הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הערכת דינמיקת ביקוע/היתוך מיטוכונדריאלית בתאים צינוריים פרוקסימליים בכליה

1.1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/69268

⸱

14 בנובמבר 2025

 ,  ,  ,  , 
1Lewis Katz Medical School at Temple University

במאמר זה

סיכום

מאמר זה מתאר את השימוש במיקרוסקופיה קונפוקלית וב-ImageJ כדי להעריך דינמיקת ביקוע/היתוך מיטוכונדריאלית באמצעות פלואורסצנטיות מיתוג צילום Dendra2.

תקציר

מיטוכונדריה מוכרים בעיקר בזכות תפקידם בסינתזת ATP ומשמשים כמווסתים מרכזיים של חילוף החומרים התאי. דינמיקה מיטוכונדריאלית מבינה את התנועה התוך-תאית והבין-תאית של המיטוכונדריה, כמו גם את תהליכי הביקוע/היתוך. אירועים אלה חיוניים לשמירה על תפקוד המיטוכונדריה על ידי שמירה על הומאוסטזיס תאי, מורפולוגיה, ביו-אנרגטיקה, בקרת איכות ותגובות לחץ. מצד שני, חוסר ויסות של הדינמיקה המיטוכונדריאלית משפיע על המורפולוגיה והתפקוד של התא. מדידה מדויקת של אירועי ביקוע/היתוך מיטוכונדריה יכולה להעיד על בריאות התאים. המתודולוגיות הנוכחיות למדידת דינמיקת המיטוכונדריה משתמשות בהדמיה מתקדמת כמו מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה, טכניקות פלואורסצנטיות (התאוששות פלואורסצנטית לאחר פוטו-הלבנה (FRAP)) לקישוריות, וכלים אופטוגנטיים לבקרה מרחבית-זמנית. ניתוח כמותי משתמש בכלים חישוביים למדידת פרמטרים כמו אורך, מספר והסתעפות, המצביעים על איזון ביקוע/היתוך. עם זאת, שיטות אלו דורשות מיומנויות ומכשירים מתוחכמים. במאמר זה, אנו מתארים את השימוש במיקרוסקופיה קונפוקלית בשילוב עם כלים חופשיים לשימוש ב-ImageJ (פיג'י) כדי לחקור אירועי ביקוע/היתוך באמצעות תכונת מיתוג התמונות של חלבון dendra2, המתויג לציטוכרום המיטוכונדריאלי c.

מבוא

מיטוכונדריה היא אברון דינמי הממלא תפקיד חיוני בייצור אנרגיה, מוות תאים והעברת אותות1. מורפולוגיה מיטוכונדריאלית מתייחסת לגודל ולצורה של תאים מיטוכונדריאלים, המגיבים מאוד לתנאים תוך-תאיים וחוץ-תאיים והם חיוניים לשמירה על בריאות התאים2. המורפולוגיה של המיטוכונדריה יכולה לספק תובנות מפתח לגבי תפקודם, עם זאת, שינויים בצורת המיטוכונדריה יכולים להשפיע על חילוף החומרים התאי ועל הבריאות הכללית3. שיבושים במורפולוגיה המיטוכונדריאלית קשורים למספר מחלות, כולל הפרעות ניווניות, סרטן ומחלות מטבוליות4. מורפולוגיה מיטוכונדריאלית מווסתת באופן דינמי על ידי אירועי היתוך וביקוע/היתוך, החיוניים לשמירה על הומאוסטזיס תאי ולתגובה לדרישות מטבוליות שונות 5,6.

