייקח קצת זמן.
  9. הזן ובצע את הפקודה python assemblenetworks.py .
    הערה: SegElegans מוכן כעת לרוץ. שתי דרכים להשיג זאת מסופקות: סקריפט מהיר שיספק אוטומטית את כל הפילוח כ-ImageJ ROIs ללא אפשרות לתקן את האוצרות באופן ידני (סעיף 4), ומחברת Jupyter מקומית שתספק אפשרות לסקור ולתקן את האוצרות (סעיף 5). הגישה האחרונה מומלצת לרוב המשתמשים.

4. הפעלת הגרסה הלא מקוונת של SegElegans עם סקריפט מהיר

  1. פתח את שורת הפקודה של Windows (cmd.exe). כמתואר בשלב 3.7, נווט אל תיקיית הסביבה SegElegans והפעל אותה.
  2. על מנת להשתמש בסקריפט המהיר, בעודך בשורת הפקודה עם הסביבה הפעילה (SegElegansOffline-1) קלט ובצע את הפקודה python SegElegansBodyQuickEval.py -i "pathtoinputfolder" -x כאשר "pathtoinputfolder" הוא הנתיב המלא, במרכאות, לתיקיה עם תמונות השדה הבהיר (למשל "D:\Data\Experiment12365\Condition 1") ו- היא סיומת הקובץ המדויקת של התמונות שמשתמשים רוצים לנתח (דוגמה). TIF"). הקלד את הפקודה python SegElegansBodyQuickEval.py -h לקבלת הוראות על פרמטרים נוספים שניתן לשנות כדי להאיץ את העיבוד על ידי הסקריפט אם המכשיר יכול להתמודד עם זה.
    הערה: תיקיית הפלט במקרה זה תיווצר בתוך תיקיית הקלט (אז עבור הדוגמה לעיל: "D:\Data\Experiment12365\Condition 1\Output"). בפנים, יש סדרה של תיקיות משנה. תוצאות 0_summary כוללות גרפים המסכמים את הפלט של כל תמונה, עם מספר אינדקס המוקצה לכל תולעת. 1_complete_mask מכיל את המסכות הבינאריות שנאספו עבור כל הפילוח הלא חופף שהאלגוריתם החליט שהן טובות לניתוח. 1_edge_small_mask מכיל מסכות בינאריות עבור כל הסגמנטציות שהאלגוריתם החליט לדחות מכיוון שהחיות קטנות מדי או מוסתרות חלקית בקצה התמונה. 1_overlap_mask מכיל מסכות בינאריות לכל הסגמנטציות של תולעים שהראו חפיפות אמיתיות. 1_all_rois_results מכיל את הפילוח של כל 3 הסוגים, ללא קשר לאוצרות, בפורמט ImageJ (קבצי zip עם החזר ROI). מכיוון שאין כאן דרך לתקן ידנית את האוצרות, 2_curated_rois_results כולל כברירת מחדל את כל הפילוח שנחשב טוב על ידי האלגוריתם ואת כל הפילוח החופף בפורמט ImageJ (קבצי zip עם החזר ROI).

