הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר מחקר

הגנה קרדיו-מוחית באמצעות אלקטרואקפונקטורה במודל עכברי של היפוקסיה כרונית

277 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/69329

⸱

31 במרץ 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Heilongjiang University of Chinese Medicine, 2Hebei Medical University, 3Chengde Medical University, 4Hebei Province Key Lab. of Research and Development for Chinese Medicine, Chinese Medicine Research Institute, Chengde Medical University, 5Hebei University of Chinese Medicine, 6The Second Affiliated Hospital of Heilongjiang University of Chinese Medicine, 7State Key Laboratory for Innovation and Transformation of Luobing Theory

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

מחקר זה קבע מודל עכברי היפוקסיה כרונית ל-12 שבועות לבחינת ההגנה הקרדיו-מוחית של אלקטרואקפונקטורה (אלקטרואקופונקט). הממצאים הראו כי גירוי אלקטרואקפונקטורה בנקודות דיקור שבדרך כלל משמשות לשיפור התפקוד הקוגניטיבי לא רק משפר את התפקוד הקוגניטיבי, אלא גם מקל על תפקוד לקוי הלב ומפחיתה נזק פתולוגי ברקמת שריר הלב.

תקציר

מחקר זה קבע מודל כרוני של היפוקסיה כרונית ל-12 שבועות לחקור את ההשפעות המגנות הקרדיו-מוחיות של אלקטרואקפונקטור. גישות טיפוליות קיימות להפרעות הקשורות להיפוקסיה, כגון טיפול בחמצן היפרברי ותרופות מסוימות, מוגבלות לעיתים קרובות על ידי נגישות לקויה או מנגנונים ממוקדים במטרה יחידה. כדי להתמודד עם הפער הזה, השענו כי גירוי EA בנקודות דיקור ששימשו באופן מסורתי לשיפור קוגניטיבי יכול לשפר בו-זמנית את התפקוד הקוגניטיבי והקרדיאלי במצבים כרוניים של היפוקסיד. שלושים עכברים זכרים מסוג C57BL/6J חולקו באקראי לשלוש קבוצות: קבוצת הביקורת (Con), קבוצת מודל היפוקסיה כרונית (CH), וקבוצת טיפול בהיפוקסיה כרונית עם אלקטרואקופונקטורה (CH+EA). קבוצות CH+EA נחשפו לסביבה היפוקסית (10.0% ± 0.5% O₂) במשך 8 שעות ביום במשך 12 שבועות, כאשר קבוצת CH+EA עברה בנוסף גירוי EA יומי ב-GV20, GV24 ו-ST36 דו-צדדי במהלך השבועיים האחרונים. בדיקות התנהגות, הערכת אקו לב וניתוח היסטופתולוגי חשפו כי EA לא רק הקלה משמעותית על התנהגויות חרדה ושיפרה את הזיכרון המרחבי, אלא גם שיפרה פרמטרים מרובים של תפקוד הלב, תוך הפחתת נזק נוירוני להיפוקמפוס ולשינוי שריר הלב. ממצאים אלו מראים ש-EA מעניק השפעות הגנה קרדיו-מוחיות, התואמים את "הקונספט ההוליסטי" של הרפואה הסינית המסורתית, ובכך מספקת אסטרטגיית התערבות לא-פרמקולוגית חדשה למחלות נלוות קרדיו-מוחיות הקשורות להיפוקסיה.

מבוא

היפוקסיה מהווה אתגר פתולוגי נפוץ במצבים שונים, כולל סביבות בגובה רב, מחלת ריאות חסימתית כרונית (COPD), מחלות לב-מוח-כלי דם, וכן תרחישים מיוחדים כמו תעופה ופעילות צלילה, העשויים להוביל לפגיעה בתפקוד רב-איברי. כאיברים עם צריכת החמצן הגבוהה ביותר בגוף, המוח והלב פגיעים במיוחד לנזק היפוקסיבי. מחקרים מראים כי שכיחות הפגיעה הקוגניטיבית בקרב חולי COPD נעה בין 32% ל-88%1,2, בעוד שכיחות תפקוד לקוי לב מגיעה עד 70%3. מחקרים הראו כי היפוקסיה כרונית גורמת לתפקוד לקוי של מיטוכונדריה מוחית, מה שמוביל ללחץ חמצוני, עומס סידן ודלקת עצבית, אשר בסופו של דבר גורם לנזק נוירוני בהיפוקמפוס ובקליפת המוח ופוגע בתפקודי הלמידה והזיכרון 4,5,6. במקביל, היפוקסיה מפעילה הן את מערכת העצבים הסימפתטית והן את מערכת הרנין-אנגיוטנסין-אלדוסטרון (RAAS), מה שמוביל להיצרות כלי דם, לחץ דם גבוה, עומס לוואי קרדיאלי מוגבר, ולקידום היפרטרופיה ופיברוזיס של שריר הלב, מה שמוביל בסופו של דבר לאי ספיקת לב 7,8,9. הפציעה הקרדיו-מוחית המקבילה הזו מעלה משמעותית את הקושי בניהול קליני עבור המטופלים, והופכת את פיתוח אסטרטגיות טיפוליות יעילות ונגישות לצורך קליני קריטי שטרם נענה.