דינמיקה מיטוכונדריאלית עוזרת לאברון להגיב לגורמי לחץ שונים ולדרישות מטבוליותשונות 7. זה כרוך בביקוע/היתוך מתמשך, ותנועה של מיטוכונדריה בתוך תאים או בין תאים. המיטוכונדריה מסתגלת לדרישות האנרגיה התאית באמצעות שינויים במורפולוגיה באמצעות אירועי ביקוע/היתוך8. תהליכים אלה קובעים את צורת המיטוכונדריה ומשפיעים על תפקודי המיטוכונדריה כגון תפוקת אנרגיה, ייצור מיני חמצן תגובתיים (ROS) ובקרת איכות מיטוכונדריאלית 7,9,10. יתר על כן, ביקוע/היתוך מיטוכונדריאלי הם מנגנוני איזון נגדיים השומרים על רשת מיטוכונדריאלית פונקציונלית11. היתוך מאפשר חילופי תוכן מיטוכונדריה, מקדם השלמה וחציצה מפני נזק מקומי, בעוד ביקוע מאפשר הפרדה והסרה של מיטוכונדריה פגומה באמצעות מיטוכונדריה 7,12. יתר על כן, ביקוע מסייע להפריד רכיבים פגומים של המיטוכונדריה, אשר מוסרים לאחר מכן על ידי מיטופגיה, תהליך אוטופגיה סלקטיבי13. היתוך, לעומת זאת, מאפשר השלמה של תכולת המיטוכונדריה, ומדלל את כל הרכיבים הפגומים14. שחקני המפתח בביקוע/היתוך מיטוכונדריאלי הם מיטופוסינים (MFN1/2), החיוניים לאיחוי ממברנה מיטוכונדריאלית חיצונית15,16, (OPA1): GTPase דמוי דינמין זה אחראי לאיחוי ממברנה מיטוכונדריאלית פנימית16. חלבוני ביקוע כוללים חלבון הקשור לדינמין 1 (Drp1), חלבון פרו-ביקוע13,17. חלבון ביקוע מיטוכונדריאלי 1 (Fis1), גורם ביקוע מיטוכונדריאלי (Mff) ומווסת ביקוע מיטוכונדריאלי 1 כמו (MTFR1L). מספר טכניקות, כמו EM ברזולוציה גבוהה, שימשו לחקר אולטרה-מבנה מיטוכונדריאלי18. פלואורסצנציה של מולקולה אחת במקום הכלאה (smFISH) בשילוב עם מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה של STED ו-MINFLUX (ננוסקופיה) שימשו להמחשת mRNA מיטוכונדריאלי בודד וחלבונים קשורים18. טכניקות מיקרוסקופ לוקליזציה של מולקולה בודדת (SMLM) עוקבות אחר שינויים במרווח הממברנה19. מיקרוסקופיה סופר-רזולוציה של מיקרוסקופיה שחזור אופטי סטוכסטי (STORM) מאפשרת לחקור קומפלקסים של הממברנה הפנימית המיטוכונדריאלית20. עם זאת, השימוש בציוד מתקדם זה אינו נגיש בקלות. מיקרוסקופיה קונפוקלית נגישה ודורשת פחות מומחיות. יתר על כן, הפיתוח של חלבונים פלואורסצנטיים ממוקדי מיטוכונדריה קידם משמעותית את חקר הדינמיקה המיטוכונדריאלית בתאים חיים21, מכיוון שאנו משתמשים בחלבון פלואורסצנטי ירוק הניתן לפוטו-אקטיבציה (GFP) כדי לדמיין ולכמת את ההיתוך המיטוכונדריאלי22.

כדי לחקור ביקוע ואיחוי מיטוכונדריה, התאים נלחצים או נחשפים לתרופות כמו ציספלטין, שנקשר ל-DNA וגורם לנזק ל-DNA, שמגיע לשיאו באפופטוזיס בתיווך מיטוכונדריה23. במחקר זה, השתמשנו במיטוכונדריה מתויגת Dendra2 הניתנת להחלפה בעכברי מיטוכונדריה הניתנים להפעלה באור כדי לחקור את אירועי הביקוע וההיתוך בתאי צינוריות בכליה שטופלו בציספלטין, מכיוון שהם עשירים במיטוכונדריה ובעלי יכולת התחדשות גבוהה. עם זאת, ניתן להשתמש בפרוטוקול זה בכל סוג תא שיש לו מיטוכונדריה Dendra2 מתויגת הניתנת להחלפה בתמונה (איור 1A-C).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל העבודה בבעלי חיים בוצעה בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת טמפל, אוניברסיטת טמפל (פרוטוקול בעלי חיים-5183). עכברי הפאם, שיש להם מיטוכונדריה המבטאת חלבון Dendra2, נרכשו.

