מאמר שיטה

מודל אורגנואיד תלת-ממדי של גידול שמקורו במטופל לסקר תאי T של קולטני אנטיגן כימרי במבחנה

545 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/69113

⸱

30 בדצמבר 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Oncology, Shenzhen Qianhai Shekou Free Trade Zone Hospital, 2Department of Pharmacology, Joint Laboratory of Guangdong-Hong Kong Universities for Vascular Homeostasis and Diseases, School of Medicine, Southern University of Science and Technology, 3Department of Digestive Disease, Shenzhen Qianhai Shekou Free Trade Zone Hospital, 4Department of Human Cell Biology and Genetics, School of Medicine, Southern University of Science and Technology, 5Department of Surgical Endoscopy, Shenzhen People's Hospital (The First Affiliated Hospital, Southern University of Science and Technology; The Second Clinical Medical College, Jinan University), 6Department of Medicine and Therapeutics, Faculty of Medicine, The Chinese University of Hong Kong, 7Institute of Digestive Disease, State Key Laboratory of Digestive Disease, Faculty of Medicine, The Chinese University of Hong Kong

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה קובע מודל קו-קולטורציה במבחנה המשתמש באורגנואידים שמקורם במטופל ותאי קולטני אנטיגן כימריים T (CAR-T) כדי להעריך את הפעילות הציטוטוקסית הספציפית של תאי CAR-T מול תאי גידול מוצקים.

תקציר

טיפול תאי T (CAR-T) בקולטן אנטיגן כימרי השיג יעילות קלינית מרשימה במלמאירויות המטולוגיות, אך טיפול בתאי CAR-T לגידולים מוצקים עדיין דורש פיתוח נוסף. אורגנואידים גידולים שמקורם במטופלים הם מודלים של מחלות במבחנה ששומרים על הטרוגניות של המטופל ושימשו לבדיקת יעילות ובטיחות של כימותרפיה ותרופות ממוקדות. שיטה זו מתארת מודל בדיקת יעילות חוץ-גופית של שילוב אורגנואידים של גידול עם תאי CAR-T. דגימות סרטן המעי הגס ממטופלים נבנות לאורגנואידים של גידול עם מבנה תלת-ממדי (תלת-ממדי) במטריצת ממברנה בסיסית. האורגנואידים של הגידול יכולים לגדול באופן יציב ולהיות מועברים באופן רציף. אורגנואידים של גידול בוגרים מופרדים מהמטריצה באמצעות שטיפה וצנטריפוגה, ותאי CAR-T מתווספים ביחס אפקטור למטרה (E:T) שונים ליצירת מערכת קו-תרבות חיסונית-אורגנואידית. לאחר 6-24 שעות, המורפולוגיה והמבנים הבין-תאיים של האורגנואידים נצפים באמצעות הדמיית שדה בהיר. ניסוי זה מבצע גם צביעת תאים מתים במערכת הקולטורציה, מה שיכול לשקף את כדאיות האורגנואידים ולהעריך את ההשפעה הציטוטוקסית של תאי CAR-T על אורגנואידי הגידול. ניסוי זה יכול לצפות ביעילות באינטראקציה בין תאי CAR-T לאורגנואידים תלת-ממדיים של גידול, והתוצאות יכולות לשמש להערכת פעילות ההרג של תאי CAR-T.

מבוא

טיפול בתאי קולטן אנטיגן כימרי T (CAR-T) הראה הצלחה קלינית מרשימה בטיפול בממאירויות המטולוגיות1. עם זאת, היישום שלו בגידולים מוצקים נותר מוגבל בשל מספר מכשולים מרכזיים, כולל הטרוגניות גידול ואובדן אנטיגן, מחסומים פיזיים וכימיים בתוך מסת הגידול, ומיקרוסביבה מדכאת חיסון 2,3. אתגרים אלו תורמים ליעילות מוגבלת של טיפול בתאי CAR-T בסביבות גידול מוצק.

הערכת יעילות תאי CAR-T במבחנה היא שלב קריטי במהלך ההתפתחות הפרה-קלינית. המודלים הנפוצים ביותר הם קווי תאי גידול, שיכולים לבטא אנטיגנים ספציפיים הקשורים לגידול או להיות מהונדסים לשאת גנים מדווחים כמו לוסיפראז 4,5. כתוצאה מכך, תוצאות מבדיקות מבוססות קווי תאים קונבנציונליים לעיתים קרובות אינן מנבאות תוצאות קליניות. מודלים של גידולים שמקורם במטופלים מציעים אלטרנטיבה מבטיחה להערכת תפקוד CAR-T בצורה מדויקת יותר בהקשר של גידולים מוצקים.

