מאמר שיטה

אוסף רב-איברים ממודלים של עכברים למחקר הזדקנות

DOI:

10.3791/69128

⸱

12 בדצמבר 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Biophysics, University of California, San Francisco

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מספק שיטה סטנדרטית לאיסוף איברים בעכברים צעירים ומבוגרים להערכת שינויים אנטומיים והיסטולוגיים הקשורים לגיל ברקמות רבות, התומך הן בתכנון ניסויים אתי והן חסכוני.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הזדקנות היא תהליך ביולוגי מערכתי ורב-גורמי שמשפיע בהדרגה כמעט על כל האיברים והרקמות, ומוביל לשינויים מבניים, תאיים ומולקולריים. פרוטוקול זה מתאר גישה סטנדרטית וניתנת לשחזור להערכת שינויים אנטומיים ומורפולוגיים הקשורים לגיל בעכברים באמצעות איסוף איברים מקיף לניתוחים היסטולוגיים ומולקולריים עתידיים. באמצעות עכברים צעירים (2-3 חודשים) ומבוגרים (20-24 חודשים), אנו מפרטים הליכים שלב אחר שלב לכריכה אנטומית גסה ולאיסוף שיטתי של איברים מרכזיים לצורך חתך במורד הזרם, צביעה היסטולוגית והערכה מיקרוסקופית. הפרוטוקול מאפשר איסוף מגוון רחב של איברים ורקמות (כולל המוח, העיניים, הוושט, התימוס, הלב, האאורטה, הריאות, בלוטות הלימפה, הכבד, הלבלב, הקיבה, המעי הדק, המעי הגס, הטחול, הכליה, שלפוחית השתן, העור, שריר השלד, עצם ורקמת שומן) מחיה אחת. על ידי מקסום תפוקת הנתונים לכל נבדק, זרימת עבודה זו תומכת בשימוש אתי בבעלי חיים באמצעות הפחתה, משפרת את השחזוריות בין מחקרים ומקלה על ניתוחים אינטגרטיביים של הזדקנות אורגניזמים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הזדקנות היא תהליך מערכתי שמשפיע כמעט על כל האיברים, אך רוב המחקרים הניסיוניים מתמקדים ברקמה אחת, מה שמגביל תובנות לגבי האופן שבו שינויים הקשורים לגיל מתרחשים או מתקשרים בגוף. ההזדקנות מתבטאת הן בשינויים ספציפיים לרקמה והן בשינויים מערכתיים, כולל תפקוד לקוי של מערכת החיסונים, שינויים מטבוליים, אובדן יכולת ההתחדשות והתנוונות מבנית 1,2. בעוד שמחקרים ספציפיים לאיברים סיפקו תובנות חשובות, נדרשת פרספקטיבה רחבה יותר כדי להבין כיצד הזדקנות התאים בין מערכות תורמת לירידה באורגניזמים שלמים. ניתוח רב-איברי במודלים פרה-קליניים בגוף, כגון עכברים, חיוני לזיהוי שינויים מבניים, תאיים ומולקולריים מתואמים התורמים למחלות הקשורות לגיל ולאובדן חוסן פיזיולוגי 3,4.

עכבר המעבדה נותר מודל פרה-קליני חיוני ומבוסס היטב למחקר הזדקנות, בזכות יכולת הניהול הגנטית שלו, תוחלת החיים הקצרה, מסלולי ההזדקנות המשומרים שלו ויכולתו לשחזר תכונות מרכזיות של הזדקנות אנושית, כולל תפקוד לקוי של מערכת החיסונים, פיברוזיס רקמה, ירידה מטבולית ועלייה בניאופלזיה 5,6,7. עם זאת, פרוטוקולי ניתוח רב-איברי יעילים וסטנדרטיים אינם בשימוש נרחב. פרוטוקולים כאלה נחוצים לאופטימיזציה של השוואות היסטולוגיות, להפחתת השימוש בבעלי חיים ולשלב מערכי נתוני אומיקס בין רקמות מאותו נבדק 8,9.

כאן אנו מציגים פרוטוקול שניתן לשחזור ויעיל בזמן עבור פרפוזיה, דיסקציה ושימור רב-איבריים בעכברים. פרוטוקול זה מספק מדריך שלב אחר שלב לניתוח אנטומי ואיסוף איברים מרכזיים מעכברים צעירים (2-3 חודשים) ומבוגרים (20-24 חודשים), כולל המוח, העיניים, התימוס, הלב, הריאות, האאורטה, קשרי הלימפה המפשעה, מערכת העיכול (הוושט, הקיבה, המעי הדק, המעי הגס), כבד, לבלב, טחול, כליות, שלפוחית השתן, רקמת שומן, שריר שלד, עצם ועור. הוראות מפורטות לשימור רקמות התואמות לתהליכים היסטולוגיים, מולקולריים וקריו-סקציה כלולים. גישה סטנדרטית זו מאפשרת לחוקרים להעריך את סימני ההיכר הייחודיים של איברים ומערכתיים של הזדקנות באותם נבדקים ניסיוניים, ולתמוך במחקר הזדקנות משולב ואיכותי 4,10,11,12.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עכברי C57BL/6J תוחזקו באוניברסיטת קליפורניה בסן פרנסיסקו. כל ההליכים בבעלי חיים אושרו על ידי ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים המוסדית (IACUC) ופיקחו על ידי מרכז המשאבים לבעלי חיים במעבדה. העכברים שוחזקו במחזור של 12 שעות אור-חושך, עם פחות מחמישה עכברים בוגרים בכל כלוב. המתת חסד בוצעה בהתאם להנחיות האגודה הווטרינרית האמריקאית (AVMA) להמתת חסד של בעלי חיים13. לפרוטוקול זה, עכברים צעירים הוקרבו בגיל 3 חודשים, ועכברים מבוגרים בגיל 22 חודשים. לפני המשך הניתוח ואיסוף האיברים, יש להדפיס ולמלא את רשימת הבדיקה של ההכנה (טבלה 1) ואת רשימת איסוף הרקמות (טבלה 2). החומרים והציוד בהם משתמשים מופיעים בטבלת החומרים.