האסטרטגיות הטיפוליות הנוכחיות לליקויים קוגניטיביים הנגרמות מהיפוקסיה ולתפקוד לקוי של הלב כוללות בעיקר טיפול בחמצן היפרברי, משפרי מטבוליזם מוחי (כגון פיראצטם, אוקסירצטאם), טיפול בגורמים נוירוטרופי10,11, וחוסמי β (למשל, מטופרולול)12. עם זאת, גישות אלו מציבות מגבלות משמעותיות: טיפול בחמצן היפרברי דורש ציוד מיוחד וחסר נגישות; התערבויות פרמקולוגיות גורמות לעיתים קרובות לתופעות לוואי ובדרך כלל פוגעות במסלולים פתולוגיים בודדים; בעוד שטיפול בגורמים נוירוטרופיים מתמודד עם אתגרים הקשורים לחדירת מחסום דם-מוח ויציבותם. לכן, זיהוי אסטרטגיות יעילות ונגישות לטיפול קרדיו-מוחי סימולטני הפך לכיוון מחקר מרכזי.

דיקור סיני, מרכיב יסודי ברפואה הסינית המסורתית (TCM), מדגיש פרספקטיבה טיפולית הוליסטית המתיישרת עם הדרישה לרגולציה רב-ממוקדת. היא מדגימה פוטנציאל טיפולי ייחודי הן להפרעות נוירולוגיות והן למחלות לב וכלי דם. אלקטרואקופונקטורה (EA), אבולוציה מודרנית של דיקור שמשלבת דיקור מסורתי עם גירוי חשמלי, מאפשרת מודולציה מדויקת יותר של פעילות אלקטרופיזיולוגית עצבית13,14. EA משפר ביעילות את פגיעת איסכמיה-רפווזיה מוחית, מפחית שחרור אנזימי שריר הלב (GPBB, H-FABP), ומפעיל הגנה לבבית משמעותית15,16. לסיכום, כחידוש מודרני בדיקור המסורתי, אלקטרואקפונקטורה מפעילה ויסות רב-מכני ורב-ממוקד, ומדגימה ערך יישום ברור ופוטנציאל קליני בטיפול במחלות נוירולוגיות ולב וכלי דם, ומחברת בין רפואה מסורתית ברפואה מודרנית.

עם זאת, מחקרים עדכניים על EA בשל פגיעה קוגניטיבית היפוקסית ופגיעות לב מוגבלים בעיקר להשפעות של איבר יחיד/מערכת, ואינם מצליחים לחקור את הפוטנציאל שלו בטיפול קרדיו-מוחי בו-זמני. בהתבסס על "הקונספט ההוליסטי" של TCM והמציאות הקלינית של מחלות נלוות קרדיו-ריאתיות-מוחיות הנגרמות על ידי היפוקסיה כרונית ממושכת, מחקר זה שואף לחקור את השפעת EA ב"טיפול קרדיו-מוחי סימולטני", להבהיר את תפקידו בשיפור סינכרוני של נזק נוירוני שנגרם מהיפוקסיה, היפרטרופיה/פיברוזיס שריר הלב וליקויים תפקודיים נלווים, ולספק משטר הוליסטי וממוקד לא-פרמקולוגי לקרדיו-ריאות-מוח מחלות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

שלושים עכברים זכרים מסוג C57BL/6J, בגילאי 7-8 שבועות ומשקלם 18-22 גרם (ראו טבלת חומרים), שוהנו במתקן SPF במרכז להערכת התרופות החדשה של מכון המחקר התרופתי של חביי יילינג. טמפרטורת הסביבה נשמרה בין 20-26 מעלות צלזיוס עם לחות יחסית של 40%-70%, במחזור אור/חושך של 12/12 שעות. לעכברים הייתה גישה חופשית לאוכל מכרסמים סטנדרטי ולמים נקיים במעבדה. לאחר תקופת הסתגלות של שבוע, חולקו העכברים באקראי לשלוש קבוצות (n = 10): קבוצת הביקורת הנורמלית (Con), קבוצת מודל היפוקסיה כרונית (CH), וקבוצת טיפול בהיפוקסיה כרונית עם אלקטרואקפונקטורה (CH+EA). כל ההליכים הניסיוניים אושרו על ידי ועדת האתיקה למחקר בעלי חיים של מכון המחקר הפרמצבטי ביי יילינג (מס' אישור: TTN-2025001) ובוצעו בהתאם בקפדנות להנחיות לטיפול ושימוש בבעלי חיים במעבדה.

הקמת מודל עכבר של היפוקסיה כרונית (איור 1)

מודל העכבר של היפוקסיה כרונית הוקם על בסיס שיטה שתוארה קודם עם שינויים17. מערכת אוטומטית לשליטה ואספקת גז שימשה ליצירת ושמירה על סביבה היפוקסית. מערכת זו תוכנתה לווסת במדויק שסתומי סולנואידים שמערבבים חמצן טהור וחנקן ביחס מסוים, והעבירו את התערובת לתא היפוקסיה מפלדת אל-חלד מותאם אישית. הגדרה זו אפשרה שליטה מדויקת הן על תזמון והן על ריכוז אספקת הגז. ריכוז החמצן בתוך התא נוטר באופן רציף באמצעות אנלייזר חמצן דיגיטלי ונשמר על 10.0% ±-0.5% באמצעות מנגנון משוב שהתאים את קצב זרימת הגז בהתאם. עכברים בקבוצות CH ו-CH+EA שוכנו יחד בתא ההיפוקסיה ונחשפו לתנאים היפוקסיים במשך 8 שעות ביום (מ-9:00 בבוקר עד 5:00 אחר הצהריים), ולאחר מכן הוחזרו לתנאים נורמוקסיים לשארית היום. פרוטוקול זה חזר על עצמו מדי יום במשך 12 שבועות. במהלך החשיפה להיפוקסית, לבעלי חיים הייתה גישה חופשית למזון ולמים. ננקטה זהירות מיוחדת במהלך ההזרמת החנקן הראשונית להפחתת ריכוז החמצן; תהליך זה בוצע בהדרגה כדי למנוע מוות חריף של בעלי חיים כתוצאה מירידה מהירה ברמות החמצן. העכברים בקבוצת הקונס שוכנו בתנאים נורמוקסיים בתא סמוך, כאשר כל תנאי המגורים האחרים היו זהים לאלו של קבוצות הניסוי.