בעוד שמספר מחקרים החלו להשתמש ב-PDTOs להערכת תאי CAR-T, עדיין קיימים אתגרים בהקמת פרוטוקולים סטנדרטיים, חזקים ונגישים לגידולים מאזנים ביעילות בין שימור ארכיטקטורת הגידול התלת-ממדית לבין אינטראקציה יעילה בין תאי חיסון לתא גידול. אורגנואידים של גידול שמקורם במטופל (PDTOs) הם מודלים תלת-ממדיים (תלת-ממדיים) של מחלות אקס-ביבו שנוצרו מרקמות או תאי גידול של המטופל. PDTO הוקמו בהצלחה עבור מגוון רחב של סוגי גידולים, כולל סרטן המעי הגס, השד, הלבלב והריאות. מבנים אלו שומרים על הארכיטקטורה ההיסטולוגית, הפרופילים המולקולריים וההטרוגניות התפקודית של הגידולהמקורי 6. לצד תאי הגידול הראשוניים והזנוגרפטים שמקורם במטופל (PDX), PDTOs מהווים פלטפורמה חשובה למידול תכונות מחלה ספציפיות למטופל7. בהשוואה לקווי תאי גידול קונבנציונליים או תרביות ראשוניות, PDTOs משחזרים בצורה קרובה יותר את סביבת הגידול בתוך החיים, ומציגים הרכבים תאיים מורכבים וארגון מבני8. הם גם שומרים על יציבות גנומית ושומרים על דפוסי ביטוי גנים לאורך מעברים ממושכים, מה שמאפשר הערכה מדויקת יותר של תגובות טיפוליות 9,10. PDTOs שימשו בהצלחה במחקרים של ביולוגיית גידולים, סקר תרופות ורפואה מדויקת, ומוכרים יותר ויותר בזכות יעילותם בבדיקות אימונותרפיה, כולל זיהוי מטרות CAR חדשות, אופטימיזציה של עיצוב CAR והערכת ציטוטוקסיות 6,11,12,13 . מגבלה נפוצה של תרבית אורגנואידים היא תלותה ברכיבי מטריצה חוץ-תאית (ECM) כמו Matrigel (להלן מכונה מטריצת ממברנה בסיסית [BMM]) לשימור מבנה תלת-ממדי, מה שעלול להפריע לחדירת תאי מערכת החיסון בבדיקות קו-קולטורציה. כדי להבטיח עקביות ואינטראקציה מיטבית בין תאים בקולטורה, בדרך כלל נבחרים אורגנואידים בטווח גודל מוגדר (למשל, 100-200 מיקרון בקוטר).

פרוטוקול זה מתאר פלטפורמת קו-קולטורה להערכת ציטוטוקסיות של תאי CAR-T באמצעות PDTOs שמקורם בסרטן המעי הגס. דגימות גידול של מטופלים מנותקות אנזימטית ומתרבותות ב-BMM ליצירת אורגנידים תלת-ממדיים. לאחר הבשלה והתרחבות, אורגנואידים בגודל אחיד מבודדים ומתויגים בפלואורסצנטית. הם נזרעים בלוחות רב-בארים ומעובדים יחד עם תאי CAR-T ביחס אפקטור למטרה (E:T) משתנים. מאפיין מרכזי בגישה זו הוא הסרה מכוונת של PDTOs מ-BMM לפני הקולטורטורה, מה שמאפשר גישה ישירה וללא הפרעה לתאי CAR-T לאורגנואידים של הגידול תוך שמירה על שלמותם התלת-ממדית בתלוי. לאחר 24 שעות, מיקרוסקופיה בשדה בהיר חושפת התפרקות מתקדמת של PDTO, המאופיין בהפרעה במורפולוגיה תלת-ממדית, התכווצות תאי הגידול ואובדן חיוניות. הדמיית תאים חיים ומיקרוסקופיה פלואורסצנצית מדגימות עוד יותר אינטראקציות בין תאי CAR-T מסומנים פלואורסצנטית לבין מטרות גידול. בדיקות מוות כמותיות של תאים משמשות להערכת ציטוטוקסיות. קו-קולטורה חיסונית מבוססת אורגנואידים זו מספקת פלטפורמה חזקה וספציפית למטופל להערכת היעילות האנטי-גידולית של תאי CAR-T מחוץ לחיים, ומאפשרת אופטימיזציה טיפולית ותמיכה בתרגום קליני.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

נעשה שימוש באורגנואידים שמקורם בחולי סרטן המעי הגס. קטעי רקמת הגידול התקבלו ממטופלים תמימים לטיפול עם אדנוקרצינומה ראשונית של המעי הגס (CRC) שאובחנה היסטולוגית. כל הרקמות נאספו מדגימות ביופסיה אנדוסקופיות שנאספו במהלך פרוצדורות אבחון סטנדרטיות בבית החולים צ'יאנחאי שקו באזור הסחר החופשי של שנזן. כל רקמות התורם אושרו כ-CRC באמצעות בדיקה היסטופתולוגית על ידי פתולוגים מוסדיים. הפרוטוקול פועל לפי הנחיות מוסדיות. התקבלו הסכמות בכתב מדעת מכל המטופלים. המחקר אושר על ידי ועדת האתיקה של בית החולים צ'יאנחאי שקו באזור הסחר החופשי של שנזן (2024KY-009-01K).