1. פריקת צוואר הרחם

הערה: פריקת צוואר הרחם מתבצעת על ידי אדם מיומן כדי למזער טראומה מופרזת למבני צוואר הרחם.

  1. הרסן את העכבר על ידי אחיזה חזקה בבסיס הזנב ביד אחת.
  2. הנח את האגודל והאצבע של היד הנגדית בבסיס הגולגולת.
  3. הפעיל לחץ חזק ומהיר כדי לפרוק את חוליות צוואר הרחם. מישוש את הצוואר כדי לאשר הפרדה בין הגולגולת לחוליות הסמוכות.
  4. אשר המתת חסד מוצלחת (בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי מוסדות) על ידי הבטחת דום נשימה והיעדר תגובה לגירויים מזיקים לפני ההמשך.
  5. רשמו את משקל הגוף של העכבר לפני הפרפוזיה ואיסוף רקמות.

2. תורקוטומיה ופרפוזיה

הערה: פרפוזיה היא אופציונלית. בצע את כל ההליכים הכוללים פאראפורמלדהיד (PFA) במכסה אדים כימי מוסמך תוך לבישת ציוד מגן אישי (PPE) מתאים, כולל חלוק מעבדה, כפפות ניטריל ומשקפי בטיחות. להשליך את תמיסות ה-PFA בהתאם להנחיות בטיחות כימיות מוסדיות. אסוף את כל הפסולת של פסולת PFA וחומרים מזוהמים (כגון כפפות, טישו, מיכלים) במיכל פסולת מסוכנת מסומנת בבירור והשליכו אותן דרך משרד הבריאות והבטיחות הסביבתית של המוסד, בהתאם לפרוטוקולים התואמים לתקנות מקומיות, מדינתיות ופדרליות.

זהירות: אם משתמשים בפאראפורמלדהיד (PFA) לקיבוע בפועל, בצע את כל השלבים מתחת למכסה אדים כדי להימנע מחשיפה לאדי פורמלדהיד.

  1. הניחו מכסה קלקר מכוסה בחומר סופג לאיסוף נוזלים מהזרזיה במגש איסוף. הנח את העכבר על משטח הכריתה הזה במצב שכיבה ומאבטח את הגפיים באמצעות סיכות לייצוב הגוף: הגפיים הקדמיות ממוקמות לרוחב כדי לפתוח את חלל החזה והגפיים האחוריות נמתחות לכאורה ליצירת מתח עדין על דופן הבטן.
    הערה: מיקום זה משפר את הראות, מפחית חסימות, וממקסם את שטח העבודה לאיסוף איברים.
  2. מרחי 70% אתנול באזור החזה.
  3. השתמשו במספריים חדות כדי ליצור חתך רוחבי בגובה הסרעפת, ואחריו שני חתכים בצורת V המתארכים לחשיפת כלוב הצלעות (איור 1A).
  4. באמצעות מלקחיים קהים, הרימו בעדינות את העור וחתכו בזהירות את שאר התוספות כדי לחשוף במלואו את אזור החזה.
  5. בצע שני חתכים בצורת V באורך של כ-2 ס"מ לאורך שני צידי כלוב הצלעות כדי לפתוח את חלל החזה.
  6. משוך את עצם החזה ותנעץ אותו מעל כתף העכבר לצד הראש.
  7. באמצעות מלקחיים קהים, חשפו בזהירות את הלב. הסר בועות אוויר כלואות מקו הפרפוזיה, ואז הכניס מחט פרפר או קנולה לקצה החדר השמאלי לעומק של כ-3-4 מ"מ. בצע חתך באורך של כ-5 מ"מ באטריום הימני כדי לאפשר יציאת הפרפוזאט (איור 1B).
  8. התחל בפרפוזיה עם תמיסה פיזיולוגית ללא סידן ומגנזיום (כגון PBS, מי מלח או HBSS) כדי לנקות את מערכת הדם.
    הערה: הפרפוזיה יכולה להתבצע באמצעות מזרק, משאבה או מערכת המופעלת בכוח הכבידה בנפח 20 מ"ל. בממוצע, נדרש 15-20 מ"ל תמיסת פרפוזיה לכל עכבר כדי להשיג ניקוי מלא של הדם מכלי הדם. פרפוזיה טובה מתבצעת על ידי ניקוי מהיר (החלחול) של הכבד והריאות, וכן על ידי הפה והלשון שנראים חיוורים. פרפוזיה מלאה תוביל לזרימה נקייה וללא דם מהלב.
  9. אם רוצים, יש להתחיל את הזרם PFA על ידי החלפת קו הפרפוזיה מתמיסה פיזיולוגית ללא סידן ומגנזיום (המשמשת לשטיפה והסרת דם) למזרק של 50 מ"ל המכיל 4% פאראפורמלדהיד (PFA), תוך שמירה על המחט במקומה. היזהרו להימנע מהכנסת בועות אוויר לקו. המשיכו להפרפיוז עם 4% PFA עד שרמת הקיבוע הרצויה תיקבע לפי ההתקשות ההדרגתית של הגוף. כ-30 מ"ל של קיבוע מספיקים לעכבר אחד.

