מאמר שיטה

ייצור יעיל של תאי T של קולטני אנטיגן כימרי (CAR) עם טרנסגנים העולים על 10 ק"ב באמצעות וקטורים לנטיויראליים

DOI:

10.3791/69121

⸱

23 בינואר 2026

 ,  ,  , 
1Center for Cellular Immunotherapies, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, 2Department of Pathology and Laboratory Medicine, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, 3Parker Institute for Cancer Immunotherapy, University of Pennsylvania

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מציגים תהליך עבודה אופטימלי לייצור תאי T של קולטני אנטיגן כימרי (CAR) עם גנים טרנסג'ינים גדולים העולים על 10 קילו-באט, באמצעות וקטורים לנטי-ויראליים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הנדסת קולטנים מרובים לתאי T של קולטני אנטיגן כימריים (CAR) הפכה לאסטרטגיה עוצמתית למניעת הישנות שלילית לאנטיגן ולהפחתת רעילות הגידולים במטרה/מחוץ להם. עם זאת, ייצור תאי CAR T רב-קולטניים נותר מאתגר, שכן הגדלת גודל הטרנסגנים של הלנטי-ויראליים מפחיתה משמעותית את הטיטרים הוויראליים ואת קצב ההעברה של תאי T. תהליכי הייצור הנוכחיים מסתמכים לעיתים קרובות על מיון תאים להעשיר תאי T מועברים מייצור בתפוקה נמוכה. עם זאת, טכניקות מיון תאים אינן מגדילות את המספר המוחלט של תאי CAR T ומוסיפות מורכבות נוספת לתהליך הייצור המורכב ממילא. כתוצאה מכך, מגבלות אלו מעכבות את התרגום הקליני של תאי CAR T רב-קולטניים ומגבילים את התפתחות האימונותרפיות מהדור הבא.

כאן אנו מציגים תהליך ייצור מפורט שלב אחר שלב, מותאם ליצירת תאי CAR T עם טרנסגנים לנטיויראליים גדולים. באמצעות תהליך עבודה זה, אנו מראים עלייה תלויה בגודל ביעילות ההעברה בטווח גדלים של גנים טרנסדקטיביים, כאשר השיפור הבולט ביותר נצפה עד פי 14.8 עבור וקטור לנטיוויראלי של 10.1 קילו-בייט. חשוב לציין שזרימת העבודה תומכת בהרחבה חזקה של תאי T ומבטלת את הצורך במיון תאים. על ידי התגברות על מגבלות גודל נוכחיות בהעברת גנים לנטיויראליים, תהליך זה מאפשר יצירת תאי CAR T רב-קולטניים יעיל, ובכך מקל על פיתוח אימונותרפיות מתקדמות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

קולטני אנטיגן כימרי (CAR) תאי T חוללו מהפכה בתחום האימונותרפיה. עם זאת, למרות הצלחתם המרשימה, עדיין קיימים אתגרים קריטיים, כולל דיכוי חיסון המתווך על ידי מיקרו-סביבת הגידול (TME), חזרות גידולים שליליים לאנטיגן, ורעילות גידולים במטרה/מחוץ להן 1,2. הנדסת תאי CAR T עם מספר קולטנים סינתטיים, כגון CAR כפול, מבני CAR ו-TCR משולבים, או קולטני מתג ציטוקינים, יכולה להתגבר על מכשולים אלו 3,4. בסרטן הדם, ציוד תאי T אפקטוריים ב-CAR כפול מאפשר מיקוד בו-זמני של שני אנטיגנים מובחנים, כגון CD19 ו-CD205, ובכך מפחית את הסיכון לבריחת אנטיגן הגידול. בגידולים מוצקים, ניתן להפחית רעילות גידול במטרה/מחוץ להן על ידי הכנסת, למשל, מעגלי קולטנים סינתטיים מסוג Notch (synNotch) שמאפשרים ביטוי CAR עם שער לוגי ומשפרים את דיוק המיקוד 6,7,8,9,10,11,12,13 . עם זאת, ייצור תאי CAR T הנושאים מספר קולטנים נותר מאתגר בשל העלייה הבסיסית בגודל הגנים המועברים. וקטורים לנטי-ויראליים מהדור השלישי שמקורם בנגיף הכשל החיסוני האנושי (HIV) סוג 1 הם התקן הזהב הנוכחי לייצור תאי CAR T בקנה מידהמחקרי וקליני 14. כדי לייצר תאי T של CAR, וקטורי לנטי-ויראליים מתוכננים עם קלטות ביטוי CAR מותאמות אישית המוקפות ברצפי חזרה ארוכים (LTR), המתווכים אינטגרציה בגנום של תא T. קיבולת האריזה האפקטיבית המקסימלית (EPC) של וקטורי הלנטי-ויראליים הנוכחיים היא כ-9.2 קילובסיסים (kb) מ-LTR ל-LTR, התואם לגודל הגנום הטבעי של HIV-1. ככל שטיטרים לנטיויראליים יורדים חצי-לוגריתמית עם עלייה באורך הווקטור15, הנדסת טרנסגנים גדולים עם מספר קולטנים מפחיתה באופן דרסטי את ייצור הלנטי-וירוסים ולבסוף פוגעת בייצור תאי CART 16. בעוד שטכניקות מיון תאים, כגון מיון תאים מופעל על ידי פלואורסצנציה או מגנטית (MACS או FACS, בהתאמה), יכולות לשמש להעשיר תאי CAR T מייצור בתפוקה נמוכה, שיטות אלו אינן מגדילות את המספר המוחלט של תאי CAR T ומוסיפות מורכבות נוספת לתהליך ייצור שכבר מפורט. כתוצאה מכך, אתגרי ייצור של תאי CAR T עם טרנסגנים גדולים של לנטי-ויראליים ממשיכים להוות מחסום מרכזי הן למחקר פרה-קליני והן ליישום קליני.

לאחרונה הקמנו תהליך ייצור תאי CAR T מותאם לתאי T אפקטוריים הנושאים טרנסגנים לנטיויראליים גדולים, כמו מערכת סינוץ' חד-וקטורית (svsNotch)17. כאן, אנו מפרטים את המתודולוגיה בפרוטוקול שלב אחר שלב כדי להקל על אימוציה הרחב. כהוכחה לקונספט, אנו מראים שיפורים תלויים בגודל ביעילות ההעברה בטרנסדקציה בגדלי הלנטי-ויראליים, הנעים בין 5.7 קילובארט ל-9.2 קילובייט ו-10.1 קילובייט. בסך הכול, זרימת העבודה המותאמת הזו משפרת את קצב ההעברה עד פי 14.8, ובכך מבטלת את הצורך במיון תאים ומאפשרת יצירה יעילה של תאי T אפקטוריים עם גודל גנים טרנסג'נדרים העולים על 10 קילובייטים.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאי T אנושיים נרכשו דרך ליבת האימונולוגיה האנושית של אוניברסיטת פנסילבניה, הפועלת על פי עקרונות של פרקטיקות מעבדה טובות עם נהלי פעולה ו/או פרוטוקולים סטנדרטיים לקבלה, עיבוד, הקפאה וניתוח דגימות התואמים את קווי האתיקה של MIATA ואוניברסיטת פנסילבניה.