5. הפעלת הגרסה הלא מקוונת של SegElegans עם מחברת Jupyter

  1. פתח את שורת הפקודה של Windows (cmd.exe). כמתואר בשלב 3.7, נווט אל תיקיית הסביבה SegElegans והפעל אותה.
  2. על מנת להשתמש בממשק Jupyter, בעודך בשורת הפקודה עם הסביבה הפעילה (SegElegansOffline-1), הזן ובצע את מחברת הפקודה. פעולה זו תפתח חלון/כרטיסייה של דפדפן אינטרנט עם אתר המתארח באופן מקומי. במסך הראשוני, בחר את הקובץ SegElegansOfflineJupyterInterface.ipynb.
  3. הפעל את הקוד בבלוק קוד 1 על ידי בחירתו (לחץ בצד שמאל מחוץ לקוד בפועל) ולחיצה על כפתור ההפעלה (figure-protocol-2) בסרגל הכלים למעלה. הודעת אישור תופיע מתחת לבלוק הקוד לאחר השלמת הביצוע.
  4. הפעל בלוק קוד 2. פעולה זו תיצור כמה טפסי קלט בקריאה מתחת לבלוק הקוד. מלא את הטפסים שנוצרו עם הנתיב לתיקיית הקלט עם תמונות השדה הבהיר (דוגמה: "D:\Data\Experiment12365\Condition 1"), הנתיב הרצוי עבור פלט הניתוח (דוגמה: "D:\Data\Experiment12365\Condition 1\Output"), וסיומת הקובץ המדויקת של התמונות שיש לנתח (דוגמה). TIF"). התאם את ההגדרות הנוספות שסופקו (הגדל את מספר גידולי המשנה לכל אצווה ל-9 או 16, והפעל מספר תהליכים מקבילים לאחר עיבוד) אם המכשיר מסוגל מספיק.
  5. הפעל את בלוק הקוד 3.
  6. הפעל בלוק קוד 4. זה ייקח קצת זמן, אז ודא שהוא שלם לפני שתמשיך.
  7. הפעל בלוק קוד 5. שוב, זה ייקח קצת זמן. לאחר מכן, נווט לתיקיית הפלט שצוינה לעיל.
    הערה: בשלב זה, SegElegans סיימה את ההערכה הראשונית והעיבוד שלאחר הפילוח ויצרה מספר תיקיות משנה עם פלטים. תוצאות 0_summary כוללות גרפים המסכמים את הפלט של כל תמונה, עם מספר אינדקס המוקצה לכל תולעת. 1_complete_mask מכיל את המסכות הבינאריות שנאספו עבור כל הפילוח שהאלגוריתם החליט שהן טובות לניתוח. 1_edge_small_mask מכיל מסכות בינאריות עבור כל הסגמנטציות שהאלגוריתם החליט לדחות מכיוון שבעלי החיים קטנים מדי או מוסתרים חלקית בקצה התמונה. 1_overlap_mask מכיל מסיכות בינאריות עבור כל הסגמנטציות של תולעים שהפגינו חפיפות אמיתיות, וכברירת מחדל אינן מתווספות לפלט שנאסף. 1_all_rois_results מכיל את הפילוח של כל 3 הסוגים, ללא קשר לאוצרות, בפורמט ImageJ (קבצי zip עם החזר ROI).
  8. בדומה לגרסה המקוונת של SegElegans, השתמש באחת משלוש האפשרויות המפורטות להלן:
    1. השתמש בהחזר ה-ROI המסופק ב-1_all_rois_results ב-ImageJ ודחה החזר ROI לא רצוי לאחר הייבוא לשם (ראה סעיף פרוטוקול 6).
    2. קבל את המסכות הטובות שנאספו אוטומטית ללא כל תיקון ידני (וללא הכללת תולעים חופפות) (דלג לשלב 5.11).
    3. התאם ידנית את האוצרות על ידי בחירת התולעים (כולל החופפות) שייכללו בפלט (המשך לשלב 5.9).
  9. על מנת להתאים את האוצרות באופן ידני, השתמש בבלוקי קוד 6 ו-7. תחילה בצע 6. פעולה זו תיצור טפסי קלט בקריאה מתחת לקוד.
  10. בדוק את תוצאות האוצר הראשוני מגרפי הסיכום בתיקיית המשנה 0_summary תוצאות . עבור כל תמונה שזקוקה לתיקון, הזן את השם המלא של תמונת הקלט (עם סיומת) בתמונה כדי לתקן: טופס ואת מספרי המסכות שיש לשמור (מגרף הסיכום) מופרדים בפסיקים במסכות לשמור: טופס. הפעל את בלוק הקוד 7 וודא שהביצוע הושלם. חזור על שלב זה עבור כל תמונה אחרת הזקוקה לתיקון.
  11. לאחר סיום תיקון האוצרות או אם משתמשים בוחרים לקבל את האוצרות הראשונית ללא תיקונים (וללא התולעים החופפות), הפעל את בלוק הקוד 8. תיקיית משנה חדשה תיווצר בתיקיית הפלטים המיועדת בשם 2_curated_rois_results. הוא כולל את כל הפילוח הסופי שנאסף בפורמט ImageJ (קבצי zip עם החזר ROI).
  12. על מנת לבצע את התהליך שוב עבור תיקיית תמונות אחרת, אפס את זמן הריצה דרך התפריט Kernel > הפעל מחדש את הליבה ונקה פלטים של כל התאים והתחל מההתחלה.

