אנו מציגים שיטה פשוטה ומהירה כדי לטעון מוגדרים מראש מספרי של תאים לתוך בארות microfabricated ולשמור אותם לפיתוח גוף embryoid.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
טיפולית נידחת תלוי טיפות: דרך פשוטה טופס ותרבות גופים Embryoid
במאמר זה
סיכום
תקציר
גופים Embryoid (EB) הם אגרגטים של תאים עובריים. הדרך הנפוצה ביותר ליצירת אגרגטים אלה היא השיטה ירידה תלוי, גישה מייגע של pipetting מספר שרירותי של תאים לתוך צלחות היטב. אינטראקציות בין בתאי גזע בכפייה בסמיכות זה לזה מקדמת את הדור של EBS. בגלל התקשורת בכל בארות יש להחליף באופן ידני כל יום, גישה זו היא אינטנסיבית באופן ידני.
יתר על כן, בגלל פרמטרים סביבתיים כולל תאים תאים, תא מסיסים אינטראקציות גורם, pH, זמינות החמצן יכול להיות פונקציות של גודל EB, אוכלוסיות תאים המתקבל טיפות תלוי המסורתי יכול להשתנות באופן דרמטי, גם כאשר בתרבית בתנאים זהים. מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי אכן מספר ראשוני של התאים המרכיבים את המצרף יכולה להיות השפעה משמעותית על התמיינות בתאי גזע. פיתחנו שיטה תרבות פשוטה, מהירה, וניתן להרחבה לטעון מוגדרים מראש מספרי של תאים לתוך בארות microfabricated ולשמור אותם לפיתוח גוף embryoid. לבסוף, תאים אלה נגישים בקלות לניתוח ניסויים נוספים. שיטה זו ניתנת לכל מעבדה ואינה דורשת ציוד ייעודי. אנו להדגים שיטה זו על ידי יצירת גופים embryoid באמצעות תא אדום ניאון העכבר קו (129S6B6-F1).
פרוטוקול
1. ביצוע טיפולית נידחת עובש
- הדפס את התבנית הרצויה על גיליון טיפולית נידחת באמצעות מדפסת הגדרה טובה.
- אופים טיפולית נידחת בבית גיליון 163 מעלות למשך כ -10 דקות, או עד התכווץ באופן מלא לאחר שרכש צורה רגילה.
- לאחר טיפולית נידחת עובש מתקרר, להטביע אותו באמבטיה isopropanol עד פני השטח להשלים מכוסה בקושי.
- בזהירות, לרסס קצת אצטון על התבנית ולנער המיכל כמה פעמים. הוסף isopropanol יותר לשטוף את עודפי אצ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
פיתחנו שיטה תרבות פשוטה, מהירה, וניתן להרחבה לטעון מוגדרים מראש מספרי של תאים לתוך בארות microfabricated (יצוק מ-טיפולית Dinks) ולשמור אותם לפיתוח גוף embryoid. לבסוף, תאים אלה נגישים בקלות לניתוח ניסויים נוספים. שיטה זו ניתנת לכל מעבדה ואינה דורשת ציוד ייעודי כי אנחנו לייתר את הצורך photolithography. אנחנו יכולים לשנות את הגודל של microwells וכן ריכוז של תאים / בארות כדי לשנות את המספר והגודל של הגופים embryoid.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תודות
ברצוננו להודות על התמיכה CIRM של עבודה זו. קו התא נתרם בנדיבות בבית החולים הר סיני, טורונטו, אונטריו מד"ר Andras נאגי.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
עבור התקשורת המסקלין (McCloskey מעבדה פרוטוקול): (עבור מדיה בסך הכל מוכן: 50 מ"ל, 100 מ"ל) KO DMEM: 40.8ml; 81.6ml KSR 15%: 7.5ml: 15 מ"ל 1x פן, דלקת: 0.5 מ"ל; 1ml 2mm-L-גלוטמין: 0.5 מ"ל; NEAA 1ml: 0.5 מ"ל; 1ml LIF: 100ul; 200ul BMP-4 (10ng/ml): 50ul; 100ul מדולל BME:. 50ul; 100ul (הוסף 35ul של BME סינון סטרילי עד 5 מ"ל של PBS ו מזרק מסנן לעקר מחק לאחר 2 שבועות. הריכוז הסופי הפתרון הוא 0.1 mM)
מקורות
- Keller, G. M. In vitro differentiation of embryonic stem cells. Curr Opin Cell Biol. 7, 862-869 (1995).
- Doetschman, T. C., Eistetter, H., Katz, M., Schmidt, W., Kemler, R. The in vitro de....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