הערה: סקירה סכמטית של זרימת העבודה האופטימלית לייצור תאי T של לנטי-וירוס ו-CAR מוצגת באיור 1. השוואה בין שלבי האופטימיזציה המרכזיים לבין זרימת העבודה הסטנדרטית הנוכחית מסוכמת בטבלה 1. כל תרביות התאים נשמרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור לחות עם 5%CO2 באמצעות מדיום תאי T (TCM) המורכב מ-RPMI-1640 בתוספת 10% סרום בקר עוברי מנותק חום (FBS), 10 מ"מ בופר HEPES, 2 מ"מ L-אלניל-L-גלוטמין (ראו טבלת חומרים), 100 U/mL פניצילין ו-100 U/mL סטרפטומיצין.

figure-protocol-1
איור 1: תהליך עבודה אופטימלי לייצור תאי T של לנטיווירוס ו-CAR עם גנים טרנסג'נדרים גדולים. ייצוג סכמטי של ייצור לנטיווירוס (למעלה) ויצירת תאי CAR T (למטה), המדגים שלבים מרכזיים ואופטימיזציות שמגבירות את הטיטרים הוויראליים ויעילות ההעברה. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

תהליך עבודה סטנדרטיתהליך עבודה אופטימלי
וירוסמעטפה ויראליתVSV-GCocal-G
טרנספקציהL2000L30001
קציר LV24 שעות2 + 48 שעות230-36 שעות3
תא Tכלי שיטבקבוק T25פלטת תחתית שטוחה עם 96 בארות
יחס פני שטח לנפחמשתנה5.12 ס"מ2/מ"ל4
אדג'ובנטאיןSF1085
13 מיקרוליטר L3000 לכל 1 מיקרוגרם DNA, ללא שינוי מדיה
2צנטריפוגציה ב-106,800 x גרם ל-2.5 שעות, צינור תחתית עגול
3צנטריפוגציה ב-12,300 x גרם במהלך הלילה, צינור תחתית חרוטי
4תוספת מדיה נוספת לאחר ההמרה
555 מיקרוגרם/מ"ל

טבלה 1: השוואה בין זרימות עבודה סטנדרטיות ואופטימליות. אופטימיזציות מרכזיות של זרימת העבודה המשופרת בהשוואה לזרימת העבודה הסטנדרטית הנוכחית. טבלה זו הותאמה באישור רומל ואחרים. 17.

