הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

אסטרטגיות השוואתיות לזיהוי יוביקוויטינציה בליזטים של תאי יונקים באמצעות SMAD2/SMURF2 כמודל

948 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/69321

⸱

17 באפריל 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Emergency Surgery, Wuhan Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, 2Department of Medical Genetics, School of Basic Medicine, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology

במאמר זה

סיכום

יוביקוויטינציה היא רגולטור קריטי של תפקודי החלבון התוך-תאי. כאן, אנו מתארים שתי שיטות ניתוק תאים לזיהוי רמות יוביקוויטינציה של חלבוני סובסטרט בתאי יונקים ומשווים את יעילותן בניתוח רמות יוביקוויטינציה. ביטוי יתר של חלבונים בתאים HEK293T הושר על ידי טרנספקציה חולפת, וחלבונים מאוביקוויטיניים זוהו בניתוח Western Blot.

תקציר

יוביקוויטינציה, שינוי פוסט-תרגומי, היא רגולטור קריטי של תפקוד החלבון התוך-תאי. יוביקוויטינציה מווסת את תפקודי החלבון על ידי קידום פירוק פרוטאזום או שינוי מיקום תת-תאי באמצעות איתות תלוי שרשרת יוביקוויטין. כאן, אנו מתארים שתי שיטות פירוק תאים לזיהוי רמות יוביקוויטינציה של SMAD2 בתאי HEK293T ומשווים את יעילותן בניתוח רמות האוביקוויטינציה של חלבונים. ביטוי יתר של חלבון בתאים נגרם על ידי טרנספקציה חולפת. הפלסמידים (HA-Ub, FLAG-SMAD2, ו-MYC-SMURF2) ומגני הטרנספקציה נוספו בנפרד לתוך הבסיס החיצוני, התערבבו, והתערובת נוספה לתאים. לפני הקציר, נוסף MG132 כדי לעכב פירוק פרוטאזום ולשפר את הצטברות החלבון המאוביקוויטין. ההבדל העיקרי בין שתי הגישות הניסיוניות הוא שיטות ניתוק התאים שלהן – שיטת אמבט הקרח (המתבצעת בטמפרטורה של 4°C) ושיטת הטיפול בחום (הכוללת דגירה ב-95 מעלות צלזיוס), שמשפיעה באופן משמעותי על יעילות הליזה של חלבונים. לאחר סיום פירוק התאים, התערובבו ודגרו את הליזאט התא, חרוזי האגרוז ונוגדן FLAG בטמפרטורה של 4°C במהלך הלילה. חלבונים עם יוביקוויטין זוהו לאחר מכן באמצעות ניתוח ווסטרן בלוט. לפני זיהוי חלבונים מאוביקוויטינים, נעשה שימוש בנוגדן שרשרת קלה לדגירה משנית של נוגדנים. לאחר מכן, זוהו רצועות יוביקוויטינציה. התוצאות מראות שגם שיטת אמבט הקרח וגם שיטת הטיפול בחום יכולות לשמש לזיהוי רמות יוביקוויטינציה, בעוד ששיטת הטיפול בחום עשויה להקל על זיהוי יוביקוויטינציה של SMAD2. מחקר זה מגדיר ומשווה בין שתי שיטות פירוק תאים למדידת רמות יוביקוויטינציה בתאי יונקים, תוך שימוש ב-SMURF2/SMAD2 כמודל, כדי לסייע לחוקרים בבחירת שיטות מתאימות יותר לזיהוי רמות האוביקוויטינציה של חלבוני הסובסטריט.

