מאמר שיטה

מסגרת גנומית שכבתית לחיזוי סרוטיפ סלמונלה : הערכת MLST, SeqSero, SeqSero2, SeqSero2S ו-SISTR בדרום-מערב סין

503 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/69117

⸱

9 בינואר 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1West China School of Public Health and West China Fourth Hospital, Sichuan University, 2College of Pharmacy, Youjiang Medical University for Nationalities, 3Chengdu Center for Disease Control and Prevention (Chengdu Institute of Health Supervision), 4Sichuan Provincial Centre for Disease Control and Prevention, 5Department of Laboratory Medicine and Port Epidemic Disease Monitoring Key Laboratory of Sichuan Province, Sichuan International Travel and Healthcare Center (Chengdu Customs District Port Clinic), 6Health Promotion and Food Nutrition & Safety Key Laboratory of Sichuan Province, 7Innovation Center of Nursing Research and Nursing Key Laboratory of Sichuan Province, West China Hospital, Sichuan University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה קובע תהליך עבודה גנומי מדורג לחיזוי סרוטיפ סלמונלה , תוך שימוש ב-MLST או SeqSero2S למעקב שגרתי, SISTR עם MLST גנומי ליבה לזיהוי התפרצויות, ו-SeqSero2S לסקר מהיר. הפרוטוקול אומת באמצעות ניתוח רב-מרכזי לשיפור המעקב בסין.

תקציר

סרוטיפינג מדויק של סלמונלה חיוני למעקב יעיל ולחקירת התפרצויות, שכן מגוון הסרוטיפים משפיע ישירות על פתוגניות והערכת סיכוני בריאות הציבור. עם זאת, שיטות אגלוטינציה קונבנציונליות של סלייד מוגבלות בשל שחזור ירוד, עוצמת עבודה ועלויות גבוהות, שמקשים על יישמן בתוכניות ניטור בעלות תפוקה גבוהה. כדי להתמודד עם מגבלות אלו, פיתחנו ואימתנו תהליך עבודה גנומי המשלב את Multilocus Sequence Typing (MLST), משאב Salmonella In Silico Typing (SISTR), SeqSero, SeqSero2 ו-SeqSero2S לחיזוי סרוטיפ באמצעות נתוני ריצוף גנומי מלא. פרוטוקול זה הוערך באמצעות ניתוח רב-מרכזי של 315 בודדי סלמונלה שנאספו ממזון ומקורות אנושיים בדרום-מערב סין. ממצאי מחקר זה הראו התאמה גבוהה משמעותית בין גישות גנומיות (עד 100%/99.1%/90.1% בסט האימון ו-100%/97.1%/93.1% בסט האימות עבור SISTR/MLST/SeqSero2S, בהתאמה) בהשוואה לסרוטיפינג מסורתי. תהליך העבודה כולל המלצות לבחירת שיטות חיזוי מתאימות בהתבסס על הקשר המעקב, תוך דגש על MLST ו-SeqSero2S למעקב שגרתי, SeqSero2S לסקר מהיר, ו-SISTR עם MLST גנומי ליבה לחקירות התפרצות. גישה זו מקלה על שילוב סרוטיפינג גנומי בפרקטיקה של בריאות הציבור, מפחיתה את התלות בסרולוגיה מסורתית ומשפרת את השכפול והיכולת להרחבה בתוכניות ניטור סלמונלה .

מבוא

סלמונלה היא אחת הפתוגנים המשמעותיים ביותר המועברים במזון בעולם, וגורמת לתחלואה ותמותה משמעותית 1,2. בסין, הוא נותר גורם מוביל למחלות המועברות במזון, כאשר מספר מוגבל של סרוטיפים אחראי לרוב ההדבקות3. זיהוי מדויק של סרוטיפים הוא קריטי למעקב ולחקירות התפרצויות, שכן המגוון הסרוטיפים קשור קשר הדוק לפתוגניות ולסיכון לבריאות הציבור. דבר זה מוכר היטב בסרוטיפים נפוצים כמו סלמונלה אנטריטידיס וסלמונלה טיפימוריום, אך חלק מהסרוטיפים הפחות נחקרים, כמו סלמונלה פנמה, מהווים גם גורם משמעותי להתפשטות עולמית ולמחלות פולשניות4, מה שמדגיש את הצורך הכללי ביכולות סרוטיפינג חזקות. שיטות הסרוטיפינג המסורתיות, שנחשבו זמן רב לסטנדרט הזהב, הן תהליך גוזל זמן ויקר שדורש מעל 150 אנטיסראות5. הם מוגבלים עוד יותר על ידי שחזוריות לקויה6, תהליכי עבודה עתיריעבודה 7, ושונות מובנית הנובעת מפרשנות סובייקטיבית של תגובות אגלוטינציה8, מה שהופך אותם לבלתי מספקים לתוכניות ניטור במהירות גבוהה9.

