מאמר שיטה

בידוד סטנדרטי והכנה ציטוקינים של תאי סטרומל מזנכימיים שמקורם במח עצם עכברי לשיפור מודולציה חיסונית

DOI:

10.3791/69397

⸱

5 בדצמבר 2025

 ,  , 
1Molecular and Cellular Biology Laboratory, ICMR-National Institute for Research in Reproductive and Child Health, Indian Council of Medical Research (ICMR), 2Department of Medicine and Carbone Cancer Center, University of Wisconsin in Madison

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן אנו מדגים פרוטוקול לבידוד תאי סטרומל מזנכימיים שמקורם במח עצם העכברים, יחד עם שיטת פריימינג ציטוקינים להעצמת ההשפעה המדכאת חיסון של BMSCs על תאי מערכת החיסון.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאי סטרומל מזנכימליים (MSCs) מחזיקים בתפקוד רגנרטיבי ואימונומודולטורי חזק. תכונות אלו הופכות את MSC לתרופות תאיות עוצמתיות לטיפול בהפרעות חיסוני מרובות. מח עצם הוא המקור העיקרי והנפוץ ביותר ל-MSCs. מחקרים מכניים פרה-קליניים המשתמשים במודלים של עכברים חיוניים לרכישת ידע על אסטרטגיות אספקת תרופות אופטימליות ל-BMSCs בניסויים קליניים בבני אדם. לכן, סטנדרטיזציה של תהליך הייצור של MSCs בעכברים היא גם קריטית להשגת תוצאות טיפוליות טובות יותר. מטרה מרכזית של פרוטוקול זה היא להראות כיצד פריימינג מבוקר של אינטרפרון-גמא (IFN-γ) משפר את התכונות המדכאות החיסון הפנימיות של BMSCs. אנו מתארים את יצירת מדיה מותנית (CM) מ-BMSCs לא מטופלים או מורשים מראש עם IFN-γ ומעריכים את פעילותם הביולוגית באמצעות מקרופאגים פריטונאליים ראשוניים. באמצעות ELISA ופרופילינג זרימה-ציטומטרי, הפרוטוקול מפרט כיצד הסקרטום שמקורו ב-BMSC – במיוחד כאשר הוא מוכן עם IFN-γ – מפעיל קיטוב מקרופאגים אנטי-דלקתיים המאופיין בייצור מוגבר של IL-10 וסמנים על פני שטח הקשורים ל-M2. בסך הכול, פרוטוקול זה יוצר מסגרת מאוחדת לייצור BMSCs עכבריים עקביים פונקציונלית ולהערכת עוצמת האימונומודולציה שלהם. על ידי הפחתת שונות טכנית ומתן בהירות ויזואלית ופרוצדורלית, היא תומכת בשיפור השחזוריות במחקר MSC פרה-קליני ומסייעת באסטרטגיות פריסת MSC אופטימליות למחקרים תרגומיים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאי סטרומל מזנכימיים שמקורם במח עצם (BMSCs) משמשים באופן נרחב הן במחקרים פרה-קליניים והן במחקרים קליניים. האימונוגניות הנמוכה שלהן, הנגישות הקלה ויכולת ההבדלה הרב-שושלתית הופכות את ה-BMSCs למועמדים מבטיחים לשימוש בסביבות קליניות כתרופות תאיות 1,2,3. התכונות המדכאות והמתחדשות שלהן נוצלו רבות במחקרים קליניים לטיפול בהפרעות דלקתיות כגון מחלת השתל נגד המארח (GVHD)4, אלח דם5, ומחלת מעי דלקתית (IBD)6. נישת סטרומל מח העצם מורכבת מאוכלוסיית תאי סטרומל הטרוגניים. עם זאת, כל ה-MSCs עומדים בקריטריונים שהוגדרו על ידי האגודה הבינלאומית לטיפול תאי (ISCT), הכוללים: היצמדות פלסטית, ביטוי קולטנים על פני השטח – CD73, CD90 ו-CD105 בבני אדם, ו-CD29, CD44 ו-CD90 בעכברים – ללא ביטוי של סמנים המטופואטיים או אנדותליים – CD11b, CD14, CD19, CD34, CD45, CD79a, HLA-DR, והיכולת לאדיפוגני, הבחנה כונדרוגנית, או אוסטאוגנית7.