מבוא

יוביקוויטינציה, שינוי פוסט-תרגומי הכרחי, הוא רגולטור קריטי של תפקודי חלבון תוך-תאי1. מערכת האוביקוויטין-פרוטאזום (UPS), המתווכת את פירוק מעל 80% מהחלבונים באאוקריוטים, מורכבת מיוביקוויטין (Ub), אנזימי E1 מפעילים, אנזימי קונוגטציה של E2, ליגזי E3, אנזימי דה-ביקוויטילציה (DUBs) ופרוטאזום2 מסוג 26S. מערכת זו מווסתת את מחזור החלבונים בספציפיות גבוהה, ובכך שולטת בתהליכים תאיים חיוניים כגון התקדמות מחזורהתא 3, העברת אותות 4,5, ותגובות לחץ 6,7. יוביקוויטינציה היא תהליך אנזימטי רב-שלבי. E1 מחבר את ATP לאדנילציה של קצה ה-C של Ub, ויוצר ביניים של Ub-AMP. לאחר מכן, ה-Ub המופעל מועבר מ-E1 לציסטאין באתר הפעיל של אנזים מצמיד E2, ויוצר קשר תיואסטר. לבסוף, ליגז E3 מגייס הן את קומפלקס E2-Ub והן חלבון מטרה, ומזרז את העברת Ub מ-E2 לשארית ליזין על הסובסטרט8.

יוביקוויטין יכול ליצור שרשראות פוליאוביקוויטין מגוונות דרך קישור בשבעה שאריות ליזין (Lys6, Lys11, Lys27, Lys29, Lys33, Lys48, Lys63) או Met1(M1)4. כל סוג קישור קובע תוצאות ביולוגיות שונות: שרשראות מקושרות K48 מכוונות בעיקר לחלבונים לפירוק פרוטאזום9, שרשראות מקושרות K63 מווסתות אותות ותיקון DNA10,11, ושרשראות מקושרות M1 הן קריטיות לתגובות חיסוניות מולדות12. יוביקוויטינציה ודאוביקוויטינציה הם תהליכי שינוי מרכזיים לאחר תרגום השולטים באירועים תאיים מגוונים, החל מפירוק חלבונים ועד העברת אותות. לדוגמה, בסרטן המעי הגס, הפעלה חריגה של יוביקוויטינציה של p53 בתיווך MDM2 גורמת לפירוק מופרז של p53, הפוגעת ביכולתו לגרום לעצירת מחזור תאים ואפופטוזיס, ובכך להוביל להתקדמות הגידול ולכימו-עמידות13,14. בפגיעת איסכמיה-רפווזיה כבדית, OTUD1 מייצב את NRF2 על ידי הסרת הפוליאוביקוויטינציה המקושרת ל-K48 שלו, ובכך מקל על רמות הלחץ החמצוני התוך-תאי15,16. מגוון מעכבי פרוטאזום, כגון בורטסומיבי, קרפילזומיב ואיקאזומיב, נכנסו בהדרגה לפרקטיקה קלינית למחלות כמו מיאלומה נפוצה 17,18,19.

כיום קיימות שיטות רבות לזיהוי חלבונים מאוביקוויטינים, כולל Western blotting, בדיקות מבוססות רדיואקטיביות ובדיקות פלואורסצנציה20. עם זאת, במחקר המדעי, הכתם המערבי נותר השיטה המועדפת לזיהוי אוביקוויטינציה של חלבונים בשל הפרוטוקול המהיר והפשוט יחסית שלו. השיטות המסורתיות לזיהוי חלבונים יוביקוויטיניים דומות לטכנולוגיית קו-אימונופרציפיטציה (co-IP): הן משתמשות בבופר ליזיס כדי לדגור ולליז כדורי תאים בטמפרטורה נמוכה לשחרור חלבונים, ואז משתמשים בנוגדנים לזיהוי האוביקוויטינציה של חלבוני סובסטרט21,22. עם זאת, פרוטוקול ניסויי זה דורש לעיתים קרובות מספר רב של תאים. בנוסף, מכיוון ששיטת הליזה המתונה יחסית בטמפרטורה נמוכה אינה יכולה לשבש לחלוטין אינטראקציות חלבונים, הדבר מעלה את הסיכוי לתוצאות חיוביות שגויות באוביקוויטינציה שמזוהה. חימום ושימוש ב-SDS יכולים להפריע משמעותית למבנה החלבון, לגרום לדנאטורציה מלאה שלהם, ובכך להפחית תוצאות חיוביות שגויות הנגרמות מאינטראקציות חלבון-חלבון 23,24,25. באופן דומה, התאים עוברים פירוק מספק לאחר חימום וטיפול ב-SDS, משחררים יותר חלבונים ובמקביל מפחיתים את כמות התאים הנדרשת לניסוי. לסיכום, גם שיטת אמבטיית הקרח וגם שיטת הטיפול בחום מזהות תאים ומזהות את רמות האוביקוויטינציה של חלבוני הסובסטרט באמצעות דגירה של נוגדנים. עם זאת, שיטת החימום גורמת לפירוק תאים גדול יותר ולחיזוק דנאטורציה של חלבונים.