הופעת ריצוף הגנום המלא (WGS) שינתה את אפיון הפתוגנים בכך שאפשרה חיזוי סרוטיפ מהיר וברזולוציהגבוהה 10,11,12. פותחו מספר כלים בסיליקו, כולל Multilocus Sequence Typing (MLST), SeqSero13, SeqSero214, SeqSero2S15, ומשאב טיפוס סלמונלה בסיליקו (SISTR)7,15. בעוד ש-MLST מציע מעקב אפידמיולוגי סטנדרטיוארוך טווח 16, SeqSero2 ו-SeqSero2S מאפשרים ניתוח ישיר מקריאות גולמיות ומסייעים בסקר מהיר של סרוטיפים נפוצים14,15. לעומת זאת, SISTR דורש גנומים מורכבים אך משלב זיהוי גן אנטיגן עם טייפינג רצף גנומי רב-לוקי (cgMLST), ומספק פתרון מקיף לחקירות התפרצויות17. בעוד שאפיון סלמונלה מבוסס WGS מאומץ יותר ויותר כראיה עיקרית במחקרים 16,18,19, יישומו במעקב בקנה מידה רחב נותר מוגבל, פער שנובע בחלקו משיקולים מעשיים שלא טופלו המשפיעים על התאמת השיטה. סקר עולמי גילה שרק 8% מהמעבדות המשתתפות משתמשות ב-WGS למעקב שגרתי, כאשר מורכבות אנליטית היא מכשולמרכזי. לדוגמה, חיזוי סרוטיפ אמין תלוי בעומק ריצוף מספק (בדרך כלל >75× לטובת עלות-תועלת, רצוי ~200× לניתוח איכותי) ובהרכבות גנום איכותיות (N50 של קונטיגים > 30 קילו-בית כמינימום חסכוני, רצוי >100 קילו-ביט), במיוחד לכלים התלויים בהרכבה כמו SISTR 21,22,23. בנוסף, בחירת הכלים חייבת להתאים למשאבי החישוב והמומחיות של המעבדה: כלים בקוד פתוח כמו SeqSero2S מציעים חלופות מהירות יותר לסינון מהיר על ידי ניתוח קריאות גולמיות ועקיפת אסמבלי15 אינטנסיבי חישובית, בעוד שמעבדות עם קיבולת ביואינפורמטיקה מוגבלת עלולות להתקשות בניתוח ואחסון נתונים. כתוצאה מכך, אין מספיק נתונים כדי לקבוע האם ניתן להפחית בדיקות סרולוגיות במעקב רחב היקף20,24, ובכך מדגיש את הצורך בגישות מותאמות משאבים. ראוי לציין כי לאחר מגפת הקורונה, קיימת כמות משמעותית של מכשירי ריצוף לא פעילים ו-qPCR ברמות שונות של מוסדות בריאות, מה שמציע הזדמנות למקם את היכולת הזו לניטור גנומי.

כדי להתמודד עם הפער הזה, ערכנו הערכה רב-מרכזית של כלי הסרוטיפינג הגנומיים שהוזכרו לעיל, תוך שימוש ב-315 מבודדי סלמונלה שנאספו ממקורות מזון ובני אדם בדרום-מערב סין25,26. בהתבסס על ממצאים אלו, פיתחנו תהליך עבודה מדורג המתחשב במשאבי מעבדה וצרכי ניטור משתנים, ומספק קריטריונים ברורים לבחירת כלים בהקשרים שונים. מסגרת זו נותנת עדיפות ל-SeqSero2S לסינון מהיר ו-SISTR בשילוב עם cgMLST לחקירות התפרצויות, ובכך מקלה על אימוץ גישות גנומיות ומפחית את התלות בשיטות סרוטיפינג מסורתיות. כאן, אנו מתארים כל שלב בזרימת העבודה בפירוט, כולל זיהוי בידוד, ריצוף, ניתוח נתונים וקריטריונים לבחירת כלי חיזוי בהקשרים שונים של מעקב.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

איסוף וטיפול בדגימות צואה אנושיות בוצעו באישור ועדת האתיקה של בית החולים הרביעי של מערב סין, אוניברסיטת סצ'ואן (מספר פרוטוקול: HXSY-EC-2022093), בהתאם להצהרת הלסינקי ולפרקטיקה קלינית טובה. הסכמה מדעת בוטלה בהתאם לתקנות בריאות הציבור הלאומיות.

הערה: כל ההליכים הכוללים תרביות סלמונלה חיות ודגימות צואה אנושיות חייבים להתבצע במעבדת בטיחות ביולוגית רמה 2 (BSL-2) על ידי צוות מיומן בפרקטיקות מיקרוביולוגיות סטנדרטיות ונהלי בטיחות ביולוגית. יש ללבוש ציוד מגן אישי מתאים (PPE) בכל עת, כולל חלוק מעבדה, כפפות ומשקפי מגן. חטא והחלף כפפות מזוהמות באופן קבוע. חטא את כל משטחי העבודה לפני ואחרי ניסויים עם חומר חיטוי מתאים (למשל, 70% אתנול, 1% נתרן היפוכלוריט). יש לנקות את כל הפסולת הנוזלית והמוצקה המכילה חומרים ביולוגיים על ידי אוטוקלב (למשל, בטמפרטורה של 121 מעלות צלזיוס למשך לפחות 30 דקות) לפני ההשלכה. הימנעו מיצירת אירוסולים והתזות. בצע את כל ההליכים שעשויים ליצור אירוסולים (למשל, צנטריפוגה, רעידות עזות) בתוך ארון בטיחות ביולוגית מוסמך.