הרדמה (איור 2)

כדי להבטיח יציבות בעלי חיים במהלך התערבות בדיקור חשמלי ולהפחית הפרעות מלחץ פיזיולוגי על התוצאות, נעשה שימוש באיזופלורן שנשאף להרדמה במחקר זה17. הרדמה ניתנה לכל העכברים בקבוצות ניסוי במהלך ההליכים כדי להבטיח תנאי תפעול עקביים. לפני ההרדמה, הוכנו מכונת הרדמה לבעלי חיים קטנים (ראו טבלת חומרים) וכרית חימום מבוקרת תרמוסטטית בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס כדי למנוע היפותרמיה בבעלי החיים במהלך ההליך. השראת ההרדמה בוצעה בתא השראה אטום באמצעות 2%-2.5% איזופלורן (ראו טבלת חומרים) למשך כדקה. לאחר אובדן התנועה הספונטנית והפחתה משמעותית בטונוס השרירים, כל עכבר הועבר לכרית החימום. מסכה מיניאטורית מיוחדת הונחה בעדינות על חוטמו כדי לשמור על הרדמה עם איזופלורן של 0.5%-1.2%. עומק ההרדמה היעיל נקבע על ידי היעדר רפלקס המצמוץ והיעדר רפלקס גמילה משמעותי בתגובה לגירוי כף הרגל. פרוטוקול ההרדמה הזה שמר על מצב הרדמה יציב בעכברים במשך יותר מ-30 דקות, מה שהספיק להשלמת כל ההליכים הבאים.

טיפול באלקטרוקפונקטורה

התערבות אלקטרואקופונקטורה החלה בקבוצת העכברים CH+EA בשבוע ה-11 של החשיפה להיפוקסיה כרונית. נקודות הדיקור שנבחרו היו Baihui (GV20) ו-Shenting (GV24) בראש, יחד עם Zusanli הדו-צדדי (ST36). GV20 ממוקם בקו האמצע של קודקוד הגולגולת, בערך בנקודת האמצע בין שני קודקודי האוזניים18. GV24 ממוקם בקו האמצע של המצח, כ-1-2 מ"מ מעל נקודת האמצע של הקו שמחבר את הקנטי הפנימי של העיניים19. ST36 נמצא בגפה האחורית, התחתונה והצידית של מפרק הברך, בשקע כ-2 מ"מ מתחת לגבול התחתון של ראש הפיבולרי 20,21. לאחר שהעכברים הגיעו למצב הרדמה יציב, המפעיל החזיק ביד ימין מחט דיקור סטרילית מפלדת אל-חלד (מפרט: 0.18 × 7 מ"מ; ראו טבלת חומרים) ביד ימין. בנקודות הראש (GV24 ו-GV20), הקרקפת הורמה בעדינות ביד שמאל, והמחט הוכנסה תת-עורית בזווית של 15-30°, מתקדמת אחורית לעומק של כ-2 מ"מ. לנקודת ה-ST36 בגפה התחתונה, המחט הוכנסה בניצב לעומק של כ-3-4 מ"מ. אלקטרודות היציאה של מכשיר האלקטרואקפונקטורה (ראו טבלת חומרים) חוברו אז לידיות המחט: סט אחד של חוטים חיבר בין GV20 ל-ST36 השמאלית, בעוד שהסט השני חיבר את GV24 ואת ST36 הימני. גירוי אלקטרואקופונקטורה בו-זמנית בוצע באמצעות שני מערכות חוטים. פרמטרי EA הוגדרו כך: גל רציף, תדר 2Hz 22,23. עוצמת הזרם הוגדלה בהדרגה מ-0.1 mA עד שנצפה עווית קצבית קלה של הגפה המקומית (בדרך כלל נשמרת סביב 2 mA). הדיקור החשמלי בוצע פעם ביום למשך 30 דקות, ברציפות במשך 6 ימים עם יום מנוחה אחד, לסך הכול של שבועיים. בינתיים, עכברים בקבוצות Con ו-CH עברו הרדמה והגבלה במשך זמן ותנאים זהים, אך ללא החדרת מחט או הפעלת מכשיר האלקטרוק דיקור.