6. ייבוא הפילוח ל-ImageJ (או לחלופות)

  1. פתח את אחת מתמונות הנתונים בפועל ב-ImageJ.
  2. פתח את קובץ ה-zip המתאים עם החזר ה-ROI של אותה תמונה. פעולה זו תטען את הבחירות למנהל ההחזר על ההשקעה של ImageJ. אם הם החזר ROI מהפלט 2_curated_rois_results הם מוכנים לניתוח בשיטות הרצויות המשמשות בדרך כלל (רצוי עם שימוש בפקודות מאקרו כדי להפוך את התהליך לאוטומטי ולהאיץ עוד יותר).
  3. אם מדובר בהחזר ROI מהפלט 1_all_rois_results , הסר סגמנטים לא רצויים ממנהל ההחזר על ההשקעה. בחר אותם ולחץ על כפתור המחיקה בחלון המנהל עצמו. אל תקיש על מקש Delete במקלדת, מכיוון שפעולה זו מוחקת את תוכן הבחירה בתמונה.
  4. אם יש צורך בתוכנה אחרת מלבד ImageJ לניתוח, סביר להניח שפורמט ה-ROI לא יהיה תואם. במקרה כזה, ייבא פילוח בצורה הנפוצה באופן אוניברסלי של מסכות בינאריות, המסופקות בתיקיות 1_complete_mask ו-1_overlap_mask. עיין בהוראות התוכנה המקבלת כיצד לבצע ייבוא זה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

על ידי ביצוע פרוטוקול זה, החוקרים אמורים להיות מסוגלים לחלץ פילוח תולעים באיכות גבוהה, אפילו לניתוח תמונות פלואורסצנטיות ללא גבולות תולעת גלויים. כפי שנדון בסעיף 6 לפרוטוקול, ניתן לייבא פילוחים אלה ישירות ל-ImageJ ולהשתמש בהם למדידה מהירה של מאפיינים רלוונטיים כגון עוצמת המדווחים הפלואורסצנטיים (המשמשים בדרך כלל לכימות ביטוי) או המספר, הגודל והמורפולוגיה של אזורים מתויגים פלואורסצנטיים (המשמשים לעתים קרובות לחקר אגרגטים או אברונים של חלבונים). יתר על כן, מכיוון ש-SegElegans נועד לרכוש סג...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

המתודולוגיה המוצגת כאן אמורה לאפשר למשתמשים לנתח ניסויי מיקרוסקופיה של C. elegans במסגרת זמן מהירה משמעותית ללא כל אובדן דיוק. מכיוון שהוא מחלץ סגמנטים מתמונות מדריך brightfield ללא תלות בפלואורסצנטיות בפועל (כפי שנדון בסעיף פרוטוקול 1), ניתן להשתמש בו עם כל זן ולכל יישום הדורש מדידת פנוטיפים על בסיס תולעת. אלה יכולים לכלול יישומים חד-ערוציים כגון כימות היווצרות תכלילי חלבון חריגים במודלים של מחלה10 (כמו בדוגמה המוצגת באיור 2...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגודי אינטרסים להצהיר עליהם.