3. איסוף איברים ורקמות

הערה: רצף איסוף האיברים הוא קריטי בהשוואה בין עכברים צעירים ומבוגרים. איברים בבעלי חיים מבוגרים נוטים להיות עדינים ורגישים לאוטוליזה או נזק מכני, ולכן טיפול מהיר ועקבי ברקמות הוא חיוני. סטנדרטיזציה של סדר האיסוף ממזערת שונות לאחר המוות, מפחיתה חפצי טיפול ומבטיחה איכות קיבוע אחידה בין בעלי חיים14,15. עקביות חיונית לזיהוי שינויים מורפולוגיים עדינים הקשורים לגיל, שכן דגימה מאוחרת או לא עקבית עלולה לגרום להטיה. אם לא בוצעה פרפוזיה PFA, יש לאסוף איברים במהירות. הלבלב, הקיבה, הריאות והמוח רגישים במיוחד לאוטוליזה מהירה ולהתדרדרות היסטולוגית אם לא מעובדים מיד. מכיוון שעכברים מבוגרים מפתחים לעיתים קרובות נגעים ניאופלסטיים, יש לבדוק בקפידה את הטחול, הכבד, בלוטות הלימפה, הריאות והתימוס לאיתור אסימטריה, התרחבות, גושים או שינוי צבע. רשמו ממצאים אלו כחלק מהנטל הכולל של המחלה (ראו טבלה 2).

  1. התחילו עם החיה במצב שכיבה לאחר פרפוזיה או פריקת צוואר הרחם כדי לאסוף את האיברים העיקריים של חללי החזה והבטן (איור 1C).
  2. מרחו בעדינות 70% אתנול באמצעות גזה או בקבוק תרסיס לאחר ההצמדה, מה שמפחית זיהום פרווה ושומר על הידרציה של רקמות באזורים רגישים. שיטה זו הוכיחה את עצמה כיעילה בידיים שלנו להפחתת פסולת פרווה ולשיפור הראות בזמן הניתוח, תוך הימנעות מהחסרונות של טבילה מלאה.
  3. באמצעות מספריים ומלקחיים, פתח בזהירות את חלל הבטן על ידי חתך קו אמצע מהסרעפת לאגן, ואחריו שני חתכים צדדיים כפי שמוצג בקווים האדומים באיור 1A. משכו את העור ודופן הבטן כדי לחשוף במלואם את האיברים הפנימיים.
  4. קיבה, מעי דק ומעי גס: ניתוק הקיבה במפגש הוושט תוך השארת הקצה הפילורי רציף למעי הדק. שחרר בעדינות את מערכת העיכול על ידי חיתוך הרצועות התומכות, ואז הסר את המסלול, כולל המעי הדק והמעי הגס. חתכו לרוחב מרוחק ברקטום.
    1. כדי לפנות את תוכן הלומינל, חתכו את המעי הדק קרוב בכיפוף הדואודנוז'יונל ובדיסטל במפגש האילאוסקלי. למעי הגס, יש לחתוך קרוב לצקום. שטוף את המעי הדק והמעי הגס בכ-20 מ"ל תמיסה פיזיולוגית באמצעות מזרק המצויד במחט האכלה, תוך קיבוע עדין של הרקמה עם מלקחיים דקים כדי למנוע נזק.
  5. הוושט: לבודד את הוושט מהצוואר הצווארי למפגש הקיבה.
  6. טחול ולבלב: לבודד את הטחול והלבלב מהרקמות הסובבות באמצעות דיסקציה עדינה, כדי למזער נזק מכני. נתק בזהירות את הלבלב מהטחול. מנתח מיד וחתוך את הלבלב לחתיכות קטנות (≤5 מ"מ) וטבול אותם בתכשיר קיבע תוך 5 דקות מהמתת חסד כדי למזער את האוטוליזה ולשמור על מורפולוגיית הרקמה המיטבית. בדקו את הטחול, שימו לב לגודל, צבע, צורה ונוכחות של חריגות נראות לעין.
  7. כבד: באמצעות מלקחיים דקים, אחיזה ברקמת החיבור המרכזית בין אונות הכבד ומושכת בעדינות כלפי מעלה כדי ליצור מתח. באמצעות מספריים לניתוח, יש לנתק בזהירות את כל החיבורים בין הכבד לאיברים הסמוכים. בדקו את הכבד לצבע, מרקם ונוכחות של גושים או חריגות אחרות.
  8. שומן ויסרלי: לאסוף דגימות ממחסני שומן ויסרליים.
    הערה: בעלי חיים צעירים בדרך כלל מכילים שומן ויסרלי מינימלי, בעוד שבעלי חיים מבוגרים מראים לעיתים הצטברות שומן מוגברת, במיוחד סביב המעיים, הכליות והאזורים הגונדליים.
  9. כליות ושלפוחית השתן: כריתת שתי הכליות יחד עם השופכן ושלפוחית השתן המחוברות. נתק בזהירות את הכליות מרקמת השומן ומהמבנים המחברים הסובבים באמצעות מספריים עדינים או מלקחיים קהים. עקבו אחרי השופכן לרוחב אל שלפוחית השתן, חתכו את כל ההתקשרות שנותרו כדי לבודד את כל דרכי השתן. בדקו את הכליות ושלפוחית השתן לגודל, צבע וחריגות לפני המשך הטיפול.
  10. בלוטות לימפה: משכו את העור מהפריטונאום כדי לחשוף את אזור המפשעה. זהה את בלוטות הלימפה בתוך כרית השומן של השד לאורך כלי הלימפה. בודדו והסירו את הבלוטות עם מלקחיים דקים, כדי למזער את הפרעות השומן והרקמות המחברות הסובבות.
  11. לב: הסרת הלב בזהירות על ידי חיתוך כלי הדם המרכזיים.
  12. תימוס: חתוך את התימוס בזהירות כדי לשמור על מבנהו. יש לשים לב שהתימוס עובר אינבולוציה עם הגיל, ובעכברים מבוגרים עשויה להיות רק רקמת תימית מינימלית או בכלל לא קיימת.
  13. ריאות: באמצעות מספריים חדים ומלקצים דקים, הסר בזהירות את הריאות יחד עם קנה הנשימה המחובר בחתיכה שלמה.
  14. אאורטה: הכנס מלקחיים סגורים בין האאורטה לעמוד השדרה והסרת בעדינות את האאורטה, מפרידה לאורך הצד הגב. היזהרו לא לקרוע את הכלי. באמצעות מלקחיים דקים, הסר בזהירות את הרקמות השומניות והחיבור מהאאורטה תחת מיקרוסקופ דיסקציה.
  15. שריר שלד: כריתת העור מעל הגפיים האחוריות כדי לחשוף את הירך והשרירים הסובבים. באמצעות מספריים עדינים, בידוד בזהירות את השרירים המחוברים לעצם הירך על ידי ניתוקם מרקמת החיבור הסובבת וניתוק החדרות הגידים כדי לשמור על שלמות הסיבים.
  16. עצם (טיביה): באמצעות מספריים לניתוח, כריתה את העור והשריר שמעל כדי לחשוף את השוקה. באמצעות מספריים לדיסקציה ומלקחיים, ניתקו בזהירות את הטיביה בברך ובמפרקי הקרסול. הסר כל רקמה רכה שנותרה מבלי לפגוע בעצם.
  17. עיניים: באמצעות מספריים גדולים, ערפו את ראש העכבר. הסירו בזהירות את העיניים באמצעות מלקחיים דקים.
  18. מוח: כריתת הקרקפת כדי לחשוף את הגולגולת הקדמית. באמצעות מספריים חדים או סכין מנתח, עקבו אחרי התפרים הגולגולתיים והרימו את מקטעי העצם כדי לחשוף את המוח (איור 1D). נתק את הנורות הריחניות והאביזרים הגחוניים. להוציא בעדינות את המוח מחלל הגולגולת. עבדו את הרקמה מיד כדי לשמור על המורפולוגיה.
  19. עור: אם יש צורך בהסרת שיער לשימושים בהמשך, הסר שיער באמצעות מכונת תספורת חשמלית. צבוטים חלק מהעור האחורי עם מלקחיים, חתכו עם מספריים, ואספו את הרקמה לעיבוד נוסף.
  20. לאחר הסרת כל האיברים המעניינים, הניחו את כל גופת העכבר במיכל של 450 מ"ל מלא מראש ב-4% PFA כדי לארכב ממצאים בלתי צפויים או לענות על שאלות המבקרים שעשויות לדרוש חזרה לרקמה רטובה קבועה.

