מאמר שיטה

בידוד פרוטופלסט איכותי ספציפי לרקמה לניתוחים חד-תאיים באראבידופסיס

DOI:

10.3791/69330

⸱

6 בפברואר 2026

 ,  , 
1Max Planck Institute of Molecular Plant Physiology

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה מציג פרוטוקול בידוד פרוטופלסט משופר לשורשים, עלים, גבעול ורקמות פרחים של Arabidopsis thaliana. הוא עושה שימוש בעיכול אנזימי אופטימלי ושלבים של טיהור אנזימים כדי למזער נזק תאים ופסולת, ובכך להגדיל את התפוקה ולקבל פרוטופלסטים איכותיים לשיטות חד-תאיות, כגון ריצוף RNA חד-תאלי.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ריצוף RNA חד-תאי (scRNAseq) הפך לכלי חיוני בביולוגיה של הצמח לקבלת מידע ברזולוציה גבוהה על ביטוי גנים ספציפי לסוג התא, דינמיקה התפתחותית ותגובות ספציפיות לרקמות לגורמים סביבתיים. אתגר טכני מרכזי ביישום scRNAseq על צמחים הוא הבידוד היעיל והניתן לשחזור של תאים בודדים ברי קיימא ללא דפנות תאים, המייצגים את ההטרוגניות של רקמות הצמח. בידוד פרוטופלסט, שמסיר את דופן התא אנזימטית כדי להפיק תאים צמחיים בודדים חיים, הוא גישה נפוצה למטרה זו. עם זאת, בידוד פרוטופלסט מוצלח דורש אופטימיזציה קפדנית לשמירה על חיוניות התא ולשימור פרופילי טרנסקריפטום ספציפיים לסוג התא. כאן אנו מציגים פרוטוקול חזק וניתן לשכפול לבידוד פרוטופלסטים איכותיים מרקמות רבות של Arabidopsis thaliana , כולל רקמות מעל הקרקע (עלים, גבעולים, פרחים) ורקמות שורש. פרוטוקול זה מתחשב בתכונות הפיזיולוגיות הייחודיות של סוגי הרקמות, ומייעל תנאי עיכול אנזימטיים וצעדי טיהור כדי להבטיח תפוקה גבוהה וייצוג רחב של סוגי תאים מגוונים. הפרוטופלסטים המתקבלים מתאימים ליישומים כמו scRNAseq, ציטומטריית זרימה (FACS) וניתוח ביטוי גנים חולפים. הוא מאפשר יצירת תליות חד-תאיות ממספר סוגי רקמות. השיטה המוצגת תומכת בחקר ההטרוגניות התאית ומשפרת את אמינות הגישות של תא יחיד במחקר צמחים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ריצוף RNA חד-תאי (scRNAseq) חולל מהפכה בביולוגיית הצמחים בכך שאפשר ניתוח ביטוי גנים ברזולוציה חסרת תקדים. scRNAseq מספק מידע על טרנסקריפטום על הטרוגניות תאית, מסלולי התפתחות ותגובות לגירויים סביבתיים ברזולוציה ספציפיתלסוג תא 1,2,3.

בניגוד למערכות בעלי חיים, דופן התאים הנוקשה של הצמח והמורכבות המבנית של רקמות הצמח מהווים מחסומים משמעותיים לבידוד יעיל של תאים בודדים לניתוח טרנסקריפטומי. בין השיטות הזמינות, הסרה אנזימטית של דופן התא ליצירת פרוטופלסטים הפכה לשיטה נפוצה, שפותחה לפני יותר מ-60 שנה 4,5,6. למרות השימוש הנרחב בה, בידוד פרוטופלסט נותר תהליך טכני תובעני הדורש אופטימיזציה ספציפית לרקמה כדי לאזן בין תפוקת התאים, הקיימות וטרנסקריפטום יציב. שיטות חלופיות, כגון ריצוף RNA בגרעין יחיד (snRNA-seq), נמנעות מהצורך בעיכול דופן התא על ידי בידוד גרעינים7. עם זאת, הדבר בא על חשבון אובדן מידע על תמלולים בוגרים שנמצאים בציטופלזמה. שיטות דיסוציאציה פיזיות אחרות, כגון מיקרודיסקציה מכנית ובאמצעות לייזר, נמנעות מעיכול דופן התא האנזימטי אך לעיתים קרובות חשופות לזיהום צולב ועלולות לגרום לחיותיות נמוכה יותר של התאים ולהגבלת תפוקה 8,9,10.