מבחן שדה פתוח

מבחן השדה הפתוח (OFT) נערך כדי להעריך את הפעילות הניידת הספונטנית, ההתנהגות החקרנית והתגובות הדמויות חרדה של עכבריםבסביבה חדשה. מכשיר ה-OFT היה תא לבן (50 ס"מ 50 ס"מ 30 ס"מ), שרצפתו חולקה למעשה לרשת של 25 ריבועים (כל אחד 10 ס"מ 10 ס"מ) לניתוח התנהגותי. לפני המבחן הרשמי, כל העכברים הסתגלו לחדר הבדיקה למשך שעה אחת כדי למזער את השפעת הלחץ שנגרם מהשינוי הסביבתי על תוצאות ההתנהגות. במהלך הבדיקות, כל עכבר הונח בעדינות במרכז המכשיר. לאחר תקופת הרגל של 2 דקות, התנהגותו נרשמה רשמית למשך 10 דקות. כל המפגש הוקלט באמצעות מערכת מעקב וידאו (ראו טבלת חומרים) כדי לעקוב אוטומטית אחרי מסלול התנועה. הפרמטרים שנותחו כללו את המרחק הכולל שנעבר, זמן השהייה באזור המרכז, מהירות באזור המרכז, ומספר הכניסות לאזור המרכזי. כל העכברים התחילו את החקירה מאותו מקום מרכזי, וכל עכבר נבדק רק פעם אחת. כדי למנוע הפרעות ריח, המכשיר נוקה היטב עם 75% אתנול לאחר הבדיקה של כל עכבר

מבוך המים של מוריס (MWM)

מבחן מבוך המים מוריס (MWM), שיטה סטנדרטית להערכת תפקוד הזיכרון, שימש בעיקר להערכת יכולות למידה מרחבית וזיכרון בעכברים25. המכשיר כלל בריכה עגולה, בקוטר 120 ס"מ ועומק 30 ס"מ, שחולקה רעיונית לארבעה רבעים שווים (I, II, III, IV). כדי למזער הסחות דעת חיצוניות, תלו וילונות אפלה סביב הבריכה, ורמזים ויזואליים מובחנים הוצבו על הקירות מעליה, שנשארו קבועים לאורך כל הניסוי. הבריכה הייתה מלאה במים שנשמרה על טמפרטורה של 22-24 מעלות צלזיוס, ומפלס המים נשמר בגובה של כ-1 ס"מ מעל פני הפלטפורמה. אבקת טיטניום דו-חמצני לא רעילה נוספה למים בריכוז של 20% כדי להפוך אותם לאטומים, ובכך לשפר את הניגודיות בין העכבר לרקע למעקב וידאו מדויק יותר. ההליך הניסויי נמשך 6 ימים רצופים, וכלל שלב אימון רכישת מרחבי בן 5 ימים ואחריו ניסוי בדיקה מרחבית של יום אחד. במהלך שלב האימונים, פלטפורמה עגולה בקוטר 10 ס"מ הונחה ברבע III, ששימשה כמיקום המטרה. ביום הראשון, הפלטפורמה הוצבה מעט מעל פני המים (~1 ס"מ) כדי להכיר את מטרת הבריחה. מימים 2 עד 5, הפלטפורמה הייתה טבועה בעומק של כ-1 ס"מ מתחת לפני המים להערכת למידה מרחבית. כל יום, כל עכבר הונח בסדר אחר כך במים הפונים לקיר הבריכה מכל אחד מארבעת הרבעים בסדר קבוע מראש. הניסוי עזב מיד את החדר לאחר שהניח את החיה כדי להימנע מלהפוך לרמז מרחבי לא מכוון. הזמן שנדרש לאיתור הפלטפורמה הנסתרת (השהיה בריחה) נרשם בכל ניסוי. אם עכבר לא מצא את הפלטפורמה בתוך זמן החיתוך של 90 שניות, הוא הונחה בעדינות אל הפלטפורמה ואפשר לו להישאר שם במשך 30 שניות כדי לחזק את הלמידה המרחבית, וההשהיה שלו נרשמה כ-90 שניות. אם העכבר מצא את הפלטפורמה בתוך 90 שניות, הוא הורשה להישאר עליה במשך 10 שניות. לאחר כל אימון, העכבר יובש במגבת והוחזר לכלוב הביתי שלו. רצף הרבע ההתחלתי השתנה באופן שיטתי, עם מרווח בין ניסיונות של כ-20 דקות לכל עכבר. מערכת מעקב וידאו (ראו טבלת חומרים) רשמה אוטומטית פרמטרים כמו מרחק שחייה, מהירות והשהיית בריחה. ביום השישי נערך ניסוי בדיקה להערכת הזיכרון המרחבי. הפלטפורמה הוסרה מרבע המטרה (רבע III), וכל עכבר שוחרר מהרבע שמול מיקום היעד הקודם (רבע I) וניתן לו לשחות בחופשיות במשך 90 שניות. הזמן שבילה ברבע המטרה (שבו הייתה הפלטפורמה ממוקמת בעבר), מספר המעברים מעל המיקום המדויק של הפלטפורמה הקודמת, ומסלול השחייה נרשמו. מיד לאחר ניסוי הגקירה, העכבר יובש היטב והוחזר לכלוב הבית שלו תחת מקור חום כדי למנוע היפותרמיה. לאורך כל הניסוי, מיקומי כל הרמזים הוויזואליים סביב המבוך נשארו ללא שינוי כדי להבטיח עקביות בתנאי הניסוי.