1. הכנת מדיום תרבית תאים

  1. לבודד תאים צינוריים פרוקסימליים של הכליה לפי הפרוטוקול אחרי שהם מופרדים מתאי אנדותל גלומרולרים באמצעות חרוזים24 (איור 1A). Bouchareb et al., פיתחו שיטה לבידוד ותרבית תאי אנדותל גלומרולרים (GECs) מכליות של עכברים טרנסגניים המבטאים מיטוכונדריה פלואורסצנטית (mito-Dendra2) באמצעות חרוזים מגנטיים. לאחר בידוד GEC, הצינוריות שנותרו בגלולה מבודדות ומתורבתות בתרבית.
  2. תרבית תאים צינוריים פרוקסימליים של הכליה בצלחת של 10 ס"מ עם 10 מ"ל של DMF-12 בתוספת 5% FBS (מנוטרל בחום), פניצילין (100 U/mL) וסטרפטומיצין (100 מיקרוגרם/מ"ל). גדל צינוריות במשך 2-3 ימים עד שהן נודדות מהצינורות.
  3. בחר תאים צינוריים לפי מורפולוגיה לאחר רעב (עם DMF-12 ללא FBS) במשך יומיים.
    הערה: לצורך הניסויים, השתמש בדיסק עם 50-70% תאים קונפלואנטים. ספרו את התאים בעזרת המוציטומטר לפני הזריעה.
  4. זריעת תאים לניסויים: זרע את התאים בצלחות תרבית עם תחתית זכוכית בצפיפות של 1-5 × 105 תאים לבאר, בהתאם לדרישות הניסוי. אפשר לתאים להיצמד ולצמוח למשך הלילה לפני הוספת ציספלטין.
    הערה: ציספלטין היא תרופה כימותרפית מסוכנת, חיוני לעקוב אחר פרוטוקולי בטיחות כדי להגן על הצוות והסביבה. למטרה זו, עקוב אחר הוראות ארון הבטיחות הביולוגי מסוג II, ציוד מגן אישי (PPE), טיהור, בקרת שפיכה וסילוק פסולת (פסולת תרופות מסוכנות-כימותרפיה): ללבוש כפפה כפולה, לחפש בגוגל, לטהר את משטח העבודה ולשמור את ערכת הדליפה ליד תחנת העבודה, לסמן בבירור את מיכל הפסולת. עבור DMSO, ללבוש PPE, לעבוד במכסה אדים ולעקוב אחר נהלי טיהור וסילוק הדליפה.

2. אינדוקציה של מתח באמצעות ציספלטין

  1. הכנת מדיום ציספלטין
    1. הכן תמיסת מלאי של 50 מ"מ של ציספלטין על ידי המסה ב-DMSO.
    2. צלחת 1-5 x 106 תאים צינוריים פרוקסימליים על צלחת התרבות התחתונה מזכוכית, הוסף 2 מ"ל של מדיה DMF-12.
      הערה: ניתן להשתמש בכל דיסק תרבית עם תחתית זכוכית.
    3. הוסף ציספלטין לריכוז סופי של 2 מיקרומטר לצלחת הניסוי, כדי לקבל 0.004% כריכוז הסופי של DMSO.
      הערה: הכן 2 מיקרוליטר של 50 מ"מ ציספלטין מדולל ב-1,998 מיקרוליטר של מדיה DMF-12 ללא FBS, והוסף 80 מיקרוליטר לצלחת הניסוי.
    4. דגרו על התאים למשך 24 שעות.