TGF-β ממלא תפקיד כפול בתהליכים פתופיזיולוגיים של מחלות שונות26,27. SMAD2 הוא גורם שעתוק קריטי במורד הזרם של TGF-β. יוביקוויטינציה מתווכת SMURF2 של SMAD2 מכוונת אותו לפירוק פרוטאזומי, ובכך מכוונת בעדינות את עוצמת איתות TGF-β28. מחקר זה מגדיר ומשווה בין שתי שיטות ניתוק תאים למדידת רמות יוביקוויטינציה בתאי יונקים, תוך שימוש ב-SMURF2/SMAD2 כמודל. כאן, ביטוי יתר של חלבון בתאי HEK293T הושרה על ידי טרנספקציה זמנית עם פלסמידים HA-Ub, FLAG-SMAD2 ו-MYC-SMURF2. התאים עברו פירוק באמצעות שיטת אמבטיית הקרח ושיטת הטיפול בחום, בהתאמה. חלבונים מאוביקוויטינים זוהו באמצעות ניתוח ווסטרן בלוט. מצאנו שגם שיטת אמבטיית הקרח וגם שיטת הטיפול בחום יכולות לשמש לזיהוי רמות יוביקוויטינציה, ושיטת הטיפול בחום עשויה להקל על זיהוי יוביקוויטינציה של SMAD2. פרוטוקול זה מספק אלטרנטיבה חדשה לזיהוי חלבונים יוביקוויטיניים. יתרה מזאת, עבור חלבוני סובסטרט מסוימים הקשורים חזק לאוביקוויטינציה, שיטת הטיפול בחום משיגה יעילות פירוק חלבונים טובה יותר, ובכך מאפשרת זיהוי קל יותר של יוביקוויטינציה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. הכנת בופר ליזיס ומגבים

הערה: הכינו את כל המאגרים בריכוזים הנדרשים. פעל לפי הוראות היצרן לגבי אבקות ריגוז כדי למנוע הבדלים בריכוז.

  1. הכינו בופר פירוק המכיל 20 מ"מ טריס-HCl (pH 7.4), 50 מ"מ NaCl, 1 מ"מ EDTA (pH 8.0), ו-1% טריטון X-100. כוון את ריכוז ה-NaCl בין 50-150 מ"מ אם צריך. הכינו את כל הבופרים באמצעות H₂O מזוקק כפול.
  2. הכינו תמיסה עובדת על ידי הוספת בופר ליזיס עם קוקטייל מעכב פרוטאז 1% (ללא EDTA). ערבבו היטב ושמרו על קרח עד השימוש.
  3. הכינו 10% SDS על ידי המסה של 1 גרם אבקת SDS ב-10 מ"ל PBS. ערבב עד שזה נמס לגמרי. אחסן בטמפרטורת החדר.
  4. הכינו 5× בופר טעינת חלבון המכיל 250 מ"מ טריס-HCl (pH 6.8), 10% SDS, 50% גליצרול, 0.5% ברומופנול כחול, ו-5% β-מרקפטואנול. המיס רכיבים ב-H2 O מזוקק כפול. ערבב היטב לפני השימוש.
    הערה: לטפל ב-SDS וב-β-מרקפטואנול בתוך מכסה אדים תוך כדי לבישת ציוד מגן מתאים. השלכת חומרים מזוהמים בהתאם להנחיות הפסולת הכימית המוסדית.