1. תרבות PDTO

  1. הכנת רקמות
    1. הניחו קטעי רקמת גידול שהתקבלו באמצעות ביופסיית קולונוסקופיה ממטופלים עם אדנוקרצינומה ראשונית של המעי הגס (CRC) שאושר היסטולוגית בתוך צינור סטרילי בגודל 50 מ"ל.
    2. הוסף 30 מ"ל של תמיסת שטיפת רקמות קרה המורכבת מתמיסת מלח מאוזנת של הנקס (HBSS), אלבומין סרום בקר 1% (BSA), 100 U/mL פניצילין, 0.1 מ"ג/מ"ל סטרפטומיצין, 50 מיקרוגרם/מ"ל גנטמיצין, 5 מיקרוגרם/מ"ל אמפוטריצין B, ו-10 מיקרומול מעכב קינאז קשור Rho (Y-27632).
    3. הנח את הצינור על קרח ונענע בעדינות במשך 5 דקות כדי לשטוף את הרקמה.
    4. חזור על שלב 1.1.3. פעמיים נוספות עם תמיסת שטיפת טישו חדשה.
  2. עיכול רקמות
    1. גזום רקמת נקרוטית או שומנית וחתוך את הגידול לחתיכות רקמה.
    2. 8 מ"ל חום של מדיום עיכול (מדיום DMEM, 500 U/mL קולגנאז IV, 1.5 מ"ג/מ"ל קולגנאז II, 20 מיקרוגרם/מ"ל היאלורונידאז, 0.1 מ"ג/מ"ל דיספאז סוג II, 10 מיקרומום Y-27632, ו-1% סרום בקר עוברי) עד 37 מעלות צלזיוס.
    3. העבר שברים לבופר העיכול ודגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באמבט מים. סובב את הצינור בעדינות ביד למשך ~10 שניות כל 5 דקות כדי להקל על חדירת האנזים.
      הערה: התאימו את נפח בופר העיכול בהתאם לגודל בלוק הרקמה. בדרך כלל, 8-10 מ"ל מספיקים לגודל ביופסיה אנדוסקופית.
    4. התבונן תחת מיקרוסקופ לאחר 15 דקות כדי לבדוק את מצב הדיסוציאציה. אם נשארו שברי רקמה, יש להמשיך לעיכול עד 30 דקות מקסימום.
    5. כאשר אשכולות נראים לעין, יש פיפטה בעדינות (5-10 פעמים) באמצעות פיפטה של 10 מ"ל כדי להתנתק מכנית. צנטריפוגה ב-350 × גרם למשך 5 דקות.
    6. להשליך סופרנטנט; החזירו את הכדור ל-10 מ"ל של תמיסת שטיפה וצנטריפוגה ב-350 × גרם למשך 5 דקות. חזור על השטיפה פעמיים.
      הערה: PDTOs בדרך כלל התחילו ליצור מבנים כדוריים דחוסים בתוך 3-5 ימים מהגידול. אורגנואידים הפגינו התרבות עמידה והגיעו לגודל מתאים לניסויים (כ-100-200 מיקרון בקוטר) ביום 10-14. מעבר בוצעה כל 7-10 ימים לשמירה על גדילה בריאה ולמנוע מפגש יתר או נמק מרכזי. בדרך כלל, משתמשים בבופר עיכול של 8-10 מ"ל לכל ביופסיה (קטעים של 2 מ"ק), מה שמבטיח ריכוז עבודה סופי של TrypLE Express ב-1× מ"ק.

2. בניית PDTO

  1. הטמעת מטריצה
    1. הניחו 200 מיקרוליטר BMM (מקורר מראש בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס) בצינור נקי והפיפטה של כדור התא למעלה ולמטה לפחות 10-15 פעמים באמצעות קצה פיפטה מקורר מראש עד שהמתלה נראה הומוגני, ללא גושים נראים לעין.
    2. הזרקו טיפות של כ-30 מיקרוליטר לכל באר בלוח עם 24 בארות. דגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות כדי להתקשות.
    3. הוסף 500 מיקרוליטר מדיום תרבית אורגנואיד (מדיום מתקדם DMEM/F12, המכיל 50 מיקרוגרם/מ"ל R-ספונדין 1, 10 מיקרוגרם/מ"ל נוגין, 500 מיקרוגרם/מ"ל EGF, 100x HEPES, 100x גלוטמקס, 500x נורמוצין, 500x גנטמיצין/אמפוטריצין B, 50x N2, 100x B27, 500 מ"מ n-אצטילציסטאין, 1 M ניאצינמיד, מעכב 5 מ"מ אלק 4/5/7, מעכב 30 מ' p38, 100 מיקרומום גסטרין, ו-100 מיקרומום פרוסטגלנדין E2) לכל באר.
      הערה: יש להשתמש בכ-30 מיקרוליטר BMM לכל טיפה; התאימו לפי צפיפות התאים.
  2. תחזוקת תרבות
    1. גידול אורגנידים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5%CO2; שנה את המדיום כל 3 ימים.
    2. עוקב אחרי היווצרות אורגנואידים מדי יום. צפו לספירואידים קטנים עד היום השלישי.
    3. העריכו הצלחת להתבסס אורגנואידים בימים 6-10. זמן היווצרות (נע בין 3 ל-14 ימים) תלוי בחיוניות הרקמה ובגבעול שלה.