אקוקרדיוגרפיה

אקו לב בעכברים היא טכניקת דימות לא פולשנית בזמן אמת, קריטית להערכת מבנה ותפקוד הלב, והיא יושמה בהרחבה במחקר מודלים של מחלות לב וכלי דם. הבדיקה מתבצעת בהרדמה כללית, תוך שמירה על מצב ההרדמה לאורך כל ההליך בהתאם לפרוטוקול שתואר קודם. העכבר מונח על הגב על פלטפורמה מבוקרת תרמוסטטית בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר שהגפיים מאובטחות בעדינות, מורחים קרם להסרת שיער באופן אחיד על אזור החזה והבטן. כל השיער והקרם שנותרו מוסרים היטב לאחר דקה עד שתיים כדי להבטיח איכות העברה אופטימלית באולטרסאונד. למעקב פיזיולוגי בזמן אמת, משתמשים בטלאי אלקטרודות המחוברים לגפיים באמצעות ג'ל מוליך כדי להמשיך את האלקטרוקרדיוגרם וקצב הנשימה. כדי לקבל תצפיות אולטרסאונד סטנדרטיות, מיקום העכבר מותאם כך שראשו יהיה מעט גבוה יותר מהזנב, מה שמבטיח שציר הלב הארוך יהיה מקביל לפלטפורמה. נוקט זהירות מיוחדת להימנע מהפעלת לחץ מופרז על דופן החזה עם הגלאי, שכן הדבר עלול לשנות את הגיאומטריה הקרדיאלית ולהשפיע על דיוק המדידה. כמות נדיבה של ג'ל אולטרסאונד ללא בועות (בעובי 2-5 מ"מ) מורחת על האזור המגולח. משתמשים בגלאי מערך ליניארי בתדר גבוה (30-50 מגה-הרץ), כאשר סמן הכיוון של הגלאי מצביע בעקביות לכיוון ראש העכבר. הגשושית ממוקמת בתחילה במקביל לציר הארוך של גוף העכבר ואז מסובבת נגד כיוון השעון בכ-30°-45°. בוצעו התאמות עדינות כדי לקבל תצפית ברורה על הציר הארוך של החדר השמאלי. רכישת התמונה הדינמית מתחילה כאשר תמונת האולטרסאונד מציגה בבירור את תא החדר השמאלי, מסתמי האאורטה והמיטרל, ומראה יישור אופקי של קודקוד הלב עם מסלול היציאה האאורטלית. כל התמונות נרכשות על ידי מפעיל מנוסה באמצעות הגדרות פרמטרים עקביות כדי להבטיח השוואת נתונים. לאחר הבדיקה, גשוש האולטרסאונד מנוקה לפי הנהלים הסטנדרטיים, וכל הג'ל שנותר מנוקה מגוף העכבר. העכבר מועבר לכלוב חם למעקב צמוד עד שיתאושש לחלוטין מההרדמה ויחזור לתנועה רגילה.

הכנת חתכי פרפין

לאחר סיום בדיקות התנהגות, העכברים הורדמו באמצעות הזרקה תוך-פריטוניאלית של נתרן פנטוברביטל (20 מ"ג/ק"ג). לאחר מכן הושגה קיבוע מערכתי באמצעות פרפוזיה טרנסקרדיאלית עם מלח, ואחריה 10% פאראפורמלדהיד (ראו טבלת חומרים). לאחר שהרקמות המוחיות הוצאו בקפידה, הן הוטבלו ב-10% פאראפורמלדהיד למשך 72 שעות קיבוע בטמפרטורת החדר. חשוב לציין כי מכיוון שפרפוזיה לבבית משנה את המיקרו-מבנה של שריר הלב, דגימות הלב ששימשו לניתוח היסטולוגי במחקר זה התקבלו במיוחד מעכברים שלא עברו את הליך הפרפוזיה, בעוד שכל שאר תנאי הטיפול נותרו זהים. בסיום הקיבוע נשטפו הרקמות במים זורמים במשך 6 שעות. התייבשות בגרדיאנט לאחר מכן בוצעה באמצעות מעבד רקמות אוטומטי (ראו טבלת חומרים), שכללה טבילה רציפה ב-60%, 70% ו-90% אתנול למשך שעה כל אחד, ואחריה 95% ו-100% אתנול למשך 2 שעות כל אחד. הדגימות המיובשות נוקו לאחר מכן בקסילן למשך שעתיים והוספנו בפרפין בטמפרטורה של 60°C למשך 3 שעות. לבסוף, הרקמות הוטמעו בפרפין באמצעות מכונת הטמעה, מה שהבטיח כיוון אנטומי סטנדרטי. לאחר שהבלוקים המשובצים התגבשו לחלוטין, חתכו קטעים סדרתיים בעובי 4 מיקרון באמצעות מיקרוטום סיבובי, הותקנו על שקופיות זכוכית מצופות פולי-אל-ליזין, יובשו באוויר ונשמרו לצביעה וניתוח לאחר מכן.

צביעת המטוקסילין-אאוזין

הבדיקה ההיסטולוגית של רקמות המוח והלב בוצעה באמצעות צביעת המטוקסילין ואאוזין (HE) להערכת פגיעה היפוקסית ולהערכת ההשפעות הטיפוליות של התערבות אלקטרואקופונקטורה (אלקטרואקופונקט). חתכי רקמה, בעובי 4 מיקרון, עברו תחילה דה-פרפין בקסילן I וקסילן II (10 דקות כל אחד) ולאחר מכן הודרו מחדש באמצעות סדרת אתנול מדורגת (100%, 95%, ו-80%, 2 דקות כל אחד), ולאחר מכן שטיפה סופית במים מזוקקים. לצורך צביעה, החלקים נטבלו בתמיסת המטוקסילין למשך 3-8 דקות עד להשגת צביעה גרעינית שקופה, נשטפו במים זורמים כדי לגרום לכחול, ולאחר מכן צובעו באאוזין למשך 1-3 דקות לקבלת צבע ורוד מתאים בציטופלזמה. לבסוף, החלקים המוכתמים יובשו באלכוהול מוחלט, נוקו בקסילן, והותקנו בבלסם ניטרלי.