4. שימור ועיבוד רקמות

הערה: כדי לשמור על שלמות הרקמה, יש למזער את הזמן בין הניתוח לשימור. עיכובים עלולים לפגוע במורפולוגיית הרקמות ובאיכות המולקולרית; פרטים נוספים לתזמון קריטי של איסוף ושימור רקמות מוצגים בטבלה 2.

אזהרה: אם משתמשים בפרפורמלדהיד (PFA) לקיבוע, יש לבצע את כל השלבים בתוך מכסה אדים כדי להימנע מחשיפה לאדי פורמלדהיד.

  1. מעבדים רקמות מיד לאחר הניתוח, בוחרים את הפרוטוקול המתאים (שלבים 4.1, 4.2 או 4.3) בהתאם ליישום המתוכנן בהמשך.
    1. קיבוע פאראפורמלדהיד (PFA): מניחים רקמות המיועדות לניתוח היסטולוגי ב-4% PFA בטמפרטורה של 4°C למשך 12-24 שעות. לאחר הקיבוע, שטפו את הרקמות היטב עם מי מלח מפוזר פוספט (PBS) להסרת קיבוע שאריתי, ואז העבירו אותן ל-70% אתנול לאחסון עד להטמעת הפרפין וחתך.
  2. הטמעת תרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT): הטמעת רקמות טריות בתרכובת OCT. הניחו רקמות בתבניות משולבות מלאות בתרכובת OCT, תוך הסרת בועות אוויר, דגרו במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, ואז הקפיאו בשלב האדים של חנקן נוזלי. אטימו עם נייר אלומיניום ואחסנו בלוקי OCT בטמפרטורה של −80°C עד לחתוך.
  3. הקפאה מיידית בשלב אדי חנקן נוזלי: רקמות הקפאה המיועדות לניתוח RNA, חלבון או מטבוליט בשלב האדים של חנקן נוזלי כדי למזער את היווצרות גבישי הקרח. הניחו רקמות בצינורות קריוטיפס מסומנים ותשאו אותן מעל חנקן נוזלי להקפאה מהירה. לאחר הקפאה מלאה, העבר דגימות לאחסון בטמפרטורה של −80 מעלות צלזיוס.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במהלך נתיחה, עכברים מבוגרים מראים לעיתים קרובות נגעים ניאופלסטיים ודורשים בדיקה קפדנית לתיעוד ממצאים פתולוגיים 13,14,16,17,18. איור 2A מציג עכבר זכר בן 22 חודשים C57BL/6 במצב שכיבה לאחר פרפוזיה. החלפת ריאות מלאה מאשרת פרפוזיה יעילה, בעוד שהכבד מציג רק החלמה חלקית. בדיקה מדוקדקת של הכבד גילתה מספר גושים ממאירים (איור 2B), בליווי שלדיוניות זרע מוגדלות (איור 2A) וגדלת טחול (איור 2C). ממצאים אלו נפוצים בעכברים מבוגרים ויש לתעד אותם כחלק מעומס המחלה הכולל18.

איור 3 מציג איברים מקרוסקופית תקינים שנאספו לאחר ניתוח ופרפוזיה, ומאפשר הערכת שלמות אנטומית ויעילות הפרפוזיה. מערכת העיכול הושטפה בתמיסה פיזיולוגית להסרת תכולה מעוכלת, מה שיצר מראה נקי ושקוף של הקיבה, המעי הגס והמעי הדק (איור 3A). מבנים נוספים, כולל הוושט, לבלב, טחול, מחסני שומן ויסרליים, כליות עם שלפוחית השתן, בלוטות לימפה, לב ותימוס, היו מזוהים בבירור ויכלו לבודדם שלמים לניתוחים במורד הזרם (איור 3B,C,E-I).

