הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

CD8+CD103+ Tregs מחלישים מחלת יובש בעיניים באמצעות דיכוי דלקת בתאי T של CD4+ והגנה על שלמות פני העיניים בעכברים

319 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/69110

⸱

21 בנובמבר 2025

 , 
1Department of Ophthalmology, Jinan Second People's Hospital

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מציגים פרוטוקול המדגים את העברת תאי T רגולטוריים CD8+CD103+ כהתערבות אימונותרפית לשיפור מחלת יובש בעיניים הנגרמת מלחץ באמצעות ויסות מקיף של תגובות תאי T פתוגניות של CD4+.

תקציר

תאי T רגולטוריים CD8+CD103+ מייצגים אוכלוסייה מדכאת חיסון מיוחדת עם פוטנציאל טיפולי מוכח במחלות אוטואימוניות; עם זאת, תפקידם בדלקת על פני העיניים נותר לא נחקר. פרוטוקול זה מתאר גישה שיטתית לבידוד תאי T מסוג CD8+CD103+ מעכברים שנחשפו ללחץ יבש והערכת יעילותם הטיפולית באמצעות העברה אימוץ במחלות עיניים יבשות ניסיוניות. המתודולוגיה כוללת מיון תאים מופעלים על ידי מגנטיות לטיהור תאי T של CD8+CD103+, השראת מאמץ ייבוש סטנדרטי, והערכות פונקציונליות מקיפות הכוללות מדידת ייצור דמעות, בדיקת חדירות מחסום קרנית, וניתוח מולקולרי של מתווכים דלקתיים. תוצאות מייצגות מראות כי טיפול בתאי T ב-CD8+CD103+ שיקם משמעותית את ייצור הדמעות, שמר על אוכלוסיות תאי גביע הלחמית, ושמר על שלמות מחסום האפיתל בקרנית. הטיפול השיג דיכוי משמעותי של ביטוי מטריקס מטלופרוטינאז, הפחית את מוות תאי האפופטוטיים, ומווסת פרופילי ציטוקינים מפרו-דלקתי לדפוסי הגנה רקמתיים. הפרוטוקול הפחית למעשה את חדירת תאי ה-CD4+ T לרקמות העין, תוך דיכוי ייצור פתוגני של IL-17A ו-IFN-γ והגברת רמות ההגנה של IL-13. גישה זו מספקת מסגרת ניסיונית איתנה לחקירת אימונומודולציה בתאי T בתאי CD8+CD103+ בהפרעות על פני העיניים ומבססת מתודולוגיה יסודית לפיתוח תרופות חדשות מבוססות תאים לניהול מחלות יובש בעיניים.

מבוא

מחלת יובש בעיניים (DED) מייצגת הפרעה נפוצה ומחלישה במשטח העין, שהפכה לבעיה בריאותית עולמית משמעותית, המשפיעה על 10-30% מאוכלוסיית העולם ופוגעת משמעותית באיכות חייהם, בפרודוקטיביות בעבודה וברווחתם הנפשית 1,2,3. הפתופיזיולוגיה של DED כוללת אינטראקציה מורכבת בין חוסר יציבות בשכבת דמעות, דלקת על פני העיניים, וחריגות נוירו-חושיות, אשר יחד מנציחות מעגל קסמים של נזק לרקמות ולקות תפקודיות4. ברמה המולקולרית, היפרו-אוסמולריות של הדמעות משמשת כמנגנון פתוגני מרכזי, המפעיל אירועים דלקתיים שדורכים שמפעילים מסלולי תגובה ללחץ, גורמים לשחרור מתווך פרו-דלקתי, ולבסוף פוגעים באיזון ההומאוסטטי העדין של מיקרו-סביבת פני העיניים 5,6,7.

הנוף החיסוני של DED נשלט על ידי תגובות חיסוניות אדפטיביות, כאשר חיסון בתאי T של CD4+ ממלא תפקיד מרכזי בארגון הידרדרות פני העיניים ובהמשכיות דלקת כרונית8. תאי T של CD8+ מהווים מרכיב חיוני באוכלוסיית תאי החיסון ההומאוסטטיים הרגילים ברקמות העין, ושומרים על פיקוח חיסון ושלמות הרקמה בתנאים פיזיולוגיים9. מחקרים מייבשים הראו כי ייבוש לחץ (DS) מפעיל תאים מציגים אנטיגן ובהמשך מכין את תאי ה-CD4+ T לפנוטיפים פתוגניים, שיכולים לגרום באופן אוטונומי לקרטוקונחונקטיביס סיקה (KCS) כאשר הם מועברים באופן אימוץ לעכברים עירומים חסרי תאי T, ובכך לשחזר את התכונות המרכזיות של DED10,11 האנושי.