3. PDTO במעבר

  1. פירוק
    1. קרר את הצנטריפוגה מראש ל-4°C. הסר את המדיום והוסיף 1 מ"ל HBSS קר וקרח ופיפטה בעדינות 3-5 פעמים כדי להפריע ל-BMM.
      הערה: אורגנואידים שגדלו היטב נראים כנקודות לבנות קטנות בעין בלתי.
    2. העבר את המתלה לצינור סטרילי של 15 מ"ל וצנטריפוגה ב-350 × גרם למשך 5 דקות.
  2. דיסוציאציה של אנזימים
    1. זרוק את הסופרנטנט והוסיף 1 מ"ל של TrypLE. שים באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות.
    2. הוסף 2 מ"ל HBSS לנטרול TrypLE; צנטריפוגה ב-350 × גרם למשך 5 דקות.
    3. הסר את הסופרנטנט ותשהה מחדש ב-2 מ"ל HBSS. צנטריפוגה שוב ב-350 × גרם למשך 5 דקות.
  3. הטמעה מחדש
    1. הוסף BMM טרי לכדור ביחס של 1:3-1:6 (כדור אורגנואיד: BMM, v/v); תשעה בעדינות. כל טיפה מכילה כ-30 מיקרו-ליטר בנפח סופי. הנח טיפות בלוח חדש עם 24 בארים; דגרו ב-37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
    2. הוסף 500 מיקרוליטר מדיום תרבית לכל באר ודגר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5%CO2.
    3. בדיקת בארות מדי יום; צפה בהרכבה תלת-ממדית מחדש בתוך כ-48 שעות.
    4. לאחר 3-5 מעברים, בחרו אורגנואידים בריאים לבדיקות או שימור בהקפאה.