1. איסוף דגימות מזון וזיהוי זנים

  1. אסוף דגימות מזון משווקי קמעונאות או מתקני עיבוד. בודדו סלמונלה מדגימות מזון בהתאם לתקן הלאומי לבטיחות מזון GB 4789.4 ולפרוטוקולי הסודיות של תוכנית ניטור מחלות המזון (FoodBorne Disease Surveillance).
  2. העשרה מוקדמת:
    1. שקלו בדיוק 25 גרם מכל דגימת מזון. הוסיפו 225 מ"ל של מים פפטונים ממוגנים (BPW) לדגימה (יחס דילול של 1:10) ומערבולת למשך 30 שניות כדי להבטיח הומוגניזציה וטבילה מלאה.
    2. דגור את הדגימה ב-BPW ב-36°C ±-1°C למשך 8-18 שעות בדוגמת רעידה מכוונת ל-150 סל"ד.
      הערה: העשרה מוקדמת במרק לא סלקטיבי מעלה משמעותית את עומס הפתוגן. לטפל בכל החומרים הבאים (מיכלים, פיפטות וכו') כחומרים מדבקים מאוד.
  3. העשרה סלקטיבית: לאחר העשרה מוקדמת, העבר 1 מ"ל מהדגימה למרק טטרתיונאט (TTB). דגרו את ה-TTB ב-42 מעלות צלזיוס למשך 18-24 שעות ללא רעידות.
  4. בידוד: לאחר הדגירה, יש לפזר את התרבית המועשרת על לוחות אגר סלקטיביים הבאים: אגר הקטואן אנטרי (HE), אגר קסילוז ליזין דאוקסיכולט (XLD), וסלמונלה כרומאגר. דגרו את הלוחות בטמפרטורה של 36 מעלות צלזיוס למשך 18-24 שעות.
    הערה: בעת סידור לוחות, יש להיזהר להימנע מיצירת אירוסולים וזיהום צולב. באגר HE, מושבות סלמונלה משוערות בדרך כלל נראות בצבע כחול-ירוק עד כחול, עם או בלי מרכזים שחורים. האגר שמסביב עשוי לקבל גוון ירקרק-דומה. באגר XLD, מושבות סלמונלה משוערות בדרך כלל אדומות עם מרכזים שחורים. ב-CHROMagar, מושבות סלמונלה משוערות מאופיינות בצבע מג'נטה עד סגול, כפי שמצוין על ידי היצרן. בכל פלטה סלקטיבית, צפו למושבות מבודדות היטב לאחר 18-24 שעות של דגירה. צלחות שגדלו יתר על המידה (>300 מושבות) עשויות לדרוש דילול ושינוי פסים.
  5. זיהוי: בדוק את הלוחות למושבות חשודות לסלמונלה . זהה זנים חשודים באמצעות מערכת זיהוי אוטומטית עם כרטיס זיהוי גרם-שלילי (GN), בהתאם להוראות היצרן לניתוח.
    הערה: ודא שמספרי האצווה של כרטיסי GN תקפים ובמועד התפוגה.
    1. הכינו תמסה חיידקית ממושבה טהורה לעמידות מוגדרת (0.50-0.63 תקן מקפרלנד) באמצעות תמיסת מלח של 0.45%.
    2. טען את המתלים לכרטיס GN ובצע את הבדיקה. ודאו שהמערכת מוגדרת לדגירה אוטומטית של הכרטיס בטמפרטורה של 35.0 מעלות צלזיוס ± 2.0 מעלות צלזיוס ומנטרים תגובות ביוכימיות עד 8 שעות.
    3. קבל תוצאה של סלמונלה אנטריקה ssp. enterica עם הסתברות ≥ של 95% ודירוג ביטחון מצוין .
  6. סרוטיפינג: איסוף מושבות בודדות מלוח האגר של Swarm לאחר דגירה לילה בטמפרטורה של 37°C. בצע בדיקות אגלוטינציה של שקופית לזיהוי אנטיגנים O-ואנטיגני H. השתמשו בערכות אנטיסרום סלמונלה הזמינות מסחרית (ראו טבלת חומרים) לבדיקה.

2. איסוף דגימות אנושיות וזיהוי זן

הערה: לצורך בידוד סלמונלה מדגימות צואה אנושית, יש לעקוב אחר פרוטוקולי הסודיות של תוכנית ניטור מחלות המזון (Foodborne Disease Surveillance).

  1. איסוף: איסוף כ-2 גרם של דגימות צואה אנושיות שזה עתה התרוקנו. הניחו את דגימות הצואה במיכלים נקיים, יבשים ורחבי פה. העבירו את דגימות הצואה למעבדה תוך שעה באמצעות קופסאות הובלה מבודדות לשמירה על שלמות הדגימה.
    אזהרה: דגימות צואה אנושיות עשויות להכיל מספר פתוגנים מעבר לסלמונלה. לטפל בכל הדגימות ככאלה שעלולות להיות מדבקות ולשמור על אמצעי זהירות סטנדרטיים לטיפול בחומרים ביולוגיים.
  2. חיסון: החסן את דגימות הצואה שנאספו ישירות על לוחות האגר הסלקטיביים הבאים: סלמונלה CHROMagar, אגר סלמונלה-XLD ואגר שיגלה (SS).
    הערה: עיין בשלב 1.4 למורפולוגיית המושבה האופיינית על סלמונלה CHROMagar ואגר XLD. באגר SS, מושבות סלמונלה משוערות בדרך כלל נראות חסרות צבע, אטומות או שזומות עם מרכזים שחורים. האגר עצמו נשאר כמעט ללא שינוי.
  3. זיהוי: זיהוי מושבות חשודות לסלמונלה כפי שמתואר בשלב 1.5.
  4. סרוטיפינג: לבצע סרוטיפינג באמצעות אגלוטינציה בשקף כפי שמתואר בשלב 1.6.