3. הדמיה

  1. שימוש במיקרוסקופ קונפוקלי
    1. הגדר לייזרים ל-405 ננומטר (המרת תמונות Dendra2), 488 ננומטר (עירור Dendra2 לא מומר) ו-561 ננומטר (Dendra2 מומר בתמונות, Alexa 594).
    2. הפעל לייזרים ואפשר זמן לייצוב (~10 דקות)
  2. חקר אירועי ביקוע והיתוך
    1. הגדר לייזרים ל-405 ננומטר (המרת תמונות Dendra2), 488 ננומטר (עירור Dendra2 לא מומר) ו-561 ננומטר (Dendra2 מומר בתמונות, Alexa 594).
    2. הנח את דיסק התרבות בתא הדגירה.
    3. מוסיפים מים סביב החדר ומגדירים את הטמפרטורה ל-37 מעלות צלזיוס. יש לשמור על אספקת CO2 .
    4. אפשר לתא הדגירה להתאזן. שינוי הטמפרטורה ילחיץ את התאים.
    5. דמיין את התאים באמצעות הגדלה ורזולוציה גבוהות יותר להדמיה מיטוכונדריאלית.
    6. פתח את התפריט הנפתח בפינה השמאלית העליונה ובחר באפשרויות FRAP (איור 2A-D).
    7. הגדר את אזור העניין (ROI) באמצעות תוכנת LAS X, בו יבוצע פוטו-הלבנה.
      הערה: ניתן לצייר את אזור העניין בכל גודל, מה שלא משפיע על התוצאות, שכן מנתחים מיטוכונדריה בודדים.
    8. רכוש סדרה של תמונות טרום-אקונומיקה בעוצמת לייזר נמוכה כדי לבסס את עוצמת הקרינה הבסיסית. Setlasersto405nmאורך גל עבור מיתוג צילום (0.00), 48 ננומטר (0.20) ו-56 ננומטר (0.20), מה שמבטיח שהתאים ממוקדים.
      הערה: הערכים בסוגריים העוקבים אחר אורכי גל הלייזר מצביעים על עוצמות לייזר שניתן להגדיר לכל ערך מכיוון שהדבר אינו משפיע על פוטוהלבנה.
    9. כדי להלבין את התאים, החל דופק לייזר בעוצמה גבוהה כדי להלבין את ה-ROI. הגדר את לייזרי FRAP ל-405 ננומטר (4.00), 488 ננומטר (0.00) ו-561 ננומטר (0.00). הגדר את ההלבנה המוקדמת ל-5.140 שניות עבור 59 איטרציות, ואת ההלבנה לאחר ההלבנה לתזמון הרצוי (איור 2B) (עוצמת הלייזר Prebleach ו-Post-Bleach מוזכרת בסוגריים).
    10. להדמיה לאחר הלבנה, המשך לרכוש תמונות בעוצמת לייזר נמוכה כדי לצפות בהתאוששות הקרינה למשך 10 דקות. שמור על לייזר FRAP ב-405 ננומטר (0.00), 488 ננומטר (0.50) ו-561 ננומטר (0.50).
      הערה: זמן ההלבנה עשוי להשתנות בהתאם לסוגי התאים, בידינו, תזמוני הלבנה דומים שימשו למיטוכונדריה בתאים צינוריים ובתאי שסתום אינטרסטיציאליים (VIC). לאחר סיום ה-FRAP, ניתן לבצע את התמונות או הדמיית תאים חיים (איור 3 וסרטון משלים 1), מלבד רכישת התמונות לאחר ההלבנה.

4. ניתוח תמונות

הערה: מכיוון שהמיטוכונדריה מתויגים עם חלבון Dendra2, לאחר שעוברים פוטו-הלבנה, שינוי קונפורמציה בלתי הפיך בחלבון Dendra2 מוביל לעלייה בקרינה האדומה שזוהתה באמצעות לייזר 561 ננומטר. כאשר המיטוכונדריה האדומה מתמזגת עם המיטוכונדריה הירוקה הלא מולבנת, השילוב נותן צבע צהוב. תוך ניצול תופעה זו, ניתן למדוד את אירועי הביקוע/היתוך הדינמיים.