4. קו-קולטורה של תאי CAR-T ו-PDTOs

  1. הכנת מדיום קו-קולטורה
    1. הוסיפו מדיום תרבית אורגנואיד בסיסי עם 10 ng/L IL-2 ו-0.05 mM β-מרקפטואנול לתמיכה בחיוניות CAR-T.
      הערה: מדיום בסיסי תומך במבנה תלת-ממדי ובכדאיות של PDTOs.
  2. הכנה ל-PDTO
    1. הסר את טיפות ה-BMM המכילות PDTOs בוגרים (למשל, ימים 4-6) מפלטת התרבית באמצעות מגרד תאים סטרילי או קצה פיפטה.
    2. העבר את תערובת BMM/PDTO לצינור קוני של 15 מ"ל.
    3. הוסף 5-10 מ"ל של HBBS קר או תמיסת שטיפת טישו (כפי שמתואר בשלב 1.1.2) לצינור. הפוך בעדינות 5-10 פעמים כדי לשחרר אורגנואידים מ-BMM.
    4. תן לתערובת לעמוד על הקרח במשך 5 דקות. ה-BMM יהפוך לנוזלי, בעוד ש-PDTO מנותקים יישארו במצב תלוי.
    5. שאפו בזהירות את הסופרנטנט המכיל את ה-BMM, והשאירו את כדור ה-PDTO מאחור. הימנע מהפרעה לכדור.
    6. חזרו על שלבים 4.2.3 עד 4.2.5 פעמיים נוספות כדי להבטיח הסרה מלאה של BMM.
    7. לאחר השטיפה הסופית, יש לאסוף את הסופרנטנט והצנטריפוגה המכילים PDTO בטמפרטורה של 300 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
    8. שואף את הסופרנטנט והחזיר את כדור ה-PDTO ל-1-2 מ"ל של מדיום תרבית אורגנואידי או מדיום קו-קולטורציה.
    9. (אופציונלי לספירה) הכינו מתלה חד-תא.
      1. אם נדרש ספירה מדויקת, העבר את האורגנידים המוחזרים לצינור חדש ודגור עם TrypLE Express מחומם מראש ב-37 מעלות צלזיוס למשך 3-5 דקות, ולאחר מכן פיפטציה עדינה להשגת תלייה חד-תאית. המשיכו בספירת תאים (למשל, באמצעות המוציטומטר או מונה תאים אוטומטי).
        הערה: שלב זה מפרק את האורגנידים ומשמש רק לספירה לפני הצלחת מחדש.
    10. בחירת גודל וסטנדרטיזציה: כדי להבטיח גודל אחיד של אורגנואיד לתרבית משותפת, העבירו את ה-PDTOs המועברים (מהשלב 4.2.8) דרך מסננת תאים של 70 מיקרון המונחת על גבי צינור קוני של 50 מ"ל. שלב זה מסיר אגרגטים ופסולת אורגנואידית גדולה, המייצגים שבר בגודל סטנדרטי המתאים לקו-קולטורה אחידה.
    11. צנטריפוגה את המתלה האורגנואידי הסטנדרטי ב-300 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
    12. שאפו את הסופרנטנט והחזירו את ה-PDTO הסטנדרטיים בנפח מתאים של מדיום קו-קולטורה מחומם מראש.
    13. ספירת ה-PDTOs הסטנדרטיים (למשל, באמצעות המוסיטומטר תחת מיקרוסקופ, ספירת מספר האורגנידים בשדה).
      הערה: הספירה מבוססת על מספר אורגנואיד, לא על מספר התא.
    14. הזרעו את ה-PDTOs הסטנדרטיים לתוך לוח רב-באר רצוי (למשל, לוח U-תחתית עם 96 בארים) במספר היעד לכל באר.
    15. הוסף תאי CAR-T לבארות ביחס אפקטור למטרה (E:T) הרצויים.
  3. תיוג PDTOs
    1. קרר מראש את הצנטריפוגה ל-4 מעלות צלזיוס. שאפו את המדיום; הוסף 1 מ״ל HBSS כדי להוציא טיפות מהן.
    2. העבר לצינור צנטריפוגה בנפח 15 מ"ל, הוסיף 4 מ"ל HBSS, ופיפט בעדינות. צנטריפוגה ב-350 × גרם למשך 5 דקות.
    3. זרוק את הסופרנטנט, הוסף 5 מ"ל של HBSS, ופיפט בעדינות. צנטריפוגה שוב ב-350 × גרם למשך 5 דקות.
    4. הכינו פתרון עובד Hoechst 33342.
    5. השעה מחדש של כדור בתמיסת Hoechst 33342 בנפח 1 מ"ל (ריכוז סופי 5 מיקרוגרם/מ"ל). ערבבו בעדינות על ידי היפוך 3-5 פעמים כדי להבטיח חדירת צבע אחידה. הגן מפני אור על ידי עטיפת הצינור בנייר אלומיניום. דגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לאחר הצביעה, שטוף פעמיים עם HBSS כדי להסיר צבע עודף.
  4. PDTOs לציפוי
    1. הערכת צפיפות אורגנואידים ביחס טיפות ג'ל לבאר של 1:5; תלייה מחדש במדיום קו-קולטורה בכ-1 ×10 3 אורגנואידים למ"ל.
    2. הוסף 100 מיקרוליטר לכל באר לפלטה עם 96 בארות; כלול לפחות שלושה עותקים לכל תנאי.
      הערה: אין לבצע ספירת תאים בשלב זה; אורגנואידים נשארים שלמים.
  5. תרבות משותפת בין CAR-T
    הערה: פרוטוקול זה מתמקד בקו-קולטורציה והערכת יעילות של תאי CAR-T עם PDTOs. היצירה והאפיון של תאי CAR-T ששימשו במחקר זה מתוארים בסעיף 8.
    1. קציר תאי CAR-T בשלב הלוגריתם. צבע עם Trypan Blue לאישור עמידות >95%.
    2. תאי צנטריפוגה ב-350 × גרם למשך 5 דקות; השעיה מחדש במדיה של תרבות משותפת.
    3. כוון את הריכוזים ל-4 × 106/מ"ל, 2 × 106/מ"ל, ו-1 × 106/מ"ל.
    4. יש להוסיף 100 מיקרוליטר של מתלים CAR-T לכל באר בהתאם לעיצוב הניסוי. הוסף 100 מיקרוליטר של מדיום קו-קולטורה לבקרת בארות.
    5. דגירה של צלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5%CO2 למשך 6-24 שעות.

5. צביעת תאים מתים

  1. צביעת SYTOX ירוקה
    1. לכל 1 × 105 תאים, יש להכין 100 מיקרוליטר של תמיסת צביעת Nuclear Green על ידי דילול 1 מיקרוליטר SYTOX Green (1000x) ל-1 מ"ל של בופר בדיקה.
    2. בנקודות הזמן של 6 ו-24 שעות של קו-קולטורה, הוסף 100 מיקרוליטר של תמיסת צביעת SYTOX Green לכל באר. דגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות בחושך.

6. רכישת תמונה

  1. שואף את הסופרנטנט והוסיף 100 מיקרוליטר DMEM/F12.
  2. לכידת תמונות בשדה בהיר ופלואורסצנציה באמצעות מיקרוסקופ (למשל, קונפוקלי):
    Hoechst 33342 (PDTOs): עירור (Ex)/פליטה (Em) = 350 ננומטר/461 ננומטר
    mCherry (CAR-T): Ex/Em = 587 ננומטר/610 ננומטר
    SYTOX Green (תאים מתים): Ex/Em = 504 ננומטר/528 ננומטר
  3. לצלם לפחות שלוש תמונות בכל באר, תוך התמקדות בשדה המרכזי.

7. ניתוח נתונים

  1. Launch ImageJ (גרסה 1.54, NIH, https://imagej.nih.gov/ij/); ייבא תמונות SYTOX בערוץ ירוק. הגדר את הסף ידנית להבחין בין אותות פלואורסצנציה לרקע (תמונה > כוון > סף).
  2. השתמש בפונקציית ניתוח > מדידה כדי לחשב צפיפות משולבת. ייצוא נתונים כ.csv לניתוח סטטיסטי עתידי בתוכנת ניתוח סטטיסטי מתאימה (למשל, GraphPad Prism).
  3. הגדר סף להפרדת אותות פלואורסצנציה מהרקע.
  4. בחר את כל השדה; הרץ ניתוח > מדידה כדי לחשב את עוצמת אות הפלואורסצנציה המכובדת.
  5. ייצוא נתונים וביצוע ניתוח סטטיסטי להשוואה בין מטופלים לביקורת ב-24 שעות.

8. יצירה ואפיון של תאי CAR-T

  1. עיצוב מבנה CAR
    הערה: תאי CAR-T ששימשו במחקר זה מכוונים ל-B7-H3 (מקודד על ידי גן CD276), אנטיגן שמביטא לעיתים קרובות יתר על המידה בסרטן המעי הגס14. מבנה CAR מורכב מ:
    תחום חוץ-תאי: קטע משתנה בעל שרשרת אחת (scFv) שמקורו בנוגדן חד-שבטי נגד שיבוט B7-H3 376.96.
    ציר ותחום טרנסממברנה: ציר CD8α ותחום טרנסממברניה.
    תחום הגירוי המשותף: CD28 אנושי.
    תחום האיתות: CD3ζ אנושי.
  2. יצירת תאי CAR-T
    1. בידוד: בידוד תאי דם חד-גרעיניים היקפיים (PBMCs) משכבות באפי בריאות של תורם באמצעות צנטריפוגציה14 של גרדיאנט צפיפות Ficoll-Paque.
    2. הפעלה: הפעלת PBMCs אנושיים עם נוגדנים נגד CD3/CD28 ל-48 שעות במדיה של תאי T בתוספת 10 ng/mL IL-7 ו-5ng/mL IL-15. הכינו את מדיום תאי ה-T על ידי ערבוב נפחים שווים (250 מ"ל כל אחד) של RPMI 1640 ומדיה של Click, והשלמה עם 10% סרום בקר עוברי (FBS), 1x GlutaMAX, ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין (Pen/Strep).
    3. טרנסדוקציה: המרה של תאי T המופעלים עם סופרננטנט רטרו-וירוס באמצעות פלטה מצופה רטרונקטין כפי שתואר קודם15.
    4. הרחבה: קציר ותרבות תאי T 3 ימים לאחר ההמרה במדיום תאי T אנושי מלא המכיל IL-7 ו-IL-15 למשך 7-9 ימים נוספים לפני האפיון והבדיקות הפונקציונליות.
  3. אפיון תאי CAR-T
    1. ביטוי CAR: הערכת ביטוי CAR 5-7 ימים לאחר ההעברה באמצעות ציטומטריית זרימה באמצעות חלבון רקומביננטי B7-H3-Fc, ולאחר מכן נוגדן משני מסומן פלואורסצנטי נגד Fc14 אנושי. יעילות ההעברה הטיפוסית (תאי CAR+) נעה בין 80% ל-90%.
    2. פנוטיפ: אפיון תת-הקבוצות של תאי T (למשל, CD4+, CD8+ וכו') באמצעות ציטומטריית זרימה באמצעות נוגדנים נגד CD3, CD4, CD8, CD45RA, CCR7 וכו'14.
    3. אימות פונקציונלי (טרום-קו-קולטורציה אופציונלי): לפני ניסויי קו-קולטורציה, יש לאמת תאי CAR-T פונקציונלית על ידי קו-קולטורציה עם קווי תאי מטרה חיוביים B7-H3 ושלילי B7-H3 ומדידת שחרור ציטוקינים (למשל, IFN-γ באמצעות ELISA) או ציטוטוקסיות (למשל, באמצעות ציטומטריית זרימה15).
  4. הכנה לקו-קולטורה (PDTO Assay)
    1. השתמשו בתאי CAR-T לקו-קולטורציה במהלך התרחבות הלוגריתם פאזה (בדרך כלל בין הימים 10-14 לאחר ההפעלה). לפני השימוש, שטפו את התאים פעמיים עם HBSS כדי להסיר את IL-7/IL-15 ותשתה אותם מחדש במדיום הקו-קולטורציה המתואר בשלב 4.1.
    2. אשר את הרלוונטיות היא >95% באמצעות צביעת Trypan Blue.
    3. נקודות ביקורת ויזואליות: בדקו אשכולות כדוריים קטנים (50-100 מיקרון) בימים 3-5 וספרואידים בוגרים (100-200 מיקרון) בימים 10-14.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