איכות הפרפוזיה הוערכה על ידי בדיקת בלונץ' ברקמות עם כלי דם גבוהים. כפי שמוצג באיור 3D ובאיור3J, הכבד והריאות הראו הבדלים ברורים בין מצבים ללא פרפיוז, פרפיוזציה טובה וחלקית פרפיוז. החלומות מלאה אישרה פרפוזיה מוצלחת, בעוד שחליפה לא שלמה העידה על שונות טכנית או חריגות בסיסיות. רקמות נוספות, כולל אאורטה, שריר שלד, טיביה, מוח, עין ועור, בודדו עם מורפולוגיה משומרת, המתאימה ליישומים היסטולוגיים, מולקולריים או דימותיים נוספים (איור 3K-P). הליך הניתוח הסטנדרטי הזה מספק שיקום עקבי של רקמות ואיברים שלמים ושמורים היטב, ומאפשר הערכה אנטומית גסה לתמיכה במגוון ניתוחים במורד הזרם. ניתוח ואיסוף איברים דרשו כ-40-60 דקות לכל בעל חיים, בהתאם לניסיון המפעיל ולנוכחות ממצאים פתולוגיים.

איור 4 מציג שינויים דוגמיים הקשורים להזדקנות באיברים שנאספו לאחר הטמעת פרפין, חתך וצביעת המטוקסילין ואאוזין (H&E). בחתכי עור של עכברים מבוגרים נצפו דילול אפיתל ואובדן זקיקי שיער בהשוואה לקבוצת ביקורת צעירה (איור 4A). חתכי הכליה חשפו התרחבות של קפסולות בואמן יחד עם שינויים פיברוטיים ונמקיים, וכן אזורים התואמים ללימפומות (איור 4B). בחתכי לבלב, נצפתה עלייה בגופים אפופטוטיים19 ובאזורים לימפומטוריים בבעלי חיים מבוגרים, מה שמעיד על פגיעה בשלמות הרקמה עם הגיל (איור 4C). חתכי הטחול הציגו משקעים אמילואידיים ואזורים של לימפומה בבעלי חיים מבוגרים, המשקפים סימני הזיהוי נוספים של פתולוגיה הקשורה לגיל (איור 4D).

תוצאות אלו מדגישות מאפיינים היסטופתולוגיים מייצגים של הזדקנות ברקמות רבות, ומדגימות את השימושיות של פרוטוקול זה בזיהוי סימני המבנה של ירידה הקשורה לגיל.

figure-results-1
איור 1: סקירה סכמטית של ניתוחי ניתוח עכבר וחשיפת איברים. (א) אתרי חתך לפתיחת חללי החזה והבטן (קווים אדומים), כולל חתך רוחבי ברמת הסרעפת, ואחריו חתכים בצורת V משני צידי כלוב הצלעות לפתיחת חלל החזה, וחתך קו אמצע מהסרעפת לאגן עם חתכים דו-צדדיים לחשיפת חלל הבטן במלואו. (ב) הגדרת פרפוזיה שמראה הכנסת מחט פרפר לחדר השמאלי וחתך בעלייה הימנית לאפשר ניקוז דם יעיל. (ג) פריסה אנטומית של איברי החזה והבטן העיקריים לאחר חשיפה לחללים. (ד) שלבי כריתת ראש, כולל הסרת הקרקפת ופתיחת הגולגולת לאורך התפרים הגולגולתיים לחשיפת המוח. קווים אדומים מציינים אתרי חתך. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-2
איור 2: זיהוי נגעים ניאופלסטיים בעכברים מזדקנים. (A) עכבר זכר C57BL/6 בן 22 חודשים במצב שכיבה לאחר פרפוזיה עם 4% PFA. הלבנה מלאה של הריאות (ראש חץ ורוד) מאשרת פרפוזיה יעילה, בעוד שהכבד (ראש החץ הירוק) מציג רק חלונה חלקית. ראשי חץ כחולים מסמנים ווסיקולות זרע מוגדלות. (ב) תצוגה מפורטת של הכבד החושפת גושים ממאירים מרובים (ראשי חץ שחורים). (C) טחול מוגדל מעכבר מבוגר C57BL/6 (צד ימין) בהשוואה לטחול תקין של בעל חיים צעיר (צד שמאל). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-3
איור 3: סקירה של איברי העכבר המרכזיים ושלמות הרקמה לאחר ניתוח והפרפוזיה. (א) קיבה, מעי דק ומעי גס לפני ואחרי שטיפה בתמיסה פיזיולוגית להסרת תוכן מעוכל. (ב) הוושט. (ג) לבלב עם טחול מחובר. (D) כבד ללא פרפוזיה, עם החלפת חליפה מלאה לאחר פרפוזיה יעילה, ועם החלטה חלקית המצביעה על פרפוזיה לא שלמה או פתולוגיה בסיסית. (ה) רקמת שומן ויסרלית. (F) כליות עם שלפוחית דבישה. (G) בלוטות לימפה אינגווינליות. (ה) לב. (I) תימוס. (J) ריאות ללא פרפוזיה, עם החלטה מלאה לאחר פרפוזיה יעילה, ועם החלפת חלקית. (K) אאורטה. (L) שריר שלד מבודד מהגפה האחורית. (זכר) שוקה עם מבנה עצם משומר. (N) מוח. (O) עין. (פ) עור. פסי סולם: 5 מ"מ ב-A, C, D, E, F, J, L, N, P; 1 מ"מ בכל שאר הפאנלים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-4
איור 4: ניתוח היסטולוגי של איברים עיקריים באמצעות צביעת המטוקסילין ואאוזין (H&E). (א) חתכי עור של עכברים בני 3 חודשים (צעירים) ו-22 חודשים (מבוגרים). חתכים מבעלי חיים מבוגרים מראים דילול אפיתל ואובדן זקיקי שיער. (B) חלקי כליות המדגישים את קפסולות בואמן. חתכים של בעלי חיים מבוגרים מראים הגדלת קפסולה, שינויים פיברוטיים ונמקיים, ולימפומות (ראשי חץ כתומים). (ג) חתכי לבלב מבעלי חיים צעירים ומבוגרים, כאשר בעלי חיים מבוגרים מראים גוף אפופטוטי מוגבר (ראשי חץ כחולים) ואזורי לימפומה (ראשי חץ כתומים). (ד) חתכי טחול מעכברים בני 3 חודשים (צעירים) ועכברים מבוגרים בני 22 חודשים. חתכים מבעלי חיים מבוגרים מראים משקעים אמילואידיים (ראשי חץ ירוק-ליים) ואזורים של לימפומה. מוט סולם (A-C) 100 מיקרון. פס קנה מידה (D) 500 מיקרון. אנא לחצו כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של האיור הזה.