1. ייצור לנטיווירוס

  1. תחזוקת תאי HEK293T
    1. ודא HEK293T התאים מפוזרים באופן שווה, נקיים מגושים וביחס של 50-70% (תפוקה טיפוסית: 1.0-1.5 ×10 7 תאים לבקבוק T150).
    2. שאפו את הסופרנאנט, הוסיפו 20 מ"ל PBS בטמפרטורת החדר (RT) לצד העליון של הבקבוק כדי למנוע הסרת התאים, סובבו בעדינות PBS מעל התאים, ושאבו את השטיפה.
    3. הוסיפו 3 מ"ל של 0.05% טריפסין-EDTA ודגרו 15-30 שניות ב-RT תוך הטיית הבקבוק מצד לצד. לעקוב אחרי ניתוק התאים.
    4. הוסיפו 7 מ"ל של TM קר, החזירו את התאים לתחתית הבקבוק ליצירת תלייה חד-תאית, והעבירו לצינור של 50 מ"ל. שטוף את הבקבוקון עם 10-20 מ"ל של תרמיל סיני קר והוסף את השטיפה לאותו צינור.
    5. צנטריפוגה את התאים (300 × גרם, 5 דקות, 4 מעלות צלזיוס), שאפו את הסופרנאנט, הושפו מחדש ב-10 מ"ל של TCM, וספרו את התאים.
    6. תאי HEK293T בצלחות בבקבוקי T150 ב-3 × 10או 6 תאים לכל בקבוק למעבר כל יומיים (למשל, שני ורביעי) או ב-1 ×10 תאים לכל בקבוק למעבר כל 3 ימים (למשל, ציפוי ביום שישי למעבר בסוף השבוע) באמצעות 30 מ"ל של TCM מחומם מראש ל-37 מעלות צלזיוס.
  2. טרנספקציה של תאי HEK293T לייצור לנטיווירוס
    הערה: בצע ניסוי פיילוט קטן כדי לקבוע את צפיפות הזריעה שמניבה באופן עקבי 70-80% מפגש לאחר יומיים. ודא שחיבור התאים HEK293T לא עולה על 80% בזמן הטרנספקציה (ראו דיון). טרנספקציה אופטימיזציה באמצעות מדיום חיוני מינימלי עם סרום מופחת וחומרים מסחריים של ליפופקציה (L3000 ו-P3000, ראו טבלת חומרים).
    1. קציר HEK293T תאים באמצעות טריפסיניזציה כפי שתואר לעיל, ולוחית 4 ×10 6 תאים בכל בקבוק T150 עם 30 מ"ל TCM מחומם מראש ל-37 מעלות צלזיוס.
    2. לאחר יומיים, ודאו שהתרביות מפוזרות באופן שווה ו-70-80% מתאחדות.
    3. חממו 50 מ"ל של מדיום חיוני מינימלי עם סרום מופחת ל-RT. הפשרו פלסמידים לנטיויראליים, ערבבו בעדינות, וסובבו מהר. תגובות ליפופקציה של מערבולת פולס, סיבוב מהיר, ומשאירים אותם ב-RT.
    4. הכינו תערובות DNA ראשיות. לכל בקבוק, יש לשלב בסדר הבא: 2 מ"ל של מדיום חיוני מינימלי עם סרום מופחת, 39 מיקרוגרם של פלסמידים לנטיויראליים (18 מיקרוגרם pTRP Gag-Pol, 18 מיקרוגרם pTRP RSV-Rev, 3 מיקרוגרם pTRP Cocal-G), 15 מיקרוגרם פלסמיד העברה, ו-108 מיקרוליטר של תגובת P3000 (2 מיקרוליטר של P3000/μg DNA). הגדילו לפי הצורך והגדלו את הכמות הסופית לפחות ב-10% כדי להתחשב באובדן הפיפטינג. Pulse Vortex, סיבוב מהיר, ואחסון ב-RT.
    5. הכינו מיקסים מאסטר של L3000. לכל בקבוק, משלבים בסדר הבא: 1.84 מ"ל של מדיום חיוני מינימלי עם סרום מופחת ו-162 מיקרוליטר של L3000 (3 מיקרוליטר של L3000/μg DNA). הגדילו לפי הצורך והגדלו את הכמות הסופית לפחות ב-10% כדי להתחשב באובדן הפיפטינג. מערבולת פולס, סיבוב מהיר, ודגירה ב-RT למשך 5 דקות.
    6. לאחר 5 דקות, מוסיפים 2 מ"ל תערובת מאסטר L3000 לכל בקבוק לתערובת ה-DNA המתאימה כדי להשיג דילול בקירוב של 1:2. הוסף לאט לאט את תערובת L3000 מהתחתית של הצינור מבלי לגעת בצדדים. ערבבו היטב על ידי פיפטינג ודגרו 15 דקות ב-RT.
    7. בינתיים, הסר בזהירות 6 מ"ל של סופרנטנט מכל תרבית HEK293T ותייג כל בקבוק.
    8. לאחר 15 דקות, יש להעביר כל תרבית על ידי הטיית הבקבוק לכיוון העליון ושחרור איטי של 4 מ"ל תערובת טרנספקציה לתוך הסופרנטנט בצד העליון של הבקבוק כדי למנוע הזזת התאים. הפיפט לאט למעלה/למטה פעמיים, החזר את הבקבוק למקומו המקורי, סובב בעדינות, החזר אותו לאינקובטור ותעדים את הזמן.
      הערה: השאירו את התרביות ללא הפרעה עד לקטיף הלנטי-וירוס. בניגוד להמלצת היצרן להחליף את הסופרנטנט HEK293T המכיל את תערובת הטרנספקציה L3000 במדיום תרבית טרי לאחר טרנספקציה18, השמטת שלב זה שומרת על טיטרים גבוהים יותר של לנטיוויראלים17.
  3. קציר, ריכוז והקפאה של סופרנטנטים לנטיויראליים
    הערה: שמרו על סופרנטנטים לנטיויראליים על הקרח או בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס במהלך כל שלבי העיבוד כדי למנוע התדרדרות.
    אזהרה: וקטורים לנטיויראליים מסווגים כחומרים זיהומיים. יש להקפיד על אמצעי זהירות ביו-בטיחותיים מתאימים, כולל שימוש בציוד מגן אישי (למשל, כפפות כפולות, חלוקי מעבדה חד-פעמיים). חטא את כל משטחי העבודה עם 10% אקונומיקה ואחריה 70% אתנול. חיטוי מוצרי צריכה מזוהמים ופסולת נוזלית עם 10% אקונומיקה לפני ההשלכה כפסולת ביולוגית מסוכנת, בהתאם להנחיות הבטיחות הביולוגית המוסדיות.
    1. נקו ציוד אולטרה-צנטריפוגה (דליים, צינורות חרוטיים ומתאמים חרוטיים) עם 10% אקונומיקה, ואז שטפו במים. ייבוש קצר באוויר, לאחר מכן ריסוס עם 70% אתנול וייבוש באוויר מתחת למכסה תרבית טישו.
    2. קרר מראש את האולטרה-צנטריפוגה עם הרוטור המוכנס ל-4 מעלות צלזיוס.
    3. אספו סופרנטנטים לנטיויראליים 30-36 שעות לאחר הטרנספקציה על ידי העברתם לצינורות של 50 מ"ל. בהיר סופרנטנטים באמצעות צנטריפוגציה (500 × גרם, 5 דקות, 4 מעלות צלזיוס), סינון דרך פילטר נקבוביות של 0.45 מיקרון, ואחסן על קרח.
    4. הכנס מתאמים חרוטיים לדליים, העבר את הסופרנטנטים המסוננים לצינורות אולטרה-צנטריפוגה חרוטיים, והעמס אותם לדליים. איזון בין דליים מנוגדים ל-TCM קר, כדי להבטיח שהבדלי המשקל יהיו מתחת ל-0.1 גרם.
    5. ריכזו את הסופרנטנטים באמצעות אולטרה-צנטריפוגציה ב-12,300 × גרם בלילה בטמפרטורה של 4°C.
    6. למחרת בבוקר, הסר בזהירות את הדליים ואחסן אותם על קרח.
    7. הכינו קופסה עם קרח יבש להקפאה וקריוביאלים מסומנים לאליקוטינג.
    8. מתחת למכסה תרבית רקמה, פתח כל דלי והוציא את צינור האולטרה-צנטריפוגה שבתוכו עם מלקחיים. לכל צינור, יש להמשיך כך:
    9. שאף בזהירות את הסופרנטנט עד 0.5 אינץ' מתחתית הצינור ושפך את הנוזל שנותר לפלטה עם 6 בארות. טפחו בעדינות על הצינור כדי להסיר חלק מהנוזל שנותר.
    10. הוסיפו 300 מיקרוליטר של TCM קר, השערו בעדינות למשך 30 שניות, והעבירו את המתלה למקרר קריוביאלי.
    11. שטוף את הצינור ב-200 מיקרו ליטר של TCM קר והוסף את השטיפה לאותו מכשיר קריוביאלי.
    12. מערבבים בעדינות והפרישו 60 מיקרוליטר לטיטרינג לנטי-וירוס (ראו שלב 1.4), כמה אליקוטים של 100 מיקרוליטר לייצור תאי T של CAR, וצינור נוסף עם הנפח הנותר כשאריות. הקפיאו מיד את האליקוות על קרח יבש. העבר את הנקודות ל-80 מעלות צלזיוס לאחסון ארוך טווח.
  4. מדידת לנטיווירוס מרוכז באמצעות תאי T ראשוניים
    הערה: בערך 1 × 105 נדרשים תאי T לכל מילול לכל לנטיווירוס. לדוגמה, שישה לנטי-וירוסים עם שמונה דילול כל אחד דורש: 6 × 8 × 1 × 105 = 4.8 × 106 תאי T. יש להכין תאים נוספים כדי להתחשב באובדן הפיפטינג. תאי T מעוררים באמצעות חרוזי הפעלה מגנטיים המצופים בנוגדנים נגד CD3 ואנטי-CD28 (ראו טבלת חומרים).
    1. הפעלת תאי T (יום 0)
      1. דרישה מוקדמת: שמור על תאי T מאוהרים ב-CD4+ ו-CD8+ בבני אדם ב-TCM מוכנים.
      2. ספרו תאי T של CD4+ ו-CD8+ ומשלבים אותם ביחס של 1:1.
      3. שטוף את חרוזי ההפעלה כך: הוסף 1 מ"ל של TCM לצינור, החזיר את החרוזים לתלייה על ידי מערבולת והעבר את הכמות הנדרשת כדי להגיע ליחס של 3 ל-1 בין חרוזים לתאי T. הניחו את הצינור במעמד מגנטי ואפשרו לחרוזים ליצור כדור לאורך דופן הצינור. לאחר 30 שניות, שואף בזהירות את הסופרנאנט, הסר את הצינור מהעמדה המגנטית, ותלה מחדש את החרוזים ב-1 מ"ל של TCM. חזור על הכביסה עוד פעמיים.
      4. הוסיפו חרוזי הפעלה לתאי ה-T והתאימו את הריכוז הסופי ל-1 ×-106 תאים/מ"ל עם TCM מחומם מראש ל-37 מעלות צלזיוס.
      5. ערבב היטב והעבר את המתלים למאגר ריאגנט. תאי לוחות בלוחות שטוחים עם 96 בארות עם 100 מיקרוליטר TCM לכל באר באמצעות פיפטה רב-ערוצית. ערבבו היטב כל 1-2 דקות כדי למנוע שקיעת חרוזים.
    2. טרנסדוקציה לתאי T (יום 1)
      הערה: עבור לנטיווירוסים עם טרנסגנים גדולים (למשל, 9 kb LTR-to-LTR), יש להכין 6 תנאים באמצעות דילול סדרתי של 1:2 (לא מדולל, 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32). עבור לנטי-וירוסים עם טרנסגנים קטנים יותר (למשל, 7 קילובייט LTR ל-LTR), נדרשים 8 מצבים עם דילול סדרתי של 1:4. השתמשו בבארות שנותרו כבקרות לא מומרת (UTD).
      1. הפשרה של 60 מיקרוליטר מכל לנטיווירוס מרוכז ב-RT ואחסון על קרח.
      2. הכינו סדרת דילול בפלטת תחתית עגולה עם 96 בארות: הוסיפו 60 מיקרוליטר של לנטיווירוס לשורה העליונה, הוספו 30 מיקרוליטר של נוזל TCM קר לכל שורה מתחת, העבירו 30 מיקרוליטר מהשורה העליונה לשורה השנייה וערבבו (דילול 1:2), העבירו 30 מיקרוליטר מהשורה השנייה לשלישית וערבבו (דילול 1:4). המשך עד שיוכנו שישה תנאים בסך הכל (לא מדולל, 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32). השתמשו בו מיד להמרת.
      3. בין 23 ל-26 שעות לאחר גירוי החרוזים, המרו תאי T עם 25 מיקרו-ליטר לכל באר של לנטיווירוס מלוח הדילול באמצעות פיפטה רב-ערוצית. הוסף 25 מיקרוליטר של TCM לבארות הבקרה של UTD.
    3. האכלה בתאי T (יום 3)
      1. מוסיפים בעדינות 125 מיקרו-ליטר של TCM מחוממים מראש ל-37 מעלות צלזיוס לכל באר באמצעות פיפטה רב-ערוצית.
    4. הסרת חרוזים של תאי T וניתוח ציטומטריית זרימה (יום 5)
      1. הכינו שלושה סטים של צינורות מכסה בורג בנפח 1.5 מ"ל לכל מצב והסרו את המכסים. הניחו שניים מתוך שלושת הסטים במעמד מגנטי.
      2. תלו מחדש כל באר והעבירו את התאים לקבוצת הצינורות הראשונה כדי לאפשר לחרוזים ליצור כדור לאורך דופן הצינור. לאחר 30 שניות, העבר בזהירות את הסופרנטנטים לסט השני של הצינורות. המתינו 30 שניות (החרוזים כבר לא אמורים להיות גלויים), ואז העבירו את הסופרנטנטים לסט השלישי של הצינורות ואחסנו על קרח.
      3. צבע תאי T לסמן הטרנסדוקציה המתאים (למשל, אנטי-CD19 CAR או אנטי-HER2 synNotch) עם נוגדנים (ראו טבלת חומרים) וניתוח ביטוי סמן באמצעות ציטומטריית זרימה.
      4. זהה מצבים עם קצב טרנסדוקציה מתחת ל-30%, התואם בקירוב לטווח הליניארי בין נפח הווירוס לקצב ההעברה.
      5. חשב טיטרים של לנטיויראליים באמצעות הנוסחה הבאה:
        טיטר (TU/mL) = (מספר תאי T התחלתי x אחוז התאים המומרת x גורם דילול)/נפח הווירוס (mL)
        לדוגמה, ביטוי CAR של 20% עם דילול של 1:32 של מאגר הלנטי-ויראלי:
        (100,000 תאים x 0.2 x 32) / (0.025 מ"ל) = 2.56 ×10 7 TU/מ"ל