צביעת Nissl

כדי להעריך את מצב ההישרדות של נוירונים באזור ההיפוקמפוס, נעשה שימוש בצביעת Nissl כדי לבחון את התפלגות גופי ה-Nissl והמורפולוגיה התאית בתוך הנוירונים. לאחר דה-פרפיניזציה והידרציה מחדש של חלקי הפרפין ברקמת המוח, הפרוסות נטבלו בתמיסת צביעת טולואידין כחולה מחוממת מראש ודגרו בטמפרטורה של 56 מעלות צלזיוס באינקובטור בטמפרטורה קבועה למשך שעה. לאחר הצביעה, החלקים נשטפו בעדינות במים מזוקקים ואז הועברו לתמיסת התמיינות Nissl למשך מספר שניות ועד 2 דקות. תהליך ההבחנה נערך בקפידה תחת מיקרוסקופ עד שהרקע הפך כמעט ללא צבע. לאחר מכן, החתכים המובחנים יובשו במהירות דרך סדרת אתנול מוחלטת, נוקו בקסילן, ולבסוף הורכבו עם שרף ניטרלי לשימור ותצפית קבועים.

צביעת טריכרום מסון

צביעת תלת-כרום, טכניקת צביעת רקמות חיבור קלאסית, שימשה בעיקר להבחין בין סיבי קולגן לסיבי שריר ברקמת הלב. לאחר דה-פרפיניזציה והידרציה מחדש של מקטעי הפרפין בלב, בוצעה הליך הצביעה בהתאם להוראות היצרן שסופקו עם ערכת הצביעה הטריכרום של Masson (ראו טבלת חומרים). פרוטוקול הצביעה בוצע כך. בתחילה, החלקים הוטבעו בתמיסת עבודה של המטוקסילין מברזל Weigert's שהוכנה זה עתה למשך 4 דקות לצביעת הגרעין, עם ערבוב עדין להבטחת צביעה אחידה. לאחר מכן, החלקים נשטפו במים זורמים, הובדלו באלכוהול חומצי 1% למשך 5-10 שניות, ואז טופלו בתמיסת כחול במשך 4 דקות להשגת צביעה גרעינית כחולה-סגולה שקופה. החתכים צוברו לאחר מכן בתמיסת פוקסין חומצה פונסו למשך 5 דקות, ולאחר מכן התמיינות בתמיסת חומצה פוספומוליבדית של 0.2% למשך דקה אחת. לאחר שטיפה קצרה בתמיסה חלשה לעבודה עם חומצה למשך דקה, החלקים צובעו נגד בתמיסה כחולה של 0.2% אנילין (pH 6.8) למשך 2 דקות להדגשת סיבי הקולגן. עם סיום שלבי הצביעה, החלקים יובשו באמצעות סדרת אתנול מדורגת, נוקו בקסילן, ולבסוף הורכבו בבלסם נייטרלי. כל החלקים המותקנים תועדו דיגיטלית באמצעות מערכת סריקת שקופיות אוטומטית מלאה (ראו טבלת חומרים) לניתוח מאוחר יותר.

ניתוח סטטיסטי

התוצאות שהושגו מוצגות כממוצע ± SEM. הנתונים נותחו באמצעות ANOVA חד-כיווני ואחריו מבחן פוסט-הוק LSD או t-test. ANOVA דו-כיווני שימש לניתוח הנתונים מה-OFT ומ-MWM. P < 0.05 נחשב לרמת המובהקות. הניתוח הסטטיסטי והתרשימים נוצרו על ידי תוכנת GraphPad Prism 9.0.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

דיקור אלקטרוקופונקטור משפר התנהגות דמוית חרדה ותפקוד קוגניטיבי לקוי הנגרם מהיפוקסיה כרונית ומתמשכת בעכברים.