בהינתן התפקיד המרכזי של תגובות תאי CD4+ T הלא מבוקרות בפתוגנזה של DED, אסטרטגיות טיפוליות שמטרתן ויסות חיסון תאי T פתוגני הפכו לגישות מבטיחות לניהול מחלה זו. בהקשר זה, תאי T רגולטוריים של CD8+ (Tregs), במיוחד תת-הקבוצה CD8+CD103+, זכו לתשומת לב רבה בזכות יכולותיהם המדכאות חיסון החזקות ותפקידיהם להגנה על רקמות במגוון מצבים אוטואימוניים ודלקתיים. אוכלוסיות רגולטוריות מיוחדות אלו מווסתות את תגובות החיסון באמצעות מנגנונים רבים, כולל דיכוי מתווך ציטוקינים, עיכוב מגע ישיר בין תאים, וויסות מטבולי של תפקוד הלימפוציטים האפקטוריים 12,13,14. אינטגרין αEβ7 (CD103) משמש כקולטן הומינג קריטי המסייע למיקום הלימפוציטים התוך-אפיתליאליים ברקמות הריריות, ומאפשר ל-CD8+CD103+ Tregs להפעיל השפעות אימונו-רגולטוריות מקומיות באתרי דלקת15.

ישנן עדויות הולכות וגדלות לכך של-CD8+CD103+ Tregs יש פוטנציאל טיפולי משמעותי להפחתת תגובות חיסוניות מזיקות במגוון מצבים ריריים אוטואימוניים 16,17,18. תאים אלו מציגים דפוסי תנועה ייחודיים המאפשרים הצטברות מועדפת באתרי ריר, שם הם יכולים לנטרל ביעילות תגובות חיסוניות הרסניות לרקמות תוך קידום ריפוי והומאוסטזיס. מחקרים עדכניים החלו להבהיר את תפקידם של תאי T מסוג CD8+CD103+ במערכת החיסון מפני העיניים, ומדגימים את ההתרחבות הנומרית שלהם בבלוטות הלימפה הצוואריות לאחר חשיפה ל-DS ואת יכולתם להגר לרקמות הלחמית 19,20,21,22. עם זאת, למרות התצפיות המעניינות הללו, התרומה הפונקציונלית הספציפית של תאי CD8+CD103+ T לפתוגנזה עין יבשה והפוטנציאל הטיפולי שלהם בוויסות נזק על פני העיניים המתווכים על ידי תאי CD4+ T נותרו בלתי מובנות לחלוטין.

העברת אימוץ של CD8+CD103+ Tregs מהווה התקדמות ברורה לעומת גישות טיפוליות קונבנציונליות ל-DED, כולל דמעות מלאכותיות, תרופות אנטי-דלקתיות ותרופות מדכאות חיסון, על ידי מיקוד במנגנוני החיסון הפתוגניים הבסיסיים ולא רק בטיפול בתסמינים23. בניגוד לטיפולים מדכאים חיסון מערכתיים שמדכאים באופן נרחב את תפקוד מערכת החיסון, התערבות מבוססת Treg ב-CD8+CD103+ מציעה ויסות ממוקד של תגובות תאי T פתוגניות של CD4+ תוך שמירה על חיסון מגן24. גישה זו משלימה טיפולים קיימים מבוססי תאים, כגון יישומים בתאי גזע מזנכימליים והעברת Treg CD4+CD25+, על ידי מתן ספציפיות מוגברת של רקמת הרירבאמצעות מנגנוני הומינג המתווכים על ידי CD103.

