הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר מחקר

חומצה ליפואית מווסת את מסלול Nrf2/HO-1 לדיכוי דלקת בקרטיטיס פטרייתית באמצעות מנגנוני הגנה על הציטו-מגן על ידי המארח

403 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/69362

⸱

9 בדצמבר 2025

 , 
1Department of Ophthalmology, Jinan 2nd People's Hospital

במאמר זה

סיכום

חומצה ליפואית מפעילה את מסלול הציטופרוטקינג Nrf2/HO-1 בקרטיטיס פטרייתי, ומפחיתה את רמות הציטוקינים הדלקתיים ונזק לקרנית. טיפול מונחה על ידי מארח זה מציג פרופילי בטיחות טובים יותר בהשוואה לתרופות אנטי-פטרייתיות קונבנציונליות, תוך מתן תובנות מכניות לטיפול במחלות עיניים המונעות מלחץ חמצוני באמצעות שיפור מסלולי נוגדי חמצון אנדוגניים.

תקציר

חומצה ליפואית (LA), נוגד חמצון דיתיול עם פרופיל בטיחות עיני יוצא דופן, נחקר בשל יכולתו למתן את הסביבה החמצנית-דלקתית שמניעה קרטיטיס פטרייתית. תאי אפיתל הקרנית האנושיים סבלו LA עד 60 מיקרומולר ללא אובדן קיום, ובאתגר של אספרגילוס פומיגאטוס , LA גרם להסלמה פי שלוש של טרנסלוקציה גרעינית של גורם גרעיני אריתרואיד 2 (Nrf2) ועלייה פי חמישה באפקטור המורד המים אוקסיגנאז-1 (HO-1). השתקה פרמקולוגית של Nrf2 עם ML385 או חסימה קטליטית של HO-1 עם פרוטופורפירין בדיל IX ביטלה את האירועים המולקולריים הללו והחזירה את האינטרלוקין-1β ואת ביטוי פקטור הנמק של הגידול α, ואישרה תלות מוחלטת ב-Nrf2/HO-1. ניסויים מקבילים במודל קרטיטיס בעכברים אישרו את התצפיות במבחנה : LA טופיקלי הפחיתו את עכירות הקרנית ואת ציוני הדלקת ב-47%, ובמקביל הגביר את ביטוי Nrf2 ו-HO-1 בקרנית תוך חציית תמלילי הציטוקינים; מתן משותף של SnPPIX ביטל את היתרונות הללו. ביחד, הנתונים מגדירים היררכיה מכנית קוהרנטית שבה LA, בריכוזים קליניים ניתנים להשגה, מעלה את רמות חלבוני Nrf2 ומגביר טרנסלוקציה גרעינית, מגביר את פעילות HO-1, ובכך מדכא טורבולנציה ציטוקינית הנגרמת על ידי פתוגנים. ממצאים אלו מציבים את LA כתוסף שניתן לתרגם בקלות, מונחה על ידי המארח, המסוגל להשלים כימותרפיה אנטי-פטרייתית ומציעים אופקים טיפוליים רחבים יותר לוויסות Nrf2 של דלקת קרנית המסכנת ראייה.

מבוא

קרטיטיס פטרייתי (FK) מוכרת כיום כמצב חירום עיני נרחב, האחראית ליותר ממיליון מקרים מוכחים בתרבית מדי שנה ולחלק לא פרופורציונלי של עיוורון קרניתבאזורים טרופיים וסובטרופיים. הערכות השכיחות המתקרבות ל-6-8 ל-100,000 בארצות הברית ואף גבוהות יותר בכלכלות החקלאיות מדגישות איום עולמי גובר שמעדיף פוגע באוכלוסיות בגיל עבודה לאחר טראומה צמחיתאו לבישת עדשות מגע. פטריות סיביות, במיוחד מיני Fusarium ו-Aspergillus, שולטות בנוף האטיולוגי, משגשגות באקלים חם ולח ומנצלות פגיעות מיקרו-עיניות כדי להתחיל זיהום5.

למרות חצי מאה של שימוש קליני, נטמיצין 5% נותר החומר המקומי היחיד שאושר במיוחד ל-FK; עם זאת, הכימיה הפוליאנית שלו גורמת לחדירת קרנית לקויה, דורשת מינון תכוף, ואינה זמינה באופן אוניברסלי 6,7. באופן מדאיג, מחקר מעקב עוקב מדרום אסיה חשף עליות הדרגתיות בריכוזי המעכבים המינימליים של נטמיצין וטריאזולים, כאשר מבודדי הפוסאריום מציגים עלייה שנתית של ≥6% בעמידות לנטמיצין ומגמה מקבילה לווריקונזול8. נתונים אלה תואמים את הדיווחים הקליניים על כישלון טיפולי ומחזקים את התחזיות ששוק התרפיות של FK יתרחב מ-0.9 מיליארד דולר ב-2023 ל-1.48 מיליארד דולר עד 2033, בעיקר בשל החסרונות של התרופות התרופתיות הנוכחיות. צעדים כירורגיים אד-הוק, כגון פלפים של הלחמית או קרטופלסטיה חודרת, מצליחים להציל אנטומיה בכיבים עקשנים, אך הם דורשים משאבים כבדים ומגבילים את הראייה9. ביחד, ליקויים אלו מדגישים את הצורך באסטרטגיות מונחות מארח או רב-מטרות, החורגות מעבר לפעולה פטריתית בלבד.