2. ייצור תאי T של CAR

הערה: הכמויות ההתחלתיות הטיפוסיות לייצור תאי CAR T הן 1-5 ×-106 תאי T לכל קבוצה. הגדלת מספר התאים בקבוצת הביקורת של UTD ב-50%, שכן קבוצה זו תשמש גם לנרמול רמות ההעברה בניסויים במורד הזרם. צפו להכפלת אוכלוסייה של 5-6 במהלך ההרחבה. טרנסדוקציה של תאי T אופטימלית באמצעות קופולימר בלוק כמשפר (ראו טבלת חומרים) ועם יחסי תרבית ספציפיים בין פני שטח לנפח בלוחות שטוחים עם 96 בארות17.

  1. הכנת תמיסת מאגר 100 מ"ג/מ"ל
    1. הוסיפו 5 גרם משפר קופולימר לבקבוק פלסטיק, ואז הוסיפו 45 מ"ל מים אולטרה-טהורים. ערבב לילה ב-RT.
    2. העבר את התמיסה לצילינדר מדורג וכוון את הנפח ל-50 מ"ל עם מים אולטרה-טהורים.
    3. סנן את התמיסה דרך מסנן נקבוביות של 0.22 מיקרון ואחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  2. הפעלת תאי T (יום 0)
    1. דרישה מוקדמת: שמור על תאי T מאוהרים ב-CD4+ ו-CD8+ בבני אדם ב-TCM מוכנים.
    2. ספרו תאי T של CD4+ ו-CD8+ ומשלבים אותם ביחס של 1:1.
    3. חרוזי הפעלה לשטוף כדלקמן.
      1. הוסיפו 1 מ"ל TCM לצינור, החזירו את החרוזים על ידי מערבולת והעבירו את הכמות הנדרשת להשגת יחס של 3 ל-1 בין חרוזים לתאי T. הניחו את הצינור במעמד מגנטי ואפשרו לחרוזים ליצור כדור לאורך דופן הצינור.
      2. לאחר 30 שניות, שואף בזהירות את הסופרנאנט, הסר את הצינור מהעמדה המגנטית, ותלה מחדש את החרוזים ב-1 מ"ל של TCM. חזור על הכביסה עוד פעמיים.
    4. הוסיפו חרוזי הפעלה לתאי ה-T והתאימו את הריכוז הסופי ל-1 ×-106 תאים/מ"ל כאשר ה-TCM מחומם מראש ל-37 מעלות צלזיוס.
    5. ערבב היטב והעבר את המתלים למאגר ריאגנט. תאי לוחות בלוחות שטוחים עם 96 בארות עם 50 מיקרוליטר TCM לכל באר באמצעות פיפטה רב-ערוצית. ערבבו היטב כל 1-2 דקות כדי למנוע שקיעת חרוזים.
  3. טרנסדוקציה לתאי T (יום 1)
    הערה: בחרו כמויות לנטי-וירוס בהתבסס על תוצאות הטיטרציה הקודמת, כדי להבטיח שרמות ההעברה הסופיות יהיו דומות בין קבוצות (בדרך כלל בין 20% ל-30%). כדי למנוע אינטגרציות לנטי-ויראליות מרובות, שמרו על רמות הטרנסדוקציה המקסימליות ≤ 30%. לנטיווירוסים עם טרנסגנים גדולים בדרך כלל דורשים או וירוס לא מדולל או דילול של 1:4-1:8. התאם את גודל הקבוצות כדי להימנע משאריות לנטיווירוס, שכן כל מחזור הקפאה-הפשרה מפחית את הטיטרים של הלנטיויראליים. השתמש בתערובות לנטיויראל מאסטר מיד לאחר ההכנה.
    1. הפשרו את הכמויות הנדרשות של לנטיווירוס מרוכז ב-RT ואחסנו על קרח.
    2. הכינו מלאי עבודה של משפר 2 מ"ג/מ"ל ב-TCM קר על ידי ערבוב, למשל, 100 מיקרוליטר של משפר (100 מ"ג/מ"ל) עם 4.9 מ"ל של TCM.
    3. הכינו תערובות לנטי-וירוס על בסיס תוצאות הטיטרציה והוסיפו מגבר לריכוז סופי של 275 מיקרוגרם/מ"ל. הגדילו את הנפח הסופי לפחות ב-10% כדי להתחשב באובדן פיפטינג. לדוגמה, כדי להשיג דילול של 1:16 עם 100 בארות:
      נפח כולל: 100 בארות × 12.5 מיקרוליטר לנטיווירוס × 110% = 1,375 מיקרוליטר
      1:16 דילול: 1,375 מיקרוליטר/16 = 85.9 מיקרוליטר של לנטיווירוס
      משפר: 189 מיקרוליטר (275 מיקרוגרם/מ"ל סופי)
      תערובת מאסטר סופית: 1,100 מיקרוליטר של TCM + 85.9 מיקרוליטר לנטיווירוס + 189 מיקרוליטר של מגבר = 1,375 מיקרוליטר
    4. בין 23 ל-26 שעות לאחר גירוי החרוזים, המרו תאי T עם 12.5 מיקרו-ליטר לבאר תערובת מאסטר של לנטיווירוס באמצעות פיפטה רב-ערוצית, מה שמוביל לריכוז המגבר הסופי של 55 מיקרוגרם/מ"ל. הוסף 12.5 מיקרוליטר של TCM לבארות הבקרה של UTD.
  4. האכלה בתאי T (יום 3)
    1. מוסיפים בעדינות 125 מיקרו-ליטר של TCM מחוממים מראש ל-37 מעלות צלזיוס לכל באר באמצעות פיפטה רב-ערוצית.
  5. הסרת תאי T (יום 5)
    הערה: הכינו מאגר סטרילי ושלושה סטים של צינורות של 50 מ"ל לכל תרבית. הגבל את נפח השטיפה הכולל ל-≤ 20% מנפח תרבית תאי T כדי למנוע דילול תאים מתחת ל-8 × 105 תאים למ"ל.
    1. מחברים כל תרבית למאגר סטרילי באמצעות פיפטה רב-ערוצית, שטפו את הלוחות המקוריים עם TCM, והוסיפו את השטיפה למאגר. העבר כל מתלה תא לסט הראשון של צינורות 50 מ"ל.
    2. הנח את הצינורות במעמד מגנטי כדי לאפשר לחרוזים ליצור כדור לאורך דופן הצינור. לאחר 30 שניות, העבר בזהירות את הסופרנטנטים לסט השני של הצינורות ומניח אותם במעמד המגנטי. המתינו 30 שניות (החרוזים כבר לא אמורים להיות גלויים), ואז העבירו את הסופרנטנטים לסט השלישי של הצינורות ואחסנו אותם באינקובטור.
    3. סופרים כל תרבית ומנרמל ל-8 ×10 5 תאים למ"ל כאשר ה-TCM מחומם מראש ל-37 מעלות צלזיוס. הצלחת בכלי הגידול המתאים בהתאם לנפח הסופי (טבלה 2).
    4. אפשר לתאי ה-T לנוח יום אחד, ואז להתחיל בהאכלה יומית החל מהיום השביעי (ראו שלב הבא).
  6. האכלה בתאי T (יום 7 ויום יומי לאחר מכן)
    הערה: תאי T מתכפלים בערך כל 24-36 שעות ועוברים הכפלת אוכלוסייה של 5-7 לפני המנוחה. מעקב אחר נפחי תאי T באמצעות מונה תאים מבוסס התנגדות חשמלית (ראו טבלת חומרים) כדי לזהות את נקודת הזמן האופטימלית לשימור קריופרטיבי.
    1. איחד כל תרבית, ערבב היטב וספר את התאים.
    2. נרמול כל תרבית ל-8 ×-105 תאים/מ"ל כאשר ה-TCM מחומם מראש ל-37 מעלות צלזיוס, והחליף את הצלחות בכלי התרבית המתאים (טבלה 2).
    3. ממשיכים להתרחב עד שנפח התא הממוצע יורד מתחת ל-320 מיקרון3, ואז עברו לשלב השימור בהקפאה.
  7. אימות של טרנסדוקציה של תאי T באמצעות ציטומטריית זרימה
    הערה: ניתן להעריך העברת תאי T בכל שלב בין היום החמישי ליום הקריושימור. רמות הביטוי ירדו במהלך ההתרחבות, כך שמדידה מוקדמת תבטיח הפרדה ברורה של שברים שליליים וחיוביים במהלך ניתוח ציטומטריית זרימה.
    1. קצור 2 ×-10תאי T מכל תרבית.
    2. צבע תאי T עבור סמן ההעברה המתאים (למשל, אנטי-CD19 CAR או אנטי-HER2 synNotch) עם נוגדנים (ראו טבלת חומרים) וניתוח ביטוי הסמנים באמצעות ציטומטריית זרימה
  8. שימור תאי T בהקפאה (בדרך כלל בין הימים 10-12)
    הערה: קריו-שימור הרחיב את תאי ה-T ממש לפני או אחרי מצב המנוחה שלהם כדי לשפר את החיוניות במהלך הפשרה. נפח ממוצע של 320 מיקרוןל-3 יכול לשמש כנקודת חיתוך לשימור קריופ. כאשר נפח התאים יורד מתחת ל-300 מיקרומטר3, תאי T מפסיקים להתחלק, ומספרם הכולל מתחיל לרדת. ודא שלכל הקבוצות יש נפחים דומים בנקודת השימור בהקפאה, מה שעשוי לדרוש יום נוסף של תרבות עבור חלק מהקבוצות. הקפיאו תאים בקצב קבוע של -1°C לדקה באמצעות מיכלי הקפאה מתאימים (למשל, מיכלי הקפאה ללא אלכוהול, ראו טבלת חומרים).
    1. אסוף כל תרבית לצינור מתאים (למשל, 500 מ"ל), סופר את התאים, ואחסן אותם באינקובטור.
    2. חשב את מספר התאים הכולל ואת סכומי האליקוט הרצויים.
    3. תאי צנטריפוגה (300 × גרם, 10 דקות, 4 מעלות צלזיוס), שואבים את הסופרנטנטים, ומחזירים כל תרבית לתווך הקפאה המכיל 50% מדיה ללא סרום, 40% FBS מושבת חום, ו-10% דימתיל סולפוקסיד (DMSO) ב-2 × 107 תאים/מ"ל (ראו טבלת חומרים).
    4. תאים אליקווט לקריוביאלים (250 מיקרוליטר עד 1 מ"ל, המתאימים ל-5-20 × 106 תאים לכל בקבוקון). הניחו את הקריוביאלים במיכל הקפאה לתאים ואחסנו אותם בטמפרטורה של מינוס 80°C במהלך הלילה.
    5. העבר את הקריוביאלים לחנקן נוזלי לאחסון ארוך טווח.
  9. הפשרת תאי T
    הערה: לכל קבוצת תאי T, יש להכין צינור אחד עם 50 מ"ל של TCM מחומם מראש ל-37 מעלות צלזיוס כדי לדלל את ה-DMSO בתווך הקפיא לאחר הפשרה. חממו תרסיס סיני נוסף לציפוי.
    1. הפשרו במהירות את הקריוביאלים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באמבט מים או תחת מים חמים זורמים.
    2. ברגע שהנוזל נראה, יש לגשת למכסה תרבית רקמות, להוסיף 500 מיקרוליטר של TCM מחומם מראש, לערבב בעדינות ולהעביר את התאים לצינורות המוכנים המכילים 50 מ"ל TM.
    3. שטוף את הקריוביל עם 500 מיקרוליטר של TCM והוסף את השטיפה לאותו צינור.
    4. דגר את התאים ל-10 דקות ב-RT.
    5. תאי צנטריפוגה (300 × גרם, 10 דקות, טמפרטורת החדר), שואבים את הסופרנטנטים, ומחזירים את התאים ל-4 ×10 6 תאים למ"ל.
    6. הצלחתי את התאים לכלי התרבית המתאים (טבלה 2).
    7. נח את התאים ללילה באינקובטור לפני שממשיכים בניסויים במורד הזרם.
כלי שיטנפח מינימלינפח מקסימלי
באר 960.1 מ"ל לבאר*0.25 מ"ל לבאר
48-באר0.2 מ"ל לבאר1 מ"ל לבאר
24 בארות0.5 מ"ל לבאר2 מ"ל לבאר
12-בארות1 מ"ל לבאר4 מ"ל לבאר
6-בארות2 מ"ל לבאר6 מ"ל לבאר
T25 (אופקי)3 מ"ל8 מ"ל
T75 (אופקי)8 מ"ל20 מ"ל
T150 (אופקי)20 מ"ל60 מ"ל
* נפח התרבית מופחת זמנית ל-50 מיקרוליטר/באר כדי לשפר את ההעברה של תאי T