הפער הקריטי בידע לגבי המנגנונים הרגולטוריים שבאמצעותם תאי T של CD8+CD103+ עשויים להשפיע על פתוגנזה של יובש בעיניים מהווה מחסום משמעותי לפיתוח התערבויות אימונותרפיות ממוקדות למצב משתק זה. יתרה מזאת, האינטראקציה המורכבת בין אוכלוסיות תאי T רגולטוריות ואפקטוריות בדלקת פני העיניים דורשת חקירה שיטתית לזיהוי מטרות טיפוליות חדשות ואופטימיזציה של אסטרטגיות טיפול. מחקר זה נועד לאפיין באופן מקיף ויסות תאי T בתהליכים פתוגניים מונעי תאי CD4+ בתאי T במודל עכברים מבוסס היטב של מחלת יובש בעין. החידוש המתודולוגי המרכזי כולל בידוד רציף של תאי רגולציה CD8+CD103+, ולאחר מכן העברה אימוץ והערכה מקיפה של קריאות פונקציונליות, היסטולוגיות ומולקולריות כדי לקבוע יעילות טיפולית ולהבהיר מנגנונים בסיסיים. המטרה הסופית הייתה להעמיק את ההבנה שלנו לגבי תגובות החיסון על פני העיניים ולגלות אסטרטגיות טיפול פוטנציאליות לניהול DED בבני אדם.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל הפרוצדורות הניסיוניות שכללו בעלי חיים בוצעו בהתאם להצהרת ARVO לשימוש בבעלי חיים במחקר עיניים וראייה, ואושרו על ידי ועדת האתיקה לבעלי חיים ניסיוניים של בית החולים השני של ג'ינאן. נעשו כל המאמצים למזער סבל בעלי חיים ולהפחית את מספר בעלי החיים בשימוש בהתאם לעקרון 3Rs (החלפה, הפחתה וזיקוק).

1. הכנת בעלי חיים ועיצוב ניסוי

  1. קבלו עכברי C57BL/6 נקבות בגילאי 6-8 שבועות ממתקן בעלי חיים מאושר במעבדה (קוד זן: 027) עם מצב בריאותי ספציפי ללא פתוגנים.
  2. חיות בית בסביבה מבוקרת, שומרות על מחזורי אור-חושך של 12 שעות (אורות ב-06:00-18:00), טמפרטורה של 22 ± 2 מעלות צלזיוס, ולחות יחסית של 50-60% באמצעות מערכות ניטור סביבתיות.
  3. אפשרו לבעלי חיים להסתגל לטמפרטורה למשך שבוע לפני ההליכים הניסיוניים, תוך מתן אוכל מעבדה סטנדרטי ומים לפי רצונם.
  4. חלוקו 32 עכברים לארבע קבוצות ניסוי (n = 8 לכל קבוצה) באמצעות אקראיות ממוחשבת: בקרות ללא לחץ (NS), ייבוש לחץ בלבד (DS), לחץ ייבוש באמצעות בקרת רכב (DS + VC), ולחץ ייבוש עם טיפול בתאי T CD8+CD103+ (DS + CD8+CD103+).
    הערה: עקבו מדי יום אחרי בעלי חיים לסימני מצוקה, כמו ירידה בפעילות או ירידה במשקל העולה על 10%.

2. השלכת השראת מתח בייבוש

  1. הכינו תמיסת סקופולמין הידרוברומיד על ידי המסה של 0.5 מ"ג ב-0.2 מ"ל של מלח סטרילי עם בופר פוספט (PBS) מיד לפני השימוש, ולהשיג ריכוז סופי של 2.5 מ"ג/מ"ל.
  2. ניתן להזריק סקופולמין תת-עורית במינון של 0.5 מ"ג/ק"ג למשקל גוף (כ-0.04 מ"ל ל-20 גרם עכבר) ארבע פעמים ביום בשעות 8:00, 12:00, 15:00 ו-18:00 במשך חמישה ימים רצופים באמצעות מחטים של 27-G.
  3. מיקום מאווררים במהירות משתנה ליצירת משבצת אוויר רציפה במהירות סטנדרטית של 15 מ"ש בגובה כלוב באמצעות כיול אנמומטר דיגיטלי.
  4. שמרו על לחות סביבתית מתחת ל-40% באמצעות תאי ייבוש המכילים ג'ל סיליקה פעיל (רשת דרגה 40, 6-12) תוך ניטור רציף של תנאי הסביבה באמצעות מד לחות דיגיטלי (דיוק ±2% RH).
  5. שמרו על טמפרטורה של 22 ± 1 מעלות צלזיוס לאורך כל תקופת החשיפה באמצעות מערכות בקרה סביבתיות מדויקות עם ניטור רציף.
  6. פקחו על בעלי חיים פעמיים ביום לסימנים של התייבשות, ירידה במשקל (>15% מצדיקים החריגה), או התנהגויות מצוקה, כולל טיפוח מופרז או פעילות מופחתת.