התנהגות דמוית חרדה בעכברים שנחשפו ל-CH הוערכה לראשונה באמצעות OFT (איור 3A). גרפים של מסלול חשפו דפוסי התנהגות מובחנים: עכברי ביקורת הפגינו נטיות חקר חזקות בסביבה החדשה, עם דפוסי תנועה שמכסים את כל הזירה תוך ריכוז בעיקר באזורי הפינה (פאנל שמאל). לעומת זאת, עכברי מודל CH הראו ירידה משמעותית בחקר, בעיקר נשארים...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מחקר זה מאשר כי היפוקסיה כרונית לטווח ארוך יכולה לגרום להתנהגויות חרדה ולפגיעה בזיכרון מרחבי בעכברים, דבר התואם לממצאי מחקר קודמים26,27. במקביל, מצאנו כי היפוקסיה כרונית ממושכת יכולה גם לגרום לבעיות בתפקוד הלב ולנזק מבני לשריר הלב. עם זאת, כיום קיימת מחסור באסטרטגיות טיפוליות שיכולות להקל בו-זמנית על ליקויים קוגניטיביים וקרדיאליים הנגרמות מהיפוקסיה. לשם כך, הערכנו את הפוטנציאל של התערבות EA לשיפור תפקוד קוגניטיבי ליקוי וירידה בתפ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי קרן המדעים הטבעיים של מחוז היילונגג'יאנג של סין (PL2025H264), פלטפורמת הזהב יאנזאו (A20240022) ופרויקט התמיכה של המינהל הלאומי לרפואה סינית מסורתית (פרויקט מס' 272 [2021] של משרד כוח האדם והחינוך, NAPTCM).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
10% תמיסת פאראפורמלדהידBioroyee (בייג'ינג) Biotechnology Co.,
Ltd		RL3234
כל מבוךמדעSA201מערכת מעקב וידאו
עכברים C75BL/6Jבייג'ינג HFK ביוסיינס
בע"מ		מס' 110322220103041767מין: זכר,  משקל: 18– 22 גרם
מחטי דיקור חד-פעמיותהואטואו246076מחטי דיקור סטריליות לשימוש חד-פעמי (0.25 מ"מ וחרד; 13 מ"מ)
מכשיר אלקטרואקופונקטורההחומה הגדולהKWD-808 I
HistoCore MULTICUT - מיקרוטום סיבובי חצי-אוטומטיגרמניה, לייקהRM2245חותך פרפין
דיקור סיני הוואטו  מחטמפעל המכשירים הרפואיים של סוז'ואו2655519
איזופלוראןRWD לייף סיינס בע"מR510-22
מסון' ערכת כתמים תלת-כרוםסולרביולוגיהG1340ערכת צביעת מסון
מבוך המים של מוריססנסביוSA201מכשיר מבוך מים של מוריס
פתולוגיה דיגיטלית של NanoZoomerהומאצו פוטוניקה ק. ק.C9600-01
NDP. תצוגה 2יפן, סאקורהתוכנת סורק שקופיות
מכונת הרדמה לבעלי חיים קטניםהנעה אחוריתYL-LE-A106
Tissue Tech Prisma Plusיפן, סאקורה20B2X00014000034מכשיר אוטומטי לחלוטין שתוכנן לצביעה של דגימות כגון חתכי רקמה מוטמעים בפרפין, חתכים קפואים ותאים מותקנים על שקופיות.
מודול הטמעה Tissue-Tek TEC 6יפן, סאקורהM01-021E-02מכונת הטמעת פרפין