תודות

העבודה במעבדת המחברים ממומנת על ידי המזכירות הכללית עבור
המחקר והחדשנות של משרד הפיתוח היווני,
האיחוד האירופי - NextGenerationEU (קוד פרויקט: TAEDR-0535850, ראשי תיבות:
BrainPrecision) במסגרת הפעולה "פעולות דגל ב
תחומים מדעיים בין-תחומיים עם עניין מיוחד בקשר
למרקם היצרני", תחת ההתאוששות והחוסן הלאומי
תוכנית "יוון 2.0", סוכנות המחקר של הנציבות האירופית
מרכז המצוינות "CHAngeing" (GA-101087071) והקרן ההלנית
למחקר וחדשנות (H.F.R.I) תחת "הקול הקורא הראשון ל-H.F.R.I.
פרויקטים מחקריים לתמיכה בחברי סגל וחוקרים וב
רכש ציוד מחקר בעלות גבוהה" (מספר פרויקט:
HFRI-FM17C3- 0869, נוירו-מיטופאגי).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מחשב עם גישה לאינטרנט (דוגמה: Dell Vostro Desktop)כמה (למשל דל) -זה יאפשר להפעיל את SegElegans אונליין באמצעות מחשוב ענן כפי שמומלץ ובאמצעות תוכנות ניתוח תמונות כמו ImageJ.
יחידת עיבוד גרפיקה תואמת CUDA עם לפחות 6GB VRAM (לדוגמה: MSI Geforce RTX  RTX3050 Ventus 2X 6GB) (אופציונלי)NVIDIA + מספר יצרנים (למשל Micro Star International)https://developer.nvidia.com/cuda-gpusזה יאפשר להריץ SegElegans לא מקוון על מחשב מקומי.
שבבי GPU תואמים ל-CUDA נמצאים כאן:
https://developer.nvidia.com/cuda-gpus
ה-VRAM תלוי ביישום בפועל של ערכת השבבים ב-GPU על ידי היצרן.
אזהרה: תצטרך כרטיס CUDA יקר וחזק הרבה מעבר לדרישות המינימום (16+ GB VRAM) כדי להתאים לביצועים שהושגו בגרסת המחשוב בענן.
מיקרוסקופ אפיפלואורסצנציה (Invitrogen EVOS FL Auto 2)ThermoFisher Scientific AMAFD2000 למשלאנו ממליצים להשתמש במערכת שיכולה לרכוש אוטומטית תמונות הן מערוץ פלואורסצנציה ב-brightfield והן מערוץ פלואורסצנציה אחד או יותר כמעט בו-זמנית.
ImageJ (אופציונלי)NIHhttps://imagej.net/software/fiji/downloadsאנו ממליצים על הפצת פיג'י, זמינה כאן:
https://imagej.net/software/fiji/downloads
מחשב עם תאימות ל-GPU של NVIDIA (דוגמה: Dell Vostro Desktop) (אופציונלי) כמה (למשל דל) -זה נדרש יחד עם ה-GPU כדי להריץ SegElegans לא מקוון על מחשב מקומי.
GPU ידרוש חומרה תואמת Windows עם חריצי PCI מתאימים בלוח האם, מקום להתאים לכרטיס וספק כוח חזק מספיק.
SegElegans-https://github.com/KonstantinosKounakis/SegElegansOnline/tree/v1.0 ראו את כתב היד להוראות מלאות. 