3. CD8+CD103+ בידוד וטיהור תאי T

  1. הקריבו עכברים תורמים שנחשפו בעבר ללחץ ייבוש באמצעות חנק CO₂, ואחריו פריקת צוואר הרחם, בהתאם לפרוטוקולי המתת חסד מאושרים.
  2. קציר טחולים ובלוטות לימפה צוואריות שטחיות בתנאים סטריליים באמצעות כלים סטריליים בארון בטיחות ביולוגי, תוך הנחת רקמות במדיום RPMI-1640 קר קפוא בתוספת 10% סרום בקר עוברי.
  3. הכנת תליות חד-תאיות על ידי שיבוש מכני של רקמות באמצעות מסננות תאים בקוטר 70 מיקרון באמצעות מזרקים סטריליים, שטיפת תאים פעמיים עם PBS המכילים 2% FBS ו-1 mM אתילנדיאמינטרטראאצטית (EDTA).
  4. בודדו תאי CD8+ T באמצעות מיון תאים מופעלים על ידי מגנטיות עם מיקרו-חרוזי מגנטיים מצומדים בנוגדנים אנטי-CD8 בהתאם להוראות היצרן.
  5. הערכת כחיות התאים באמצעות בדיקת החרגה של טרייפן בלו (תמיסה של 0.4%), ספירת תאים ברי קיימא ולא חיוניים באמצעות מונה תאים אוטומטי, תוך המשך רק עם תכשירים העולים על 95% כדאיות.
  6. העשרה לביטוי CD103+ באמצעות דגירה רציפה עם נוגדן אנטי-CD103-APC בדילול של 1:100 למשך 30 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס בחושך.
  7. לבצע הפרדה מגנטית משנית באמצעות מיקרו-חרוזי אנטי-אלופיקוציאנין (אנטי-APC) עם עמודות LS כדי לקבל תאים כפולים CD8+CD103+ בהתאם לפרוטוקולי היצרן.
  8. אימות טוהר התאים באמצעות ציטומטריית זרימה על ידי צביעת אליקווטים בנוגדנים אנטי-CD8-FITC ואנטי-CD103-APC, תוך הבטחת אוכלוסייה של >90% CD8+CD103+ תאים כפולים חיוביים לפני ההמשך.

4. פרוטוקול העברה אימוץ

  1. הכינו תליות תאי T של CD8+CD103+ בריכוז של 5 × 106 תאים/מ"ל במי מלח סטריליים עם בופר פוספט על ידי צנטריפוגה של תאים ב-300 × גרם למשך 5 דקות והשעיה בנפח מתאים.
  2. הזרקו 1 ×-10 6 תאים ב-200 מיקרוליטר של PBS סטרילית תוך-פריטונית בימים -2, 0 ו-+2 יחסית להתחלת מאמץ יבש, תוך הבטחת ערבוב עדין לפני כל הזרקה.
  3. מתן כמויות שווות של PBS סטרילי לקבוצות ביקורת כלי רכב באמצעות לוח זמנים וטכניקה זהים להזרקה כדי לשמור על עקביות ניסיונית.
  4. לשמור על הכנת התאים על קרח והעברות מלאות תוך שעתיים מהבידוד כדי לשמור על חיוניות ותפקוד מיטביים.
  5. סובבו את אתרי ההזרקה בין הבטן התחתונה השמאלית לימנית כדי למזער דלקת מקומית ולעקוב אחרי בעלי החיים במשך 24 שעות לאחר ההזרקה לתגובות לוואי.

5. הליך הערכת פונקציונליות

  1. מדידת ייצור קרעים
    1. בצע מדידות באופן עקבי בשעה 20:00 כדי להתחשב בשינויים צירקדיים בייצור הדמעות.
    2. הרסן בעדינות את העכבר באמצעות מכשירי הגבלה מתאימים ללא הרדמה כדי למנוע הפרעה למנגנוני יצירת הדמעות הטבעיים.
    3. הניחו חוט כותנה ספוג פנול אדום בפורניקס התחתון של הלחמית למשך בדיוק 15 שניות באמצעות מלקחיים דקים.
    4. מדדו מיד את אורך ההברגה הרטובה באמצעות קליפרים דיגיטליים מדויקים (דיוק ± 0.01 מ"מ) בתנאי תאורה פלואורסצנטיים סטנדרטיים.
  2. הערכת תפקוד מחסום הקרנית26
    1. הרדימו את העכבר לזמן קצר עם שאיפת איזופלורן של 2% במהלך יישום המעקב כדי להבטיח החדרה מדויקת.
    2. הטמיעו 0.5 מיקרוליטר של 50 מ"ג/מ"ל תמיסת ירוק-דקסטרן של אורגון על פני הקרנית המרכזית באמצעות מיקרופיפטה מדויקת עם קצות הזזה חיובית.
    3. שטוף היטב את הקרניות עם תמיסת מלח סטרילית חמש פעמים לאחר דקת דגירה אחת כדי להסיר עודפי טריסר, ולהבטיח הסרה מלאה של פלואורסצנציה שטחית.
    4. צילם קרניות מיד באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנציה עם מסנן פלואורסציין איזותיוציאנאט (FITC) (עירור 490 ננומטר, פליטה 525 ננומטר) ופרמטרי חשיפה סטנדרטיים.
    5. כימות עוצמת הפלואורסצנציה באמצעות תוכנת ImageJ עם פרוטוקולי בחירה וחיסור עקביים לאזור העניין.
      1. המרו תמונות לגווני אפור של 8 ביט, הגדירו אזור עניין מעגלי סטנדרטי (ROI) המכסה את הקוטר המרכזי של הקרנית בגודל 3 מ"מ.
      2. למדוד ערך אפור ממוצע, להחסר פלואורסצנציה רקע שנמדדה מאזור שאינו קרנית סמוך, ולהביע תוצאות כפלואורסצנציה כוללת מתוקנת (CTF) המחושבת כך: CTF = צפיפות משולבת - (שטח תשואה × פלואורסצנציה רקע ממוצעת)22.