בשנים האחרונות פותחו אטלסים רבים של תאי צמחים, במיוחד עבור Arabidopsis, המספקים תובנות חשובות לנופים הטרנסקריפטומיים של רקמות שונות 2,11,12,13,14,15,16,17,18. עם זאת, אטלסים אלו מבוססים בעיקר על צמחים בשלב הצעיר או הנתילים, ומתמקדים בעיקר בשורשים או ברקמות עלים. הפרוטוקולים המשמשים במחקרים אלו דורשים תהליכי אופטימיזציה לרקמות Arabidopsis ישנות יותר, כגון עלים, פרחים וגבעולים בוגרים. בנוסף, עד לשימוש במחקרי ריצוף ספציפיים לסוג תא כגון scRNAseq או מיון תאים מופעל פלואורסצנציה (FACS) בשילוב עם ריצוף RNA, השינויים בטרנסקריפטום שגרם להם בידוד הפרוטופלסטים לא נלקחו בחשבון במלואם.

השיטה המוצגת כאן מתבססת על מאמצים קודמים תוך הכנסת מספר שיפורים חשובים: היא מתחשבת בשונות הפיזיולוגית והאנטומית בין רקמות הצמח על ידי אופטימיזציה של ריכוזי בופר הן לשורשים והן לרקמות מעל הקרקע (עלים, גבעולים, פרחים) ומשלבת שלבי טיהור עדינים למזעור נזק תאי ולשיפור טוהר הפרוטופלסטים. בהשוואה לגישות מבוססות גרעינים, לשיטה זו יש פוטנציאל לשמר את הטרנסקריפטום של כל התא, מה שמאפשר מידע ברזולוציה גבוהה יותר על מולקולות mRNA בוגרות הקיימות בציטוזול. חשוב לציין שההליך מניב חיוניות פרוטופלסט גבוהה, הטרוגניות וריכוזים ניתנים לשחזור ברקמות, הנעים מכ-9.8 × 103 תאים למ"ג בפרחים ועד 2.2 × 102 תאים למ"ג בעלים.

המטרה הכוללת של השיטה המוצגת היא להציג פרוטוקול בידוד פרוטופלסט חזק וניתן לשחזור, המותאם למספר רקמות של Arabidopsis thaliana, תוך מענה לצורך קריטי בקלט איכותי המכסה סוגי תאים מגוונים למחקרי תא בודד בצמחים.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

החומרים והציוד ששימשו למחקר זה מופיעים בטבלת החומרים.

1. הכנת בופר

  1. הכינו את בופר הבידוד פרוטופלסטי17,18 לפי טבלה 1 בצינור צנטריפוגה בנפח 15 מ"ל; בופר בידוד פרוטופלסט שורש לרקמת שורש או בופר/גבעול/עלים לבידוד פרוטופלסט לרקמות מעל הקרקע.
    הערה: כמות משוערת של בופר בידוד פרוטופלסט הנדרשת לחמישה צמחי פריחה של Arabidopsis thaliana שנקטפו (שלבים 11-12 עם ניצני פרחים סגורים): שורש (~375 מ"ג): 7 מ"ל, עלה (~930 מ"ג): 5 מ"ל, גבעול (~215 מ"ג): 3 מ"ל, פרח (~10 מ"ג): 2 מ"ל.
  2. הוסיפו 2% (עם v) צלולאז RS ו-1% (בלי v) Macerozyme R10 טרי לפני השימוש בבופר בידוד פרוטופלסט שורש/עלים. ערבבו היטב על ידי הנחת בופר בידוד פרוטופלסט על סיבוב עד שהאבקה נמסה לחלוטין (כ-10 דקות ב-25 מעלות צלזיוס). הימנעו מיצירת בועות אוויר וודאו שאין גושי אבקה בתוך הבופר.