2. הכנת תאים

  1. לשמור על תאים HEK293T ב-DMEM עתיר גלוקוז עם תוספת של 10% FBS ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO₂ בתנאים סטריליים. תאי מעבר בנקודת חיבור של כ-90%.
  2. תאי זרעים בלוחות עם 6 בארות ב-5 × 10⁵ תאים לבאר. מאגדים תאים משני בארות ליצירת דגימה אחת.
  3. הכינו תערובות טרנספקציה שייצגו 10% מנפח התרבית הכולל והשתמשו באוביקוויטינציה של SMAD2 כמודל ניסוי. שלבו 1 מיקרוגרם פלסמיד HA-Ub, 1 מיקרוגרם פלסמיד FLAG-SMAD2, ו-0.5 מיקרוגרם פלסמיד וקטורי ריק או MYC-SMURF2 ב-100 מיקרו ליטר DMEM ללא סרום. בצינור נפרד, יש לדלל 3.75 מיקרוליטר של תגובת טרנספקציה ב-100 מיקרוליטר DMEM ללא סרום. הוסיפו את תערובת התגובה טיפה לתמיסת הפלסמיד, דגרו 15 דקות בטמפרטורת החדר, ופזרו באופן שווה על התאים.
  4. החלף את מדיום הטרנספקציה אחרי 6-8 שעות ב-2 מ"ל DMEM טרי ומלא בכל באר. דגר תאים למשך 48 שעות.
  5. לטפל בתאים עם 5 מיקרומום MG132 במשך 12 שעות לפני הקציר.
    הערה: לטפל ב-MG132 בארון בטיחות ביולוגית תוך כדי לבישת כפפות. סילוק חומרים מזוהמים בהתאם לנהלי בטיחות מוסדיים.

3. איסוף תאים

  1. קציר תאים בנקודת חיבור של 90-100% (~3 × 10⁶ תאים). שאפתי מדיום ושוטף כל באר עם 1 מ"ל של PBS מקורר מראש. הסר את PBS לחלוטין.
  2. הוסף 1 מ"ל PBS לכל באר ותשהה בעדינות את התאים. העבר את המתלה לצינור של 1.5 מ"ל והנח על קרח.
  3. צנטריפוגה ב-380 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. הסר את הסופרנטנט ושמור את הכדור.

4. הכנת חרוז אגרוז

  1. העבר 50 מיקרוליטר של חרוזי אגרוז חלבון A/G לכל דגימה לצינור חדש. שטוף חרוזים 3 פעמים עם 1 מ"ל של בופר ליזיס. צנטריפוגה ב-100 × גרם למשך דקה אחת בטמפרטורה של 4°C בין שטיפות.
  2. הסר את הבופר שנותר מבלי להפריע לכדור. הוסיפו 100 מיקרוליטר של תמיסת עבודה ו-5 מיקרוליטר נוגדן נגד FLAG. דגרו במשך 6 שעות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עם סיבוב עדין.

5. ניתוק תאים

  1. שיטת אמבט קרח
    1. הוסף 500 מיקרו-ליטר של תמיסת עבודה מקוררת מראש לפלט. דגרו על קרח למשך 30 דקות.
    2. Sonicate ב-2 W עם 4 מחזורי הדלקה ו-4 שניות כבוי במשך חמש חזרות. שמור דגימות על הקרח בזמן הסוניקציה. החזר דגימות לקרח לשארית תקופת הדגירה.
      הערה: לאינטראקציות חלשות עם חלבונים, הפחיתו את ריכוז ה-NaCl ל-50-75 מ"מ והימנעו מהסוניקציה.
  2. שיטת טיפול בחום
    1. הוסף 45 מיקרו-ליטר של תמיסה עובדת לכדור. הוסיפו 5 מיקרוליטר של 10% SDS תוך כדי ערבוב רציף.
    2. מערבולות לזמן קצר ומחממים ב-95 מעלות צלזיוס עד שהמתלים הופכים לשקופים ונוזליים לחלוטין. הפוך לסירוגין כדי להבטיח דה-דנאטורציה אחידה.
    3. הוסף 450 מיקרוליטר של תמיסה עובדת. Sonicate ב-2 W עם 4 מחזורי הפעלה ו-4 שניות הפסקה במשך חמש חזרות תוך שמירה על דגימות על הקרח.
      הערה: ודאו שריכוז ה-SDS הסופי יישאר <0.1%. אשר פירוק מלא על ידי אימות היעלמות הכדור הנראה ובהירות התמיסה האחידה.