טבלה 2: נפחי מדיה מומלצים לתרבית להרחבות תאי T של CAR. נפחי מדיה מינימליים ומקסימליים בין פורמטים נפוצים של כלי שיט במהלך הרחבת תאי T.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדי להדגים את השיפורים שהושגו באמצעות תהליך העבודה האופטימלי (איור 1) במגוון רחב של גדלי טרנסגנים, בחרנו שלושה גדלי וקטורים לנטיויראליים: 5.7 קילובטים (CD19 CAR), 9.2 קילובטים (HER2-MSLN svsNotch), ו-10.1 קילובטים (HER2-MSLN-CBG svsNotch) (איור 2A). לנטי-וירוסים יוצרו בתנאים סטנדרטיים או אופטימליים (איור 2B: מחלות מיניות לעומת אופט וטבלה 1).

עבור הווקטור הקטן ביותר עם 5.7 קילובייט, נצפה שיפור בינוני בלבד בהעברת תאי T באצווה אחת לייצור (איור 2B: עליון, 73% לעומת 88% בשימוש בנגיף לא מדולל). באופן עקבי, טיטרים של לנטיויראליים עלו רק במידה מתונה בכ-1.5 פעמים (איור 2C: למעלה, 2.86 × 10⁸ TU/מ"ל לעומת 4.35 × 10⁸ TU/mL). לעומת זאת, וקטור 9.2 קילובטים הראה שיפור משמעותי בביצועים, כאשר קצב ההעברה המקסימלי של תאי T עלה בכ-5.4 או פי 3.8 בהתאם לאצווה (איור 2B: אמצע, 8.3%/16.6% לעומת 45.1%/63.1% באמצעות וירוס לא מדולל) וטיטרים פונקציונליים השתפרו בכ-3.3 פעמים (איור 2C: באמצע; 3.1 × 10⁶ TU/mL לעומת 10.1 × 10⁶ TU/mL). ההשפעה החזקה ביותר נראתה עם וקטור 10.1 קילובייט, שבו קצב הטרנסדוקציה עלה בכ-12.4 או פי 9.8 (איור 2B: תחתית, 1.4%/1.5% לעומת 17.3%/14.7% באמצעות וירוס לא מדולל) והטיטרים התפקודיים השתפרו בערך פי 10 (איור 2C: תחתית, 0.24 × 10⁶ TU/mL לעומת 2.41 × 10⁶ TU/mL).