לחץ חמצוני והמפל הדלקתי הנובע ממנו מובנים כיום כגורמים מרכזיים לפתוגנזה פטרייתית ולצלקות בקרנית. עם פלישה פטרייתית, תאי אפיתל בקרנית ואוכלוסיות חיסוניות תושבות, כולל תאי מאסט לחמית, תאי דנדריט לימבליים וקרטוציטים סטרומליים, מפעילים תגובות חיסוניות מולדות דרך קולטני זיהוי דפוסים, כגון דקטין-1 וקולטניToll-like 10. מיני חמצן תגובתיים שמקורם בנוטרופילים (ROS) מצטברים בסטרומה נגועה כחלק מהתפרצות החמצונית האנטימיקרוביאלית, בעוד שמקרופאג'ים ולימפוציטים T חודרים ממשיכים דלקת כרונית באמצעות הגברת ציטוקינים11. באופן פרדוקסלי, פטריות סיביות מעלות את מעגלי נוגדי החמצון שלהן (למשל, דיסמוטסות סופר-אוקסיד המוסדרות על ידי Yap1) כדי לשרוד את הסביבה העוינת הזו. עודף ROS מפעיל בתורו את השעתוק התלוי ב-NF-κB של IL-1β, TNF-α ומתווכים פרו-דלקתיים אחרים שמניעים הרס רקמות ואטימות הקרנית12. במרכז ההגנה הציטוגרפית האנדוגנית נמצא פקטור גרעיני אריתרואיד 2 (Nrf2), שהמעבר שלו לגרעין מפעיל את ביטוי ההם אוקסיגנאז-1 (HO-1) ומערך של אנזימים מנקים רעלים במספר סוגי תאי קרנית, כולל תאי אפיתל, קרטוציטים ותאי אנדותל13,14. הזדקנות, סוכרת ודלקת כרונית מווסתות את הציר הזה, מה שהופך את רקמות העין לפגיעות לפגיעות חמצוניות, בעוד ששיפור גנטי או פרמקולוגי של Nrf2 מזרז את סגירת פצעי האפיתל ומדכא את התפרצות הציטוקינים בפגיעות קרניותשונות.

מחקרי הוכחת היתכנות החלו לנצל מסלול זה ב-FK. מולקולות קטנות טבעיות כמו פרילאלדהיד16, חומצה גאלית17, הידרוקסיטרוזול18 והתרכובת האורגנוסלניום אבסלן19 משיגות אפקטים אנטי-פטרייתיים ואנטי-דלקתיים כפולים על ידי הגברת איתות Nrf2-HO-1 תוך פגיעה ישירה בחיוניות הפטרייתית. פלטפורמות ננו-רפואה שמספקות יחד אנטי-פטרייתיות ונוגדי חמצון ממחישות עוד יותר את ההבטחה הטיפולית בשילוב ניקוי פתוגנים עם חיזוק הגנת המאכסן20,21. עם זאת, רבים מהמועמדים הללו מתמודדים עם מכשולים תרגומיים הקשורים למורכבות הנוסחה או לבטיחות עינית לא מוכחת.

חומצה ליפואית (LA) היא נוגד חמצון דיתיול נפוץ עם רקורד בטיחות מערכתית מבוסס וגמישות פרמקודינמית יוצאת דופן. בהתבסס על מחקרים ברקמות כבדיות ועצביות, מוצעל-10,12 LA לשנות ישירות את שאריות הציסטאין (במיוחד Cys151, Cys273 ו-Cys288) על חלבון ECH-1 (Keap1) דמוי קלץ', מה שמפריע לאינטראקציה שלו עם Nrf2 ובכך מונע את יוביקוויטינציה של Nrf2 ופירוק פרוטאזומלי, מה שמוביל לעלייה ברמות חלבוני Nrf2, להגברת העברת הגרעין ולהגברת שעתוק HO-1. עם זאת, הוכחה ישירה של אינטראקציה בין Keap1 ל-LA בתאי אפיתל בקרנית מצדיקה בדיקה עתידית. LA הוכיח יתרונות ציטופרוטקטיביים במודלים כבדיים, עצביים ועיניים של פגיעות חמצוניות13,15. אופיו האמפיפתי מקל על חדירת הרקמות ללא הרעילות לממברנה שנצפית בפוליאנים, וכבר קיימות נוסחאות קליניות לאינדיקציות מקומיות ומערכתיות. עם זאת, היכולת של LA לווסת את המיקרו-סביבה הדלקתית של הקרנית ובכך לשפר את FK לא נבחנה בקפדנות.