6. עיבוד וניתוח היסטולוגי

  1. הסר את העיניים והמבנים הסובבים מיד לאחר המתת החסד, מקבע ב-4% פאראפורמלדהיד למשך 24 שעות או הטמע בתרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT) לחתכים קפואים, כדי להבטיח כיוון נכון לחתך סגיטל.
  2. הכינו חתכים סגיטליים סדרתיים (6 מיקרון לקפוא, 5 מיקרון לפרפין) באמצעות סימני אנטומיה סטנדרטיים (עצב הראייה כנקודת ייחוס) למישורי חתך עקביים בכל הדגימות.
  3. לבצע צביעת חומצה-שיף תקופתית (PAS) לכימות תאי גביע באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים עם בקרות חיוביות ושליליות מתאימות.
  4. בצע צביעת אימונופלואורסצנציה באמצעות נוגדנים ראשוניים: אנטי-MMP-3 (1:200), אנטי-MMP-9 (1:100), אנטי-קספאז-3 נגד הפעלה (1:300), אנטי-קספאז-8 (1:200), ואנטי-CD4 (1:100) עם דגירה לילית בטמפרטורה של 4°C.
  5. כמת תאי הגביע לכל מילימטר באורך הלחמית באמצעות שיטות דגימה שיטתיות, ספירת תאים בחמישה שדות חזקים לא חופפים לכל חתך וממוצע התוצאות.

7. ניתוח מולקולרי

  1. חילוץ RNA כולל מרקמות לחמית וקרנית מאוגדות באמצעות פרוטוקולי חילוץ מאומתים27.
  2. סינתזת cDNA ו-PCR בזמן אמת כמותי28
    1. הכינו תערובות תגובת שעתוק הפוך המכילות 1 מיקרוגרם RNA כולל, פריימרים אוליגו-dT (50 מיקרומון), פריימרים אקראיים של הקסאמר (100 מיקרומון), אנזים טרנסקריפטאז הפוך, בופר תגובה ומים נטולי נוקליאז בנפח סופי של 20 מיקרו-ליטר.
    2. דגרו תערובות תגובה במחזור תרמי בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות כדי לאפשר סינתזת cDNA בגדיל הראשון.
    3. נטל את האנזים ההפוך-טרנסקריפטאז על ידי חימום ב-85 מעלות צלזיוס למשך 5 שניות, ואז מקרר ל-4 מעלות צלזיוס ואחסן את ה-cDNA ב-20 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
    4. דילל סינתז cDNA 1:10 עם מים ללא נוקלאז לשימוש כתבנית בתגובות PCR מאוחרות יותר.
    5. הכינו תערובות תגובה PCR בזמן אמת (נפח סופי של 20 מיקרוליטר) המכילות 1 מיקרוליטר תבנית cDNA מדוללת, פריימרים קדמיים ואחוריים (ריכוז סופי של 0.2 מיקרומולר כל אחד), תערובת מאסטר SYBR Green ומים ללא נוקלאז.
    6. דגימות טעינה משולשות לפלטות תגובה אופטיות של 96 בארים, כולל בקרות ללא תבנית לכל זוג פריימר.
    7. תכנת את המחזור התרמי בתנאים הבאים: דנאטורציה ראשונית ב-95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, ואחריה 40 מחזורי דהנאטורציה (95 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות), אנילינג (60 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות), והארכה (72 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות).
    8. יש לכלול שלב עקומת דיסוציאציה מיד לאחר ההגברה: 95 °C למשך 15 שניות, 60 °C למשך דקה אחת, ואז העלאה הדרגתית של הטמפרטורה ל-95 °C בקצב של 0.3 °C לשנייה כדי לאמת הגברה של מוצר יחיד.
    9. ניתחו עקומות הגברה וערכי סף מחזור (Ct) באמצעות תוכנת מכשירים, תוך הבטחת יעילות הגברה בין 90-110% לכל זוגות הפריימר.
    10. נרמול ביטוי גן המטרה (IL-17A, IFN-γ, IL-13, MMP-3 ו-MMP-9) לגן הניקיון GAPDH באמצעות שיטת 2-ΔΔCt .
    11. השתמש ברצפי פריימר כפי שמפורט בטבלה 1 עבור כל הגנים המטרה והייחוסים.
  3. כמת את רמות חלבון הציטוקינים בתמציות רקמות באמצעות ערכות ELISA מסחריות עם עקומות סטנדרטיות ובקרות איכות מתאימות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