  1. פרופיל המיטוכונדריה האדום והירוק הממוזגים
    1. התקן את RGB profiler plugin כדי ליצור פרופיל של האות האדום והירוק על פני הבחירה.
      הערה: עקוב אחר ההוראות באתר כדי להוסיף את התוסף לקטע פיג'י.
    2. פתח את ImageJ (איור 4A).
    3. מתפריט קובץ , אתר ופתח את הקובץ לניתוח (איור 4B).
    4. בחר את מצב הצבע המורכב, סמן את אפשרות קנה המידה האוטומטי ופתח את הסרטון לניתוח (איור 4C).
    5. בחר אזור מלבני לניתוח (איור 4D).
    6. רחף ליד אזור המלבן שנבחר, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני ובחר שכפל (איור 4E).
    7. בחר באפשרות duplicate hyper stack , המשכפלת את כל ערימות התמונות (איור 4F).
    8. כדי להמיר את הערימה המשוכפלת לתבנית RGB, בחר את התמונה ובחר באפשרות RGB בתפריט הנפתח של התמונה (איור 4G-H).
    9. תמונת ה-RGB משוכפלת, ובוחרת מסגרת אחת בלבד (איור 4I).
    10. אם המיטוכונדריה בתמונה מעוקלת, צייר קו לאורכם. לאחר מכן, עבור לתפריט עריכה , בחר בחירה ולחץ על יישור (איור 5A).
    11. בחר כותרת עבור התמונה והגדר את רוחב הקו ל-20 פיקסלים (איור 5B).
    12. אחרי יישור המיטוכונדריה, ציירו קו לאורך המיטוכונדריה המעניינת כדי לוודא שהיא בקו ישר (איור 5C).
    13. פתח את RGB Profiler תוסף (איור 5D).
    14. לאחר ההפעלה, התוסף יפיק עלילה המציגה עוצמות פלואורסצנטיות אדומות וירוקות לאורך הקו המצויר. הגובה של כל פסגה עומד ביחס ישר לעוצמת הקרינה (איור 5E).
      הערה: ניתן לחשב מורפולוגיה מיטוכונדריאלית גם באמצעות תוסף מנתח המיטוכונדריה25. בחר את האזורים המשמשים לחשיפה, נתח את הסף באזורים שנבחרו ולאחר מכן מדוד את המורפולוגיה של המיטוכונדריה וניתוח דו-ממדי. ניתן לבחור את היקף השטח ופרמטרים אחרים.

5. לנתח אירועי היתוך

  1. קבע את קו הבסיס לפני האיחוי: לפני היתוך מיטוכונדריאלי, ודא שהפלואורסצנציה האדומה (561 ננומטר) ממוקמת במיטוכונדריון אחד והפלואורסצנציה הירוקה (488 ננומטר) לסמוכה. תרשים העוצמה המתאים צריך להציג שתי פסגות נפרדות, אחת אדומה ואחת ירוקה, עם חפיפה מינימלית.
  2. אישור אירוע לאחר האיחוי: לאחר האיחוי, האות האדום (המייצג את תכולת מטריצת Dendra2) אמור להתפשט למיטוכונדריה הירוקה הסמוכה, מה שמעיד על ערבוב תוכן. תרשים העוצמה יציג כעת פסגות אדומות וירוקות חופפות, המאשרות אירוע היתוך.
  3. ניתן לקבוע את הערכת אירועי האיחוי על ידי בחירה קפדנית של המיטוכונדריה הבריאה והמיטוכונדריה המולבנת לאיחוי בהדמיית התאים החיים. שינוי ביחס בין אדום/ירוק לאורך זמן יצביע על אירוע האיחוי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

תאי אפיתל צינוריים ראשוניים בודדו מכליות העכבר על ידי עיכול אנזימטי ותרבית ב-DMF-12 בתוספת 5% FBS, 1% פניצילין-סטרפטומיצין ב-37 מעלות צלזיוס מתחת ל-5% CO2. עם הגעתם למפגש של 80%, התאים עברו טריפסין (0.25% טריפסין-EDTA) ונזרעו בצפיפות של 5 × 104 תאים לבאר לתוך צלחות תרבית תחתית זכוכית, מצופות מראש בקולגן.