3. הכנת ספרייה וריצוף גנום מלא

  1. תרבית חיידקים: סלמונלה פס על אגר LB, דגירה ב-37°C למשך 12 שעות. בחר מושבה, הזין לתוך מרק 200 מ"ל LB, ונער במהירות של 150 סל"ד (37 מעלות צלזיוס, 12 שעות). צנטריפוגה ב-12,000 × גרם למשך 10 דקות לקצירת תאים.
    הערה: בצע את כל שלבי הצנטריפוגה עם רוטורים אטומים או כוסות בטיחות כדי למנוע יצירת אירוסולים.
  2. חילוץ DNA: חילוץ DNA גנומי באמצעות ערכת חילוץ DNA מסחרית (ראו טבלת חומרים), בהתאם לפרוטוקול היצרן.
    אזהרה: התגובות בערכות מיצוי DNA מסחריות (למשל, בופרי ליזיס, פרוטאנאז K) עלולים להיות מזיקים אם נשאפים או במגע עם העור והעיניים. בצע את החילוץ במכסה אדים או בארון בטיחות ביולוגי אם משתמשים בתגובות נדיפות, ולבש ציוד מגן אישי מתאים.
  3. הערכת איכות DNA: טיהור DNA גנומי וכימות באמצעות פלואורומטר עם ערכת בדיקת רגישות גבוהה dsDNA. אימות שלמות ה-DNA באמצעות אלקטרופורזה על ג'ל אגרוז 1% ב-100 וולט למשך 45 דקות; ה-DNA האיכותי מופיע כרצועה קומפקטית אחת >20 קילו-בית עם טשטוש מינימלי27.
    הערה: (שלב קריטי) DNA גנומי איכותי ובעל משקל מולקולרי גבוה (עם יחס A260/A280 של ~1.8-2.0) הוא קריטי להכנה וריצוף מוצלח בספריות.
    זהירות: צבעי צביעת חומצות גרעין המשמשים באלקטרופורזה של ג'ל אגרוז (למשל, GelRed, Ethidium Bromide) הם מוטגניים. תמיד יש ללבוש כפפות בעת טיפול בג'לים ותמימות לכתמים, ולהיפטר מהם בהתאם לתקנות מוסדיות לפסולת מסוכנת.
  4. פיצול DNA: מפרק כ-150 ng של DNA גנומי מאושר לגודל ממוצע של ~350 bp באמצעות מערכת אולטרסוניקציה ממוקדת לפי פרוטוקול היצרן.
  5. בנו את ספריית הריצוף מחלקי ה-DNA שנגזרו באמצעות ערכת הכנת ספרייה מסחרית (ראו טבלת חומרים). לבצע תיקון קצה וזרחון 5' של קטעי ה-DNA שנגזרו. לאחר מכן, הוסיפו בסיס 'A' אחד לקצוות של 3' וקשרו את מתאמי הרצף המאונדקסים.
  6. להגביר ולהעשיר את קטעי ה-DNA הקשורים על ידי מתאם באמצעות תוכנית PCR מוגבלת כפי שמוגדר בערכה.
  7. להכיר ולכמת את הספרייה הסופית באמצעות שיטות כמו פלואורומטריה ואלקטרופורזה קפילרית.
  8. לבצע רצף זוגות (2 × 150 bp) על פלטפורמת ריצוף בהתאם לנהלים התפעוליים הסטנדרטיים.