לאחר מכן, תאי T מתורמים בריאים הועברו עם וקטורים לנטיויראליים שנוצרו בתנאים סטנדרטיים או מותאמים, תוך שימוש בזרימות העבודה המתאימים (איור 3 וטבלה 1). להשוואת יעילות ההעברה, השתמשו בכמויות שוות של לנטי-וירוס בכל תהליך עבודה, ומינון הווירוס הותאם לשמור על קצב ההמרה של 30% או מתחת למניעת אירועי אינטגרציה מרובים. בהשוואה לתאי T שהועברו בתנאים סטנדרטיים ובאמצעות ייצור לנטי-וירוס סטנדרטי, הטרנסדוקציה עלתה בממוצע פי 5.1 עבור וקטור של 5.7 קילובייט, פי 13.3 עבור וקטור של 9.2 קילובייט, ופי 14.8 עבור וקטור של 10.1 קילו-בייט (איור 3A וטבלה משלימה 1). תרביות תאי T נבחרות שנוצרו עם זרימת העבודה האופטימלית הורחבו עוד עד שהגיעו למצב מנוחה (איור 3B,C). הכפלת האוכלוסייה נעה בין 5.3 ל-6.7, בהתאם לתורם תאי T (איור 3B). מדידות יומיות של נפח תאי T הראו פסולת תא מינימלית, מה שהצביע על חוסר סימני רעילות במהלך ההתפשטות. לפני שימור הקריאופי, שיעורי ההעברה הוערכו על ידי צביעה לביטוי קולטני CAR/synNotch או על ידי מדידת פלואורסצנציה mTag-BFP219 (איור 3C ואיור משלים 1). שיעורי הטרנסדוקציה היו 31.2% עבור וקטור 5.7 קילובייל (שחור; דילול 1:512 לנטיווירוס), 29.8% עבור וקטור 9.2 קילובי (אדום; דילול 1:16 לנטיווירוס), ו-20.2% עבור וקטור 10.1 קילוב (כחול; דילול 1:4 לנטיווירוס). נתונים פונקציונליים נוספים המאמתים את ביצועי תאי ה-T של svsNotch ותאי CAR T שנוצרו מוצגים במחקר הנלווהשלנו 17. חשוב לציין שתאי T אפקטורים שיוצרו עם הפרוטוקול האופטימלי לא הראו הבדלים בהכפלת האוכלוסייה או בפנוטיפ תאי T לעומת אלו שנוצרו בתהליך העבודה הסטנדרטי17.

figure-results-1
איור 2: ייצור לנטיוירוס בהתאם לתהליכי עבודה סטנדרטיים ואופטימליים. (א) סקירה סכמטית של וקטורים לנטיויראליים עם גדלי טרנסגנים תואמים17. עליון: CAR מול CD19 (CD19 CAR) מתבטא על ידי פרומוטר ה-EF1α של גורם ההארכה האנושי, עם גודל טרנסגן כולל של כ-5.7 קילובייט. אמצע ותחתון: קולטן סינוץ' HER2 מבוטא יחד עם חלבון מדווח כחול-פלואורסצנטי (BFP2) (באמצע) או עם לוסיפראז ירוק של חיפושית קליק (CBG) (תחתית) באמצעות פפטיד 2A חותך את עצמו (P2A) על ידי פרומוטר EF1α. הביטוי של CAR (MSLN CAR) המכוון למזותלין (MSLN) נשלט על ידי פרומוטר ציטומגלוווירוס מינימלי (CMV) ספציפי ל-GAL4 (GAL4-CMV). הגודל הכולל של הגנים המועברים הוא כ-9.2 קילובייט עבור ה-HER2-MSLN svsNotch (האמצעי) ו-10.1 קילובייט עבור ה-HER2-MSLN-CBG svsNotch (תחתית). SIN = וקטור משבטל את עצמו; LTR = רצף חזרה טרמינלי ארוך. (B) טרנסדוקציה של תאי T עם דילול סדרתי של לנטי-וירוס שנוצר בתנאים סטנדרטיים (std) ואופטימליים (opt) באמצעות הווקטורים המתוארים ב-(A). שתי הפקות עצמאיות (מעגלים ומשולשים) לכל וקטור עם שתי אצוות, ושני תורמי תאי T נפרדים בכל אצווה. שיעורי ההעברה נמדדו בממוצע בין תורמי תאי T. (ג) טיטרים פונקציונליים של וירוסים סטנדרטיים (מחלות מקשר, עיגולים פתוחים) ואופטימליים (אופטימיים, מעגלים סגורים) המוצגים ב-(B). הנתונים נוצרו משתי הפקות לנטי-וירוס עצמאיות, כל אחת עם שתי אצוות, תוך שימוש בשני תורמי תאי T נפרדים בכל אצווה. כל פסי השגיאה מציינים ממוצע ± SD. המובהקות הסטטיסטית חושבה באמצעות מבחן t זוגי דו-זנב. *p < 0.03, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. איור זה הותאם באישור רומל ואחרים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-2
איור 3: ייצור תאי CAR T עם תהליכי עבודה סטנדרטיים ואופטימליים. (A) עלייה בקצב ההמרה של תאי T עם זרימת העבודה האופטימלית (opt) בהשוואה לזרימת העבודה הסטנדרטית (std) (ראו גם טבלה S1). הנתונים התקבלו משתי או שלוש התרחבויות תאי T עצמאיות באמצעות תורמים מובחנים ושני ייצור לנטיווירוס עצמאיים. (ב) הכפלת אוכלוסייה של הרחבות תאי T שנוצרה באמצעות זרימת עבודה אופטימלית. לכל וקטור מוצגות שתי התרחבות תאי T בלתי תלויות מתורמים נורמליים (ND) שונים, שכל אחת משתמשת בייצור לנטיווירוס נפרד. (ג) גרפים של ציטומטריית זרימה המראים ביטוי קולטני CAR, BFP2 וסינוץ' בתאי T אפקטורים מורחבים ביום 7 (10.1 קילוב) או ביום העשירי (5.7 קילובאט ו-9.2 קילוב) (ראו גם איור 1 המשלים). כל פסי השגיאה מציינים ממוצע ± SD. המובהקות הסטטיסטית חושבה באמצעות מבחן t זוגי דו-זנב. *p < 0.03, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. איור זה הותאם באישור רומל ואחרים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור משלים 1: אסטרטגיית גייטינג להערכת ביטוי של CAR, קולטן synNotch ו-BFP2, בהקשר לאיור 3C. גרפים של ציטומטריית זרימה מייצגת המציגים את אסטרטגיית השער ששימשה לקביעת ביטוי CAR, synNotch ו-BFP2 בתרביות תאי T מורחבות. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

טבלה משלימה 1: קצבי טרנסדוקציה בין התפשטות תאי T בודדים, קשורים לאיור 3A. קצבי העברה של הרחבות תאי T שנוצרו באמצעות זרימות עבודה סטנדרטיות ואופטימליות. טבלה זו הותאמה באישור רומל ואחרים. 17. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן אנו מציגים פרוטוקול שלב אחר שלב המתאר תהליך ייצור אופטימלי לתאי CAR T עם טרנסגנים לנטיויראליים גדולים, כגון תאי T מסוג svsNotch. תהליך זה מבטל את הצורך במיון תאים ומאפשר יצירת תאי T אפקטוריים יעילים הנושאים טרנסגנים לנטיויראליים גדולים. באמצעות תהליך עבודה זה, אנו מייצרים באופן שגרתי תאי T אפקטורים עם טרנסגנים של לנטי-ויראליים של 9-10 קילובטים וקצב טרנסדוקציה מקסימלי של 60-70% (9 קילובייט) או 15-20% (10 קילובייט).