לכן, המחקר הנוכחי חקר האם LA יכול להקל על קרטופתיה הנגרמת על ידי A. fumigatus על ידי הפעלת ציר Nrf2/HO-1 תוך דיכוי ציטוקינים פרו-דלקתיים. באמצעות תאי אפיתל קרנית אנושיים ומודל FK מאומת של עכברים, הגדרנו את מאפייני המינון-תגובה, ניתחנו תלות מכנית עם מעכבים סלקטיביים, והשוותנו תוצאות טיפוליות מול קבוצות ביקורת לא נגועות וקבוצות שטופלו ברכבים נגועים. למיטב ידיעתנו, זהו המחקר השיטתי הראשון שקבע את היעילות הטיפולית של חומצה ליפואית בקרטיטיס פטרייתית באמצעות אפיון מקיף של מינון-תגובה, ניתוח מכניסטי באמצעות מעכבים פרמקולוגיים סלקטיביים של Nrf2 ו-HO-1, ואימות במודלים תאיים ובעלי חיים. עבודה זו משלבת באופן ייחודי קריאות מולקולריות, תאיות ותרגומיות כדי לספק ראיות חד-משמעיות לתלות במסלולים Nrf2/HO-1 שמאחורי ההשפעות האנטי-דלקתיות של LA. על ידי שילוב קריאות מולקולריות, תאיות ו-in vivo , שאפנו לספק הערכה מקיפה של LA כטיפול שניתן לתרגם בקלות, מונחה על ידי מארח, המתמודד עם שני הדחפים של חיסול פתוגנים והגבלת דלקת ב-FK.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל ההליכים לבעלי חיים אושרו על ידי ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים המוסדית (מספר פרוטוקול: IACUC-2024-FK-007) ובוצעו בהתאם להצהרת האגודה למחקר בראייה ואופתלמולוגיה לשימוש בבעלי חיים במחקר עיניים וראייה. עכברים זכרים מסוג C57BL/6, בגילאי 8-10 שבועות ומשקלם 20-25 גרם, הוחזקו בכלובים מאווררים בנפרד בתנאי סביבה מבוקרים של 22 ± 2 מעלות צלזיוס ולחות יחסית של 50%-60% עם מחזור בהיר-חושך של 12:12 שעות. בעלי החיים הספציפיים הללו, ללא פתוגן, התקבלו ממעבדות צ'ארלס ריבר (ראו טבלת חומרים). כל העכברים עברו תקופת הסתגלות של שבוע כדי להסתגל לסביבה החדשה לפני ההליכים הניסיוניים, עם גישה חופשית לאוכל מכרסמים ומים סטנדרטיים.

אזהרה: אספרגילוס פומיגאטוס הוא אורגניזם פתוגני שדורש בידוד ברמת בטיחות ביולוגית 2. כל תרביות הפטרייה חייבות להיות מטופלות בארון בטיחות ביולוגי מוסמך באמצעות ציוד מגן אישי מתאים, כולל כפפות, מעילי מעבדה והגנה על העיניים. דימתיל סולפוקסיד (DMSO) דליק ויכול לחדור לעור; לטפל בו באזורים מאווררים היטב ולהימנע ממגע ישיר. קטמין וקסילזין הם חומרים מבוקרים הדורשים אחסון מאובטח ותיעוד מתאים לפי תקנות מוסדיות.

הכנה ניסיונית
כל התגובות, התרופות והחומרים הנדרשים הוכנו בהתאם לתהליך הניסוי (ראו טבלת חומרים ואיור משלים 1 לסכמטי). תמיסות מקור ראסמית (±)-α-חומצה ליפואית (LA) הוכנו באמצעות חומצה α-ליפואית ראסמית (1,2-דיתיולן-3-פנטנואיק) שהומסו ב-DMSO לריכוז של 60 מ"מ ואוחסנו באליקווטים חד-פעמיים בטמפרטורה של -80°C למניעת פירוק חמצוני. מעכב Nrf2 ML385 ומעכב HO-1 SnPPIX הוכנו באופן דומה והופעלו לשימוש חד-פעמי כדי למנוע מחזורי הקפאה-הפשרה. כל מדיום תרבית התאים והתוספים הוכנו בתנאים סטריליים וחוממו מראש ל-37 מעלות צלזיוס לפני השימוש.

כל החומרים המזוהמים בתרביות פטריות, כולל לוחות אגר, צינורות תרבית ופלסטיקים חד-פעמיים, עברו אוטוקלב בטמפרטורה של 121 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לפני ההשלכה במיכלי פסולת ביולוגית. פסולת כימית המכילה ממסים אורגניים נאספה בנפרד והושמדה באמצעות פרוטוקולי בריאות ובטיחות סביבתית מוסדית. רקמות וגופות בעלי חיים נשרפו באמצעות שירותי פסולת ביו-רפואית מאושרים.