4. ניתוח נתונים

  1. בקרת איכות של נתוני ריצוף גולמיים: ביצוע בקרת איכות ראשונית על קבצי FASTQ הגולמיים באמצעות fastp (גרסה 0.23.0) עם פרמטרים ברירת מחדל. המטרה היא להסיר רצפי מתאם וקריאות באיכות נמוכה, ובכך ליצור נתוני FASTQ נקיים לניתוח במורד הזרם.
  2. הרכיבו את הקריאות האיכותיות והמסוננות לגנום טיוטה באמצעות SPAdes (גרסה 3.15.0) עם אפשרות זהירה להפחתת אי-התאמות וקיצור אינדל26.
  3. השתמש ברצפי הגנום (קבצי FASTQ / FASTA) כקלט לחיזוי הסרוטיפ השונים.
    1. עבור MLST, ייבא את קובץ FASTQ לתוכנת BioNumerics (גרסה 7.6).
      1. בחלון ייבוא תבנית, לחץ על עריכת ניתוח תחת אפשרויות מתקדמות. הגדר את מחרוזת ניתוח הנתונים וקישוט הנתונים ל-[DATA]. החלו את הביטויים הרגולריים DATA]_* ו-[DATA] לניתוח שמות קבצים. שמור את התבנית, בחר אותה, ולחץ על הבא ואז סיים. אשר את ההגשה בחלון שליחת המשימה כדי להעלות נתונים. כלי CEStoreUploader ייפתח אוטומטית להעברת נתוני WGS הגולמיים למנוע החישוב.
      2. בחר את רשומת הגנום לאחר ההעלאה. נווט ל-WGS Tools ובחר "TraNetGenotype" לחיזוי אוטומטי של ST. בתיבת הדיאלוג TraNetGenotype , בחרו סלמונלה כסוג הזן, בחרו ניתוח סרוטיפ, ניתוח אלימות וניתוח רגישות אנטימיקרוביאלית, ולחצו על כן.
    2. עבור SISTR (גרסה 1.1.3; https://github.com/phac-nml/sistr_cmd; פרמטרים: כל הפרמטרים הם ברירת מחדל), פתח טרמינל ונווט לתיקייה המכילה את קובץ הגנום assemble.fasta.
      1. הרץ את הפקודה הבאה כדי לבצע חיזוי סרובר ולהפיק דוח מקיף בפורמט CSV: sistr --qc --alleles-output allele-results.json --cgmlst-profiles cgmlst-profiles.csv -f tab -o sistr-output.tab -i assembly.fasta. פקודה זו יוצרת דוח המכיל את הסרובר החזויה.
        הערה: -QC: מבצע בדיקות בקרת איכות על ההרכבה. -i assembly.fasta: מגדיר את קובץ FASTA הקלט. -f csv: מגדיר את פורמט הפלט כ-CSV. -o sistr_results: מגדיר את שם הבסיס לקובץ הפלט (למשל, sistr_results.csv). -p 4: משתמש ב-4 תהליכי מעבד לניתוח כדי להאיץ את החישוב. --אללים-פלט: שומר רצפי אללים ומידע בקובץ JSON. --cgmlst-profiles: מייצא פרופילי אללים של cgMLST לקובץ CSV.
    3. עבור SeqSero (גרסה 1.0; https://github.com/denglab/SeqSero; פרמטרים: כל הפרמטרים הם ברירת מחדל), לנווט לתיקייה המכילה את קובץ נתוני הקלט. הרץ את הפקודה הבאה עם פרמטרים ברירת מחדל לניתוח: python SeqSero.py -m 4 -i assembly.fasta. הכלי יוצר תיקיית פלט המכילה את הקובץ Seqsero_result.txt עם הסרוטיפ החזויה.
      הערה: -m 4 מגדיר את סוג הקלט כהרכבת גנום. -i מגדיר את קובץ הקלט FASTA.
    4. עבור SeqSero2 (גרסה 1.3.1; https://github.com/denglab/SeqSero2; פרמטרים: כל הפרמטרים הם ברירת מחדל). הרץ את הפקודה הבאה: python3 SeqSero2_package.py -m k -t 4 -i assembly.fasta. הכלי מפיק את הסרוטיפ החזוי ישירות למסך הטרמינל לאחר סיום העבודה. הפלט מספק את הסרוטיפ החזוי.
      הערה: -m k: מגדיר זרימת עבודה מבוססת k-mer לחיזוי מהיר של סרוטיפ באמצעות k-mers ייחודיים של קובעי סרוטיפ. -t 4: מציין את סוג הקלט כרצפים מורכבים.
    5. עבור SeqSero2S (גרסה 1.1.1; https://github.com/denglab/SeqSero2S; פרמטרים: כל הפרמטרים הם ברירת מחדל): הרץ אותו באמצעות הסקריפט שסופק: python SeqSero2S.py -m k -t 4 -i assembly.fasta. הפלט מספק את הסרוטיפ החזוי.
      הערה: -m k מאפשר ניתוח מבוסס k-mer של קריאות גולמיות או הרכבות גנום. -t 4 מגדיר קלט רצף מורכב.

5. פרמטרים קריטיים ושיקולים מעשיים

הערה: השיקולים הבאים הם קריטיים ליישום מוצלח של תהליך העבודה הגנומי הזה, במיוחד בסביבות מוגבלות משאבים.

  1. ודאו שנתוני הריצוף הגולמיים משיגים עומק כיסוי מספק. עומק רצף של כ-100 פעמים בדרך כלל מספיק לניתוח איכותי.
    הערה: למעבדות שמעדיפות עלות-יעילות, עומק ריצוף מינימלי של פי 75 מומלץ כסף נמוך מעשי לחיזוי סרוטיפים אמין באמצעות MLST או SeqSero221.
  2. ודאו שאיכות הקריאות הגולמיות גבוהה, עם ציון Q30 (דיוק קריאות בסיסי של 99.9%) בדרך כלל מעל 90%.
  3. הערך את איכות הרכבת הגנום החדשה לפני שתמשיך בכלי חיזוי סרוטיפ שדורשים קונטיגים מורכבים. השתמש בסטטיסטיקת N50 כמדד מרכזי.
    הערה: N50 של לפחות 100 kbp מומלץ22, בעוד N50 מעל 30 kbp צריך להיחשב כדרישה המינימלית לניתוח אמין23.
  4. בדוק את שלמות ההרכבה על ידי הבטחת קצב מיפוי קריאה של לפחות ≥98% כאשר הקריאות המסוננות ממופות חזרה לגנום המורכב.

6. פרוטוקול חיזוי סרוטיפ מומלץ למעקב סלמונלה בתפוקה גבוהה

הערה: בחרו שיטות חיזוי סרוטיפ בהתבסס על הקשר המעקב, דיוק נדרש ומשאבי מעבדה זמינים. למעקב סלמונלה בתפוקה גבוהה, עקוב אחר הפרוטוקול הבא:

  1. זיהוי ראשוני: יש לבצע סינון ראשוני בהתאם לתקן GB 4789.4 לאישור מבודדים כסוגי סלמונלה .
    הערה: בשלב זה, אין צורך לזהות את הסרוטיפ הספציפי של המבודדים.
  2. מעקב שגרתי (מצב תפוקה גבוהה): למעקב שגרתי, מאחר ש-BioNumerics כבר אינו מעודכן, השתמש ב-MLST28 בקוד פתוח, SeqSero2S או פלטפורמות ניתוח גנומי מאומתות וידידותיות אחרות שמקבלות תמיכה טכנית ועדכונים מתמשכים.
    הערה: לגבי MLST: תכנית 7 גנים מציעה פרופיל סטנדרטי, נייד ומידע פילוגנטית (סוג רצף, ST) האידיאלי לאפידמיולוגיה ארוכת טווח והשוואת זנים גלובלית. הפשטות שלו מבטיחה ניתוח מהיר ועומס חישובי מינימלי. עבור SeqSero2S: הוא מספק יתרון כפול של חיזוי סרוטיפ מהיר ותוצאות MLST משולבות בריצה אחת. הוא יכול לנתח קריאות רצף גולמיות ישירות, תוך עקיפת הרכבת הגנום כדי לחסוך זמן ומשאבים. אפילו עם נתוני FASTA מורכבים, הוא מהיר יותר מכלים כמו SISTR, שכן הוא מבצע חיזוי סרוטיפ באופן עצמאי ללא הסתמכות על ניתוח חישובי.
  3. סקר מהיר (הגדרות רגישות לזמן): לתוצאות מהירות או במעבדות עם יכולת חישוב מוגבלת, השתמש ב-SeqSero2S לחיזוי סרוטיפ ראשוני.
    הערה: בעת ביצוע תחזיות SeqSero2S, מומלץ בעיקר לפרש את "I_4,[5],12:i:-" כסלמונלה טיפימוריום.
  4. חקירת התפרצויות (מצב דיוק גבוה): למעקב התפרצויות הדורש רזולוציה גבוהה, השתמש ב-SISTR, המשתמש ב-cgMLST כהשלמת חיזוי סרוטיפ ולניתוח אשכולות ברזולוציה גבוהה למעקב אחר מקורות.
  5. בקרת איכות ואישור תוצאות לא עקביות:
    1. עבור זנים מסוג ריצוף נפוצים, בצע אימות אקראי. לאנשים לא נפוצים, השתמש ביחס אימות של 20%. במקרים של תוצאות סרוטיפינג לא עקביות, יש להפנות מבודדים למעבדה ברמה גבוהה יותר או למעבדה ייחוס לקבלת תוצאה סופית.
    2. לניתוח אימותי יש להשתמש במספר שיטות מאומתות, כולל: ניתוח גנומי חוזר עם לפחות שני כלים שונים לחיזוי בסיליקו ; חזר על עצמו בחיזוי סיליקו עם לפחות שני כלים שונים; הקשר פילוגנטי באמצעות שיטות מבוססות WGS ברזולוציה גבוהה (למשל, cgMLST או ניתוח SNP של גנום שלם)29.
    3. הקצה את הסרוטיפ הסופי בהתבסס על קונצנזוס מהראיות המקיפות הללו.
      הערה: יחס האימות המומלץ של 20% לסרוטיפים לא נפוצים מבוסס על התצפית שכלי גנומיקה שומרים על התאמה גבוהה (93.3% ל-SISTR לעומת MLST, 95.0% ל-SISTR לעומת SeqSero2S) גם בקרב סרוטיפים לא נפוצים (טבלה 1). סף זה חסכוני ומספק מרווח בטיחות מספק לזיהוי תדירות נמוכה של אי-התאמות בין כלי גנומיקה במעקב שגרתי.

7. ניתוח סטטיסטי

  1. בצע ניתוח נתונים באמצעות תוכנת R (גרסה 4.1.2).
  2. הצג משתנים קטגוריים כתדירויות עם אחוזים.
  3. השוו קבוצות באמצעות מבחני χ2 לנתונים קטגוריים30, והתייחסו לערך P <0.05 כמובהק סטטיסטית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

הפרוטוקול אומת באמצעות 315 בודדי סלמונלה מדרום-מערב סין, כאשר 213 בודדים (2/3) שימשו כסט הדרכה להשוואת חמש שיטות חיזוי סרוטיפ מבוססות WGS (MLST, SISTR, SeqSero, SeqSero2 ו-SeqSero2S) לתוצאות סרוטיפינג קונבנציונליות, בעוד ש-102 הבודדים הנותרים (1/3) שימשו כסט אימות להערכת ביצועי MLST, SISTR ו-SeqSero2S.

ניתוח סט אימונים (n = 213)
הערכת שחזוריות: סרוטיפינג קונבנציונלי הראה התאמה מוגבלת עם כל אחת מחמש שיטות החיזוי מב...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הערכה רחבת היקף זו, הכוללת 315 בודדי סלמונלה מדרום-מערב סין, מדגימה את השחזוריות העליונה של שיטות סרוטיפינג מבוססות WGS בהשוואה לשיטות קונבנציונליות (84.1% לעומת 62.9% כיסוי, P<0.001). הממצאים שלנו מאשרים תהליך עבודה גנומי מקיף שבו שלבים ראשוניים קריטיים של הכנת דגימה ובקרת איכות DNA (סעיפים 1-3) משפיעים ישירות על אמינות במורד הזרם. הפרוטוקול מדגיש הרכבות גנום איכותיות (רצוי >100 kbp) לכלים תלויי הרכבה (סעיפים 4-5). אסטרטגיית היישום המדורגת מאפשרת למעבדות לבחור שיטות מתאימות בהת...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם.