טבלה 1: רשימת בדיקת הכנה. רשימה שלב אחר שלב של הכנות חיוניות לניתוח ושימור רקמות עכבר, כולל תיוג צינורות ותבניות, הכנת בופר וקיבוע, הכנה להטמעה קריו-אקסיטיבית, חיטוי כלי חיתול, סידור תחנות עבודה ותכנון תיעוד. אנא לחצו כאן להורדת הטבלה הזו.

טבלה 2: רשימת בדיקה לאיסוף רקמות. השתמשו בטבלה כדי לתעד רקמות שנאספו. הוסף זמן איסוף והערות על מצב או חריגות. תעדף את הרקמות הקריטיות למחקר שלך; אסוף את האיברים הרלוונטיים ביותר במסגרת הזמן המומלצת כדי למנוע אוטוליזה/התדרדרות של הרקמות.*שימו לב לכל חריגות (כולל שינוי צבע באיברים, גושים, גדילה ממאירה, גודל איברים לא תקין). **שקול לתעד שיטת שימור (כולל קיבוע PFA, הטמעת OCT או הקפאה מיידית). אנא לחצו כאן להורדת הטבלה הזו.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מספק אסטרטגיה ניתנת לשחזור לאיסוף שיטתי של מערכות איברים מרובות בעכברים צעירים ומבוגרים, ומאפשר ניתוחים אנטומיים, היסטולוגיים ומולקולריים. מספר שיקולים טכניים עשויים להשפיע על איכות התוצאה ולטפל במגבלות השיטה המתוארת. ראשית, שונות באיכות הפרפוזיה היא גורם חשוב שיש לקחת בחשבון. פרפוזיה לא שלמה עלולה להשאיר שאריות דם שפוגעות בהיסטולוגיה, באימונוהיסטוכימיה ובניתוחים מולקולריים. פרפוזיה לאחר פריקת צוואר הרחם עלולה לגרום לטראומה לרקמות צוואר הרחם ולהוביל לזיהום דם בריאות. לכן, יש לבצע פריקת צוואר הרחם רק על ידי אנשי מקצוע מיומנים. לתוצאות מיטביות, יש לבצע פרפוזיה בהרדמה סופנית כפי שמתואר במקום אחר20,21 בהתאם להנחיות IACUC ו-AVMA13. שנית, קיבוע הוא גורם קריטי לשלמות הרקמה. למרות ש-4% פאראפורמלדהיד (PFA) נמצא בשימוש נרחב, הוא עלול לחדור באופן לקוי לאיברים גדולים או צפופים, מה שמוביל להיסטולוגיה לקויה ולשימור אנטיגן. מגבלה זו ניתנת להקלה על ידי שימוש בפורמלין בופר ניטרלי 10% (NBF) או חיתוך רקמות לחתכים של ≤5 מ"מלשיפור החדירה. שלישית, חלק מהרקמות, במיוחד הלבלב, הקיבה והמוח, עוברות אוטוליזה מהירה, המחייבת קיבוע או הקפאה תוך 5-10 דקות מהמתת חסד ושימוש בכלי ניתוח מקורריםמראש. בעכברים מזדקנים, ניאופלזיה עלולה לעוות עוד יותר את האנטומיה ולסבך את הדיסקציה. ארטיפקטים נוספים עשויים להיווצר מנפח קיבוע לקוי או הקפאה, מה שמוביל להתכווצות ואפקטי קצוות; ניתן לצמצם אותם על ידי שמירה על יחס קיבוע לרקמה של לפחות 10:1, הימנעות מצפיפות, וקירור מוקדם של תבניות OCT לפני ההטבעה. לבסוף, השימוש ב-PFA ובפורמלין מעלה חששות לבטיחות ולסילוק; מקבעים מבוססי גליאוקסל מציעים חלופות פחות רעילות. טיפול סטנדרטי, קיבוע אופטימלי ותזמון מדויק הם חיוניים למקסום השחזוריות, איכות הרקמה ואמינות הניתוחים במורד הזרם24.

על ידי קצירת רקמות מיותר מ-15 איברים באותו בעל חיים, תהליך עבודה זה ממקסם את התפוקה הביולוגית לנבדק ומתיישב עם המנדטים האתיים להפחתת השימוש בבעלי חיים. ההליך השיטתי ניתן להרחבה בקלות למחקרים בקצב בינוני הבוחנים ירידה פיזיולוגית הקשורה לגיל ופתולוגיות ספציפיות לאיברים25.