2. עיכול רקמות

  1. מסננים את בופר הבידוד של הפרוטופלסט המתאים דרך פילטר של 0.2 מיקרון לפני השימוש. השתמש בצלחת פטרי בגודל סטנדרטי (100 מ"מ x 15 מ"מ) לעלים ולשורשים, ובצלחת פטרי קטנה (30 מ"מ x 15 מ"מ) לכמויות קטנות של רקמות כמו פרחים. הוסף כמה טיפות של בופר בידוד פרוטופלסט לצלחת הפטרי לפני העברת הרקמות.
  2. העבר את הרקמה המתאימה לצלחת הפטרי וחתוך אותה לחתיכות קטנות יותר במכות אנכיות באמצעות להב גילוח בעדינות ובמהירות המרבית (איור 1A).
    הערה: תמיד השתמש בלהבים ופינצטה שונים לכל דגימה כדי למנוע זיהום צולב. ללבש כפפות מגן בזמן הטיפול בלהב הגילוח.
  3. הוסיפו את בופר הבידוד הנותר של פרוטופלסט לתוך צלחת פטרי המתאימה כדי לטבול את הרקמה הקצוצה ולדוגרים בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס למשך שעה. השאר את הרקמות מעל הקרקע על הספסל (בלי רעידות) והעבר את רקמות השורש לפלטפורמת שייקר אורביטלית (60 סל"ד).

3. סינון

  1. דגימת שורש לאחר הדגירה:
    1. באמצעות פיפטת פסטר, העבירו את הפרוטופלסטים מצלחת הפטרי למסננת תאים בנפח 40 מיקרון המונחת מעל צינור צנטריפוגה פתוח מקורר מראש בנפח 50 מ"ל.
    2. כדי לקצור את שאר הפרוטופלסטים, הוסף את אותו נפח בדיוק של תמיסת W5 (2 מ"מ MES pH 5.7, 154 מ"מ מ"מ NaCl, 125 מ"מ CaCl2, 5 מ"מ KCl) לאותה צלחת פטרי כדי לאסוף את הפרוטופלסטים הדבוקים לבסיס צלחת פטרי. העבר את הפרוטופלסטים התלויות בתמיסת W5 לאותו מסננת תאים של 40 מיקרון, המונחת מעל צינור צנטריפוגה פתוח מקורר מראש בנפח 50 מ"ל.
    3. העבירו אותו בפעם השנייה דרך מסננת תאים חדשה בנפח 40 מיקרון לצינור צנטריפוגה חדש מקורר מראש בנפח 50 מ"ל. מהיום, שמרו את הדגימות על הקרח והיו עדינים מאוד בטיפול בפרוטופלסטים.
  2. דגימות מעל הקרקע לאחר הדגירה:
    1. באמצעות פיפטת פסטר, העבירו את הפרוטופלסטים מצלחת פטרי למסננת תאים בנפח 70 מיקרון, המונחת מעל צינור צנטריפוגה פתוח מקורר מראש בנפח 50 מ"ל.
    2. כדי לקצור את שאר הפרוטופלסטים, הוסף בדיוק את אותו נפח של תמיסת W5 (2 מ"מ MES pH 5.7, 154 מ"מ מ"מ NaCl, 125 מ"מ CaCl2, 5 מ"מ KCl) לאותה צלחת פטרי כדי לאסוף את הפרוטופלסטים הדבוקים לבסיס צלחת הפטרי. העבר את הפרוטופלסטים התלויים בתמיסת W5 לאותו מסננת תאים של 70 מיקרון, המונחת על גבי צינור צנטריפוגה פתוח מקורר מראש בנפח 50 מ"ל. מהיום, שמרו את הדגימות על הקרח והיו עדינים מאוד עם הפרוטופלסטים.