תודות

עבודה זו נתמכה במענקים ממימון לשכת המדע והטכנולוגיה של טיבט וסצ'ואן (XZ202301ZY0049G, 2024NSFSC0563 ל-H.Z. ו-2024NSFSC0033 ל-X.P.), תוכנית המדע והטכנולוגיה של סצ'ואן (2024JDRC0032 עד Y.X.), פרויקט מכון הבריאות לפרודוקטיביות חדשה (HN240302C ל-H.Z.), פרויקט חידוש הדיסציפלינה של מדעי המעבדות לבריאות הציבור (2023SY-04 ל-H.Z.), בית הספר לבריאות הציבור של מערב סין/בית החולים הרביעי של מערב סין, אוניברסיטת סצ'ואן.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
BioNumerics (גרסה 7.6)מתמטיקה שימושיתhttps://bionumerics.software.informer.com/7.6/MLST/חיזוי סרוטיפ/ניתוח פילוגנטי
כרומגאר סלמונלהבקטון, דיקינסון ושות'214983מדיום כרומוגני סלמונלה סלקטיבי
Fastp (גרסה 0.23.0)קוד פתוחhttps://github.com/OpenGene/fastpבקרת איכות קריאה
מערכת ריצוף Illumina NovaSeq 6000אילומינה20012850פלטפורמת ריצוף גנום מלא
M220 אולטרסוניקטור ממוקדקובאריס500295גזיר DNA
ערכת DNA מהירה של Magbeads לקרקעביומדיקל MPMP116560200ערכת חילוץ DNA גנומי
Microsoft Excel 2016מיקרוסופטKB5002794ניהול נתונים
ערכת בדיקת DNA מהירה NEXTFLEXRevvity50-255-1124הכנת ספריית ריצוף
פלואורומטרי קיוביט 2.0תרמו פישר סיינטיפיקQ32866כימות DNA
ערכת בדיקה רגישה גבוהה של קיוביט dsDNAתרמו פישר סיינטיפיקQ32851כימות DNA
R (גרסה 4.1.2)קרן Rhttps://www.r-project.org/מחשוב סטטיסטי
ערכת אנטיסרום סלמונלהמכון הסרום סטטנס60898זיהוי אנטיגן O/H
SeqSeroקוד פתוחhttps://github.com/denglab/SeqSeroחיזוי סרוטיפ
SeqSero2קוד פתוחhttps://github.com/denglab/SeqSero2חיזוי סרוטיפ
SeqSero2Sקוד פתוחhttps://github.com/denglab/SeqSero2sחיזוי סרוטיפ
SISTRקוד פתוחhttps://github.com/phac-nml/sistr_cmdחיזוי סרוטיפ
SPAdes (גרסה 3.15.0)קוד פתוחhttps://github.com/ablab/spadesהרכבת הגנום
Swarm AgarBD ביוסיינסס211519משמש לאינקובציה של סרוטיפינג
פלואורומטר TBS-380טרנר ביוסיסטמסP/N 3800-003כימות DNA
מערכת VITEK 2 קומפקטיתBioMé ריו95061-768מערכת זיהוי מיקרוביאלית אוטומטית