תרבית פטריות והכנת זיהום
Aspergillus fumigatus גודלו על אגר Saboraud dextrose בטמפרטורה של 37°C במשך 5-7 ימים עד שנצפתה היווצרות קונידיאלית בוגרת. קונידיות נקטפו על ידי הצפת תרביות בוגרות עם תמיסת מלח סטרילית עם בופר עם פוספט (PBS) המכילה 0.05% Tween-80, ותליות קונידיאליות סיננו דרך גזה סטרילית להסרת שברי היפאל. הריכוז הקונידיאלי נקבע באמצעות המוציטומטר והותאם לריכוזים שנקבעו בהתבסס על מודלים של קרטיטיס פטרייתי שפורסמו. לניסויים במבחנה, נבחר 1 x 106 קונידיות למ"ל (ריבוי זיהום של 10:1) בהתבסס על מחקרים קודמים שהראו כי ריכוז זה מעורר תגובות דלקתיות חזקות בתאי אפיתל בקרנית, תוך שמירה על חיוניות תאית מספקת לניתוחים במורד הזרם16,17. למחקרים in vivo נבחרו 1 x 107 conidia/mL, שכן חיסון זה גורם לקרטיטיס עקבי בחומרה בינונית עם ציוני מחלה ניתנים לשחזור ביום החמישי לאחר ההדבקה, ומספק טווח דינמי מספק להערכת יעילות טיפולית ללא תמותה מופרזת16,19.

טיפול בבעלי חיים וזיהום בקרנית
בהרדמה כללית (הזרקה תוך-מוצקית של קטמין 100 מ"ג/ק"ג וקסילזין 10 מ"ג/ק"ג), נגרם קרטיטיס פטרייתי על ידי יצירת שלושה שריטות ליניאריות בעובי 1 מ"מ על הקרנית המרכזית באמצעות מחט סטרילית של 25G, ולאחר מכן יישום מקומי של 5 מיקרוליטר של השעיה קונידיאלית של A. fumigatus . העכברים חולקו באקראי לקבוצות טיפול (n=8 לכל קבוצה): ביקורת (לא נגועה), קבוצת ביקורת נגועה, נגועים + טיפול ב-LA (60 מיקרומול/L 4 פעמים ביום), וטיפול נגוע + LA + SnPPIX (LA ועוד 5 מ"ג/ק"ג SnPPIX תוך-פריטונית ביום). הערכה קלינית ואיסוף רקמות בוצעו ביום החמישי לאחר ההדבקה.

אמצעי זהירות לטיפול בבעלי חיים: כל ההליכים הכוללים בעלי חיים מורדמים צריכים להתבצע בתנאים אספטיים. יש לעקוב באופן רציף אחרי בעלי חיים במהלך ההרדמה לדיכוי נשימתי. סילוק מצעים מזוהמים, פסולת ניתוחית ורקמות נגועות באמצעות אוטוקלאב ואחריו שריפה, בהתאם לפרוטוקולי ניהול פסולת ביולוגית מוסדית.

תרבית תאים וטיפול
תאי אפיתל קרנית אנושיים (HCECs) נאספו מ-ATCC ונשמרו במדיום DMEM/F-12 עם תוספת של 10% סרום בקר עוברי, 1% פניצילין-סטרפטומיצין ו-1% L-גלוטמין בריכוזים אקווימולריים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באטמוספירה לחה של 5% CO₂. התאים עברו תרבית משנה כל 3-4 ימים לאחר ההגעה למפגש של 80%-90% ושימשו בין המעברים 3-8 כדי להבטיח עקביות. לטיפולים ניסיוניים, התאים זרעו בכמות של 5 על 10⁴ תאים לכל באר בצלחות מתאימות והותרכו להידבק במשך 24 שעות לפני הטיפול. בכל הניסויים המכניסטיים במבחנה , נחשפו תחילה ל-Aspergillus fumigatus conidia ביחס רב-זיהום (MOI) של 10:1 במשך 4 שעות כדי לבסס זיהום, ולאחר מכן נוספו LA (60 מיקרומון), ML385 (5 מיקרומון) או SnPPIX (1 מיקרומון) לבדו או בשילוב למשך 24 שעות נוספות לפני איסוף הדגימה. עיצוב רציף זה מאפשר הערכת ההשפעות הטיפוליות של LA על אתגר פטרייתי מבוסס במקום טיפול מונע במיוחד.

הערכת קיום תאים (ניתוח CCK-8)
כחיות התאים הוערכה באמצעות ערכת ספירת תאים-8 (CCK-8). התאים נזרעו בלוחות של 96 בארות בגודל 5 על 10,4 תאים בכל באר ודגרו במשך 24 שעות לפני הטיפול. לאחר החשיפה לתרופות, נוספו 10 מיקרוליטר תמיסת CCK-8 לכל באר, והצלחות נדגרו למשך שעתיים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. הספיגה נמדדה ב-450 ננומטר באמצעות קורא מיקרופלט רב-מצב. כל תנאי ניסוי בוצע באוקטופליקט, והניסויים חזרו על עצמם שלוש פעמים באופן עצמאי. ריכוז בקרת הרכב (DMSO) נשמר מתחת ל-0.1% כדי למנוע השפעות ציטוטוקסיות.

חילוץ RNA ו-PCR כמותי בזמן אמת
סך ה-RNA בודד מתאים מתורבתים ורקמות קרנית באמצעות ערכת RNeasy Mini בהתאם לפרוטוקול היצרן. דגימות רקמה הומוגנו בבופר RLT באמצעות הומוגניזר רקמתי למשך 2 דקות ב-50 הרץ. איכות וריכוז ה-RNA הוערכו באמצעות ספקטרופוטומטר, כאשר דגימות עם יחס 260/280 של 1.8-2.0 שימשו לניתוח במורד הזרם. סינתזת cDNA בגדיל ראשון בוצעה באמצעות ערכת שעתוק הפוכה cDNA בעלת קיבולת גבוהה עם RNA כולל של 1 מיקרוגרם בכל תגובה. PCR כמותי בוצע באמצעות תערובת מאסטר qPCR מבוססת SYBR Green על מערכת PCR בזמן אמת עם דנאטורציה ראשונית ב-95 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות, ואחריה 40 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות ו-60 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת. בוצע ניתוח עקומת ההתכה כדי לאמת את ספציפיות האמפליקון. כל הפריימרים אומתו ליעילות (90%-110%) ולספציפיות לפני השימוש. הביטוי היחסי של mRNA חושב באמצעות שיטת 2(-ΔΔCT) עם GAPDH כגן ייחוס.

הפקת חלבון וניתוח ווסטרן בלוט
לצורך הפקת חלבון מלאה, תאים ורקמות עברו פירוק בבופר RIPA שהושלמו עם קוקטיילי מעכבי פרוטאז ופוספטאז. חלקי חלבון גרעיניים וציטופלזמיים הוכנו באמצעות תגובות NE-PER לחילוץ גרעיני וציטופלזמי בהתאם לפרוטוקול היצרן. ריכוזי החלבון נקבעו באמצעות מבחן ברדפורד. כמויות שוות של חלבון (30-50 מיקרוגרם) הופרדו על ידי SDS-PAGE והועברו לממברנות PVDF. לאחר חסימה עם 5% חלב דל שומן בתמי מלח טריס-בופר המכיל 0.1% טווין-20 למשך שעה אחת, הממברנות דוגרו בנוגדנים ראשוניים במהלך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן נוגדנים משניים מצומדים ל-HRP למשך שעה בטמפרטורת החדר. רצועות החלבון הוצגו באמצעות תגובת כימילומינסנציה משופרת עם זמני חשיפה של 30-180 שניות בהתאם לעוצמת האות. הרצועות נמדדו באמצעות תוכנת ImageJ, כאשר β-אקטין שימש כבקר עומס לחלבונים כוללים ולמין B1 לחלבונים גרעיניים.

הערכה קלינית וניתוח היסטולוגי
חומרת מחלת הקרנית הוערכה באמצעות מערכת ניקוד קלינית סטנדרטית המבוססת על פרוטוקולים מבוססים לקרטיטיס פטרייתיעכברי 22. מערכת הניקוד מעריכה שלושה פרמטרים בסולם 0-4: אטימות קרנית (0 = נקי, 4 = אטום לחלוטין), אי-סדירות על פני השטח (0 = חלק, 4 = כיב חמור עם חור), ותגובה דלקתית (0 = אין חדירה, 4 = חדירה צפופה עם היפופיון), ומניבה ציונים כוללים מ-0 עד 12. כל ההערכות הקליניות בוצעו על ידי שני צופים עצמאיים שהיו עם מסכות לקבוצות הטיפול, כאשר ההסכמה בין הצופים עברה את 90%. תמונות הקרנית צולמו באמצעות מיקרוסקופ מנורה חריצית המצויד במצלמה דיגיטלית. לצורך ניתוח היסטולוגי, העיניים עברו מחלקה מחדש, קיבעו ב-4% פאראפורמלדהיד, הוטמעו בפרפין, וחתכו בעובי 5 מיקרון. החתכים צובקו בהמטוקסילין ואאוזין להערכת מורפולוגיה כללית.

מבחן אימונוסורבנט מקושר באנזימים (ELISA)
רמות מופרשות של IL-1β ו-TNF-α בסופרנטנטים של תרביות תאים ובהומוגנטים של רקמת הקרנית נמדדו באמצעות ערכות ELISA מסחריות לפי הוראות היצרן. סופרנטנטים של תרביות תאים נאספו לאחר 24 שעות טיפול, בעוד שרקמות הקרנית הומוגניזציה ב-PBS המכילים מעכבי פרוטאז. הדגימות צנטריפוגות בעוצמה של 12,000 x גרם למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, ונעשה שימוש בסופרנטנטים לניתוח ELISA. כל הדגימות נותחו בשכפול, וריכוזי הציטוקינים חושבו מעקומות סטנדרטיות.

ניתוח סטטיסטי
כל הניסויים בוצעו עם שכפולים ביולוגיים מתאימים (n ≥6 למחקרים במבחנה , n =8 למחקרים בבעלי חיים) וחזרו על עצמם לפחות פי 3 באופן עצמאי. הנתונים מוצגים כממוצע ± שגיאת תקן של הממוצע (SEM). ניתוח הנתונים בוצע באמצעות גרסה 9.0 של GraphPad Prism. באופן ספציפי, השתמשנו בפונקציית בדיקת נורמליות (שפירו-וילק) להערכת התפלגות הנתונים, ב-ANOVA חד-כיווני עם מבחן ההשוואות המרובות של טוקי לניסויים עם יותר משתי קבוצות, ובמבחן t הלא מזווג של סטודנט להשוואות בין שתי קבוצות. גרפים נוצרו כתרשימי עמודות מקובצים עם נקודות נתונים בודדות שהונחו כגרפים פיזור, כאשר פסי השגיאה מייצגים את השגיאה הסטנדרטית של הממוצע.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

תהליך העבודה הניסיוני הראה כי טיפול בחומצה ליפואית מווסת ביעילות את מסלול האיתות Nrf2/HO-1 כדי לדכא דלקת במודלים של קרטיטיס פטרייתית.

הערכת ציטוטוקסיות של חומצה ליפואית ומעכבים ספציפיים למסלול
נערכו מחקרי מינון-תגובה ראשוניים כדי לקבוע ריכוזים אופטימליים לכל תרכובת ששימשה במחקר זה. LA הפגין תאימות ביו-תאימות מצוינת עם HCECs, ושומר על חיוניות תאים בריכוזים של עד 60 מיקרומום לאחר חשיפה של 24 שעות, מה שהפך לריכוז האופטימלי של LA למחקרים מכניים מאוחרים יותר (

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הממצאים הנוכחיים מאשרים את החומצה הליפואית (LA) כגורם חזק לציר Nrf2/HO-1 שמקל על דלקת קרטיטיס פטרייתית (FK) על ידי צמצום ביטוי ציטוקינים פרו-דלקתיים ושימור ארכיטקטורת הקרנית. בהתאם למחקרים עדכניים שהראו הפעלה חזקה של Nrf2 על ידי תרכובות דיתיולאן בהפרעות חמצוניות15, LA גרם לעלייה פי חמישה בתמלילי HO-1 והפחית את הפרשת IL-1β/TNF-α בחצי, תוך שיפור במספר מפעילים פיטוכימיים שדווחו לדלקת עינית 2,23. מחקרים עדכניי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין ניגודי עניינים הקשורים לעבודה זו. לא מימון חיצוני או קשרים מסחריים השפיעו על העיצוב, הביצוע או הפרשנות של המחקר.

תודות

מחקר זה נתמך במימון פנימי מהמחלקה לאופתלמולוגיה, בית החולים העממי השני של ג'ינאן. המחברים מודים בהכרת תודה על הסיוע הטכני שמספק צוות המעבדה לתחזוקת תרביות תאים ונהלי מודלים של בעלי חיים. תודה מיוחדת לוועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים המוסדית על סקירת ואישור הפרוטוקולים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אנטי-HO-1טכנולוגיית איתות סלולרי, דנברס, מסצ'וסטס, ארה"ב#8803
אנטי-&בטא;-אקטיןסיגמא-אלדריץ', סנט לואיס, מיזורי, ארה"בA5441
אנטי-למין B1אבקאם, קיימברידג', מסצ'וסטס, ארה"בab16048
אנטי-Nrf2אבקאם, קיימברידג', מסצ'וסטס, ארה"בab62352
Aspergillus fumigatus204305 ATCCלא זמין
ערכת מבחן ברדפורדמעבדות ביו-ראד5000006
עכברים C57BL/6מעבדות צ'ארלס ריברלא זמין
ערכת ספירת תאים-8 (CCK-8)מעבדות דוג'ינדו, קומאמוטו, יפן343-07623
DMEM/F-12 בינוניגיבקו, תרמו פישר סיינטיפיק11320033
DMSOסיגמא-אלדריץ'D2650
מגיב ECLתרמו פישר סיינטיפיק32106
סרום בקר עובריגיבקו, תרמו פישר סיינטיפיק16000044
פריימר קדימה של GAPDHסינתזה מותאמת אישיתמנהג
GlutaMAXגיבקו, תרמו פישר סיינטיפיק35050061
ערכת שעתוק הפוך cDNA בקיבולת גבוההמערכות ביולוגיות יישומיות, תרמו פישר סיינטיפיק4368814
HO-1 Forward Primerסינתזה מותאמת אישיתמנהג
פריימר הפוך HO-1סינתזה מותאמת אישיתמנהג
IgG אנטי-עכבר מצומד HRPאבקאם, קיימברידג', מסצ'וסטס, ארה"בab205718
IgG אנטי-ארנב מצורף-HRPאבקאם, קיימברידג', מסצ'וסטס, ארה"בAB205719
תאי אפיתל בקרנית אנושיים (HCECs)ATCC, מנאסס, וירג'יניה, ארה"בCRL-11135
IL-1 ובטא; ערכת אליסהR& D Systems, מיניאפוליס, מינסוטה, ארה"בDY201
חומצה ליפואית (LA)סיגמא-אלדריץ', סנט לואיס, מיזורי, ארה"בT1395
ML385 (מעכב Nrf2)MedChemExpress, מונמות' ג'נקשן, ניו ג'רזי, ארה"בHY-100523
ספקטרופוטומטר NanoDrop 2000תרמו פישר סיינטיפיקND-2000
תגובות חילוץ גרעיניות וציטופלזמיות של NE-PERתרמו פישר סיינטיפיק78833
פריימר קדמי Nrf2סינתזה מותאמת אישיתמנהג
פריימר הפוך של Nrf2סינתזה מותאמת אישיתמנהג
PBS עם 0.05% Tween-80הכנה מותאמת אישיתמנהג
פניצילין-סטרפטומיציןגיבקו, תרמו פישר סיינטיפיק15140122
PowerUp SYBR Green Master Mixמערכות ביולוגיות יישומיות, תרמו פישר סיינטיפיקA25741
מערכת PCR בזמן אמת QuantStudio 5תרמו פישר סיינטיפיקA28140
בופר RIPAהכנה מותאמת אישיתמנהג
ערכת מיני RNeasyקיאגן, הילדן, גרמניה74104
אגר סאבורו דקסטרוזהכנה מותאמת אישיתמנהג
ביומיקרוסקופ מנורת חריץציוד מותאם אישיתלא זמין
SnPPIX (מעכב HO-1)פרונטיר סיינטיפיק, לוגן, יוטה, ארה"בF6140
קורא מיקרופלט רב-מצבי Synergy HTXBioTek Instruments, ווינוסקי, ורמונט, ארה"בSYNHXTTR
TBS-T (0.1% טווין-20)הכנה מותאמת אישיתמנהג
TissueLyser LTקיאגן69980
TNF-α ערכת אליסהR& D Systems, מיניאפוליס, מינסוטה, ארה"בDY210

מקורות

  1. Kam, K. W., Rao, S. K., Young, A. L. The diagnostic dilemma of fungal keratitis. Eye. 37 (3), 386-387 (2023).
  2. Shaikh, N. R., Choudhary, K. G. Fungal keratitis- an update on the global threat. Int J Adv Res. 11 (03), 51-55 (2023).
  3. Lambert, L. H., Finger, G. E., Tompkins, B. L. Case Report: Vision-Threatening Fungal Keratitis in a Service Member Stationed at Guantanamo Bay. Military Med. 189 (1-2), 379-383 (2023).
  4. Arboleda, A., Ta, C. N. Overview of Mycotic Keratitis. Cornea. 43 (9), 1065-1071 (2024).
  5. Gautam, M., et al. An Emerging Global Threat of Mycotic Keratitis Caused by Uncommon Fungal Species: A Systematic Review and Meta-Analysis. Transl Vis Sci Technol. 14 (4), 4(2025).
  6. Qiu, S., et al. Natamycin in the treatment of fungal keratitis: a systematic review and Meta-analysis. Int J Ophthalmol. 8 (3), 597-602 (2015).
  7. Hoffman, J. J., et al. Topical Chlorhexidine 0.2% versus Topical Natamycin 5% for the Treatment of Fungal Keratitis in Nepal: A Randomized Controlled Noninferiority Trial. Ophthalmology. 129 (5), 530-541 (2022).
  8. Prajna, N. V., et al. Patterns of Antifungal Resistance in Adult Patients With Fungal Keratitis in South India: A Post Hoc Analysis of 3 Randomized Clinical Trials. JAMA Ophthalmol. 140 (2), 179-184 (2022).
  9. Khalil, A. S., Baioumy, S. A., Hegab, M. A., Khairy, M. A., Ali, A. G. Temporary Conjunctival Flap Plus Medical Treatment Versus Medical Treatment Only for High-Risk Fungal Keratitis: A Randomized Controlled Trial. Cornea. 44 (7), 866-873 (2025).
  10. Wang, B., et al. Oxidative Stress Initiates Receptor-Interacting Protein Kinase-3/Mixed Lineage Kinase Domain-Like-Mediated Corneal Epithelial Necroptosis and Nucleotide-Binding Oligomerization Domain-Like Receptor Protein 3 Inflammasome Signaling during Fungal Keratitis. Am J Pathol. 193 (7), 883-898 (2023).
  11. Barnes, T. C., Anderson, M. E., Edwards, S. W., Moots, R. J. Neutrophil-derived reactive oxygen species in SSc. Rheumatology (Oxford). 51 (7), 1166-1169 (2012).
  12. Mendoza-Martínez, A. E., Cano-Domínguez, N., Aguirre, J. Yap1 homologs mediate more than the redox regulation of the antioxidant response in filamentous fungi. Fungal Biol. 124 (5), 253-262 (2020).
  13. Zhang, Y. N., Ouyang, W. J., Hu, J. Y., Liu, Z. G. Targeting Nrf2 signaling in dry eye. Int J Ophthalmol. 17 (10), 1911-1920 (2024).
  14. Wang, M. X., et al. Potential Protective and Therapeutic Roles of the Nrf2 Pathway in Ocular Diseases: An Update. Oxid Med Cell Longev. 2020, 9410952(2020).
  15. O'Rourke, S. A., Shanley, L. C., Dunne, A. The Nrf2-HO-1 system and inflammaging. Front Immunol. 15, 1457010(2024).
  16. Fan, Y., et al. Perillaldehyde Ameliorates Aspergillus fumigatus Keratitis by Activating the Nrf2/HO-1 Signaling Pathway and Inhibiting Dectin-1-Mediated Inflammation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 61 (6), 51(2020).
  17. Luan, S., et al. Gallic Acid Ameliorates Aspergillus fumigatus Keratitis Through Reducing Fungal Load and Suppressing the Inflammatory Response. Invest Ophthalmol Vis Sci. 63 (12), 12(2022).
  18. Gu, L., et al. Hydroxytyrosol downregulates inflammatory responses via Nrf2/HO-1 axis during fungal keratitis and exerts antifungal effects. Int Immunopharmacol. 149, 114202(2025).
  19. Yu, B., et al. Ebselen improves fungal keratitis through exerting anti-inflammation, anti-oxidative stress, and antifungal effects. Redox Biol. 73, 103206(2024).
  20. Liu, X., et al. Macrophage Membrane-Coated Nanoparticles for the Delivery of Natamycin Exhibit Increased Antifungal and Anti-Inflammatory Activities in Fungal Keratitis. ACS Appl Mater Interf. 16 (44), 59777-59788 (2024).
  21. Liu, F., et al. Synergistic wall digestion and cuproptosis against fungal infections using lywallzyme-induced self-assembly of metal-phenolic nanoflowers. Nat Comm. 15 (1), 9004(2024).
  22. Leal, S. M., et al. Distinct Roles for Dectin-1 and TLR4 in the Pathogenesis of Aspergillus fumigatus Keratitis. PLoS Pathogens. 6 (7), e1000976(2010).
  23. Awad, R., Ghaith, A. A., Awad, K., Mamdouh Saad, M., Elmassry, A. A. Fungal Keratitis: Diagnosis, Management, and Recent Advances. Clin Ophthalmol. 18, 85-106 (2024).
  24. Qu, S., Zheng, S., Muhammad, S., Huang, L., Guo, B. An exploration of the ocular mysteries linking nanoparticles to the patho-therapeutic effects against keratitis. J Nanobiotechnol. 23 (1), 184(2025).
  25. Kim, L. N., Karthik, H., Proudmore, K. E., Kidd, S. E., Baird, R. W. Fungal Keratitis, Epidemiology and Outcomes in a Tropical Australian Setting. Trop Med Infect Dis. 9 (6), (2024).
  26. Puumala, E., Fallah, S., Robbins, N., Cowen, L. E. Advancements and challenges in antifungal therapeutic development. Clin Microbiol Rev. 37 (1), e0014223(2024).
  27. Yagishita, Y., Gatbonton-Schwager, T. N., McCallum, M. L., Kensler, T. W. Current Landscape of NRF2 Biomarkers in Clinical Trials. Antioxidants (Basel). 9 (8), (2020).
  28. Li, X., et al. Developing the biomarker panels and drugs by proteomic analysis for autoimmune uveitis and posterior scleritis. iScience. 27 (12), 111389(2024).
  29. Jin, K., Zhang, C. Personalized Medicine in Ophthalmic Diseases: Challenges and Opportunities. J Pers Med. 13 (6), (2023).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

מסלול Nrf2ביטוי HO-1עקה חמצוניתדלקת בקרניתטיפול מכוון למארחתגובה נוגדת חמצוןדיכוי ציטוקינים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.