4. שטיפה וטיהור פיקול

  1. קירור את הצנטריפוגה ל-4 מעלות צלזיוס ואסף (פלט) את הפרוטופלסטים למשך 5 דקות בטמפרטורה של 500 × גרם ללא בלימה של הצנטריפוגה.
  2. דגימת שורש לאחר צנטריפוגה:
    1. להשליך את הסופרנטנט מבלי להפריע לכדור הפרוטופלאסט.
    2. החזירו את הפרוטופלסטים בעדינות רבה בבופר שורש מקורר מראש (4 מעלות צלזיוס) בנפח 600-700 מיקרולטר (בחלקים שווים של בופר בידוד פרוטופלסט שורש (ללא אנזימים) ותמיסת W5) באמצעות פיפטת פסטר או פיפטת גילסון בנפח 1 מ"ל עם קצה חתוך כדי למנוע גזירה.
    3. העבר את המתלה לצינורות מקוררים מראש בנפח 1.5 מ"ל (4 מעלות צלזיוס).
  3. דגימות מעל הקרקע לאחר צנטריפוגה:
    1. להשליך את הסופרנטנט מבלי להפריע לכדור.
    2. החזירו את הכדור בעדינות רבה בבופר מקורר מראש (4 מעלות צלזיוס) בנפח 600-700 מיקרולטר לתליית פרחים/גבעול/עלה (חלקים שווים של בופר/גבעול/עלה לבידוד פרוטופלסט (ללא אנזימים) ותמיסת W5) באמצעות פיפטת פסטר או פיפטת גילסון 1 מ"ל עם קצה חתוך כדי למנוע גזירה.
    3. העבר את המתלה לצינורות מקוררים מראש בנפח 1.5 מ"ל (4 מעלות צלזיוס).
    4. הכינו 300 מיקרוליטר של תמיסת Ficoll PM 400 של 13.3% (ללא וולט) בצינור של 1.5 מ"ל. ערבב ושמור על הקרח.
    5. הוסיפו את דגימת הפרוטופלסט המושפעת מחדש (600-700 מיקרוליטר) לאט מעל תמיסת Ficoll המוכנה מבלי לגעת או לערבב את שכבת Ficoll.
    6. צנטריפוגה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ב-700 × גרם עם אפס שבירת צנטריפוגה.
    7. אספו את הפרוטופלסטים שנמצאים בשכבה האמצעית (הממשק) יחד עם הפאזה העליונה (השכבה הראשונה) (איור 1B). היזהרו לא לאסוף את השכבה השלישית התחתונה, שמכילה את פיקול ואת הפסולת המופרדת. אחסן ב-4 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף.

5. ספירה ובדיקת איכות

  1. השתמשו ב-10 מיקרוליטר של תמיסת פרוטופלסט כדי לספור את מספר הפרוטופלסטים המבודדים באמצעות המוציטומטר נויבאואר.
    אופציונלי: ניתן להוסיף צבע כחול של אוונס 1% להערכת היתכנות הפרוטופלסטים (איור 1C).
  2. דילל את תמיסת הפרוטופלסט לריכוז הנדרש של פרוטופלסטים/מ"ל באמצעות בופר תלייה מקורר מראש (4°C) (מוסבר בשלב 4.2.2 לשורש ובשלב 4.3.2 לרקמות מעל הקרקע) של הרקמה המתאימה.
  3. יש להמשיך בניסוי המתוכנן במהירות האפשרית, לדוגמה, ריצוף RNA חד-תאי ו/או FACS15,19.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקולי בידוד פרוטופלסט שיושמו לרקמות מעל הקרקע והשורש מאפשרים בהצלחה עיכול יעיל של דופן התא ושחרור תאים בודדים שלמים מכל רקמות Arabidopsis thaliana. בסוגי הרקמות שנבדקו, שכללו פרחים, גבעולים, עלים ושורשים, תהליך העיכול האנזימטי יצר פרוטופלסטים מופרדים היטב עם מספר מינימלי של קבוצות תאים לא מעוכלים (איור 2A-D). בדיקות צבע אוונס בלו אישרו כי הפרוטופלסטים שהפגינו מורפולוגיה כדורית עם גבולות חלקים של ממברנת הפלזמה הם תאים ברי קיימא (איור 1C). לכל סוג רקמה נספרו פרוטופלסטים כדוריים. הפרחים הכילו בממוצע 97,875 ±-7,531 (9,788 תאים/מ"ג, n = 3), גבעולים 119,025 ± 22,508 (550 תאים/מ"ג, n = 4), עלים 210,483 ± 15,572 (225 תאים/מ"ג, n = 3), ושורשים 225,363 ±-52,561 (599 תאים/מ"ג, n = 4).