6. אימונופרציפיטציה וזיהוי יוביקוויטינציה

  1. הצנטריפוגה מקבלת ליזציה ב-13,680 × גרם למשך 15 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. העבר את הסופרנטנט לצינור חדש.
  2. שמרו 60 מיקרוליטר ליזאט והוסיפו 15 מיקרוליטר של בופר עומס 5×. חממו ב-95 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות ותויגו כקלט.
  3. הוסף 100 מיקרוליטר של חרוזים מקושרים בנוגדנים לשאר הליזאט (הנפח הסופי 540 מיקרוליטר). דגרו ב-4 מעלות צלזיוס במשך 8-12 שעות עם סיבוב.
  4. חרוזי צנטריפוגה ב-100 × גרם למשך דקה אחת ב-4 מעלות צלזיוס ומשליכים את הסופרנטנט. שטוף חרוזים 3 פעמים עם בופר ליזיס. הוסיפו 75 מיקרוליטר של בופר טעינה SDS 1× וחממו בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות לחלבונים. תייג כקניין רוחני.
  5. לזהות חלבונים מאוביקוויטינים על ידי ווסטרן בלוט לפי פרוטוקול JoVE סטנדרטי.
    הערה: עיין בפרוטוקול Western Blot29 לפרטוקול העברה וזיהוי מפורטים. כתמים באורך מלא לא חתוכים עם סימני משקל מולקולרי מסופקים בקובץ המשלים 1.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

כ"שליח מולקולרי" במסלול האיתות של TGF-β, SMAD2, לאחר שפוספורילציה על ידי קולטני TGF-β, יוצר קומפלקס עם SMAD3 ו-SMAD4, עובר לגרעין ומתחיל את השעתוק של גני יעד30 במורד הזרם. לכן היא מולקולה מרכזית המקשרת בין אותות חוץ-תאיים לביטוי גנים תוך-תאי. הפירוק שלו מתווך על ידי SMURF2, ליגז יוביקוויטין E3 שמזרז את הפוליאוביקוויטינציה של חלבון היעד, ובכך מכוון אותו לפירוק פרוטאזומי. הפירוק המתווך על ידי SMURF2 של SMAD2 קריטי לסיום איתות TGF-β, למניעת הפעלה מופרזת של גנים במורד...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מחקר זה מציג ומשווה בין שני פרוטוקולי פירוט של ניתוק חלבונים שתוכננו במיוחד לזיהוי יוביקוויטינציה של סובסטרטים המתווכים על ידי ליגאזים E3. כדי להבטיח גילוי, השתמשנו בביטוי יתר מבוסס פלסמיד (למשל, SMAD2, SMURF2 או Ub) בתאים, שסיפק רמות חלבון מספקות כדי להמחיש אותות יוביקוויטינציה ספציפיים, קריטיים לאימות אינטראקציות בין ליגאז-סובסטרט E3 במחקר זה. לפני איסוף התאים, נוסף MG132, מעכב פרוטאזום חזק, כדי לחסום את הפירוק המתווך של חלבונים יוביקוויטיניים על ידי פרוטאזום. שלב זה הבטיח הצטברות של ק...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם.