היישום המוצלח של פרוטוקול זה מניב שיפור מקיף של פתולוגיית פני השטח העיניים הנגרמת על ידי מתחים מיובשים, באמצעות CD8+CD103+ אימונומודולציה בתאי T. תוצאות חיוביות מראות שיקום משמעותי בייצור הדמעות, בדרך כלל משיג התאוששות של 60-80% בהשוואה לבקרות ללא לחץ, בעוד שבעלי חיים שטופלו ברכב מציגים ליקויים מתמשכים בקרימציה (איור 1A).

טיפול מוצלח שומר על אוכלוסיות תאי גביע הלחמי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מחקר זה קובע כי תאי T רגולטוריים של CD8+CD103+ הם חומרים טיפוליים רבי עוצמה המייבשים מחלת יובש בעיניים הנגרמות מלחץ באמצעות מודולציה מקיפה של תגובות פתוגניות בתאי CD4+ T בתגובה. הממצאים מגלים כי העברה אימוץ של תאי T מסוג CD8+CD103+ משיגה הגנה רב-ממדית על שלמות פני העין, הכוללת שיקום תפקודי של ייצור דמעות, שימור ארכיטקטורת הרירית, שמירה על תפקוד מחסום האפיתל ודיכוי נזק לרקמות דלקתיות.

מחקר זה מראה כי Tregs של CD8+CD103+ ממלאים תפקיד מדכא בפתוגנזה הנגרמת על ידי ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים מתחרים, כלכליים או אחרים, שיכולים להשפיע באופן בלתי הולם על העבודה המתוארת בכתב היד.

תודות

אנו מודים לתמיכה הטכנית שניתנה על ידי צוות המעבדה בבית החולים העממי השני של ג'ינאן וצוות מתקן הטיפול בבעלי חיים ששמרו על תנאי מגורים מיטביים לאורך תקופת הניסוי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
נוגדן אנטי-CD103-APCביולג'נדשיבוט 2E7ציטומטריית זרימה ומיון תאים
מיקרו-חרוזים מגנטיים נגד CD8מילטני ביוטק-הפרדת תאים מגנטיים
קרניאל, אורגון ירוק-דקסטרןInvitrogenD7172משקל מולקולרי 70,000
ערכת ELISA IFN-& גמא;מדעי הביולוגיה האלקטרונייםBMS606כימות ציטוקינים
ערכת ELISA IL-13מדעי הביולוגיה האלקטרונייםBMS6015כימות ציטוקינים
ערכת ELISA IL-17Aמדעי הביולוגיה האלקטרונייםBMS6001כימות ציטוקינים
ImageJהמכונים הלאומיים לבריאותגרסה 1.53K
חוטי כותנה אדומים בצבע פנולZone-Quick, יוקוטה-מדידת ייצור קרעים
סקופולמין הידרוברומידמלונפארמהMB5860האנטגוניסט המוסקריני