תסמיני הפרוטופלסטים הראו פיזור רחב של גדלי תאים ונוכחות של פלסטידים ירוקים או בהירים, המשקפים את הרכב התאים ההטרוגני של כל רקמה שנקטפה (איור 3A-D). כדי לאשר זאת, בוצע בידוד פרוטופלסט עם קו דיווח YFP ספציפי לתאי לוויין טרנסגניים, והמתלה הכיל פרוטופלסטים קטנים ברי קיימא עם אות YFP המייצג תאים מלווים (איור 3E). דבר זה מדגיש כי פרוטוקול בידוד פרוטופלסט שבו משתמשים מתאים לתאים וסקולריים שקשה לבודד אותם עם דפנות תא קשיחות.

בשיטה האופטימלית שהוצגה, ניתן לבודד מספר רב של פרוטופלסטים ברי קיימא עם כמות מינימלית של פסולת מרקמות שונות של צמחים בוגרים. כדי לשפר את טיהור הדגימות מעל הקרקע, כללנו שלב ניקוי כרית Ficoll להסרת אברונים ששוחררו ושאריות תאים אחרות מהדגימות המעוצלות תוך שמירה על איכות הטרנסקריפטום (איור 4).

בספריות cDNA של scRNAseq שנוצרו מהפרוטופלסטים, זוהו תמלולים בעלי ביטוי גבוה כמו ACTIN2 ותמלולים נדירים/נמוכים כמו גורם השעתוק ההומאודומיין KNAT1, סמן ייחודי לתאים קמביאליים ומריסטמטיים, וכן סמני התאים הנלווים SUC2 ו-PARCL1, באמצעות בדיקות PCR ספציפיות של cDNA15 (איור 5). דבר זה מצביע על ייצוג רחב של סוגי תאים והטרוגניות של אוכלוסיית הפרוטופלסט שהתקבלה, דבר שאושר עוד יותר על ידי ניתוח נתוני scRNAseq שהופקו בשיטה זו15.

figure-results-1
איור 1: זרימת העבודה של שלבי בידוד פרוטופלסט. שישה שלבים עיקריים מוצגים: (1) הכנת בופר, (2) עיכול רקמות, (3) סינון, (4) שטיפה וטיהור פיקול, (5) ספירה ובקרת איכות, ו-(6) המשך ניסויים במורד הזרם. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-2
איור 2: תמונות של שלבי הכנת פרוטופלסט. (א) תמונה מייצגת של שלב החיתוך של דגימת העלה (שלב 2.1). התמונה העליונה מראה את הרקמה שנקטפה עם כמה טיפות של בופר בצלחת פטרי בגודל סטנדרטי ולהב גילוח לקיצוק. התמונה למטה, משמאל, מייצגת את הרקמה לאחר כמה משיכות אנכיות עם להב הגילוח (ראו חץ). התמונה למטה, מימין, מייצגת את הדגימה הקצוצה, מוכנה לשלב הבא. (ב) תמונה של כרית פיקול לאחר צנטריפוגה בצינור של 1.5 מ"ל (שלב 4.3.7). החץ הלבן מציין את השכבה האמצעית, הכוללת פרוטופלסטים. (C) תמונת מיקרוסקופ מייצג של פרוטופלסטי עלים שנקרעו בצבע Evans Blue. פס קנה מידה: 250 מיקרון. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של הדמות הזו.