מקורות

  1. Kaletta, T., Hengartner, M. O. Finding function in novel targets: C. elegans as a model organism. Nat Rev Drug Discov. 5 (5), 387-398 (2006).
  2. Markaki, M., Tavernarakis, N. Caenorhabditis elegans as a model system for human diseases. Curr Opin Biotechnol. 63, 118-125 (2020).
  3. Zuryn, S. C. elegans as a model for health and disease. Semin Cell Dev Biol. 154 (Pt A), 1-3 (2024).
  4. Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A transparent window into biology: A primer on Caenorhabditis elegans. WormBook. , 1-31 (2015).
  5. Kerr, R. A. Imaging the activity of neurons and muscles. WormBook. , 1-13 (2006).
  6. Feinberg, E. H., et al. GFP reconstitution across synaptic partners (GRASP) defines cell contacts and synapses in living nervous systems. Neuron. 57 (3), 353-363 (2008).
  7. Hammarlund, M., Jin, Y. Axon regeneration in C. elegans. Curr Opin Neurobiol. 27, 199-207 (2014).
  8. Daniele, J. R., et al. UPR(ER) promotes lipophagy independent of chaperones to extend life span. Sci Adv. 6 (1), eaaz1441(2020).
  9. Yemini, E., et al. NeuroPAL: A multicolor atlas for whole-brain neuronal identification in C. elegans. Cell. 184 (1), 272-288.e11 (2021).
  10. Sinnige, T., et al. Kinetic analysis reveals that independent nucleation events determine the progression of polyglutamine aggregation in C. elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (11), e2021888118(2021).
  11. Gkikas, I., Daskalaki, I., Kounakis, K., Tavernarakis, N., Lionaki, E. MitoSNARE assembly and disassembly factors regulate basal autophagy and aging in C. elegans. Int J Mol Sci. 24 (4), 4230(2023).
  12. Kutscher, L. M., Shaham, S. Forward and reverse mutagenesis in C. elegans. WormBook. , 1-26 (2014).
  13. Praitis, V., Maduro, M. F. Transgenesis in C. elegans. Methods Cell Biol. 106, 161-185 (2011).
  14. Kim, H. M., Colaiacovo, M. P. CRISPR-Cas9-guided genome engineering in Caenorhabditis elegans. Curr Protoc Mol Biol. 129 (1), e106(2019).
  15. Kamath, R. S., Ahringer, J. Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans. Methods. 30 (4), 313-321 (2003).
  16. Lai, C. H., Chou, C. Y., Ch'ang, L. Y., Liu, C. S., Lin, W. Identification of novel human genes evolutionarily conserved in Caenorhabditis elegans by comparative proteomics. Genome Res. 10 (5), 703-713 (2000).
  17. Kuwabara, P. E., O'Neil, N. The use of functional genomics in C. elegans for studying human development and disease. J Inherit Metab Dis. 24 (2), 127-138 (2001).
  18. Ranganathan, R., Sawin, E. R., Trent, C., Horvitz, H. R. Mutations in the Caenorhabditis elegans serotonin reuptake transporter MOD-5 reveal serotonin-dependent and -independent activities of fluoxetine. J Neurosci. 21 (16), 5871-5884 (2001).
  19. Lackner, M. R., et al. Chemical genetics identifies Rab geranylgeranyl transferase as an apoptotic target of farnesyl transferase inhibitors. Cancer Cell. 7 (4), 325-336 (2005).
  20. Yoon, S., et al. Microfluidics in high-throughput drug screening: Organ-on-a-chip and C. elegans-based innovations. Biosensors (Basel). 14 (1), 55(2024).
  21. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  22. Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis. Mol Reprod Dev. 82 (7-8), 518-529 (2015).
  23. Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529(2017).
  24. Valente, A. J., Maddalena, L. A., Robb, E. L., Moradi, F., Stuart, J. A. A simple ImageJ macro tool for analyzing mitochondrial network morphology in mammalian cell culture. Acta Histochem. 119 (3), 315-326 (2017).