מקורות

  1. Tang, Q., et al. Selective decrease of donor-reactive T(regs) after liver transplantation limits T(reg) therapy for promoting allograft tolerance in humans. Sci Transl Med. 14 (669), eabo2628(2022).
  2. Harrell, C. R., Feulner, L., Djonov, V., Pavlovic, D., Volarevic, V. The molecular mechanisms responsible for tear hyperosmolarity-induced pathological changes in the eyes of dry eye disease patients. Cells. 12 (23), 2755(2023).
  3. Britten-Jones, A. C., et al. Epidemiology and risk factors of dry eye disease: considerations for clinical management. Medicina (Kaunas). 60 (9), 1458(2024).
  4. Bhujbal, S., Rupenthal, I. D., Steven, P., Agarwal, P. Inflammation in dry eye disease-pathogenesis, preclinical animal models, and treatments. J Ocul Pharmacol Ther. 40 (10), 638-658 (2024).
  5. Nieto-Aristizabal, I., Mera, J. J., Giraldo, J. D., Lopez-Arevalo, H., Tobon, G. J. From ocular immune privilege to primary autoimmune diseases of the eye. Autoimmun Rev. 21 (8), 103122(2022).
  6. Sheppard, J., Shen Lee, B., Periman, L. M. Dry eye disease: identification and therapeutic strategies for primary care clinicians and clinical specialists. Ann Med. 55 (1), 241-252 (2023).
  7. Rolando, M., Merayo-Lloves, J. Management strategies for evaporative dry eye disease and future perspective. Curr Eye Res. 47 (6), 813-823 (2022).
  8. Vereertbrugghen, A., et al. CD4+ T cells drive corneal nerve damage but not epitheliopathy in an acute aqueous-deficient dry eye model. Proc Natl Acad Sci U S A. 121 (48), e2407648121(2024).
  9. Yaman, E., et al. Mouse corneal immune cell heterogeneity revealed by single-cell RNA sequencing. Invest Ophthalmol Vis Sci. 65 (12), 29(2024).
  10. Niederkorn, J. Y., et al. Desiccating stress induces T cell-mediated Sjogren's syndrome-like lacrimal keratoconjunctivitis. J Immunol. 176 (7), 3950-3957 (2006).
  11. Ogawa, Y., Takeuchi, T., Tsubota, K. Autoimmune epithelitis and chronic inflammation in Sjogren's syndrome-related dry eye disease. Int J Mol Sci. 22 (21), 11820(2021).
  12. Flippe, L., Bezie, S., Anegon, I., Guillonneau, C. Future prospects for CD8+ regulatory T cells in immune tolerance. Immunol Rev. 292 (1), 209-224 (2019).
  13. Olson, K. E., Mosley, R. L., Gendelman, H. E. The potential for Treg-enhancing therapies in nervous system pathologies. Clin Exp Immunol. 211 (2), 108-121 (2023).
  14. Boonpiyathad, T., Sozener, Z. C., Akdis, M., Akdis, C. A. The role of Treg cell subsets in allergic disease. Asian Pac J Allergy Immunol. 38 (3), 139-149 (2020).
  15. Xu, W., Bergsbaken, T., Edelblum, K. L. The multifunctional nature of CD103 (αEβ7 integrin) signaling in tissue-resident lymphocytes. Am J Physiol Cell Physiol. 323 (4), C1161-C1167 (2022).
  16. Zhang, X., et al. CD8+CD103+ iTregs inhibit chronic graft-versus-host disease with lupus nephritis by the increased expression of CD39. Mol Ther. 27 (11), 1963-1973 (2019).
  17. Liu, Y., et al. Phenotypic and functional characteristic of a newly identified CD8+ Foxp3- CD103+ regulatory T cells. J Mol Cell Biol. 6 (1), 81-92 (2014).
  18. Chen, Q., et al. CD8+ CD103+ iTregs protect against ischemia-reperfusion-induced acute kidney injury by inhibiting pyroptosis. Apoptosis. 29 (9-10), 1709-1722 (2024).
  19. Kaneko, N., et al. Cytotoxic CD8+ T cells may be drivers of tissue destruction in Sjogren's syndrome. Sci Rep. 12 (1), 15427(2022).
  20. Kudryavtsev, I., et al. Circulating CD8+ T cell subsets in primary Sjogren's syndrome. Biomedicines. 11 (10), 2778(2023).
  21. Heidari, M., Noorizadeh, F., Wu, K., Inomata, T., Mashaghi, A. Dry eye disease: emerging approaches to disease analysis and therapy. J Clin Med. 8 (9), 1439(2019).
  22. Ibiayo, A. G., Varinthra, P., Nagarajan, M., Liu, I. Y. Coniferaldehyde reverses 3-nitropropionic acid-induced Huntington's disease pathologies via PKM2 restoration and JAK2/STAT3 inhibition. Mol Med. 31 (1), 271(2025).
  23. Loi, J. K., et al. Corneal tissue-resident memory T cells form a unique immune compartment at the ocular surface. Cell Rep. 39 (8), 110852(2022).
  24. Kennedy-Batalla, R., et al. Treg in inborn errors of immunity: gaps, knowns and future perspectives. Front Immunol. 14, 1278759(2023).