figure-results-3
איור 3: תמונות מיקרוסקופ של פרוטופלסטים שנוצרו. תמונות פרוטופלסט מכל סוג רקמה מוצגות. (א) פרח, (ב) גבעול, (ג) עלה, (ד) שורש. פס קנה מידה: 250 מיקרומטר. (E) תמונות מיקרוסקופ קונפוקלי של קו דיווח YFP ייעודי לתא נלווי. התמונה הראשונה (משמאל) מייצגת את הביטוי של מדווח תאי ה-YFP בכלי הדם של העלה (צבע ירוק). התמונה השנייה (מימין) מייצגת פרוטופלסטים מתאים המבטאים את מדווח YFP (אות ירוק). צבע סגול/כחול מייצג אוטו-פלואורסצנציה של כלורופלסטים. פס קנה מידה 10 מיקרון. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של הדמות הזו.

figure-results-4
איור 4: תמונות מיקרוסקופ של פרוטופלסטים של העלים לפני (A) ואחרי (B) ניקוי כרית Ficoll. פסי קנה מידה: 250 מיקרון. אנא לחצו כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של הדמות הזו.

figure-results-5
איור 5: PCR בקרת איכות של ספריות scRNAseq. תמונות ג'ל מייצגות של PCRs בקרת איכות של ספריות RNAseq חד-תאיות של שורש ומעל הקרקע. בדקו גניםSUC2, PARCL, KNAT1, ACT2 (A עד D, בהתאמה), ולכל רקמה: פרח, גבעול, עלה, שורש משמאל לימין, בהתאמה. cDNA (+) משמש כבקרה חיובית, ומים משמשים כבקרה שלילית. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

בופר פרוטופלסטינג שורשבופר/גבעול/עלה פרוטופלסטינג
מניטול 600 מ"ממניטול 400 mM
2 mM MgCl2-
0.1% BSA0.1% BSA
2 mM CaCl210 mM CaCl2
2 מילימטר MES pH 5.720 מ"מ MES pH 5.7
10 mM KCl20 mM KCl
כוון pH ל-5.5 עם בסיס טריס של 1M אם צריךכוון pH ל-5.5 עם בסיס טריס של 1M אם צריך

טבלה 1: הרכבי בופר בידוד פרוטופלסט. מסופקים מתכוני בופר בידוד פרוטופלסט לשורשים ולרקמות מעל הקרקע (פרח, גבעול, עלים).

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול אופטימלי זה לבידוד פרוטופלסטים מרקמות ארבידופסיס שונות הותאם ליישומי scRNAseq, תוך ניתוח כל הטרנסקריפטום הנמצא בציטופלזמה ובגרעינים. אופטימיזציה ספציפית לרקמות של הבופרים ושלבים נוספים לעיכול וטיהור הניבו תפוקות עמידות וניתנות לשחזור ברקמות שונות. בפרט, פרוטופלסטי פרחים הביאו בממוצע ~98,000 תאים לדגימה (~9,788 תאים לרקמת מ"ג), פרוטופלסטי גזע ~119,000 תאים (~550 תאים למ"ג), פרוטופלסטים עלים ~210,500 תאים (~225 תאים למ"ג), ופרוטופלסטי שורש ~225,000 תאים (~599 תאים למ"ג), מה שמשקף את המגוון המבני והפיזיולוגי של רקמות אלו.

שיפור מרכזי בפרוטוקול זה היה השימוש בכרית מבוססת פיקול במקום השיפועים/כריות המבוססות על סוכרוז הנפוצים יותר לטיהור. בניגוד לסוכרוז, שנספג על ידי תאים ויש לו השפעה משמעותית על הטרנסקריפטום 13,20,21, פיקול הוא אינרטי אוסמוטית ובלתי חדיר לממברנה, ובכך שומר על שלמות ה-RNA במהלך בידוד22. שלב זה גם הפחית את מספר האברונים החופשיים, כגון כלורופלסטים, מתאים שבורים ושאריות תאים במתלים. נוכחות פסולת כזו עלולה להפריע להיווצרות טיפות על ידי סתימת תעלות של מכשירים מיקרופלואידיים או גרימת נוכחות של יותר מתא אחד בטיפות שנוצרו, מה שתורם לזיהום RNA סביבתי. כל הגורמים הללו עלולים להוביל למסקנות שגויות או להטיות בניתוח נתוני scRNA-seq.