בעת פתרון תקלות של טיטרים נמוכים או שיעורי טרנסדוקציה נמוכים, יש לקחת בחשבון מספר גורמים מרכזיים. ראשית, איכות תאי HEK293T. חשוב שתאי HEK293T יעברו לפי לוח זמנים עקבי ולעולם לא יאפשרו להם לגדול מעבר ל-50-70% קונגלוויזציה. לפי ניסינו, וקטורים לנטיויראליים שנוצרים מתאי HEK293T שהיו בעבר גדלים יתר על המידה מראים טיטרים מופחתים, גם כאשר התאים נראים מורפולוגית שוקמו. אנו מייצרים באופן שגרתי וקטורים ויראליים בעלי טיטר גבוה באמצעות תאים HEK293T מעבר למעבר 30, מה שמעיד שמספרי מעבר גבוהים יותר נסבלים אם התאים מתוחזקים כראוי. בנוסף לאיכות התא, המפגש בין HEK293T התאים בזמן הטרנספקציה הוא גורם קריטי. ראינו ירידה בטיטרים של לנטיווירוס בעת העברת תאי HEK293T במפגש גבוה (90-100%).

שנית, הקפדה קפדנית על התזמונים, הריכוזים והנפחים המפורטים בפרוטוקול זה היא חיונית, שכן שלבים רבים עברו אופטימיזציה יסודית במחקר קודם17. לדוגמה, משפר הקופולימר (ראו טבלת חומרים) עבר טיטרציה כדי למקסם את קצב ההעברה ללא רעילות ניתנת לזיהוי. בעוד שריכוזים גבוהים יותר יכולים להגביר עוד יותר את ההעברה, הם גם גורמים לרעילות ומפחיתים את התפשטות תאי T. באופן דומה, קטיף סופרנטנטים לנטיויראליים מחוץ לחלון המומלץ של 30-36 שעות (למשל, ב-24 שעות או 48 שעות) הניב טיטרים נמוכים יותר בניסוי זמןמקביל 17. לעומת זאת, היצמדות קפדנית ליחס תאי T של 1:1 בין CD4 ל-CD8 אינה הכרחית, שכן לא ראינו הבדלים משמעותיים ביעילות ההעברה בעת שימוש בתאי T בתפזורת עם התפלגות משתנה של CD4/CD8. עם זאת, סטיות מיחס זה עשויות להשפיע על משך ההתרחבות ועל מספר ההכפלות באוכלוסייה. לכן, בדרך כלל אנו שומרים על יחס 1:1 בין CD4 ל-CD8 לצורך עקביות בין הניסויים.

מאמצי אופטימיזציה עתידיים עשויים להתמקד באסטרטגיות נוספות לשיפור העברת תאי T באמצעות טרנסגנים לנטיויראליים גדולים אף יותר, כגון נוסחאות מדיה מיוחדות או משטרי ציטוקינים מותאמים אישית. הרחבת תהליך זה לסוגי תאי חיסון אחרים, כולל תאי רוצח טבעיים ומאקרופאגים, עשויה להרחיב את יישומיו הטיפוליים. חשוב לציין שתרגום קליני של תהליך עבודה זה עשוי גם לסייע בהפחתת עלויות הייצור של מוצרי טיפול תאים מותאמים בלנטיווירוס.

הפרוטוקול המקיף שלב אחר שלב המוצג כאן מספק התייחסות מעשית לייצור תאי CAR T עם טרנסגנים לנטיויראליים גדולים ומניח את היסודות לפיתוח תאי CAR T חדשים נגד סרטן מוצק וסרטן דם.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

P.C.R. היא ממציאה בתחום הפטנטים ובקשות פטנט המורשות ל-Kite Pharma ומקבלת הכנסות רישיונות מהרישיונות הללו. B.L.L. הוא ממציא בתחום פטנטים ו/או בקשות פטנט המורשות למכוני נוברטיס למחקר ביו-רפואי ול-Kite Pharma, ומקבל הכנסות רישיונות מהרישיונות הללו. B.L.L. הוא מייסד מדעי של Tmunity Therapeutics ו-Capstan Therapeutics. B.L.L. היא חברה במועצות הייעוץ המדעיות של Avectas, Capstan Therapeutics, Cellula Therapeutics, Immuneel Therapeutics, Immusoft, In8bio, Ori Biotech, Oxford Biomedica, Quell Therapeutics, ThermoFisher Pharma Services ו-UTC Therapeutics. B.L.L. הוא יועץ ב-12 החודשים האחרונים עבור אסטרהזנקה, ביומריו, קייט גילעד ומכון לודוויג לחקר סרטן. C.H.J. הוא ממציא בתחום פטנטים ו/או בקשות פטנט המורשים ל-Novartis Institute of Biomedical Research, Kite Pharma, Capstan Therapeutics, Dispatch Biotherapeutics ו-BlueWhale Bio. C.H.J. הוא חבר בוועדות הייעוץ המדעיות של AC Immune, BluesphereBio, BlueWhale Bio, Cabaletta, Cartography, Cellares, Celldex, Decheng, Qihan Biotech, Shinobi Therapeutics, Verismo, ViTToria Bio ו-WIRB-Copernicus.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו רוצים להודות לכל חברי מעבדת יוני, וכן ליוהנס סי. מ. ואן דר לו, דיוונשו שוקלה וג'יימס ל. ריילי, על דיוניהם. בנוסף, אנו מבקשים להודות למקס אלדאבאס, אמילי מדוקס, טנישק סינה וג'יאי שו מליבת האימונולוגיה האנושית בבית הספר לרפואה פרלמן באוניברסיטת פנסילבניה, על מתן תאי T אנושיים מטוהרים. לבסוף, אנו מבקשים להודות למעבדת המשאבים המשותפת Penn Cytomics and Cell Sorting על תחזוקת מכשירי הציטומטר הזרימה שלנו. P.C.R. נתמך על ידי המכון הלאומי לסרטן (מספר מענק 5T32CA009140).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
נוגדן - אנטי-CD19 CARסייטוארט200101אנטי-CD19 CAR (אידיוטייפ), AF647-קונוגטציה, 1:100
נוגדן - אנטי-HER2 synNotchR& D SystemsFAB95471Gאנטי-טרסטוזומאב (אידיוטיפי), AF488-קונוגטיבי, 1:80
אקונומיקהקלורוקסאקונומיקה קוטלת חיידקים
מיכל הקפאת תאיםביוציזיהFTS30ללא אלכוהול
צנטריפוגה (גדולה)תרמו-סיינטיפיקלג'נד XTR
צנטריפוגה (מיני)פישר סיינטיפיקספראוט פלוס
צנטריפוגה (קטנה)אפנדורף5425
מונה קולטרבקמן קולטרמולטיסייזר 4מונה תאים מבוסס התנגדות חשמלית שקובע את מספר התאים ונפחי התאים
צינורות קריותרמו-סיינטיפיק375418
דימתיל סולפוקסיד (DMSO)טכנולוגיית איתות סלולרי12611P
DPBS (ללא סידן, ללא מגנזיום)גיבקו14190-136
דיינאבידס (CD3/CD28)גיבקו40203Dחרוזי הפעלה המשמשים לגירוי תאי T
אתנולמעבדות דקוןהוכחת 200
FBS (מושבת חום)אוונטור (VWR)97068-091
ציטומטר זרימהBDLSRFortessa (647177)
מקפיא (-80 & דרג; C)פנאסוניקMDFU76VA-PA
מקפיא (חנקן נוזלי)MVE HEco1500-190
מקרר (4 מעלות ומעלות; C)פישר סיינטיפיקאיזוטמפ
כפפות (ניטריל)הליארד55082
תוסף GlutaMAXגיבקו35050-061L-אלניל-L-גלוטמין 
HEPES (1M)גיבקו15630-080
קרח (יבש)נ.א.נ.א.
קרח (רטוב)נ.א.נ.א.
דלי קרחפישר סיינטיפיק07-210-108
מעיל מעבדה (חד-פעמי)קפלרPVS112WH-MD
פלסמידי אריזה לננטיויראלייםקניינינ.א.pTRP Gag-Pol, pTRP RSV-Rev, pTRP Cocal-G
פלסמידים לנטיויראליים להעברת מידעקניינינ.א.לדוגמה, pTRPE svsNotch
ליפופקטמין 3000 מגיב טרנספקציהInvitrogenL3000015מגיב ליפופקציה מסחרי; מכיל ליפופקטמין 3000 (L3000) ומגיב המגבר שלו (P3000)
מעמד מגנטי (גדול)תאי גזעאיזיספטמפ 18103ל-5 מ"ל/15 מ"ל
מעמד מגנטי (קטן)InvitrogenDynaMag-2 12321Dלצינורות של 1.5 מ"ל
מוט ערבוב מגנטיפישר סיינטיפיק14-513-82ערכת מוט קטן
פלטפורמת ערבוב מגנטיתתרמו-סיינטיפיקS88857100
גליל מדידה (100 מ"ל)VWR76019-316 
מים ב-MQמרקQ-PODמים אולטרפו; משתמש במסנן סופי Millipak 40 Express, 0.22 מיקרון (MPGP04001)
פיפטה רב-ערוציתפישר סיינטיפיקראו תגובות30-300 ומיקרו; L:  FBE1200300; 5-50 ומיקרו; L:  FBE1200050
Opti-MEM (עם L-גלוטמין, פנול אדום)גיבקו31985-070מדיום חיוני מינימלי עם סרום מופחת המשמש להעברת DNA
פניצילין-סטרפטומיצין (10,000 U/mL, 10,000 ומיקרו; g/mL)גיבקו15140-122
פיפטיםפישרברנדראו תגובות50 מ"ל: 13-678-11F; 25 מ"ל: 13-678-11; 10 מ"ל: 13-678-11E; 5 מ"ל: 13-678-11D
פיפטים (שאיפות)פלקון3575582 מ"ל
פיפטהגילסוןPIPETMAN P10/P20/P200/P1000
בקר פיפטההירשמןפיפטוס Z314951
טיפים של פיפטהתומאס סיינטיפיקראו תגובות1000 ומיקרו; L: 1159M42; 200 ומיקרו; אורך: 1159M40; 20 ומיקרו; L: 1159M43; 10 ומיקרו; L: 1159M41
בקבוק אחסון מפלסטיק (500 מ"ל)קורנינג430282
מאגר ריאגנטסלטריט3054-2007
RPMI-1640 (עם L-גלוטמין, פנול אדום)גיבקו11875-085
קנה מידהאוהאוסחלוץדיוק מינימלי של 0.1 גרם נדרש
מסנן סטריפליפ (0.45 & מיקרו; m)מיליפורSE1M003M00
סינפרון F 108 (SF108)סיגמא-אלדריץ'07579-250G-Fקופולימר בלוקים המשמש לשיפור הטרנסדוקציה של תאי T
בקבוק תרבית רקמה - T150קורנינג430825
בקבוק תרבית רקמות - T25קורנינג430639
בקבוק תרבית רקמה - T75קורנינג430641U
מכסה תרבית רקמהתרמו-סיינטיפיקסדרת 1300 A2
חממת תרבית רקמהתרמו-סיינטיפיקהרסל 150i
צלחת תרבית רקמה - 6 בארותקורנינג3516
צלחת תרבית רקמה - 96 בארות שטוחהפלקון353072
צלחת תרבית רקמה - 96 בארות עגולה-תחתית פלקון353077
Trypsin-EDTA (0.05%)גיבקו25300-054
צינורות - פקקי בורג בגודל 1.5 מ"לסארסטדט72692005
צינורות - 15 מ"לפלקון352099
שפופרות - 5 מ"לMSP62-1028-2
צינורות - 500 מ"לקורנינג431123
צינורות - 50 מ"לפלקון352098
אולטרה-צנטריפוגהבקמן קולטראופטימה XPN-100
רוטור אולטרה-צנטריפוגה עם דלייםבקמן קולטרSW 32 Ti
מתאמי צינורות אולטרה-צנטריפוגה (לצינורות חרוטיים)סיטון סיינטיפיק4230
צינורות אולטרה-צנטריפוגה (קוניקליים)סיטון סיינטיפיק5067
מערבולתפישר סיינטיפיק02215414
אמבט מים (37 מעלות; C)פישר סיינטיפיקאיזוטמפ 210משמש עם חרוזי Lab Amor (Gibco) במקום מים
X-VIVO-15לונזה04-418Qמדיה ללא סרום המשמשת להקפאת תאי T