  25. Suffia, I., Reckling, S. K., Salay, G., Belkaid, Y. A role for CD103 in the retention of CD4+CD25+ Treg and control of Leishmania major infection. J Immunol. 174 (9), 5444-5455 (2005).
  26. De Paiva, C. S., et al. IL-17 disrupts corneal barrier following desiccating stress. Mucosal Immunol. 2 (3), 243-253 (2009).
  27. Rio, D. C., Ares, M. Jr, Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Purification of RNA using TRIzol (TRI reagent). Cold Spring Harb Protoc. 2010 (6), (2010).
  28. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(−ΔΔC(T)) method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  29. Zareh, H., et al. Doxycycline versus curcumin for inhibition of matrix metalloproteinase expression and activity following chemically induced inflammation in corneal cells. J Ophthalmic Vis Res. 19 (3), 273-283 (2024).
  30. Yang, X., et al. IFN-gamma facilitates corneal epithelial cell pyroptosis through the JAK2/STAT1 pathway in dry eye. Invest Ophthalmol Vis Sci. 64 (3), 34(2023).
  31. Lollett, I. V., Galor, A. Dry eye syndrome: developments and lifitegrast in perspective. Clin Ophthalmol. 2018, 125-139 (2018).
  32. Zhang, X., et al. CD8+ cells regulate the T helper-17 response in an experimental murine model of Sjogren syndrome. Mucosal Immunol. 7 (2), 417-427 (2014).
  33. Zhou, H., Yang, J., Tian, J., Wang, S. CD8+ T lymphocytes: crucial players in Sjogren's syndrome. Front Immunol. 11, 602823(2020).
  34. Lu, Z., et al. Rapid and quantitative detection of tear MMP-9 for dry eye patients using a novel silicon nanowire-based biosensor. Biosens Bioelectron. 214, 114498(2022).
  35. Burgalassi, S., et al. Functionalized hyaluronic acid for "in situ" matrix metalloproteinase inhibition: a bioactive material to treat the dry eye syndrome. ACS Macro Lett. 11 (10), 1190-1194 (2022).
  36. Chen, X., et al. Tc17/IL-17A up-regulated the expression of MMP-9 via NF-kappaB pathway in nasal epithelial cells of patients with chronic rhinosinusitis. Front Immunol. 9, 2121(2018).
  37. Alam, J., et al. IL-17 producing lymphocytes cause dry eye and corneal disease with aging in RXRalpha mutant mouse. Front Med (Lausanne). 9, 849990(2022).
  38. Flores-Pliego, A., et al. Matrix metalloproteinase-3 (MMP-3) is an endogenous activator of the MMP-9 secreted by placental leukocytes: implication in human labor. PLoS One. 10 (12), e0145366(2015).
  39. You, Y., et al. Investigation of conjunctival goblet cell and tear MUC5AC protein in patients with Graves' ophthalmopathy. Transl Vis Sci Technol. 12 (10), 19(2023).
  40. Tukler Henriksson, J., Coursey, T. G., Corry, D. B., De Paiva, C. S., Pflugfelder, S. C. IL-13 stimulates proliferation and expression of mucin and immunomodulatory genes in cultured conjunctival goblet cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (8), 4186-4197 (2015).
  41. Fang, Z., et al. Clinical ocular surface characteristics and expression of MUC5AC in diabetics: a population-based study. Eye (Lond). 38 (16), 3145-3152 (2024).
  42. Garcia-Posadas, L., et al. Interaction of IFN-gamma with cholinergic agonists to modulate rat and human goblet cell function. Mucosal Immunol. 9 (1), 206-217 (2016).
  43. Volpe, E. A., et al. Interferon-gamma deficiency protects against aging-related goblet cell loss. Oncotarget. 7 (40), 64605-64614 (2016).
  44. Gustafsson, J. K., Hansson, G. C. Immune regulation of goblet cell and mucus functions in health and disease. Annu Rev Immunol. 43 (1), 169-189 (2025).
  45. Lin, N., et al. Ectoine enhances mucin production via restoring IL-13/IFN-gamma balance in a murine dry eye model. Invest Ophthalmol Vis Sci. 65 (6), 39(2024).
  46. Ogawa, Y., Shimizu, E., Tsubota, K. Interferons and dry eye in Sjogren's syndrome. Int J Mol Sci. 19 (11), 3548(2018).
  47. Zhang, X., et al. Interferon-gamma exacerbates dry eye-induced apoptosis in conjunctiva through dual apoptotic pathways. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (9), 6279-6285 (2011).
  48. Hassan, M., Elzallat, M., Mohammed, D. M., Balata, M., El-Maadawy, W. H. Exploiting regulatory T cells (Tregs): cutting-edge therapy for autoimmune diseases. Int Immunopharmacol. 155, 114624(2025).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

TT CD4
הסרטון יגיע בקרוב
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.