הוכח כי בידוד פרוטופלסט יכול לשנות את הטרנסקריפטום של תאי הצמח 2,15,16,19. אסטרטגיה מרכזית בפרוטוקול זה לצמצום הארטיפקט היא שמירה על פרוטופלסטים בטמפרטורה של 4°C (על קרח) לאחר עיכול אנזימטי, מה שמאט את פעילות המטבולית והשעתוק ובכך מפחית שינויים שעתוקיים הידועים כקשורים לבידוד פרוטופלסט. בנוסף, חשוב לשמור על זמן קצירת הרקמות עקבי בין שכפולים וליישר אותו עם מטרת המחקר, שכן הוכח כי שונות בתזמון משפיעה הן על גנים מונעים על ידי פרוטופלסט והן על תמלולים מפוקחים על ידי צירקדיאן שזוהו במאגרי scRNA-seq15.

בשיטה זו, מעבר לייצור תאים בודדים עם פסולת מינימלית, נקודה חשובה נוספת הייתה שמירת ההטרוגניות של הרקמות כדי לייצג את כל סוגי התאים. המגוון בתליות הפרוטופלסטים אושר על ידי זיהוי מורפולוגיות שונות של פרוטופלסטים, כולל גדלים מגוונים ונוכחות אותות מקווי דיווח ספציפיים לסוג תא בתוך האוכלוסייה שהושגה (איור 2). בנוסף, אוכלוסיית הפרוטופלסט הוערכה על ידי זיהוי תמלול נדיר וספציפי לסוגי תאים וכן תמלול בית בספריות cDNA scRNA-seq באמצעות PCR (איור 4). אלה כללו גנים נדירים של המריסטם האפיקלי של הענף, וסמנים של תאי לוויין15. הלכידה המוצלחת של תמלילים אלו מאשרת שהשיטה המוצגת מאפשרת בידוד של סוגי תאים מגוונים עם שלמות גבוהה, מה שהופך אותה לכלי חשוב לקידום מחקר תא יחיד בצמחים. בנוסף ל-scRNAseq, שיטה זו יכולה לשמש גם לציטומטריית זרימה, ניתוח ביטוי גנים חולפים ובדיקות התחדשות צמחים.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים הצהירו כי אין ניגוד עניינים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מאמר זה הוא חלק מפרויקט שקיבל מימון מהמועצה האירופית למחקר (ERC) במסגרת תוכנית המחקר והחדשנות Horizon 2020 של האיחוד האירופי (הסכם מענק מס' 810131).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צלולאז RS דוצ'פה ביוכימיהC8003
דגם צנטריפוגה 5810Rאפנדורף5810000010
Ficoll PM 400 סיגמא-אלדריץ'26873-85-8
מקרוזיים R10דוצ'פה ביוכימיהM8002
דגם מיקרוצנטריפוגה 5417Rאפנדורףהופסק
מסנן מזרק סטרילי Puradisc 30, 0.2 ומיקרו; mציטיבה10462200מכונה 0.2 ומיקרו; מסנן M בפרוטוקול
מסננת תאים סטריליים 40 ומיקרו; m Nylon Mesh פישרברנד22363547
מסננת תאים סטריליים 70 ומיקרו; m Nylon Mesh פישרברנד22363548