מדיום התרבית הכיל ציספלטין בריכוז סופי של מיקרומטר ב-DMF-12 בתוספת 0.004% DMSO (v/v; תואם לנפח הממס של ציספלטין). התאים נחשפו לטיפולים ב...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

ביקוע/היתוך מיטוכונדריאלי הם תהליכים דינמיים חיוניים השומרים על הומאוסטזיס מיטוכונדריאלי וכדאיות תאית26. הערכה נכונה של תהליכים אלה דורשת טכניקות הדמיה מתקדמות כדי לדמיין ולכמת את המורפולוגיה, הדינמיקה והתפקוד המיטוכונדריאלי27,28. טכניקות שונות שימשו למדידת ביקוע/היתוך מיטוכונדריאלי. חלק מהכלים המתוחכמים כוללים ננוסקופיה של דלדול פליטה מגורה (STED), המאפשרת הדמיה של דינמיקת קריסטה מיטוכונדריאלית בתאים חיים...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין להם מה לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי מענקי מחקר ממענק המכון הלאומי לבריאות מספר 5R01DK135470-03, מענק ISAC-NIH 5U24DK128851-03 ומלגת פוסט-דוקטורט של איגוד הלב האמריקאי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Cell Culture 
DMEM/F12 בסיס בינוני (גיבקו/חתול. מס' 11320033 ) תרבית תאים צינורית פרוקסימלית 
סרום בקר עוברי (FBS) 5-10% תוספים (ביוווסט/קט. No.S181B) עשרה של מדיה תרבותית  
פניצילין-סטרפטומיצין 100X (גיבקו/חתול. מס' 15140122) הגנה מפני אנטיביוטיקה  
קולגן IV ציפוי  (סיגמא-C5533-5M) ציפוי לוחות Ibidi  
Trypsin-EDTA 0.25% פתרון  (גיבקו/חתול. מס' 25200056) ניתוק תאים 
סליין מפוזר-פוספט (PBS) (גיבקו/חתול. מס' 10010023 ) שטיפת תאים 
<חזק>טיפולים 
Cisplatin 2 ומיקרו; M בעבודה התמחות ו-nbsp;(סלק כימיקלים/חתול. מס' S1166) השראה למתח   
דימתיל סולפוקסיד (DMSO) בקרת רכב (פישר סיינטיפיק/קט. No.D1391) Cisplatin solvent control 
imaging 
פנול אדום-חופשי מדיום הדמיה חיה  (גיבקו/חתול. מס' 21041025) הפחתת פלואורסצנציה ברקע 
ביולוגיה מולקולרית  
טריזול ורג;  חילוץ RNA  (גיבקו/חתול. מס' 15596018) בידוד RNA מלא  
SYBR Green Master Mix  qPCR כימיה  (תרמו סיינטיפיק/Cat. No.K0221) ביטוי גנים בדינמיקת מיטוכונדריה (DNM1L, FIS1, MFN1, MFN2, OPA1) 
Fluorescent Tools 
Dendra2 תג מטריצה מיטוכונדריאלית  מעבדת ג'קסון (PhAMexcised) כתב שניתן להחליף תמונות (המרה ל-405 ננומטר, הדמיית 488/561 ננומטר) 
<חזק>מיקרוסקופים 
מיקרוסקופ קונפוקלי  לייקה DMi8 הדמיה של תאים חיים ו-FRAP לייזרים 405nm/488nm/561nm  
תמונה J https://imagej.net/software/fiji/downloads 
תוסף ל-RGB Profiler  https://imagej.net/ij/plugins/rgb-profiler.html. ניתוח אירועי היתוך (חפיפה בין אות אדום/ירוק) 