BMSCs נשארים מתפקדים באמצעות שחרור גורמים פרקריניים הידועים יחד כסקרטום, הכוללים ציטוקינים, כימוקינים, גורמי גדילה, ווסיקולות חוץ-תאיות ומולקולות מסיסות ותלויות במגע נוספות 8,9. הסקרטום של ה-MSCs מווסת את הנישה על ידי אינטראקציה עם מרכיבי מערכת החיסון המולדת באופן דו-כיווני10. גורמים המשתחררים במהלך אינטראקציות בין MSCs למקרופאגים יכולים להזיז את המקרופאגים לכיוון פנוטיפ פרו-דלקתי או אנטי-דלקתי11,12. לעומת זאת, המצב התפקודי של תאי MSC מוסדר גם על ידי תאי חיסון מקומיים – במיוחד מקרופאגים – דרך מנגנוני משוב11. השיח המשולב בין ה-MSC למקרופאגים הוא חיוני לתפקוד המדכא החיסון של MSCs. MSCs המועברים באופן אימוץ מפחיתים דלקת רקמה רק כאשר יש מקרופאגים, כפי שנצפה במודלים של עכברי קוליטיס. לעומת זאת, האינטראקציה של MSCs עם לימפוציטים מסוג B או T בהיעדר מקרופאגים אינה מספיקה כדי להפעיל את השפעתם הטיפולית13.

הניסוי הקליני הראשון בשלב III שהשתמש ב-BMSCs אלוגניים הושלם על ידי Osiris Therapeutics בארצות הברית לטיפול ב-GVHD עמיד לסטרואידים (NCT00366145)1. מאז, נערכו מחקרים פרה-קליניים וקליניים רבים, אם כי הצלחת הניסויים הקליניים לא עמדה בציפיות המבוססות על תוצאות פרה-קליניות. כדי לשפר את שיעור ההצלחה של ניסויים קליניים מבוססי MSC, אופטימיזציה של אסטרטגיות פריסת התרופות היא חיונית. הבנת מסלול המשלוח האופטימלי, מינון התאים הטיפולי והמצב הפיזיולוגי של התאים בנקודת הטיפול היא קריטית. לדוגמה, במודל עכבר עם קוליטיס ב-in-vivo , מחקרים הראו כי MSCs שמורת קריופיקציה או מתן תוך-ורידי הם שיטות לא אופטימליות למתן14.

גישות שונות, כמו רישוי מוקדם של ציטוקינים, שינוי גנטי או קדם-התניה היפוקסית, נחקרו רבות לשיפור ההתמדה והתועלת הטיפולית של MSCs בחיים 15. במודל איסכמיה של גפיים אחוריות בעכברים, קדם-התניה של היפוקסיה (2% O2) שיפרה את יכולת ההתרבות והנדידה של MSCs באמצעות ביטוי מוגבר של חלבון הלם חום, חלבון מבוקר גלוקוז 78-kD (GRP78)16. רישוי מוקדם של IL-1β (אינטרלוקין-1 בטא) מגביר את יכולת ה-MSCs להשתמש בנויטרופילים, מונוציטים, לימפוציטים ואאוזינופילים17. לאחר הלידה ב-IVVO, MSCs נחשפים לתאי T ו-NK מופעלים שמקורם ב-IFNγ, מה שמגביר את ייצור האינדולאמין 2,3-דיאוקסיגנאז (IDO) על ידיMSCs 18. IDO הוא מרכיב חיוני בסיקרטום של MSCs, שמפחית את קצב רביית תאי T. מעניין לציין כי יכולת הדיכוי החיסונית של MSCs פוחתת כאשר הם מעובדים יחד עם לימפוציטים T שמקורם בעכבריםIFNγ 19. מחקרים זיהו כי רישוי מוקדם של IFN-γ מפחית את שיעור האפופטוזיס המתווך על ידי תאי T ב-MSCs מוקפאים13,20. פריימינג IFNγ משפר את התוצאה הטיפולית של BMSCs13. כל הראיות הללו מצביעה יחד על התפקיד ההכרחי של IFNγ בייצור MSCs מדכאי חיסון חזקים יותר.