  25. Ramki, K., Thiruppathi, G., Ramasamy, S. K., Sundararaj, P., Sakthivel, P. An aggregation-induced emission-based ratiometric fluorescent chemosensor for Hg(II) and its application in Caenorhabditis elegans imaging. Methods. 221, 1-11 (2024).
  26. Boulin, T., Etchberger, J. F., Hobert, O. Reporter gene fusions. WormBook. , 1-23 (2006).
  27. Braeckman, B. P., Smolders, A., Back, P., De Henau, S. In vivo detection of reactive oxygen species and redox status in Caenorhabditis elegans. Antioxid Redox Signal. 25 (10), 577-592 (2016).
  28. He, K., Gkioxari, G., Dollár, P., Girshick, R. Mask R-CNN. arXiv. , (2017).
  29. Ronneberger, O., Fischer, P., Brox, T. U-Net: Convolutional networks for biomedical image segmentation. arXiv. , (2015).
  30. Exploring deep learning architectures in NAECON 2018. Proc IEEE NAECON. Alom, M. Z., Yakopcic, C., Taha, T. M., Asari, V. K. IEEE National Aerospace and Electronics Conference, , 228-233 (2018).
  31. Micallef, N., Seychell, D., Bajada, C. J. Exploring the U-Net++ model for automatic brain tumor segmentation. IEEE Access. 9, 125523-125539 (2021).
  32. Plebani, E., et al. High-throughput segmentation of unmyelinated axons by deep learning. Sci Rep. 12 (1), 1198(2022).
  33. Fudickar, S., Nustede, E. J., Dreyer, E., Bornhorst, J. Mask R-CNN based C. elegans detection with a DIY microscope. Biosensors (Basel). 11 (8), 257(2021).
  34. Lalit, M., Tomancak, P., Jug, F. EmbedSeg: Embedding-based instance segmentation for biomedical microscopy data. Med Image Anal. 81, 102523(2022).
  35. Layana Castro, P. E., Garvi, A. G., Sanchez-Salmeron, A. J. Automatic segmentation of Caenorhabditis elegans skeletons in worm aggregations using improved U-Net in low-resolution image sequences. Heliyon. 9 (4), e14715(2023).
  36. A convolutional neural network model for worm imaging in 2020. Proc IEEE ISBI. Chen, L., et al. IEEE 17th International Symposium on Biomedical Imaging (ISBI), , 508-512 (2020).
  37. Guan, G., et al. Cell lineage-resolved embryonic morphological map reveals signaling associated with cell fate and size asymmetry. Nat Commun. 16 (1), 3700(2025).
  38. Cao, J., et al. Establishment of a morphological atlas of the Caenorhabditis elegans embryo using deep-learning-based 4D segmentation. Nat Commun. 11 (1), 6254(2020).
  39. Zhao, C., et al. EmbSAM: Cell boundary localization and Segment Anything Model for fast images of developing embryos. bioRxiv. , (2024).
  40. Castro, P. E. L., et al. SegElegans: Instance segmentation using dual convolutional recurrent neural network decoder in Caenorhabditis elegans microscopic images. Comput Biol Med. 190, 110012(2025).
  41. Trebing, K., Stańczyk, T., Mehrkanoon, S. SmaAt-UNet: Precipitation nowcasting using a small attention-UNet architecture. Pattern Recognit Lett. 145, 178-186 (2021).
  42. Woo, S., Park, J., Lee, J. Y., Kweon, I. S. CBAM: Convolutional block attention module. arXiv. , (2018).
  43. Shi, X., et al. Convolutional LSTM network: A machine learning approach for precipitation nowcasting. arXiv. , (2015).
  44. Stuhr, N. L., et al. Rapid lipid quantification in Caenorhabditis elegans by Oil Red O and Nile Red staining. Bio Protoc. 12 (5), e4340(2022).
  45. Kuzmic, M., et al. In situ visualization of carbonylation and its co-localization with proteins, lipids, DNA and RNA in Caenorhabditis elegans. Free Radic Biol Med. 101, 465-474 (2016).
  46. Fang, E. F., et al. In vitro and in vivo detection of mitophagy in human cells, C. elegans, and mice. J Vis Exp. (129), e56301(2017).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

C elegansU NetImageJConvolutional LSTM
ניתוח אוטומטי של תמונות פלואורסצנטיות של C. elegans באמצעות SegElegans
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.