מקורות

  1. Liesa, M., Palacin, M., Zorzano, A. Mitochondrial dynamics in mammalian health and disease. Physiol Rev. 89 (3), 799-845 (2009).
  2. Chen, Z., Berquez, M., Luciani, A. Mitochondria, mitophagy, and metabolic disease: towards assembling the puzzle. Cell Stress. 4 (6), 147-150 (2020).
  3. Ding, Y., et al. Mitochondrial segmentation and function prediction in live-cell images with deep learning. Nat Commun. 16, 743(2025).
  4. Jiao, H., et al. Mitocytosis, a migrasome-mediated mitochondrial quality-control process. Cell. 184 (11), 2896-2910.e13 (2021).
  5. Kraus, F., Roy, K., Pucadyil, T. J., Ryan, M. T. Function and regulation of the divisome for mitochondrial fission. Nature. 590 (7844), 57-66 (2021).
  6. He, X., et al. GTPBP8 modulates mitochondrial fission through a Drp1-dependent process. J Cell Sci. 137 (8), jcs261612(2024).
  7. San-Millán, I. The key role of mitochondrial function in health and disease. Antioxidants. 12 (4), 782(2023).
  8. Ponte, S., et al. Drp1-mediated mitochondrial fission regulates calcium and F-actin dynamics during wound healing. Biol Open. 9 (5), bio048629(2020).
  9. Sabouny, R., Shutt, T. E. The role of mitochondrial dynamics in mtDNA maintenance. J Cell Sci. 134 (24), jcs258944(2021).
  10. Huang, H., et al. Mitochondrial dynamics tracking with two-photon phosphorescent terpyridyl iridium(III) complexes. Sci Rep. 6, 20887(2016).
  11. Chen, W., Zhao, H., Li, Y. Mitochondrial dynamics in health and disease: mechanisms and potential targets. Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 333(2023).
  12. Sabouny, R., Shutt, T. E. Reciprocal regulation of mitochondrial fission and fusion. Trends Biochem Sci. 45 (7), 564-577 (2020).
  13. Jin, P., et al. Mitochondrial adaptation in cancer drug resistance: prevalence, mechanisms, and management. J Hematol Oncol. 15 (1), 97(2022).
  14. Wai, T., et al. The membrane scaffold SLP2 anchors a proteolytic hub in mitochondria containing PARL and the i-AAA protease YME1L. EMBO Rep. 17 (12), 1844-1856 (2016).
  15. Schiavon, C. R., Shadel, G. S., Manor, U. Impaired mitochondrial mobility in Charcot-Marie-Tooth disease. Front Cell Dev Biol. 9, 624823(2021).
  16. Sivakumar, A., Shanmugarajan, S., Subbiah, R., Balakrishnan, R. Cardiac mitochondrial PTEN-L determines cell fate between apoptosis and survival during chronic alcohol consumption. Apoptosis. 25 (7-8), 590-604 (2020).
  17. Simula, L., et al. Mitochondrial metabolism sustains CD8+ T cell migration for an efficient infiltration into solid tumors. Nat Commun. 15 (1), 2203(2024).
  18. Kopek, B. G., Shtengel, G., Xu, C. S., Clayton, D. A., Hess, H. F. Correlative 3D superresolution fluorescence and electron microscopy reveal the relationship of mitochondrial nucleoids to membranes. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (16), 6136-6141 (2012).
  19. Whelan, D. R., Bell, T. D. Image artifacts in single molecule localization microscopy: why optimization of sample preparation protocols matters. Sci Rep. 5, 7924(2015).
  20. Palmer, C. S., et al. Super-resolution microscopy reveals the arrangement of inner membrane protein complexes in mammalian mitochondria. J Cell Sci. 134 (13), jcs252197(2021).