עיבוד מהיר של רקמות הרגישות לאוטוליזה הוא חיוני לשמירה על שלמות היסטולוגית. שימוש בתמיסות פיזיולוגיות ללא סידן ומגנזיום, ואחריהן 4% PFA, משמר באופן אמין את ארכיטקטורת האיברים ומפחית את האוטוליזה ברקמות רגישות כמו הלבלב ומערכת העיכול. בניגוד לפרוטוקולים המתמקדים באיברים בודדים או במודלים של מחלה, גישה זו מאפשרת איסוף מהיר ועקבי של מספר איברים, מה שמפחית שונות ומשפר את התפוקה. הניתוח כולו, מהפרפוזיה ועד כריתת הרקמה הסופית, יכול להסתיים תוך 60 דקות לכל בעל חיים, מה שהופך אותו למתאים למחקרים רחבי היקף או רגישי זמן 3,11,26. הקפדה על רצף קיבוע פרפוזיה מדויק ממזערת ארטיפקטים ומאפשרת תוצאות שחזוריות.

עקביות באיסוף רקמות, חיתוך והטמעה חיונית להערכה היסטופתולוגית מדויקת, במיוחד במחקרים אורך או רב-מרכזיים. שונות באופן הטיפול ברקמות עלולה לגרום לארטיפקטים, לטשטש ממצאים פתולוגיים, או להוביל לפרשנות שגויה של נטל המחלה. המדריכים המתוקנים לדגימה וגזירת איברים בעכברים וחולדות, כמו מדריכי הטרימינג של RENI, מספקים פרוטוקולים מפורטים וסטנדרטיים לצמצום אי-עקביות כזו22. אימוץ שיטות מתואמות אלו משפר את השוואת הנתונים בין מחקרים ומוסדות, מחזק את השחזוריות ומגביר את שלמות התוצאות המבוססות על פתולוגיה במחקר הזדקנות 4,9.

איסוף מגוון איברים חשוב במיוחד במחקר ההזדקנות, שבו הבנת האופן שבו מערכות האיברים מתקשרות היא חיונית כדי לחשוף את התהליכים שמניעים את הירידה הפיזיולוגית של כל הגוף עם הגיל. בעוד שגישה זו יכולה להיות מועילה גם למגוון שאלות מחקר נוספות, המוקד של פרוטוקול זה הוא לתמוך במחקרי הזדקנות שבהם שינויים הקשורים לגיל עשויים להשפיע על מספר מערכות איברים בו-זמנית. עם זאת, ניתן ליישם אותו גם במחקרים המתמקדים בפיברוזיס, התחדשות והזדקנות, במיוחד כאלה שמשלבים טרנסקריפטומיקה או גילוי ביומרקרים מרובי רקמות 9,27,28.

הערכות היסטולוגיות חשפו שינויים אופייניים הקשורים לגיל ברקמות מרובות (איור 4). בעור, בעלי חיים מבוגרים הראו דילול אפיתל ואובדן זקיקי שיער. בכליה, חתכים מעכברים מבוגרים הראו את הגדלת הקפסולה של בואמן יחד עם שינויים פיברוטיים, נמקיים ולימפומתיים. רקמת הלבלב מבעלי חיים מבוגרים הראתה הצטברות גופים אפופטוטיים ולימפומות, בעוד שחתכי הטחול חשפו משקעים אמילואידיים ואזורים נוספים של לימפומה. תצפיות אלו תואמות את הפנוטיפים המוכרים של הזדקנות עכברים ומדגימות את התועלת של פרוטוקול זה בזיהוי סמנים היסטופתולוגיים מייצגים של הזדקנות 1,18,19,27,29,30,31,32,33,34.

לסיכום, פרוטוקול זה מציע מסגרת אמינה וניתנת להרחבה לאיסוף ושימור רקמות במודלים של הזדקנות טרום-קלינית. ניתן לאמץ אותו הן במחקרים חקרניים והן במחקרים מונחי השערות כדי לחשוף מנגנונים ספציפיים ומערכתיים של הזדקנות, התדרדרות וחוסן.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה במענק סטארט-אפ מקרן לארי ל. הילבלום, מענק מחקר רפואי מקרן AFAR וגלן לסגל זוטר, פרס חוקר זוטר של קרן אדוארד מאלינקרודט ג'וניור, ופרס מחקר חדש של תוכנית למחקר ביומדיצי פורץ דרך (PBBR) לחנה מרטנס. איור 1 נוצר באמצעות BioRender.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
רפידת סופג
גיל C57BL/6J עכברים מעבדת ג'קסון  #000664
מגשי איסוף ו-nbsp;
גוזם אלחוטיBravMini+ CLP-41590להסרת שיער
תרסיס אתנול 70%פישר סיינטיפיק50-163-3592
מלקחיים נוספים 5 INOXדומוןF6521-1EAמלקחיים דקים במיוחד לבלוטות לימפה
מלקחייםמיליפורסיגמאXX6200006Pמלקחיים קהים
מלקחיים 5 INOXדומוןF6521-1EAמלקחיים עדינים עם קצה
תמיסת המלח המאוזנת של האנק (HBSS) 1x 500 מ"לגיבקו14025092
מספריים מיקרו-דיסקטיים (ישרים, חדים/חדים, 25 מ"מ)רובוז כירורג'יהRS-5668מספריים מיקרו סטנדרטיים, פלדת אל-חלד, להב 25 מ"מ (M-37)
מספריים מיקרו-דיסקטיים (ישרים, חדים/חדים, להבים דקים)רובוז כירורג'יהRS-5918מספריים דקים לניתוח, אורך 4.5 אינץ' (H-327)
NBFSigma HT501128לקיבוע
תמיסת מלח רגילהציטיבה76081-514
טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT)פישר סיינטיפיק23730571
פאראפורמלדהיד (PFA) 4%מדעי מיקרוסקופיית אלקטרונים15710לקיבוע
צלחות פטרי 100 מ"ל x 15 מ"למיליפורסיגמאP5856-500EA
מלח ממוגן בפוספט (PBS)גיבקו10010023
פיניםמעבדות אייסקוDISPINS1כדי לאבטח את העכבר במהלך ניתוח
מזרק פלסטיק 20 מ"ל, נעילת לוארפישרברנד302830לפרפוזיה
קופסת Seal'N Freeze (מיכל קריו)טד פלה, בע"מ.20956
קריוטריי Seal'N Freezeטד פלה, בע"מ.20956-1למיקום דגימות במיכל הקריו
מחט פרפר Sol-Vet עם מתאםSol-Millenium Medical110301070003עבור פרפוזיה
מכסה קלקר
Tissue-Tek Cyromold (ביופסיה)סאקורה25608-922
עכברים צעירים C57BL/6Jמעבדת ג'קסון  #000664