מקורות

  1. Antonelli Incalzi, R., et al. Cognitive impairment in chronic obstructive pulmonary disease--a neuropsychological and spect study. J Neurol. 250 (3), 325-332 (2003).
  2. Dodd, J. W., Getov, S. V., Jones, P. W. Cognitive function in COPD. Eur Respir J. 35 (4), 913-922 (2010).
  3. Mohammed, R. A., et al. Assessment of cardiac dysfunction in patients with chronic obstructive pulmonary disease (COPD): a cross-sectional study. Cureus. 15 (5), e39629(2023).
  4. Zhou, L., Chen, P., Peng, Y., Ouyang, R. Role of oxidative stress in the neurocognitive dysfunction of obstructive sleep apnea syndrome. Oxid Med Cell Longev. , 9626831(2016).
  5. Nisar, A., et al. Hypoxia and aging: molecular mechanisms, diseases, and therapeutic targets. MedComm. 5 (11), e786(2024).
  6. Xu, Y., Fan, Q. Relationship between chronic hypoxia and seizure susceptibility. CNS Neurosci Ther. 28 (11), 1689-1705 (2022).
  7. Fuhrmann, D. C., Brune, B. A graphical journey through iron metabolism, microRNAs, and hypoxia in ferroptosis. Redox Biol. 54, 102365(2022).
  8. Duan, X., Liu, X., Zhan, Z. Metabolic regulation of cardiac regeneration. Front Cardiovasc Med. 9, 933060(2022).
  9. Rocher, A., Aaronson, P. I. Inflammation, nitro-oxidative stress and altered autonomic outflow in obstructive sleep apnoea: an assault on homeostasis. J Physiol. 601 (24), 5465-5466 (2023).
  10. Rodrigo, R., Libuy, M., Feliu, F., Hasson, D. Molecular basis of cardioprotective effect of antioxidant vitamins in myocardial infarction. Biomed Res Int. 437613, (2013).
  11. Page, T. F., et al. Comparative cost analysis of sequential, adaptive, behavioral, pharmacological, and combined treatments for childhood ADHD. J Clin Child Adolesc Psychol. 45 (4), 416-427 (2016).
  12. Bauersachs, J., de Boer, R. A., Lindenfeld, J., Bozkurt, B. The year in cardiovascular medicine 2021: heart failure and cardiomyopathies. Eur Heart J. 43 (5), 367-376 (2022).
  13. Chen, Z., et al. A review on traditional Chinese medicine natural products and acupuncture intervention for Alzheimer's disease based on the neuroinflammatory. Chin Med. 19 (1), 35(2024).
  14. Li, B., et al. The mechanistic effects of acupuncture in rodent neurodegenerative disease models: a literature review. Front Neurosci. 18, 1323555(2024).
  15. Kun, W., et al. Electroacupuncture ameliorates cardiac dysfunction in myocardial ischemia model rats: a potential role of the hypothalamic-pituitary-adrenal axis. J Tradit Chin Med. 43 (5), 944-954 (2023).
  16. Wu, R., et al. Electroacupuncture stimulation to modulate neural oscillations in promoting neurological rehabilitation. Brain Res. 1822, 148642(2024).
  17. Wan, F., et al. Acupuncture treatment in a mouse model of chronic hypoxia-induced cognitive dysfunction. J Vis Exp. (202), e65784(2023).
  18. Xie, L., et al. Electroacupuncture improves M2 microglia polarization and glia anti-inflammation of hippocampus in Alzheimer's disease. Front Neurosci. 15 (3), 689629(2021).
  19. Lin, W., et al. TNEA therapy promotes the autophagic degradation of NLRP3 inflammasome in a transgenic mouse model of Alzheimer's disease via TFEB/TFE3 activation. J Neuroinflammation. 20 (1), 21(2023).
  20. Liu, S., et al. A neuroanatomical basis for electroacupuncture to drive the vagal-adrenal axis. Nature. 598 (7882), 641-645 (2021).
  21. Jang, J. H., et al. Acupuncture inhibits neuroinflammation and gut microbial dysbiosis in a mouse model of Parkinson's disease. Brain Behav Immun. 89, 641-655 (2020).
  22. Dong, W., et al. Electroacupuncture improves synaptic function in SAMP8 mice probably via inhibition of the AMPK/eEF2K/eEF2 signaling pathway. Evid Based Complement Alternat Med. 2019, 8260815(2019).
  23. Han, Y. G., et al. Electroacupuncture prevents cognitive impairment induced by lipopolysaccharide via inhibition of oxidative stress and neuroinflammation. Neurosci Lett. 683, 190-195 (2018).
  24. Zhang, Q., et al. Electroacupuncture pretreatment ameliorates anesthesia and surgery-induced cognitive dysfunction via inhibiting mitochondrial injury and neuroapoptosis in aged rats. Neurochem Res. 47 (6), 1751-1764 (2022).
  25. Zheng, X., et al. Electroacupuncture ameliorates beta-amyloid pathology and cognitive impairment in Alzheimer disease via a novel mechanism involving activation of TFEB (transcription factor EB). Autophagy. 17 (11), 3833-3847 (2021).
  26. Wan, F., et al. Electroacupuncture mitigates cognitive impairments in chronic hypoxia-induced mice by modulating neuroinflammation. IBRO Neurosci Rep. 18, 432-442 (2025).
  27. Wei, Q., et al. Chronic intermittent hypoxia induces cardiac inflammation and dysfunction in a rat obstructive sleep apnea model. J Biomed Res. 30 (6), 490-495 (2016).
  28. Cui, S., et al. Electroacupuncture improved the function of myocardial ischemia involved in the hippocampus-paraventricular nucleus-sympathetic nerve pathway. Evid Based Complement Alternat Med. 2018, 2870676(2018).
  29. Simats, A., et al. Innate immune memory after brain injury drives inflammatory cardiac dysfunction. Cell. 187 (17), 4637-4655.e26 (2024).
  30. Del Rio, R., Moya, E. A., Iturriaga, R. Carotid body potentiation during chronic intermittent hypoxia: implication for hypertension. Front Physiol. 5, 434(2014).
  31. Oyarce, M. P., Iturriaga, R. Contribution of oxidative stress and inflammation to the neurogenic hypertension induced by intermittent hypoxia. Front Physiol. 9, 893(2018).
  32. Li, S., et al. Time-dependent inflammatory factor production and NFκB activation in a rodent model of intermittent hypoxia. Swiss Med Wkly. 141, w13309(2011).
  33. Roloff, E. V., et al. Parasympathetic innervation of vertebrobasilar arteries: is this a potential clinical target. J Physiol. 594 (22), 6463-6485 (2016).
  34. Xiangyang, Z., et al. Application of electroacupuncture assisted local anesthesia in transperineal prostate biopsy. J Clin Urol. 39 (2), 131-135 (2024).
  35. Li, M. C., et al. Efficacy of the spirit-regulation method of Jin's three-needle therapy for post-stroke anxiety and its effect on the hypothalamus-pituitary-adrenal axis. Zhen Ci Yan Jiu. 49 (1), 57-63 (2024).
  36. Shen, E. Y., Chen, F. J., Chen, Y. Y., Lin, M. F. Locating the acupoint Baihui (GV20) beneath the cerebral cortex with MRI reconstructed 3D neuroimages. Evid Based Complement Alternat Med. 2011, 362494(2011).
  37. Atalay, B., et al. Transcorneal stimulation of trigeminal nerve afferents to increase cerebral blood flow in rats with cerebral vasospasm: a noninvasive method to activate the trigeminovascular reflex. J Neurosurg. 97 (5), 1179-1183 (2002).
  38. Suzuki, T., et al. Electroacupuncture of the ophthalmic branch of the trigeminal nerve: effects on prefrontal cortex blood flow. Med Acupunct. 32 (3), 143-149 (2020).
  39. Xu, K., et al. Research hotspots and frontiers of functional magnetic resonance imaging in treatment of ischemic stroke by traditional Chinese medicine. Chin J Tissue Eng Res. 28 (11), 1789-1796 (2024).
  40. Tian, D. S., et al. De qi, a threshold of the stimulus intensity, elicits the specific response of acupoints and intrinsic change of human brain to acupuncture. Evid Based Complement Alternat Med. 2014, 914878(2014).
  41. Min, X., Zhang, Z. Y. Mechanism of electroacupuncture at Zusanli (ST36) in improving cardiac function in mice with chronic heart failure. Zhen Ci Yan Jiu. 49 (12), 1231-1238 (2024).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.