אורגנואידים מסרטן המעי הגס נגזרו בהצלחה מדגימות ביופסיה אנדוסקופיות (איור 1), כאשר זהות הגידול אושרה על ידי אבחנה פתולוגית (איור 2). שברי הגידול שגודלו ב-BMM החלו ליצור מבנים תלת-ממדיים בתוך 24 שעות. אורגנואידים מהדור הראשון (P0) עברו בין הימים 7-14. אורגנואידים הציגו מורפולוגיות מגוונות, כולל מבנים כדוריים, ציסטיים ומעגליים (איור 2A).

מערכת הדמיה פלואורסצנטית שימשה למעקב...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מאמר זה מציג שיטה להערכת ההשפעה הציטוטוקסית של תאי CAR-T על PDTOs, המשלבת דימות שדה בהיר וצביעה פלואורסצנטית להערכת שרייתיות אורגנואידים. גישה דו-מודאלית זו מאפשרת הדמיה מעמיקה של מוות תאי הגידול במערכת מודלים תלת-ממדיים ומספקת הערכה חצי-כמותית של ציטוטוקסיות CAR-T.

רכיב קריטי בפרוטוקול זה הוא מדיום התרבות. מכיוון שתאי CAR-T ואורגנואידים בגידול דורשים חומרים מזינים שונים, הוערכה תחילה תאימות תאי CAR-T עם מדיום תרבית אורגנואידים. תאי CAR-T שמרו על חיוניות ויכול...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין ניגוד עניינים.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי תוכנית המחקר והפיתוח המרכזית הלאומית של סין (2022YFC2304400, 2022YFC2304401), פרויקט המדע והטכנולוגיה במערכת הרפואה והבריאות של נאנשאן (NSZD2024046, NS2024105) וקרן המחקר הרפואי של שנזן (D2401023).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צינור 15 מ"לסיינינג3030100
פלטת 24 בארותקורנינג3524
צינור בנפח 50 מ"לסיינינג3030000
לוח 96 בארותקורנינג3599
DMEM/F12 מתקדםגיבקוC11330500BT
מעכב אלק 4/5/7MCEHY-10432 
B27גיבקו17504044
ארון בטיחות ביולוגית (מחלקה II)תרמו פישרלא זמין
אלבומין סרום בקרסיגמא אולדריץ'A9056
צלחת תרבית תאיםBIOFILTCD010060
צנטריפוגהאפנדורף5810R
המדיום של קליקסרט פוג'י9195
חממת CO2יאמטהIP610
קולגנאז IIסולרביולוגיהC8150
קולגנאז IVסיגמא אולדריץ'C9407
מיקרוסקופ לייזר קונפוקליצייסLSM900
מדיום משמר קריו-זנואקCELLBANKERTM2
בופר עיכולחומרים מוכנים פנימיתלא זמיןהיצירה שסופקה בכתב היד
שייקר דיגיטליMIULABHS-25
דיספאזה סוג IIסיגמא-אלדריץ'D4693
DMEMגיבקוC11995500BT
Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28תרמו פישר11131D
EGFPeproTechAF-100-15-500UG
סרום בקר עובריגיבקו1631389
גסטריןGlpBioGA20228
גנטמיצין/אמפוטריטין BגיבקוR0151
גלוטמקסגיבקו35050061
תמיסת מלח מאוזנת של הנקסגיבקוC14175500BT
HEPESגיבקו15630080
Hoechst 33342 ביוטייםC1027
היאלורונידאזסולרביולוגיהh8030
IL-15פפרוטק200-15-10UG
IL-2נובופרוטאיןCK24-10
IL-7פפרוטק200-07-10UG
ImageJNIH (קוד פתוח)https://imagej.nih.gov/ij/
הפוך  מיקרוסקופ פלואורסצנטיMshotMF52-N
מטריג'לקורנינג356231
N2גיבקו17502048
n-אצטילציסטאיןסיגמא אולדריץ'A7250-5G
ניאצינמידסיגמא אולדריץ'N0636-100G
נוגיןPeproTech120-10C-20
נורמוסיןInvivoGenאנט-אן-אן-1
מדיום גידול אורגנואידחומרים מוכנים פנימיתלא זמיןהיצירה שסופקה בכתב היד
מעכב p38MCEHY-10295 
פניצילין-סטרפטומיהגיבקו15140122
פרוסטגלנדין פרק 2MCEHY-101952 
מעכב קינאז מקושר Rho תאי גזע72304
RPMI 1640הייקלוןSH30809.01B
R-ספונדין 1PeproTech120-38-20UG
מילויי פיפט S1תרמו-סיינטיפיק9501
פיפטה סרולוגיתBIOFILGSP-010-050
פיפטה חד-ערוציתאפנדורף3123000063
פיפטה חד-ערוציתאפנדורף3123000055
פיפטה חד-ערוציתאפנדורף3123000098
פיפטה חד-ערוציתאפנדורף3123000022
סכינים חד-פעמיים סטרילייםטק-סSSD10
סיטוקס גריןביוטייםC1181S
TexMACS מדיוםמילטני ביוטק130-097-196
מיכל מים עם תרמוסטטבלופארדBWS-10
טרייפן בלופיג'יןPH0519
TrypLE Expressגיבקו12605028
β-מרקפטואנולגיבקו21985023