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lopez-Otin, C., Blasco, M. A., Partridge, L., Serrano, M., Kroemer, G. Hallmarks of aging: An expanding universe. Cell. 186 (2), 243-278 (2023).
  2. Schafer, M. J., et al. The senescence-associated secretome as an indicator of age and medical risk. JCI Insight. 5 (12), e133668(2020).
  3. Sladitschek-Martens, H. L., et al. Yap/taz activity in stromal cells prevents aging by controlling cGAS-STING. Nature. 607 (7920), 790-798 (2022).
  4. Tabula Muris, C. A single-cell transcriptomic atlas characterizes aging tissues in the mouse. Nature. 583 (7817), 590-595 (2020).
  5. Farooqi, I. S., Xu, Y. Translational potential of mouse models of human metabolic disease. Cell. 187 (16), 4129-4143 (2024).
  6. Marttala, J., Andrews, J. P., Rosenbloom, J., Uitto, J. Keloids: Animal models and pathologic equivalents to study tissue fibrosis. Matrix Biol. 51, 47-54 (2016).
  7. Yuan, R., Peters, L. L., Paigen, B. Mice as a mammalian model for research on the genetics of aging. ILAR J. 52 (1), 4-15 (2011).
  8. Wang, Q., et al. The mouse multi-organ proteome from infancy to adulthood. Nat Commun. 15 (1), 5752(2024).
  9. Zhuang, J., et al. Comparison of multi-tissue aging between human and mouse. Sci Rep. 9 (1), 6220(2019).
  10. Basisty, N., et al. A proteomic atlas of senescence-associated secretomes for aging biomarker development. PLoS Biol. 18 (1), e3000599(2020).
  11. Wu, C., et al. Spatially resolved transcriptome of the aging mouse brain. Aging Cell. 23 (5), e14109(2024).
  12. Yousefzadeh, M. J., et al. Tissue specificity of senescent cell accumulation during physiologic and accelerated aging of mice. Aging Cell. 19 (3), e13094(2020).
  13. Treuting, P. M., Snyder, J. M. Mouse necropsy. Curr Protoc Mouse Biol. 5 (3), 223-233 (2015).
  14. Antal, C., et al. Tissue collection for systematic phenotyping in the mouse. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 29 (Unit 29A), 24(2007).
  15. Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. Mouse tissue fixation. Cold Spring Harb Protoc. 2014 (5), pdb.prot073403(2014).
  16. Brayton, C., Justice, M., Montgomery, C. A. Evaluating mutant mice: Anatomic pathology. Vet Pathol. 38 (1), 1-19 (2001).
  17. Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. Limited mouse necropsy. Cold Spring Harb Protoc. 2014 (5), pdb.prot073395(2014).
  18. Pettan-Brewer, C., Treuting, P. M. Practical pathology of aging mice. Pathobiol Aging Age Relat Dis. 1, (2011).
  19. Xiong, Y., et al. Arginase-II promotes tumor necrosis factor-alpha release from pancreatic acinar cells causing beta-cell apoptosis in aging. Diabetes. 66 (6), 1636-1649 (2017).
  20. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. 65, e3564(2012).
  21. Navarro, K. L., et al. Mouse anesthesia: The art and science. ILAR J. 62 (1-2), 238-273 (2021).
  22. Morawietz, G., et al. Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice--part 3. A joint publication of the Rita and NACAD groups. Exp Toxicol Pathol. 55 (6), 433-449 (2004).
  23. Zhao, H., et al. Identifying specific functional roles for senescence across cell types. Cell. 187 (25), 7314-7334 (2024).
  24. Aversa, Z., et al. Biomarkers of cellular senescence in idiopathic pulmonary fibrosis. Respir Res. 24 (1), 101(2023).
  25. Aghali, A., Koloko Ngassie, M. L., Pabelick, C. M., Prakash, Y. S. Cellular senescence in aging lungs and diseases. Cells. 11 (11), 1781(2022).
  26. Travaglini, K. J., et al. A molecular cell atlas of the human lung from single-cell RNA sequencing. Nature. 587 (7835), 619-625 (2020).
  27. Chen, S., et al. Integration of spatial and single-cell data across modalities with weakly linked features. Nat Biotechnol. 42 (7), 1096-1106 (2024).
  28. Wu, J., et al. Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation. Bio Protoc. 11 (5), e3988(2021).
  29. Hoj, K., et al. Age-related decline in pancreas regeneration is associated with an increased proinflammatory response to injury. Gastro Hep Adv. 3 (7), 973-985 (2024).
  30. Roeder, S. S., et al. Changes in glomerular parietal epithelial cells in mouse kidneys with advanced age. Am J Physiol Renal Physiol. 309 (2), F164-F178 (2015).
  31. Russell-Goldman, E., Murphy, G. F. The pathobiology of skin aging: New insights into an old dilemma. Am J Pathol. 190 (7), 1356-1369 (2020).
  32. Sparks, J., et al. Presence of systemic amyloidosis in mice with partial deficiency in pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) in aging. App Sci. 11 (16), 7373(2021).
  33. Sun, P., Juskevicius, R. Histological and immunohistochemical features of the spleen in persistent polyclonal B-cell lymphocytosis closely mimic splenic B-cell lymphoma. Diagn Pathol. 7, 107(2012).
  34. Vannan, A., et al. Spatial transcriptomics identifies molecular niche dysregulation associated with distal lung remodeling in pulmonary fibrosis. Nat Genet. 57 (3), 647-658 (2025).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים