מאמר שיטה

זרימת עבודה מקיפה לפרוטאומיקה של פלזמה באמצעות ספקטרומטריית מסה: אסטרטגיה לגילוי סמנים ביולוגיים במחלות אנושיות מערכתיות

DOI:

10.3791/69359

⸱

13 במרץ 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Jubilee Centre for Medical Research, Jubilee Mission Medical College and Research Institute, 2Department of Biochemistry, Amrita Institute of Medical Sciences, Amrita Vishwa Vidyapeetham Campus, 3Manipal Academy of Higher Education

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטאומיקס פלזמה מאפשר גילוי סמנים ביולוגיים למחלות מערכתיות באמצעות דגימה זעיר-פולשנית. למרות האתגרים האנליטיים שמציבים מורכבות הפלזמה, מחקר זה מציג תהליך עבודה אופטימלי של כרומטוגרפיה נוזלית-ספקטרומטריית מסה (LC-MS/MS) שמגביר את כיסוי הפרוטאום, מפחית שונות ומשפרת את השחזור, ומאפשרת השוואות מדויקות בין דגימות מחלה לביקורת.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פלזמה, הרכיב החופשי מהתאים בדם, מציעה מקור מידע ביומולקולרי זעיר-פולשני ועשיר, מה שהופך אותה לאידיאלית לחקר מחלות מערכתיות. הופעת טכנולוגיות פרוטאומיות בעלות תפוקה גבוהה חוללה מהפכה בניתוח הפלזמה בכך שאפשרה זיהוי וכימות בקנה מידה גדול של חלבונים בסירקולציה. התקדמויות אלו אפשרו גילוי סמנים ביולוגיים לאבחון מוקדם, פרוגנוזה ומיקוד טיפולי של הפרעות שונות, כולל סרטן ומחלות דלקתיות. עם זאת, המורכבות הטבועה בפלזמה, יחד עם שיטות הכנת דגימות וניתוח לא עקביות, הגבילו היסטורית את כיסוי הפרוטאום ואת השחזוריות. גישות מוקדמות שהסתמכו על ניתוח פלזמה גס סבלו לעיתים קרובות מעקביות לקויה ומהשפעות אצווה משמעותיות, מה שהקשה על מחקרים השוואתיים אמינים בין קבוצות קליניות.

כדי להתגבר על מגבלות אלו, המחקר הנוכחי מציג תהליך פרוטאומיקה פלזמה חזק וניתן להרחבה. הפרוטוקול משלב שלבי הכנה מרכזיים כגון התרוקנות חיסונית, סינון חיתוך משקל מולקולרי, ליופיליזציה, כימות ונרמול חלבונים, עיכול אנזימטי ופרופיל LC-MS/MS. אסטרטגיה אופטימלית זו משפרת משמעותית את עומק הפרוטאום ומפחיתה שונות, ובכך מאפשרת ניתוח ביטוי חלבון שונה מדויק וניתן לשחזור בין מקרי מחלה לביקורת בריאה. תהליך העבודה מספק פלטפורמה חשובה לחוקרים השואפים לייצר נתוני פרוטאומיים איכותיים מפלזמה, ובסופו של דבר תורם לקידום אבחון מונחה ביומרקר ורפואה מותאמת אישית.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פלזמה, הרכיב החופשי מהתאים בדם, זוכה להכרה הולכת וגוברת כמאגר מידע ביולוגי הרלוונטי למחקרי מחלה. הוא נושא שפע של מולקולות ביולוגיות מגוונות, החל מחלבונים ומטבוליטים ועד לליפידים וחומצות גרעין, מה שמדמה את המצב הפיזיולוגי והפתולוגי של האורגניזם. הטבע המערכתי הזה של הפלזמה הופך אותה לביודוגימה אידיאלית לחקר פתופיזיולוגיה של מחלות, החל מסרטן ועד הפרעות מטבוליות ודלקתיות. יתרון מרכזי בשימוש בפלזמה כדגימה טמון בשיטת האיסוף המינימלית הפולשנית שלה, המאפשרת דגימה חוזרת בהקשרים קליניים, דבר חשוב לצפייה בהתקדמות המחלה או בתגובה טיפולית. עם זאת, לפלזמה יש מטריצה פרוטאומית מורכבת מאוד, שבה חלבונים כמו אלבומינים ורמות אימונוגלובולין משתרעות על פני יותר מעשרה סדרי גודל, ומסתירה זיהוי1.

במהלך שני העשורים האחרונים, פרוטאומיקה בפלזמה אפשרה זיהוי סמנים ביולוגיים רלוונטיים קלינית כגון גונדוטרופין כוריוני בטא-אנושי (β-hCG) וטרופונין I, בהובלת התקדמות בטכנולוגיות ניתוח חלבונים בקנה מידה גדול2. כלים אלו מקבלים, כקלט, מידע רגיש מאוד, ובזכות אופיים המהיר בקצב הייצור הגבוה, מספקים פרופילינג רחב היקף של חלבוני פלזמה. עם הופעת פלטפורמות הכרומטוגרפיה הנוזלית-ספקטרומטריית מסה (LC-MS/MS), ניתן כעת לנתח אלפי מיני חלבונים באמצעות קלט פלזמה של 10-50 מיקרוליטר בלבד, עם טווח זיהוי דינמי המשתרע על פני כמה סדרי גודלשל 3,4. דבר זה הגביר את השימוש בפרוטאומיקה בפלזמה במחקר תרגומי: גילוי מוקדם של מחלות, שיפור מודלים פרוגנוסטיים, וגילוי מטרות טיפוליות חדשות5.

אבן דרך חשובה בתחום זה הייתה הקמת פרויקט פרוטאום הפלזמה האנושית (HUPO-HPPP), אשר קטלג באופן שיטתי חלבוני פלזמה והדגים את היתכנות פרוטאומיקת הפלזמה כתחום מבוסס6. לאחר מכן, הקונסורציום לניתוח גידולים פרוטאומיים קליניים (CPTAC) אימץ פרוטוקולים מאומתים בקפדנות ומחקרים בין-מעבדתיים כדי להתמודד עם סוגיות של שחזוריות שבעבר בלבלה את מחקר הפרוטאומיים7. יוזמות אלו הדגישו את הצורך בסטנדרטיזציה והדגישו נהלים מרכזיים, כולל טיפול אחיד בפלזמה, דלדול חלבונים בשפע, עיכול אנזימטי ופרמטרי LC-MS/MS עקביים. מחקרים עדכניים של גייר ועמיתיו הראו כי חתימות פרוטאומיות בפלזמה יכולות להיווצר באופן אמין בקרב פרטים רבים כאשר משתמשים במתודולוגיות סטנדרטיות, מה שמספק בסיס למחקרים ברמת האוכלוסייה ותהליכי אימות סמנים ביולוגיים8.

ההתקדמות של פרוטאומיקת הפלזמה עוצבה במידה ניכרת על ידי ההכרה בבקרת איכות (QC) ומדדי ביצועים כרכיבים קריטיים בתכנון הניסוי. באופן מסורתי, הבדלים ביעילות העיכול, שיעורי זיהוי פפטידים וביצועי המכשירים הובילו לאי-עקביות במחקרי מחקר, ובכך השפיעו על השחזוריות. נערכו מחקרים רבים לטיפול בבעיות. גאוור ואחרים הציגו מדדי איכות מדידים להכנת דגימה וביצועי ספקטרומטריית מסה, ובכך סיפקו שיטה שיטתית להערכת עמידות צינור פרופיל החלבונים9. צ'נטילאס ועמיתיו הציגו כלים ממוחשבים להשוואה להשוואה בין פלטפורמות ומעבדות, ובכך להגדיל את השקיפות בהצגת נתוני הפרוטאומיקס10. יתרה מזאת, התקדמות במתודולוגיה, כגון התרוקנות חיסונית, שבירת גודל והשלמת גודל ורכישה בלתי תלויה בנתונים (DIA), שיפרה את כיסוי הפרוטאום והפחיתה הטיה טכנית11,12. אמצעי הבטחת איכות כאלה מבטיחים שנתוני פרוטאומיים בפלזמה יהיו ניתנים לשחזור ומשמשים כבסיס למחקרי תרגום קליניים עתידיים.

למרות ההתקדמות המשמעותית הזו, המורכבות הטבועה בפלזמה ממשיכה להוות אתגרים. נפוץ שניתוח ישיר של פלזמה גולמית מניב כיסוי פרוטאום לא אופטימלי, שכן חלבונים בשפע גבוה משתלטים על אנליטים בעלי שפע נמוך, שרבים מהם הם המועמדים המבטיחים ביותר לסמנים ביולוגיים. יתרה מזאת, שונות טכנית הנובעת מכמות חלבון משתנה, עיכול לא שלם וניקוי לא מספק עלולות לתרום לתופעות אצווה ולירידה בהשוואה בין קבוצות13. מגבלות אלו מדגישות את הצורך בתהליכי עבודה מותאמים במיוחד שמאזנים בין עומק פרוטאום, שחזוריות ויכולת הרחבה. פרוטוקול מחקר זה מתמודד עם צורך זה על ידי הדגמת תהליך פרוטאומיקה אופטימלי בפלזמה המשלב אימונודפילציה, סינון חיתוך משקל מולקולרי, ליופיליזציה, נרמול וכימות חלבונים, עיכול אנזימטי ופרופיל LC-MS/MS. על ידי הגדלת כיסוי הפרוטאום והפחתת שונות טכנית, המסגרת המתודולוגית מאפשרת כימות יחסי עקבי בין קבוצות המושפעות ממחלה לקבוצות הביקורת. על ידי הכנסת יכולת הרחבה והתאמת ניתוחים במורד הזרם, זרימת העבודה מספקת שיטה שימושית וניתנת לשחזור להפקת מידע קליני משמעותי מפרוטאומיקה בפלזמה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר תהליך עבודה יעיל שמטרתו לשפר את פרוטאומיקת הפלזמה לגילוי סמנים ביולוגיים במחלות דלקתיות מערכתיות14,15. המחקר נערך בהתאם לוועדת האתיקה המוסדית ולהצהרת הלסינקי משנת 1975, כפי שתוקנה בשנת 2000. הושגה הסכמה מדעת מהמשתתפים. בתחילה, דגימות הפלזמה עוברות התרוקנות חיסונית להסרת חלבונים בעלי שפע גבוה, ולאחר מכן סינון מבוסס משקל מולקולרי להפחתת מורכבות הדגימה. הדגימות עוברות ליופיליזציה וכמותיות כדי להבטיח שריכוז החלבון מספיק לעיבוד במורד הזרם. לאחר הנורמליזציה, חלבונים עוברים עיכול טריפטי ליצירת פפטידים המתאימים לניתוח. לבסוף, ספקטרומטריית מסה משמשת לזיהוי וכימות חלבונים בעלי שפע נמוך, מה שמקל על השוואות אמינות בין תנאים בריאים למחלות (איור 1) מראה את צינור הפרוטאומיקה בדם.

1. איסוף דגימות:

  1. השגת 3 מ"ל דם ממשתתפים בחצוצרות ואקוטיינר אתילנדיאמינטרטראאצטית (EDTA) באמצעות וניפונקטור מהווריד האנטקוביטלי בתנאים אספטיים. זה נעשה על ידי פלבוטומיסט מיומן.
  2. כדי להפריד את הפלזמה, יש לצנטריפוגה את הדגימות (רוטור בזווית קבועה עם 12 × 15 מ"ל) למשך 10 דקות ב-704 גרם. שמור את דגימות הפלזמה באחסון בטמפרטורה של מינוס 80°C עד לבדיקה הבאה.

2. דלדול חיסוני

הערה: אימונודפילציה היא שיטה מבוססת כרומטוגרפיה של אפיניטי, המשמשת להסרה סלקטיבית של חלבונים בעלי שפע גבוה מנוזלים ביולוגיים כמו סרום, פלזמה ונוזל מוח-שדרה (CSF). מחסנית ספין המכילה נוגדנים מקובעים מכוונת ולוכדת 14 חלבונים נפוצים בעלי שפע גבוה, כולל אלבומין, אימונוגלובולינים (IgG, IgA, IgM), טרנספרין ומשלים C3. חלבונים אלו נשמרים במחסנית בעוד חלבונים בעלי שכיח נמוך עוברים לניתוח נוסף. הטכניקה משפרת את הפרופיל הפרוטאומי על ידי הפחתת מורכבות הדגימה ושיפור זיהוי סמנים ביולוגיים פוטנציאליים. גישה זו מאומצת באופן נרחב בפרוטאומיקה בפלזמה לשיפור הרגישות והשחזוריות16,17.

  1. הכנת מחסנית
    1. הסר את מחסנית הסיבוב של 0.45 מ"ל מהמקרר. תשאיר את זה להתאזן לטמפרטורת הסביבה.
    2. הכינו את שקווה/טעינה/שטיפה של בופר A ו-Buffer B, שקוחה בהתאם למספר הדגימות שעובדו. יש להחיל כ-5 מ"ל בופר A ו-2 מ"ל בופר B לכל דגימת פלזמה של 10 מיקרוליטר. דנט לתוך צינורות צנטריפוגה סטריליים של 50 מ"ל.
    3. יש לסמן שני מזרקי Luer-Lok סטריליים בנפח 5 מ"ל כ-A עבור בופר A ו-B עבור בופר B.
  2. הכנת דגימת פלזמה
    1. מדלל כל 10 מיקרוליטר של דגימת פלזמה עם 190 מיקרוליטר של בופר A לנפח סופי של 200 מיקרוליטר.
      הערה: הוסף מעכבי פרוטאז ל-Buffer A כדי למנוע פירוק חלבוני פלזמה במהלך העיבוד.
    2. דגימת פלזמה עשויה להכיל חלקיקים. זה עלול לסתום את המגע. כדי למנוע סתימה ולשפר את בהירות הדגימה, צנטריפוגה את הדגימה המדוללת דרך מסנן ספין של 0.22 מיקרון למשך דקה אחת בטמפרטורה של 16,000 × גרם בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  3. הגדרת מחסנית
    1. הסר את מכסה המחסנית ואת המכסה התחתון ושמור אותם לשימוש מאוחר יותר.
    2. שים מתאם Luer-Lok על מחסנית הסיבוב.
    3. משוך 4 מ"ל של Buffer A במזרק המסומן "A" וחבר את המזרק למתאם Luer-Lok.
    4. זרם בהדרגה בופר A דרך המחסנית כדי לאפשר לשרף להתאזן ולהזיז כל אוויר כלוא.
    5. שאיפת הבופר העודף מהחלק העליון של המחסנית עם מיקרופיפטה סטרילית.
    6. הסר את מתאם Luer-Lok והפקיד את מחסנית הסיבוב בצינור איסוף עם מכסה בורג המסומן F1.
  4. טעינת דגימות ואיסוף שברים
    1. הוסף 200 מיקרוליטר של פלזמה מסוננת מדוללת ישירות אל מיטת השרף.
    2. צנטריפוגה את המחסנית ב-100 × גרם למשך דקה אחת בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. השאירו את המחסנית ללא מכסה או עם מכסה רפוי כדי לאפשר זרימה חלקה.
    3. אסוף את שבר הזרימה F1 בצינור האיסוף המסומן. ודאו שמיטת השרף והסדירים נשארים לחים לאחר הצנטריפוגה.
    4. תן למחסנית לעמוד בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.
  5. שטיפה והתאוששות של שברי זרימה דרך
    1. הוסיפו 400 מיקרוליטר של בופר A למשטח השרף ולצנטריפוגה ב-100 × גרם למשך 2.5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. הוסיפו את ה-eluate הזה לצינור האוסף של F1.
    2. העבר את המחסנית לצינור איסוף חדש המסומן F2.
    3. הוסיפו עוד 400 מיקרוליטר של בופר A וצנטריפוגה ב-100 × גרם למשך 2.5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. אסוף את האלואט בצינור F2.
  6. שחרור חלבונים קשורים
    1. הוצא את המחסנית מצינור F2 וחבר את מתאם Luer-Lok.
    2. מלא את המזרק המסומן "B" ב-2.5 מ"ל של בופר B וחבר אותו למחסנית.
    3. דחוף לאט את Buffer B דרך המחסנית כדי לשחרר את החלבונים בעלי השפע הגבוה הקשורים לצינור איסוף חדש.
      הערה: שמור את השבר הקשור אם נדרש ניתוח נוסף; אחרת, להשליך בצורה נכונה.
  7. איזון מחדש של המחסנית
    1. הסר את המזרק המכיל בופר B מהמחסנית וחבר את המזרק המסומן "A" המכיל 5 מ"ל Buffer A.
    2. דחוף לאט את Buffer A דרך משטח השרף כדי לאזן מחדש את המחסנית בקצב זרימה של 0.5 מ"ל לדקה.
      הערה: אל תתנו למיטת השרף או לשבריט להתייבש. השאירו מעט בופר מעל הפריט בזמן האחסון.
    3. לאחר שיווי משקל, המקלט מוכן לדגימה הבאה.
  8. שימוש במורד הזרם
    1. למקסימום התאוששות של חלבונים בעלי שפע נמוך, יש לשלב את חלקי הזרימה של F1 ו-F2.
      הערה: ניתן גם לנתח F1 ו-F2 בנפרד אם נדרש ניתוח דיפרנציאלי. הבופר שנוסף הוא 1 מ"ל, כך שחלק ה-F1 המשולב עשוי להיות ~850 מיקרו-ליטר כדי להבטיח התאוששות טובה. לנתח את הפלזמה הגולמית, את זרימת הפלזמה הגולמית, ולשחרר באמצעות אלקטרופורזה ג'ל נתרן דודציל סולפט-פוליאקרילאמיד (SDS-PAGE) כדי לאשר הסרת 14 החלבונים בעלי השפע הגבוה העליון מהזרם הדרך. 12.5 מיקרוליטר זרימה דרך F1, פלזמה גולמית ואלוויין ישמשו לטעינה בג'ל ליצירת נפח באר של 25 מיקרוליטר (בופר דגימות Laemmli: יחס דגימה 2:1)

3. ריכוז חלבון באמצעות מרכז ספין של 5 קילו-דלטון

הערה: ריכוז דגימה באמצעות מרוכז ספין של 5 קילו-דלטון מבוסס על עקרון הדרת גודל וסינון מולקולרי להשגת ריכוז מהיר והתאוששות גבוהה של מולקולות ביולוגיות יעד בצינור יחיד. דבר זה מאפשר ריכוז חלבונים על ידי הסרת חילוף הממס והבופר או דה-מלח של תמיסת החלבון.

  1. מלא את מרכז הסיבוב עד 4 מ"ל של דגימת החלבון.
  2. הניחו את מרכז הסיבוב בצנטריפוגה מקוררת.
  3. צנטריפוגה ב-5,000 × גרם בטמפרטורה של 10 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, או עד להשגת הפחתת הנפח הרצויה (למשל, ריכוז של 30×).
  4. הסר את מרוכז הסיבוב מהצנטריפוגה ושחזר את הדגימה המרוכזת מתחתית תא המושמר באמצעות מיקרופיפטה. כדי להבטיח התאוששות טובה, צפו לריכוז ~150 מיקרוליטר שיילקח מתוך סך של 850 מיקרוליטר דגימת חלבון.
    הערה: ודאו שהממברנה אינה מתייבשת במהלך הצנטריפוגציה כדי לשמור על שלמות החלבון ויעילות ההתאוששות.

4. דה-מלח והחלפת בופר

  1. להשליך את הסינון מהתא התחתון של המרכז.
  2. מלאו מחדש את צינור הצנטריפוגה בנפח שווה של בופר ביקרבונט אמוניום של 50 מ"מ (pH 7.2-7.4). (לדוגמה, אם הרטנטאט הוא 150 מיקרוליטר, מוסיפים 150 מיקרו-ליטר של בופר)
  3. צנטריפוגה שוב ב-5,000 × גרם בטמפרטורה של 10 מעלות צלזיוס עד להשגת הריכוז המקורי.
  4. חזור על תהליך החלפת הבופר שלוש פעמים כדי להסיר כ-99% מזהמים קטנים כמו מלחים או אוריאה.
  5. ריכזו את דגימות החלבון על ידי ייבוש בהקפאה באמצעות ליופילייזר ואקום מהיר.
    הערה: התאם את מספר המחזורים בהתאם לרמת ההסרה הנדרשת ליישומים במורד הזרם.

5. כימות חלבון באמצעות בדיקת חומצה ביצינכונינית (BCA)

הערה: ריכוז החלבון בדגימות נקבע באמצעות מבחן החלבון BCA, כאשר אלבומין הסרום של הפר (BSA) הוא הסטנדרט. מבחן BCA הוא שיטה קולורימטרית התואמת לדטרגנטים, המבוססת על חומצה ביצינכונינית, לזיהוי וכימות של חלבון כולל. היא מתבססת על הפחתה של Cu²⁺ ל-Cu⁺ על ידי חלבונים בסביבה אלקלית (תגובת ביורט), ואחריה זיהוי קולורימטרי רגיש וסלקטיבי של יון הכוסות (Cu⁺) באמצעות מגיב המכיל חומצה ביצינכונינית. הבדיקה מייצרת קומפלקס בצבע סגול הנוצר מכלציה של יון קופרוס אחד עם שתי מולקולות BCA. בדיקת BCA מפיקה תגובה עקבית וליניארית עם BSA, ומבטיחה הפניה עקומה סטנדרטית אמינה. למרות שידוע שחלבונים שונים מניבים תגובות שונות במבחן BCA, השימוש ב-BSA מספק כימות יחסי שניתן לשחזר בין דגימות מגוונות. מכיוון שמטרתנו הייתה נרמול לעומס חלבון שווה ולא לכימות מוחלט של כל מין, כיול מבוסס BSA הציע את הגישה החזקה והניתנת לשחזור ביותר.

  1. הליך
    1. הוסף 25 מיקרוליטר מכל תקן BSA (טווח עבודה 20-2000 מיקרוגרם/מ"ל) ודגימת חלבון לא ידועה לבארות ייעודיות של לוח 96 בארות.
    2. הוסף 200 מיקרו-ליטר של תגובת BCA פועלת לכל באר.
    3. ערבב היטב עם שייקר מיקרופלטה למשך 30 שניות.
    4. כסו את הצלחת ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
    5. הביאו את הצלחת לטמפרטורת החדר.
    6. מדדו את הספיגה ב-562 ננומטר באמצעות קורא מיקרופלט.
  2. ניתוח נתונים
    1. מחסר את הספיגה הממוצעת של החלבון הריק (חלבון אפס) מכל ערכי הדגימה והספיגה הסטנדרטית.
    2. צייר עקומה סטנדרטית של ספיגה מול ריכוז BSA (מיקרוגרם/מיקרוליטר).
    3. השתמש במשוואת הרגרסיה מהעקומה כדי לחשב ריכוזי חלבונים בדגימות לא ידועות.

6. נרמול ריכוז החלבון

  1. הליך
    1. למדוד את ריכוז החלבון בכל דגימת פלזמה באמצעות שיטת כימות מתאימה.
    2. רשמו את הריכוז והנפח הכולל של כל דגימה.
    3. הכינו בופר ביקרבונט אמוניום של 50 מ"מ (pH 7.8) כמדלל.
    4. מחשבים את הדילול הנדרש באמצעות הנוסחה C₁V₁ = C₂V₂.
    5. עבור דגימה בריכוז של 1.3 מ"ג/מ"ל ונפח של 100 מיקרוליטר, חשב את הנפח הסופי הנדרש כדי להגיע ל-1 מ"ג/מ"ל:[V₂ = \frac{1.3 \כפול 100}{1} = 130\ \mu L]
    6. חשב את נפח הבופר שיש להוסיף על ידי הפחתת הנפח ההתחלתי מהנפח הסופי: נפח בופר = 130 מיקרוליטר − 100 מיקרו-ליטר = 30 מיקרוליטר.
    7. הוסף 30 מיקרוליטר של ביקרבונט אמוניום של 50 מילימטר (pH 7.8) לדגימת הפלזמה של 100 מיקרוליטר.
    8. ערבבו את הדגימה בעדינות על ידי פיפטינג או מערבולת קצרה.
    9. אשר שהנפח הסופי הוא 130 מיקרוליטר בריכוז מנורמל של 1 מ"ג/מ"ל.
    10. המשך בהכנת דגימות פרוטאומיות במורד הזרם.
      הערה: ודא התאמה מדויקת של הריכוז על ידי חישוב גורם הדילול הנדרש בהתבסס על תוצאות מבחן BCA. כל שלב מאומת, והנתונים ניתנים כנתונים משלימים (טבלה משלימה 1).

7. הכנת דגימה ועיכול טריפטי

  1. הפחתת חלבון
    1. הוסף סוכן חיזור מתאים (למשל, 1,4-דיתיותרייטול [DTT]) לתמיסת החלבון בבופר אמוניום ביקרבונט לריכוז סופי של 100 מ"מ.
    2. דגרו את התערובת בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות בתרמומיקסר או בלוק חימום.
      אזהרה: DTT הוא מגרה ויש לטפל בו עם כפפות בתוך מכסה אדים.
      הערה: מידע נוסף על הטריפסין המשמש לעיכול סופק בטבלת החומרים. בקצרה, נעשה שימוש בטריפסין טופל טוזיל פנילאלניל כלורומתיל קטון (TPCK) בדרגת ריצוף (לביטול פעילות כימוטריפטית) כדי להבטיח ספציפיות גבוהה לפיצול בשאריות ליזין וארגינין. פעילות האנזימים אושרה על פי מפרטי היצרן, התואמים לפעילות N-Benzoyl-L-Arginine Ethyl Ester (BAEE) של כ-1 יחידה למ"ג חלבון. לגבי ריכוזי DTT ו-Iodo Acetamide (IAA), אנו מאשרים כי 100 mM DTT ו-200 mM IAA מתייחסים לתמיסות המלאי, ולא לריכוזים הסופיים ששימשו בתגובה. ריכוזי העבודה הסופיים במהלך ההפחתה והאלקילציה היו בטווח הסטנדרטי (בדרך כלל 5-10 mM DTT ו-10-20 mM IAA, בהתאמה).
  2. אלקילציה של שאריות ציסטאין
    1. תן לדגימה להתקרר בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות לאחר ההפחתתה.
    2. צנטריפוגה קצרה לאיסוף עיבוי בתחתית הצינור.
    3. הוסף 200 מ"מ IAA שהוכנה בבופר אמוניום ביקרבונט (ABC) של 50 מ"מ כדי לאלקליט את שאריות הציסטאין המופחתתות.
    4. דגר את הדגימה בחושך בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות כדי למנוע התדרדרות IAA.
      הערה: יודואצטמיד רגיש לאור ועלול להיות רעיל; הימנעו מחשיפה ותטפלו באור עמום.
  3. עיכול אנזימטי
    1. הכינו טריפסין מותאם בדרגת ריצוף בבופר ABC של 50 מ"מ מיד לפני השימוש.
    2. הוסף טריפסין לכל דגימה ביחס טריפסין לחלבון של 1:25 (w/w).
    3. דגרו את התגובה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 17 שעות כדי לאפשר עיכול אנזימטי מלא.
      הערה: זמני עיכול ממושכים עלולים להוביל לעיכול יתר; להבטיח יציבות טמפרטורה לאורך כל הדגירה.
  4. כיבוי התגובה
    1. עצרו את התגובה האנזימטית על ידי הוספת חומצה פורמית לכל דגימה כדי להגיע לריכוז סופי של 1.0% (v/v).
    2. דגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות כדי לדטר את שאריות הטריפסין ולייצב את תערובת הפפטידים.
      אזהרה: חומצה פורמית היא קורוזיבית; השתמשו בציוד מגן אישי מתאים (PPE) ועבדו במכסה אדים כימי.
  5. שחזור פפטידים
    1. צנטריפוגה את תערובת הפפטידים המעוצלת בטמפרטורה של 3500 גרם למשך 12 דקות בטמפרטורת החדר כדי להסיר חומר בלתי מסיס.
    2. העבר בזהירות את הסופרנטנט השקוף המכיל פפטידים מעוכלים לבקבוקי אוטוסמפלר מבלי להפריע לכדור.
    3. אחסן את תמיסות הפפטידים בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס עד לניתוח נוסף של LC-MS/MS.
  6. הכנה לניתוח LC-MS
    1. טעינו את דגימות הפפטיד ישירות על מערכת LC-MS המצוידת בניידות יונים להפרדה וניתוח פפטידים.
    2. ודאו שכל הבקבוקים אטומים כראוי כדי למנוע אידוי וזיהום.

8. ניתוח LC MS-MS

  1. טעינת פפטידים והסרת מלח
    1. טעין 1 מיקרוגרם מדגימת הפפטיד ללולאת דגימה במצב הזרקה בלולאה חלקית.
    2. הסרת מלח של פפטידים באמצעות עמודת מלכודת C18 על ידי שטיפה עם ממס מימי המכיל 0.1% חומצה פורמית בקצב זרימה של 15 מיקרוליטר לדקה למשך דקה.
      הערה: השתמשו במים עם חומצה פורמית של 0.1% כממס A ובאצטוניטריל עם חומצה פורמית 0.1% כממס B לאורך כל הריצה.
  2. הפרדת פפטידים
    1. חבר את עמודת המלכודת בקו עם עמודת C18 אנליטית הפוכה.
    2. פפטידי אלוט המשתמשים בגרדיאנט ליניארי בין 3% ל-40% ממס B במשך 55 דקות בקצב זרימה של 300 ננוליטר לדקה.
    3. שטוף את העמודה עם 80% ממס B למשך 7.5 דקות כדי להסיר רכיבים שנשארו.
    4. איזון מחדש את העמודה עם 3% ממס B לפני ההזרקה הבאה.
    5. שמרו על תנור העמוד ב-35 מעלות צלזיוס ועל האוטוסמפלר ב-4 מעלות צלזיוס במהלך הריצה.
      הערה: כלול הזרקות ריקות בין דגימות כדי למזער את ההעברה.
  3. הגדרות רכישת ספקטרומטריית מסה
    1. ניתוח ספקטרום מסה של פפטידים מתבודדים
      1. הגדר את מערכת ה-UPLC וחבר אותה ישירות ל-MS באיכות גבוהה.
      2. שלוט במערכת באמצעות תוכנת מיקרוסופט.
      3. ודאו שספקטרומטר המסה מוגדר כמכשיר היברידי של ניידות רביעי-יון-תאוצה-זמן טיסה (oa-TOF).
      4. ודאו שכל חיבורי החנקן וגז התזת מנעולים בטוחים וללא דליפות לפני תחילת הפעלה.
        זהירות: לטפל בחיבורים במתח גבוה ובגזים בלחץ בהתאם לתקני בטיחות במעבדה.
    2. הגדרת יינון
      1. הפעל את ספקטרומטר המסה במצב יינון אלקטרוספריי חיובי (ESI) באמצעות מקור יונים אלקטרוספריי כפול.
      2. הגדר את מתח הננו-ESI הקפילרי ל-3.4 קילו-וולט.
      3. כוון את מתח קונוס הדגימה ל-40 וולט ואת מתח קונוס החילוץ ל-4 וולט.
      4. הגדר את זרימת גז החנקן של ספקטרומטריית ניידות היונים (IMS) ל-90 מ"ל לדקה.
      5. בדוק את יציבות הריסוס וודא שזרם יונים עקבי לפני ההתקדמות.
    3. הפרדת ניידות יונים
      1. הגדר את גובה הפולס של מדריך היונים IMS ל-40 וולט במהלך שידור היונים.
      2. כוון את מהירות מדריך היונים של IMS ל-800 מ"ש.
      3. הגדילו את גובה הגל הנע בקו ישר מ-8 וולט ל-20 וולט לאורך כל מחזור ה-IMS כדי להשיג הפרדה אופטימלית של יונים באמצעות ניידות.
        זהירות: להבטיח זרימת גז יציבה של IMS; תנודות עשויות להשפיע על הפרדת היונים ועל שחזור זמן הסחף.
    4. כיול מסה של מנעול
      1. כיילן את מנתח זמן הטיסה (TOF) באמצעות תמיסת יודיד נתרן (NaI) של 2 מיקרוגרם/מיקרוליטר.
      2. הגדר את טווח הכיול לזיהוי יונים בין 50 מ/ז ל-2000 מ/ז.
      3. רכוש ספקטרום ייחוס מסה נעילה כל 45 שניות באמצעות ערוץ מקור יונים אלקטרוספריי כפול לתיקון מסה בזמן אמת.
      4. ודאו שעקומת הכיול משיגה דיוק מסה בטווח של ±5 ppm לפני המשך לאיסוף נתונים.
  4. רכישת נתונים
    1. רכישת נתונים במצב רציף, לסירוגין בין שתי פונקציות:
      1. פונקציה 1 (MS באנרגיה נמוכה): תיעוד ספקטרום יוני קדם-אנרגיה נמוכה.
      2. פונקציה 2 (HDMSE באנרגיה גבוהה): תיעוד ספקטרום יוני מקטעים באנרגיית התנגשות מוגברת עם הפרדת ניידות יונים.
    2. בפונקציה 2, הגדר את אנרגיית ההתנגשות באזור המלכודת ל-4 eV.
    3. הגבירו את אנרגיית ההתנגשות באזור ההעברה מ-20 eV ל-45 eV כדי להשיג פיצול פפטידי מבוקר.
    4. הגדר את זמן הרכישה הספקטרלי לכל פונקציה ל-0.9 שניות ואת עיכוב הבין-סריקות ל-0.024 שניות.
    5. יש לעקוב אחרי הכרומטוגרמה היונית הכוללת (TIC) כדי לוודא תגובת מכשיר עקבית לאורך כל הריצה.
    6. ייבאו נתונים גולמיים לתוכנות ניתוח פרוטאומיקס (למשל, Progenesis QI או מקבילה).
    7. יישר כרומטוגרמות בין ריצות באמצעות יישור ברירת המחדל או הרצת ייחוס שנבחר ידנית.
    8. זהה פפטידים וחלבונים באמצעות מאגר נתונים מובחר (למשל, UniProt Human - רק רשומות שנבדקו).
    9. הגדר את פרמטרי החיפוש הבאים:
      אנזים: טריפסין
      שינוי קבוע: קרבמיטומתילציה (C)
      שינוי משתנה: חמצון (M)
      סבילות לפפטידים: בהתאם לרזולוציית המכשיר
      החמצות חישוך מותרות: 1
      שיעור גילוי שגוי (FDR): ≤ 1%
    10. בצע נרמול באמצעות שיטת הנרמול לכל החלבונים .
    11. החלו ספי סינון: ≥2 פפטידים לכל חלבון, ≥1 פפטיד ייחודי, שינוי קיפול ≥1.5, וערך p מותאם <0.05.
      הערה: זהו הנחיות כלליות לבטיחות במעבדות – תמיד יש לעקוב אחרי תקנות ה-EHS (בריאות ובטיחות סביבתית) של המוסד ולדרישות החוק המקומיות.
  5. בקרת איכות
    1. בצע בדיקות כיול לפני ואחרי הריצה באמצעות תקן NaI לאימות דיוק המסה.
    2. ודא שההתייחסות למסה של המנעול נשארת יציבה לאורך כל הניתוח.
    3. העריך הזרקות שכפול כדי לאשר שחזוריות בזמן החזקה, זמן ההסחפה והעוצמה הספקטרלית.
      אזהרה: יודיד נתרן הוא מגרה. בעת הטיפול, יש להשתמש בכפפות ולהימנע משאיפה או מגע עם העור.
      הערה: עיינו בקובץ המשלים 1 לקבלת הנחיות לטיפול בפסולת. תמיד עבוד בסביבה קרה או על קרח בעת טיפול בדגימות פלזמה כדי למנוע פירוק חלבון. לבש כפפות ניטריל, חלוק מעבדה והגנה לעיניים בעת טיפול בדגימות ביולוגיות ובופרים. בצע שלבי צנטריפוגה באמצעות צנטריפוגה מקוררת מראש ל-4 מעלות צלזיוס. ודא שכל צינורות הצנטריפוגות והמזרקים המשמשים סטריליים ומסומנים כראוי כדי למנוע זיהום צולב. תמיד השתמש במים בדרגת פרוטאומית להכנת בופרים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דגימות פלזמה עובדו באמצעות מחסנית ספין להסרה סלקטיבית של 14 חלבונים בעלי שפע גבוה, כלומר אלבומין, IgG, IgA, טרנספרין, פטוגלובין, אנטיטריפסין, פיברינוגן, אלפא2-מקרוגלובולין, גליקופרוטאין חומצה אלפא1, IgM, אפוליפופרוטאין AI, אפוליפופרוטאין AII, משלים C3 וטרנסתירטין. שלב הדלדול הזה היה קריטי לשיפור זיהוי סמנים ביולוגיים בעלי שפע נמוך בניתוח פרוטאומי במורד הזרם. כל דגימת פלזמה (8-10 מיקרוליטר) דוללה, הובהרה באמצעות סינון ספין של 0.22 מיקרון, ועברה דרך מחסנית הזיקה בתנאי צנטריפוגה מבוקרים. חל...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המורכבות הפנימית של הפלזמה כמטריצה ביולוגית מציבה אתגר משמעותי לניתוח פרוטאומי. הטווח הדינמי העצום של ריכוזי החלבון, יחד עם הדומיננטיות של כמה מינים בעלי שפע גבוה, יכולים להסתיר את גילוי החלבונים בעלי שפע נמוך הרלוונטי קלינית. למחקר הנוכחי, הפחתנו את החסרונות הללו באמצעות צינור רב-שלבי וסטנדרטי להכנת דגימות, שנועד להעשיר באופן סלקטיבי חלבונים בעלי שפע בינוני ונמוך ולשמור על עקביות אנליטית בין הדגימות. כל שלב בתהליך העבודה של פרוטאומיקה בפלזמה מותאם לניהול רעש טכני, הגברת הרגישות ושיפור ה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים הראשונים הם מקבלי פרסי SRF (מלגות מחקר בכירות) של המועצה המדעית והתעשייתית (CSIR) והמועצה ההודית למחקר רפואי (ICMR), ממשלת הודו. המחבר המקביל מודה בתמיכה כספית מ-ICMR (מס' פרויקט: 2021-13589), גם התמיכה של מרכז יובל למחקר רפואי מוערכת. המחברים מביעים את תודתם לד"ר ד. מ. וסודבן וד"ר פ. ר. ורג'יס על תמיכתם והכווניהם. המחברים מודים בתודה על התמיכה שניתנה על ידי מתקן הליבה של הפרוטאומיקה במתקן הלאומי DBT-SAHAJ לספקטרומטריית מסה, מרכז ראג'יב גנדי לביוטכנולוגיה, טריוונדרום, קרלה, הודו, וד"ר ארון סורנדרן וד"ר עבדול ג'ליל.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מרוכז ספין חיתוך משקל מולקולרי של 5 קילו-דלטוןאג'ילנט טכנולוגיות5185&מינוס; 5991משמש להחלפת בופר והסרת מלח; שומר על חלבונים מעל 5 kDa
ביקרבונט אמוניום (ABC)סיגמא אולדריץ'מספר קטגוריה: T6567משמש לעיכול טריפטי
Buffer A Equil/Load/Wash אג'ילנט טכנולוגיות5185-5987
Buffer B Elution אג'ילנט טכנולוגיות5185-5988
צנטריפוגה מגניבהצנטריפוגה מקוררת CPR-30 Plusלא זמיןמשמש לצנטריפוגציה של דגימות חלבון בטמפרטורה נמוכה
DTTסיגמא אולדריץ'  CASNo: 3483-12-3משמש לעיכול טריפטי
מכשיר אלקטרופורטיBIO RAD1658004משמש ל-SDS PAGE
IAAסיגמא אולדריץ'CAS מס' 144-48-9משמש לעיכול טריפטי
IMS T-Wave מיםhttps://www.waters.com/content/dam/waters/en/library/white-papers/2012/water-whitepapers-Triwav
eMoreCompleteCharacterization של Mi
xturesandMolecules-720004176.pdf		הפרדת ניידות יונים (IMS)
קורא Infinite M Plex Multimodeטקאןקורא מולטיפלט
מערכת LC-MSמיםhttps://www.waters.com/nextgen/us/en/products/mass-spectrometry/mass-spectrometry-systems/liquid-chromatography-ms-systems.html
תוכנת MassLynx 4.1 SCN781מיםhttps://www.waters.com/nextgen/us/en/products/informatics-and-software/mass-spectrometry-software/masslynx-mass-spectrometry-software.htmlתוכנת ספקטרומטריית מסה
מחסנית סיבוב להסרת זיקה מרובה אדם 14 (MARS Hu-14)אג'ילנט טכנולוגיות5188&מינוס; 6560משמש להפחתת 14 חלבוני פלזמה בעלי שפע גבוה כולל אלבומין, IgG, IgA, טרנספרין ועוד.
מערכת nanoACQUITY UPLCמיםhttps://www.waters.com/nextgen/en/products/chromatography/chromatography-systems/acquity-uplc-m-class-system.html
NanoLockSprayמיםhttps://www.waters.com/nextgen/us/en/services/instrument-services/instrument-upgrades/mass-spectrometry-ms-upgrades/nanolockspray-exact-mass-ionization-source-upgrade.html
אופרון FDU-7003אופרוןhttp://www.operon.co.kr/en/pro2-FDU.htmlליופילייזר ואקום מהיר
ערכת בדיקת חלבון Pierce BCAתרמו-סיינטיפיק23225משמש לכימות ריכוז החלבון באמצעות מבחן קולורימטרי
פרוגנזה QI עבור פרוטאומיקס מיםV4.2 
צנטריפוגה מעבדת R-8C BL, רוטור בזווית קבועה עם 12 פעמים &; 15 מ"לרמיצנטריפוגה
SYNAPT G2 MS באיכות גבוההמערכת HDMSE, תאגיד ווטרסhttps://www.waters.com/content/dam/waters/en/app-notes/2009/720003057/720003057-en.pdfספקטרומטר מסה היברידי של IMS עם תאוצה אורתוגונלית בזמן טיסה (oa-Tof)
בקבוקון החזרה מלאמיםhttps://www.waters.com/nextgen/us/en/shop/vials-containers--collection-plates/186004631-clear-glass-12-x-32-mm-screw-neck-total-recovery-vial-preassembl.html
טריפסיןסיגמא אולדריץ'  מספר קטגוריה: T6567משמש לעיכול טריפטי

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Blume, J. E., et al. deep and precise profiling of the plasma proteome with multi-nanoparticle protein corona. Nat Commun. 11 (1), 3662(2020).
  2. Anderson, N. L. The clinical plasma proteome: a survey of clinical assays for proteins in plasma and serum. Clin Chem. 56 (2), 177-185 (2010).
  3. Serban, K. A., Pratte, K. A., Bowler, R. P. Protein biomarkers for COPD outcomes. Chest. 159 (6), 2244-2253 (2021).
  4. Ignjatovic, V., et al. Mass spectrometry-based plasma proteomics: considerations from sample collection to achieving translational data. J Proteome Res. 18 (12), 4085-4097 (2019).
  5. Bonaroti, J., et al. Plasma proteomics reveals early, broad release of chemokine, cytokine, TNF, and interferon mediators following trauma with delayed increases in a subset of chemokines and cytokines in patients that remain critically ill. Front Immunol. 13, 1038086(2022).
  6. Omenn, G. S., et al. Overview of the HUPO Plasma Proteome Project: results from the pilot phase with 35 collaborating laboratories and multiple analytical groups, generating a core dataset of 3020 proteins and a publicly-available database. Proteomics. 5 (13), 3226-3245 (2005).
  7. Ellis, M. J., et al. Connecting genomic alterations to cancer biology with proteomics: the NCI Clinical Proteomic Tumor Analysis Consortium. Cancer Discov. 3 (10), 1108-1112 (2013).
  8. Geyer, P. E., et al. Plasma proteome profiling to detect and avoid sample-related biases in biomarker studies. EMBO Mol Med. 11 (11), e10427(2019).
  9. Gawor, A., Bulska, E. A standardized protocol for assuring the validity of proteomics results from liquid chromatography-high-resolution mass spectrometry. Int J Mol Sci. 24 (7), 6129(2023).
  10. Tsantilas, K. A., et al. A framework for quality control in quantitative proteomics. J Proteome Res. 23 (10), 4392-4408 (2024).
  11. Malmström, E., et al. Large-scale inference of protein tissue origin in gram-positive sepsis plasma using quantitative targeted proteomics. Nat Commun. 7 (1), 10261(2016).
  12. Gillet, L. C., et al. Targeted data extraction of the MS/MS spectra generated by data-independent acquisition: a new concept for consistent and accurate proteome analysis. Mol Cell Proteomics. 11 (6), (2012).
  13. Anderson, N. L., Anderson, N. G. The human plasma proteome: history, character, and diagnostic prospects. Mol Cell Proteomics. 1 (11), 845-867 (2002).
  14. Das, S., Adiody, S., Varghese, J., Vanditha, M., Maria, E., John, M. Exploring the novel duo of Reticulocalbin and Sideroflexin as future biomarker candidates for exacerbated chronic obstructive pulmonary disease. Clin Proteomics. 21 (1), 10(2024).
  15. Mohan, V., et al. Myosin Light Chain 12b and MASP1 as novel biomarker candidates in active juvenile idiopathic arthritis─a combined proteomics/bioinformatics approach. J Proteome Res. 24 (3), 1439-1448 (2025).
  16. Bellei, E., et al. High-abundance proteins depletion for serum proteomic analysis: concomitant removal of non-targeted proteins. Amino Acids. 40 (1), 145-156 (2011).
  17. Tu, C., et al. Depletion of abundant plasma proteins and limitations of plasma proteomics. J Proteome Res. 9 (10), 4982-4991 (2010).
  18. Zolotarjova, N., et al. Differences among techniques for high-abundant protein depletion. Proteomics. 5 (13), 3304-3313 (2005).
  19. Huang, C. S., et al. Multiplexed cancer biomarker detection using quartz-based photonic crystal surfaces. Anal Chem. 84 (2), 1126-1133 (2012).
  20. Cañas, B., et al. Trends in sample preparation for classical and second-generation proteomics. J Chromatogr A. 1153 (1-2), 235-258 (2007).
  21. Izquierdo-Sandoval, D., et al. Benefits of ion mobility separation in GC-APCI-HRMS screening: from the construction of a CCS library to the application to real-world samples. Anal Chem. 94 (25), 9040-9047 (2022).
  22. Katayama, T., Sawada, J., Takahashi, K., Yahara, O., Hasebe, N. Meta-analysis of cerebrospinal fluid neuron-specific enolase levels in Alzheimer's disease, Parkinson's disease, dementia with Lewy bodies, and multiple system atrophy. Alzheimers Res Ther. 13 (1), 163(2021).
  23. Soni, R. K. Frontiers in plasma proteome profiling platforms: innovations and applications. Clin Proteomics. 21 (1), 43(2024).
  24. Gold, L., Walker, J. J., Wilcox, S. K., Williams, S. Advances in human proteomics at high scale with the SOMAscan proteomics platform. New Biotechnol. 29 (5), 543-549 (2012).
  25. Assarsson, E., et al. Homogenous 96-plex PEA immunoassay exhibiting high sensitivity, specificity, and excellent scalability. PLoS One. 9 (4), e95192(2014).
  26. Desaire, H., Go, E. P., Hua, D. Advances, obstacles, and opportunities for machine learning in proteomics. Cell Rep Phys Sci. 3 (10), 100947(2022).
  27. Shoaib, A. S., Nishat, N., Raasetti, M., Arif, I. Integrative machine learning approaches for multi-omics data analysis in cancer research. Int J Health Med. 1, 26(2024).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

LC MS MS
הסרטון יגיע בקרוב

מאמרים קשורים