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Macosko, E. Z., et al. Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
  2. Denyer, T., et al. Spatiotemporal developmental trajectories in the Arabidopsis root revealed using high-throughput single-cell RNA sequencing. Dev Cell. 48 (6), 840-852.e5 (2019).
  3. Tenorio Berrío, R., et al. Dual and spatially resolved drought responses in the Arabidopsis leaf mesophyll revealed by single-cell transcriptomics. New Phytol. 246 (3), 840-858 (2025).
  4. Cocking, E. C. A Method for the Isolation of Plant Protoplasts and Vacuoles. Nature. 187 (4741), 962-963 (1960).
  5. Zhai, Z., Jung, H., Vatamaniuk, O. K. Isolation of protoplasts from tissues of 14-day-old seedlings of Arabidopsis thaliana. J Vis Exp. (30), e1149(2009).
  6. Adedeji, O. S., Naing, A. H., Kim, C. K. Protoplast isolation and shoot regeneration from protoplast-derived calli of Chrysanthemum cv. White ND. Plant Cell Tissue Organ Cult. 141 (3), 571-581 (2020).
  7. Wang, K., et al. An optimized FACS-free single-nucleus RNA sequencing (snRNA-seq) method for plant science research. Plant Sci. 326, 111535(2023).
  8. Kerk, N. M., Ceserani, T., Tausta, S. L., Sussex, I. M., Nelson, T. M. Laser capture microdissection of cells from plant tissues. Plant Physiol. 132 (1), 27-35 (2003).
  9. Brandt, S., Walz, C., Schad, M., Pavlovic, N., Kehr, J. A simple, chisel-assisted mechanical microdissection system for harvesting homogenous plant tissue suitable for the analysis of nucleic acids and proteins. Plant Mol Biol Report. 21 (4), 417-427 (2003).
  10. Berkowitz, O., et al. RNA-seq analysis of laser microdissected Arabidopsis thaliana leaf epidermis, mesophyll and vasculature defines tissue-specific transcriptional responses to multiple stress treatments. Plant J. 107 (3), 938-955 (2021).
  11. Jean-Baptiste, K., et al. Dynamics of gene expression in single root cells of Arabidopsis thaliana. Plant Cell. 31 (5), 993-1011 (2019).
  12. Ryu, K. H., Huang, L., Kang, H. M., Schiefelbein, J. Single-cell RNA sequencing resolves molecular relationships among individual plant cells. Plant Physiol. 179 (4), 1444-1456 (2019).
  13. Shulse, C. N., et al. High-throughput single-cell transcriptome profiling of plant cell types. Cell Rep. 27 (7), 2241-2247.e4 (2019).
  14. Wendrich, J. R., et al. Vascular transcription factors guide plant epidermal responses to limiting phosphate conditions. Science. 370 (6518), eaay4970(2020).
  15. Apelt, F., et al. Shoot and root single-cell sequencing reveals tissue- and daytime-specific transcriptome profiles. Plant Physiol. kiab537. , (2021).
  16. Kim, J. -Y., et al. Distinct identities of leaf phloem cells revealed by single-cell transcriptomics. Plant Cell. 33 (3), 511-530 (2021).
  17. Zhang, T. -Q., Chen, Y., Wang, J. -W. A single-cell analysis of the Arabidopsis vegetative shoot apex. Developmental Cell. 56 (7), 1056-1074.e8 (2021).
  18. Shahan, R., et al. A single-cell Arabidopsis root atlas reveals developmental trajectories in wild-type and cell identity mutants. Dev Cell. 57 (4), 543-560.e9 (2022).
  19. Birnbaum, K., et al. A gene expression map of the Arabidopsis root. Science. 302 (5652), 1956-1960 (2003).
  20. Aghdasi, M., Smeekens, S., Schluepman, H. Microarray analysis of gene expression patterns in Arabidopsis seedlings under trehalose, sucrose and sorbitol treatment. Int J Plant Prod. 2 (4), 309-320 (2008).
  21. Nakayama, Y., Kusano, M., Kobayashi, M., Manabe, R., Watanabe, M. Catabolic reprogramming of Brassica rapa leaf mesophyll protoplasts during the isolation procedure. Plant Growth Regul. 99 (2), 337-357 (2023).
  22. Grgac, R., Rozsypal, J., Des Marteaux, L., Štětina, T., Koštál, V. Stabilization of insect cell membranes and soluble enzymes by accumulated cryoprotectants during freezing stress. Proc Natl Acad Sci USA. 119 (41), e2211744119(2022).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Single Cell AnalysisArabidopsis ThalianaSingle Cell RNAseqTissue Specific IsolationEnzymatic DigestionCell ViabilityFlow CytometryGene Expression AnalysisPlant Cell Suspension

מאמרים קשורים