תודות

מחקר זה נתמך על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין, מס' 82370647 (W.H.), מס' 82170642 (J-X. Z), מס' 81801923 (X-F. Z), מס' 81670575 (J-X. Z), מס' 81570570 (W.H.) ומספרים 81070355 (J-X. Z), ותוכנית צוות הנוער האקדמי של HUST, אוניברסיטת המדע והטכנולוגיה חואג'ונג (2018QYTD02). הקרן הפתוחה של מעבדת הוביי המרכזית לרפואה רגנרטיבית ומחקר תרגומי רב-תחומי (2022zsyx003). תוכנית המחקר והפיתוח המרכזית הלאומית של סין (2024YFA1107601).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מיקרוצינור 1.5 מ"לסרוויסביוEP-150-M
צלחת 100 מ"מ מתורבת בטיפול TCסרוויסביוCCD-100
דיסק 6 בארותסרוויסביוCCP-6H
נוגדנים נגד FLAGפרויטנטק20543-1-APדילול השתמש ב-1:200 עבור IP ו-1:10000 עבור WB
נוגדנים נגד GAPDHפרויטנטקMA5-15738דילול בשימוש 1:10000
נוגדנים נגד HAפרויטנטק51064-2-APדילול בשימוש 1:10000
נוגדנים נגד IgGCST#3900שימוש בדילול 1:200 עבור IP
נוגדנים אנטי-MYCפרויטנטק60003-2-Igדילול בשימוש 1:10000
נוגדנים נגד SMAD2CST#5339דילול השתמש ב-1:200 עבור IP ו-1:2000 עבור WB
ברומופנול כחולסרוויסביוGC307006-5 גרם
EDTA (pH=8.0)סרוויסביוG1207-1L
FBSABW
גליצרולסינופארם10010618
חימום/קירור אמבטיה יבשהגואוצ'נג
HEK293T תאיםATCCCRL-3216
DMEM עם רמות סוכר גבוהותסרוויסביוG4515-500ML
שרשרת אור IgG אנטי-עכבר של עזים בצורת HRP אבקלונלAS062דילול בשימוש 1:5000
שרשרת אור IgG עכברית נגד ארנב עם HRP קונוגט אבקלונלAS061דילול בשימוש 1:10000
Lipo8000ביוטייםC0533
MG132אלדיןM421264
מיקרוצנטריפוגהלבאג'יקCF1524R
אבקת NaClסרוויסביוGC102004
PBS סרוויסביוG4202-500ML
pCMV-FLAG-SMAD2לביטוי יונקים
pCMV-HA-Ubלביטוי יונקים
pCMV-MYCלביטוי יונקים
pCMV-MYC-SMURF2לביטוי יונקים
פניצילין-סטרפטומיציןסרוויסביוG4003-100ML
קוקטייל מעכב פרוטאז ללא EDTATargetMolC0001
חרוזי אגרוז חלבון A/GביוטייםP2017
ממברנת PVDFוייזמהE801
אבקת SDSסולרביולוגיהS8010-500g
מערכת SDS-PAGEארבייצביוBVE4-BVT4
סוניקסתא אויברה
אבקת טריס-HClביוטופHST-0372
טריטון X-100סרוויסביוGC204003-100 מ"ל
טריפסיןסרוויסביוG4021-100ML
מערבל מערבולתנתרם בנדיבות על ידי וייזמה
β-מרקפטואנולאלדיןM301573