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sterner, R. C., Sterner, R. M. CAR-T cell therapy: current limitations and potential strategies. Blood Cancer J. 11 (4), 69(2021).
  2. Wagner, J., Wickman, E., Derenzo, C., Gottschalk, S. CAR T cell therapy for solid tumors: Bright future or dark reality. Mol Ther. 28 (11), 2320-2339 (2020).
  3. Hong, M., Clubb, J. D., Chen, Y. Y. Engineering CAR-T cells for next-generation cancer therapy. Cancer Cell. 38 (4), 473-488 (2020).
  4. Teppert, K., et al. Joining forces for cancer treatment: From "TCR versus CAR" to "TCR and CAR". Int J Mol Sci. 23 (23), 14563(2022).
  5. Aparicio-Perez, C., Carmona, M., Benabdellah, K., Herrera, C. Failure of ALL recognition by CAR T cells: a review of CD 19-negative relapses after anti-CD 19 CAR-T treatment in B-ALL. Front Immunol. 14, 1165870(2023).
  6. Roybal, K. T., et al. Precision tumor recognition by T cells with combinatorial antigen-sensing circuits. Cell. 164 (4), 770-779 (2016).
  7. Moghimi, B., et al. Preclinical assessment of the efficacy and specificity of GD2-B7H3 SynNotch CAR-T in metastatic neuroblastoma. Nat Commun. 12 (1), 511(2021).
  8. Roybal, K. T., et al. Engineering T cells with customized therapeutic response programs using synthetic notch receptors. Cell. 167 (2), 419-432.e16 (2016).
  9. Srivastava, S., et al. Logic-gated ROR1 chimeric antigen receptor expression rescues T cell-mediated toxicity to normal tissues and enables selective tumor targeting. Cancer Cell. 35 (3), 489-503.e8 (2019).
  10. Williams, J. Z., et al. Precise T cell recognition programs designed by transcriptionally linking multiple receptors. Science. 370 (6520), 1099-1104 (2020).
  11. Hyrenius-Wittsten, A., et al. SynNotch CAR circuits enhance solid tumor recognition and promote persistent antitumor activity in mouse models. Sci Transl Med. 13 (591), eabd8836(2021).
  12. Hernandez-Lopez, R. A., et al. T cell circuits that sense antigen density with an ultrasensitive threshold. Science. 371 (6534), 1166-1171 (2021).
  13. Choe, J. H., et al. SynNotch-CAR T cells overcome challenges of specificity, heterogeneity, and persistence in treating glioblastoma. Sci Transl Med. 13 (591), eabe7378(2021).
  14. Dull, T., et al. A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system. J Virol. 72 (11), 8463-8471 (1998).
  15. Kumar, M., Keller, B., Makalou, N., Sutton, R. E. Systematic determination of the packaging limit of lentiviral vectors. Hum Gene Ther. 12 (15), 1893-1905 (2001).
  16. Sweeney, N. P., Vink, C. A. The impact of lentiviral vector genome size and producer cell genomic to gag-pol mRNA ratios on packaging efficiency and titre. Mol Ther Methods Clin Dev. 21, 574-584 (2021).
  17. Rommel, P. C., et al. Engineering single-vector logic-gated CAR T cells with transgene sizes beyond current limitations. J Immunother Cancer. 14, e012318(2026).
  18. Improve Lentiviral Production Using Lipofectamine 3000 Reagent. , Thermo Fisher Scientific Inc. At https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cell-culture/cell-culture-learning-center/cell-culture-resource-library/cell-culture-transfection-application-notes/improve-lentiviral-production-using-lipofectamine-3000-reagent.html (2025).
  19. Subach, O. M., Cranfill, P. J., Davidson, M. W., Verkhusha, V. V. An enhanced monomeric blue fluorescent protein with the high chemical stability of the chromophore. PLoS One. 6 (12), e28674(2011).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

CARTT
הסרטון יגיע בקרוב

מאמרים קשורים