מקורות

  1. Lu, J., Jiang, G. The journey of CAR-T therapy in hematological malignancies. Mol Cancer. 21 (1), 194(2022).
  2. Maalej, K. M., et al. CAR-cell therapy in the era of solid tumor treatment: Current challenges and emerging therapeutic advances. Mol Cancer. 22 (1), 20(2023).
  3. Albelda, S. M. CAR T cell therapy for patients with solid tumours: Key lessons to learn and unlearn. Nat Rev Clin Oncol. 21 (1), 47-66 (2024).
  4. Shi, H., et al. IL-15 armoring enhances the antitumor efficacy of claudin 18.2-targeting CAR-T cells in syngeneic mouse tumor models. Front Immunol. 14, 1165404(2023).
  5. Zhang, D. K. Y., et al. Enhancing CAR-T cell functionality in a patient-specific manner. Nat Commun. 14 (1), 506(2023).
  6. Qu, S., et al. Patient-derived organoids in human cancer: A platform for fundamental research and precision medicine. Mol Biomed. 5 (1), 6(2024).
  7. Yoshida, G. J. Applications of patient-derived tumor xenograft models and tumor organoids. J Hematol Oncol. 13 (1), 4(2020).
  8. Qu, J., Kalyani, F. S., Liu, L., Cheng, T., Chen, L. Tumor organoids: Synergistic applications, current challenges, and future prospects in cancer therapy. Cancer Commun. 41 (12), 1331-1353 (2021).
  9. Mo, S., et al. Patient-derived organoids from colorectal cancer with paired liver metastasis reveal tumor heterogeneity and predict response to chemotherapy. Adv Sci. 9 (31), 2204097(2022).
  10. Nam, C., Ziman, B., Sheth, M., Zhao, H., Lin, D. -C. Genomic and epigenomic characterization of tumor organoid models. Cancers. 14 (17), 4090(2022).
  11. Taurin, S., et al. Patient-derived tumor organoids: A preclinical platform for personalized cancer therapy. Transl Oncol. 51, 102226(2025).
  12. Tao, B., et al. Organoid-guided precision medicine: From bench to bedside. MedComm. 6 (5), e70195(2025).
  13. Ning, R. -X., et al. Application status and optimization suggestions of tumor organoids and CAR-T cell co-culture models. Cancer Cell Int. 24 (1), 98(2024).
  14. Du, H., et al. Antitumor responses in the absence of toxicity in solid tumors by targeting B7-H3 via chimeric antigen receptor T cells. Cancer Cell. 35 (2), 221-237.e8 (2019).
  15. Sun, S., et al. Preclinical evaluation of antitumor activity and toxicity of TROP2-specific CAR-T cells for treatment of triple-negative breast cancer. J Immunother Cancer. 13 (9), e012442(2025).
  16. Schnalzger, T. E., et al. 3D model for CAR-mediated cytotoxicity using patient-derived colorectal cancer organoids. EMBO J. 38 (12), e100928(2019).
  17. Zou, F., et al. The CD39+ HBV surface protein-targeted CAR-T and personalized tumor-reactive CD8+ T cells exhibit potent anti-HCC activity. Mol Ther. 29 (5), 1794-1807 (2021).
  18. Yu, L., et al. Patient-derived organoids of bladder cancer recapitulate antigen expression profiles and serve as a personal evaluation model for CAR-T cells in vitro. Clin Transl Immunol. 10 (2), e1248(2021).
  19. Wang, X., et al. Dynamic profiling of antitumor activity of CAR T cells using micropatterned tumor arrays. Adv Sci. 6 (23), 1901829(2019).
  20. Dekkers, J. F., et al. Uncovering the mode of action of engineered T cells in patient cancer organoids. Nat Biotechnol. 41 (1), 60-69 (2023).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

CAR T

מאמרים קשורים