מקורות

  1. Popovic, D., Vucic, D., Dikic, I. Ubiquitination in disease pathogenesis and treatment. Nat Med. 20 (11), 1242-1253 (2014).
  2. Han, D., Wang, L., Jiang, S., Yang, Q. The ubiquitin-proteasome system in breast cancer. Trends Mol Med. 29 (8), 599-621 (2023).
  3. Fulcher, L. J., Batley, C., Sobajima, T., Barr, F. A. Time as a danger signal promoting G1 arrest after mitosis. Trends Cell Biol. 36 (2), 142-153 (2025).
  4. Gao, L., et al. The mechanism of linear ubiquitination in regulating cell death and correlative diseases. Cell Death Dis. 14 (10), 659(2023).
  5. Serratore, V., Lucibello, M., Malanga, D., Viglietto, G., De Marco, C. Akt and DUBs: A bidirectional relationship. Cell Mol Biol Lett. 30 (1), 77(2025).
  6. Kwon, Y. T., Ciechanover, A. The ubiquitin code in the ubiquitin-proteasome system and autophagy. Trends Biochem Sci. 42 (11), 873-886 (2017).
  7. Liu, J. Z., et al. BDH2 triggers ROS-induced cell death and autophagy by promoting NRF2 ubiquitination in gastric cancer. J Exp Clin Cancer Res. 39 (1), 123(2020).
  8. Cappadocia, L., Lima, C. D. Ubiquitin-like protein conjugation: Structures, chemistry, and mechanism. Chem Rev. 118 (3), 889-918 (2018).
  9. Li, J., et al. ATRA upregulates OTUD6B to recruit CD8+ T cells to suppress colorectal liver metastasis by stabilizing DDX5/STAT3/CXCL11 axis. Cell Death Dis. 16 (1), 521(2025).
  10. Niu, K., et al. USP33 deubiquitinates PRKN/Parkin and antagonizes its role in mitophagy. Autophagy. 16 (4), 724-734 (2020).
  11. Yan, K., et al. The role of K63-linked polyubiquitination in cardiac hypertrophy. J Cell Mol Med. 22 (10), 4558-4567 (2018).
  12. Guo, Y., Zhao, Y., Cong, Y. S. Met1-linked ubiquitination in cell signaling regulation. Biophys Rep. 10 (4), 230-240 (2024).
  13. Di, Y., et al. The c-Myc-WDR43 signalling axis promotes chemoresistance and tumour growth in colorectal cancer by inhibiting p53 activity. Drug Resist Updat. 66, 100909(2023).
  14. Liebl, M. C., Hofmann, T. G. The role of p53 signaling in colorectal cancer. Cancers (Basel). 13 (9), 2125(2021).
  15. Oikawa, D., et al. OTUD1 deubiquitinase regulates NF-κB- and KEAP1-mediated inflammatory responses and reactive oxygen species-associated cell death pathways. Cell Death Dis. 13 (8), 694(2022).
  16. Zhang, Q., et al. The deubiquitinase OTUD1 stabilizes NRF2 to alleviate hepatic ischemia/reperfusion injury. Redox Biol. 75, 103287(2024).
  17. Moreau, P., et al. Oral ixazomib, lenalidomide, and dexamethasone for multiple myeloma. N Engl J Med. 374 (17), 1621-1634 (2016).
  18. Stewart, A. K., et al. Carfilzomib, lenalidomide, and dexamethasone for relapsed multiple myeloma. N Engl J Med. 372 (2), 142-152 (2015).
  19. Zhu, Y., et al. Targeting gut microbial nitrogen recycling and cellular uptake of ammonium to improve bortezomib resistance in multiple myeloma. Cell Metab. 36 (1), 159-175.e8 (2024).
  20. De Silva, A. R. I., Page, R. C. Ubiquitination detection techniques. Exp Biol Med (Maywood). 248 (15), 1333-1346 (2023).
  21. Choo, Y. S., Zhang, Z. Detection of protein ubiquitination. J Vis Exp. (30), e1293(2009).
  22. Worboys, J. D., Palazón-Riquelme, P., López-Castejón, G. Method to measure ubiquitination of NLRs. Methods Mol Biol. 2696, 105-114 (2023).
  23. DeCaprio, J., Kohl, T. O. Denaturing lysis of cells for immunoprecipitation. Cold Spring Harb Protoc. 2020 (2), 098616(2020).
  24. Bass, J. J., et al. An overview of technical considerations for western blotting applications to physiological research. Scand J Med Sci Sports. 27 (1), 4-25 (2017).
  25. Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: Technique, theory, and troubleshooting. N Am J Med Sci. 4 (9), 429-434 (2012).
  26. Crane, J. L., Cao, X. Bone marrow mesenchymal stem cells and TGF-β signaling in bone remodeling. J Clin Invest. 124 (2), 466-472 (2014).
  27. Gough, N. R., Xiang, X., Mishra, L. TGF-β signaling in liver, pancreas, and gastrointestinal diseases and cancer. Gastroenterology. 161 (2), 434-452.e15 (2021).
  28. Tzavlaki, K., Moustakas, A. TGF-β signaling. Biomolecules. 10 (3), 487(2020).
  29. The western blot. J vis exp. , e5065(2025).
  30. Wu, M., Chen, G., Li, Y. P. TGF-β and BMP signaling in osteoblast, skeletal development, and bone formation, homeostasis and disease. Bone Res. 4, 16009(2016).
  31. Jeon, S., et al. The miR-15b-SMURF2-HSP27 axis promotes pulmonary fibrosis. J Biomed Sci. 30 (1), 2(2023).
  32. Zhang, W., et al. SMURF2 predisposes cancer cell toward ferroptosis in GPX4-independent manners by promoting GSTP1 degradation. Mol Cell. 83 (23), 4352-4369.e8 (2023).
  33. Pi, Y., et al. Loss of SMURF2 expression enhances RACK1 stability and promotes ovarian cancer progression. Cell Death Differ. 30 (11), 2382-2392 (2023).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

SMAD2SMURF2Western BlotHEK293T
אסטרטגיות השוואתיות לזיהוי יוביקוויטינציה בליזטים של תאי יונקים באמצעות SMAD2/SMURF2 כמודל
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.