  21. Liu, F., et al. The interactome of intact mitochondria by cross-linking mass spectrometry provides evidence for coexisting respiratory supercomplexes. Mol Cell Proteomics. 17 (2), 216-232 (2018).
  22. Karbowski, M., Cleland, M. M., Roelofs, B. A. Methods Enzymol. , Elsevier. Netherlands. (2014).
  23. Kleih, M., et al. Direct impact of cisplatin on mitochondria induces ROS production that dictates cell fate of ovarian cancer cells. Cell Death Dis. 10 (11), 851(2019).
  24. Bouchareb, R., Yu, L., Lassen, E., Daehn, I. S. Isolation of conditionally immortalized mouse glomerular endothelial cells with fluorescent mitochondria. J Vis Exp. (187), e64147(2022).
  25. Chu, C. H., Tseng, W. W., Hsu, C. M., Wei, A. C. Image analysis of the mitochondrial network morphology with applications in cancer research. Front Phys. 10, 855775(2022).
  26. Montecinos-Franjola, F., Ramachandran, R. Methods Mol Biol. , Springer, US. (2020).
  27. Gaspar, M. L., Chang, Y. F., Jesch, S. A., Aregullin, M., Henry, S. A. Interaction between repressor Opi1p and ER membrane protein Scs2p facilitates transit of phosphatidic acid from the ER to mitochondria and is essential for INO1 gene expression in the presence of choline. J Biol Chem. 292 (45), 18713-18728 (2017).
  28. Karbowski, M. Adv Exp Med Biol. , Springer, US. (2010).
  29. Yang, X., et al. Mitochondrial dynamics quantitatively revealed by STED nanoscopy with an enhanced squaraine variant probe. Nat Commun. 11 (1), 3699(2020).
  30. Opstad, I. S., et al. Three-dimensional structured illumination microscopy data of mitochondria and lysosomes in cardiomyoblasts under normal and galactose-adapted conditions. Sci Data. 9 (1), 98(2022).
  31. Kunz, T. C., Götz, R., Gao, S., Sauer, M., Kozjak-Pavlovic, V. Using expansion microscopy to visualize and characterize the morphology of mitochondrial cristae. Front Cell Dev Biol. 8, 617(2020).
  32. Teixeira, P., Galland, R., Chevrollier, A. Super-resolution microscopies, technological breakthrough to decipher mitochondrial structure and dynamic. Semin Cell Dev Biol. 159 - 160, 38-51 (2024).
  33. Kirchweger, P., et al. Snapshots of mitochondrial fission imaged by cryo-scanning transmission electron tomography. J Cell Sci. 138 (9), jcs263639(2025).
  34. Collins, H. E., et al. Mitochondrial morphology and mitophagy in heart diseases: qualitative and quantitative analyses using transmission electron microscopy. Front Aging. 2, 670267(2021).
  35. Marshall, A. G., Damo, S. M., Hinton, A. Revisiting focused ion beam scanning electron microscopy. Trends Biochem Sci. 48 (6), 585-586 (2023).
  36. Adebayo, M., Singh, S., Singh, A. P., Dasgupta, S. Mitochondrial fusion and fission: the fine-tune balance for cellular homeostasis. FASEB J. 35 (6), e21620(2021).
  37. Munro, D., Baldy, C., Pamenter, M. E., Treberg, J. R. The exceptional longevity of the naked mole-rat may be explained by mitochondrial antioxidant defenses. Aging Cell. 18 (3), e12916(2019).
  38. Varuzhanyan, G., Chan, D. C. Mitochondrial dynamics during spermatogenesis. J Cell Sci. 133 (14), jcs235937(2020).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

FRAPDendra2ImageJ
הערכת דינמיקת ביקוע/היתוך מיטוכונדריאלית בתאים צינוריים פרוקסימליים בכליה
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.