מקורות

  1. GBD 2017 Non-Typhoidal Salmonella Invasive Disease Collaborators. The global burden of non-typhoidal Salmonella invasive disease: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2017. Lancet Infect Dis. 19 (12), 1312-1324 (2019).
  2. Selim, S. A. A comprehensive review of antibiotic susceptibility patterns in strains isolated from food. J Pure Appl Microbio. 19 (2), 818-833 (2025).
  3. Shen, Y., et al. Genomic investigation of Salmonella enterica serovar Welikade from a pediatric diarrhea case first time in Shanghai, China. BMC Genomics. 25 (1), 604(2024).
  4. Pulford, C. V., et al. Global diversity and evolution of Salmonella enterica serovar Panama: a genomic epidemiology study. Lancet Microbe. 6 (9), 101150(2025).
  5. Hong, H., et al. Genetic characterization and in silico serotyping of 62 Salmonella enterica isolated from Korean poultry operations. BMC Genomics. 26 (1), 166(2025).
  6. Kitchens, S. R., Wang, C., Price, S. B. Bridging classical methodologies in Salmonella investigation with modern technologies: a comprehensive review. Microorganisms. 12 (11), 2249(2024).
  7. Uelze, L., et al. Performance and accuracy of four open-source tools for in silico serotyping of Salmonella spp. based on whole-genome short-read sequencing data. Appl Environ Microbiol. 86 (5), e02265-e02319 (2020).
  8. Wang, B. X., et al. High-throughput fitness experiments reveal specific vulnerabilities of human-adapted Salmonella during stress and infection. Nat Genet. 56 (6), 1288-1299 (2024).
  9. Kumar, S., Kumar, Y., Kumar, G., Kumar, G., Kasana, D. A highly drug-resistant Salmonella enterica serovar Weltevreden of human origin from India and detection of its virulence factors. Indian J Microbiol. 65 (3), 1384-1394 (2025).
  10. Lu, Y., et al. Advances in whole genome sequencing: methods, tools, and applications in population genomics. Int J Mol Sci. 26 (1), 372(2025).
  11. Mukherjee, S., et al. Increasing frequencies of antibiotic resistant non-typhoidal Salmonella infections in Michigan and risk factors for disease. Front Med (Lausanne). 6, 250(2019).
  12. Yachison, C. A., et al. The validation and implications of using whole genome sequencing as a replacement for traditional serotyping for a national Salmonella reference laboratory. Front Microbiol. 8, 1044(2017).
  13. Zhang, S., et al. Salmonella serotype determination utilizing high-throughput genome sequencing data. J Clin Microbiol. 53 (5), 1685-1692 (2015).
  14. Zhang, S., et al. SeqSero2: rapid and improved Salmonella serotype determination using whole-genome sequencing data. Appl Environ Microbiol. 85 (23), e01746-e01819 (2019).
  15. Deng, X., et al. Salmonella serotypes in the genomic era: simplified Salmonella serotype interpretation from DNA sequence data. Appl Environ Microbiol. 91 (3), e0260024(2025).
  16. Cui, Q., et al. Characterization and implications of the regionally prevalent ST8333 strains of Salmonella enterica serotype 4,[5],12:i: - China, 2017-2023. China CDC Wkly. 6 (47), 1232-1235 (2024).
  17. Yoshida, C. E., et al. The Salmonella In Silico Typing Resource (SISTR): an open web-accessible tool for rapidly typing and subtyping draft Salmonella genome assemblies. PLoS One. 11 (1), e0147101(2016).
  18. Ikeuchi, S., et al. Molecular epidemiological analysis of Salmonella Schwarzengrund isolated in Japan by newly developed multi-locus variable-number tandem repeat analysis method. Lwt. 207, 116593(2024).
  19. Kong, X., et al. Emergence of extensively drug-resistant Salmonella Kentucky ST198 in Southwest China. J Glob Antimicrob Resist. 43, 264-270 (2025).
  20. Davedow, T., et al. PulseNet international survey on the implementation of whole genome sequencing in low and middle-income countries for foodborne disease surveillance. Foodborne Pathog Dis. 19 (5), 332-340 (2022).
  21. Xian, Z., et al. Subtyping evaluation of Salmonella Enteritidis using single nucleotide polymorphism and core genome multilocus sequence typing with nanopore reads. Appl Environ Microbiol. 88 (15), e0078522(2022).
  22. Liu, C. C., Hsiao, W. W. L. Machine learning reveals the dynamic importance of accessory sequences for Salmonella outbreak clustering. mBio. 16 (3), e0265024(2025).
  23. Fourteenth external quality assessment for Salmonella typing. , European Centre for Disease Prevention and Control. ECDC, Stockholm. (2025).
  24. Gomes, E., et al. Advances in whole genome sequencing for foodborne pathogens: implications for clinical infectious disease surveillance and public health. Front Cell Infect Microbiol. 15, 1593219(2025).
  25. Zhou, L., et al. Antimicrobial resistance and genomic investigation of Salmonella isolated from retail foods in Guizhou, China. Front Microbiol. 15, 1345045(2024).
  26. Zuo, H., et al. Comparative genomic and antimicrobial resistance profiles of Salmonella strains isolated from pork and human sources in Sichuan, China. Front Microbiol. 16, 1515576(2025).
  27. Feehan, J. M., et al. Purification of high molecular weight genomic DNA from powdery mildew for long-read sequencing. J Vis Exp. (121), e55463(2017).
  28. Jolley, K. A., Bray, J. E., Maiden, M. C. J. Open-access bacterial population genomics: BIGSdb software, the PubMLST.org website and their applications. Wellcome Open Res. 3, 124(2018).
  29. Yang, L., et al. Phylogeny and divergence of the 100 most common Salmonella serovars available in the NCBI Pathogen Detection database. Front Microbiol. 16, 1547190(2025).
  30. Zuo, H., et al. High-altitude exposure decreases bone mineral density and its relationship with gut microbiota: results from the China multi-ethnic cohort (CMEC) study. Environ Res. 215 (Pt 2), 114206(2022).
  31. Arrieta-Gisasola, A., et al. Genotyping study of Salmonella 4,[5],12:i:- monophasic variant of serovar Typhimurium and characterization of the second-phase flagellar deletion by whole genome sequencing. Microorganisms. 8 (12), 2049(2020).
  32. De Sousa Violante, M., et al. Genomic diversity of Salmonella Typhimurium and its monophasic variant in pig and pork production in France. Microbiol Spectr. 12 (12), e0052624(2024).
  33. Kong, X., et al. Phenotypic and genotypic characterization of Salmonella Enteritidis isolated from two consecutive food-poisoning outbreaks in Sichuan, China. J Food Safety. 43 (1), e13015(2022).
  34. Hong, W., et al. Integrating serotyping, MLST, and phenotypic data: decoding the evolutionary drivers of Salmonella pathogenicity and drug resistance. Appl Environ Microbiol. 91 (10), e0151125(2025).
  35. Lin, A., et al. Targeted next-generation sequencing assay for direct detection and serotyping of Salmonella from enrichment. J Food Prot. 87 (4), 100256(2024).
  36. van den Berg, O. E., et al. Ongoing increase in autochthonous Salmonella Enteritidis infections, the Netherlands, June 2023 to June 2025. Euro Surveill. 30 (30), 2500536(2025).
  37. Li, X., Oladeinde, A., Rothrock, M. Jr, Chung, T. J., Ghazi Al Hakeem, W. Using core genome and machine learning for serovar prediction in Salmonella enterica subspecies I strains. FEMS Microbiol Lett. 372, fnaf040(2025).
  38. Krüger, G. I., et al. Adaptive signatures of emerging Salmonella serotypes in response to stressful conditions in the poultry industry. Lwt. 215, 117188(2025).
  39. Gou, J., et al. Microbial biomarkers and sex-associated gut microbiota characteristics of thyroid cancer. BMC Cancer. 25, 1688(2025).
  40. Meng, J., et al. Medical laboratory data-based models: opportunities, obstacles, and solutions. J Transl Med. 23 (1), 823(2025).
  41. Wu, X., et al. Evaluation of multiplex nanopore sequencing for Salmonella serotype prediction and antimicrobial resistance gene and virulence gene detection. Front Microbiol. 13, 1073057(2022).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

MLSTMLST

מאמרים קשורים