כדי לקבוע את שיטת האספקה היעילה ביותר של MSCs, נעשה שימוש נרחב במודלים של בעלי חיים בשל נגישותם האתית. כדי להפחית שונות בתוצאות טרום-קליניות, חשוב לקבוע שיטה אופטימלית לתהליך הייצור של ה-MSCs שתבטיח תפוקה גבוהה, חיוניות תאים ועקביותלאורך זמן. המעבר של MSC הוא משתנה חשוב שיכול להוביל לתוצאות טיפוליות שונות. במהלך גידול חוץ-גופית , מעבר יכול לווסת את האפיון והעוצמה של MSCs, ואחרי מספר מסוים של מעברים, התאים הופכים להזדקנים22. לכן, בכל מחקר קליני או פרה-קליני, חשוב להיות עקביים בשימוש במספר המעבר של MSC. באופן דומה, עקביות עם פרוטוקול מסוים לבידוד MSC היא גם גורם מרכזי להשגת שחזוריות בתוצאות השימוש ב-MSCs. מבין גישות רבות, מיון תאים מבוססנוגדנים 23, שיטת סלקציה שלילית24, עיכול אנזימטי25 הן שיטות פופולריות לבידוד MSCs. עם זאת, היישום של שיטות אלו תלוי במקור, שכן שימוש לא נכון מפחית את התפוקה, העוצמה והיכולת להבדיל בשלושה קווים.

כאן, אנו מציגים פרוטוקול סטנדרטי לבידוד ואפיון של BMSCs, תוך הדגשת מספר המעבר המועדף, טכניקת הקפאה ואיסוף מדיות המצב שמקורן ב-BMSC. אנו גם מספקים פרוטוקול לפריימינג MSC בתיווך IFN γ ולבסוף מדגימו מחקר השוואתי של האופן שבו מקרופאגים פריטונאליים מגיבים באופן שונה ל-BMSCs תקינים או IFN-γ מורשים מראש.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחקר הנוכחי בוצע באישור ובהתאם להנחיות ועדת האתיקה לבעלי חיים של ICMR-המכון הלאומי למחקר ברבייה ובריאות הילד (פרויקט IAEC מס' 09/23) ושל ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת ויסקונסין-מדיסון. עכברים נקבות C57Bl/6J בגילאי 6-8 שבועות, שגודלו והוחזקו בתנאים מסוימים ללא פתוגנים (SPF), שימשו למחקר הנוכחי.

הערה: פעלנו לפי פרוטוקולי הבטיחות הביולוגית שנקבעו על ידי ועדת הבטיחות הביולוגית המוסדית (IBSC) במהלך העבודה על מחקרי in vivo או in vitro . בקיצור, למחקר על בעלי חיים, שמרנו על טיפול עדין כדי להפחית לחץ וסיכון לפציעה. השתמשנו בציוד מגן מתאים, כגון משקפי בטיחות, כפפות, מעיל מעבדה, מסכה וכובע בופאנט חד פעמי. עבור חומרים כימיים ביו-מסוכנים כמו DMSO, השתמשנו בארון בטיחות ביולוגית לטיפול בכימיקלים. השתמשנו במיכל הפסולת הספציפי כדי להשליך תגובות ביולוגיות מסוכנות או חפצים חדים.

1. בידוד תאי סטרומל מזנכימליים מח עצם עכברו

הערה: לאחר איסוף הגפיים האחוריות, שאר השלבים צריכים להתבצע במכסה זרימה למינרי לתרבות רקמה, וטכניקות סטריליות אספטיות26.

  1. המית את העכבר באמצעות ניתוק צווארי הרחם, ואחר כך שטיפה יסודית של העכבר עם 70% אתנול. באמצעות מלקחיים עיניים, מכוננים בעדינות את עור הבטן בין שני מפרקי הירך של העכבר וחתכו בזהירות את העור עם מספריים.
  2. הפרדו את העור על ידי משיכה עדינה לכיוון כף הרגל. חתכו את מפרקי הירך והקרסול כדי לשחרר את שתי הגפיים האחוריות.
  3. העבירו במהירות את הגפיים האחוריות ל-DMEM קרח עם תוספת של 1x פניצילין/סטרפטומיצין ו-2% FBS כדי למנוע נזק לרקמות עד לתהליך הניתוח הבא.
  4. קח כל גפה אחורית בצלחת פטרי המכילה את המדיה הקרה כקרח. קילף בזהירות את השריר ורקמת החיבור מהירך והטיביה על ידי גירוד עדין של הדיאפיזיזה של העצם. העבר את העצם הנקייה לצלחת פטרי חדשה המכילה את המדיום הקר כקרח.
  5. נתק את עצם הירך והטיביה, ואחר כך בצע חתך בקצות הטיביה והירך ממש מתחת לסוף חלל מח העצם. הגן על חלל מח העצם בצורה מקסימלית במהלך הליך כריתת הירך והטיביה.
  6. קח מזרק סטרילי של 1 מ"ל עם מחט של 21 גרם ושאב את המדיה מהפלטת פטרי. עם מלקחיים סטריליים, החזקו את הירך שנחתכה והכניסו בעדינות את המחט לחלל מח העצם. שטוף את חלל מח העצם כדי לקבל את מח העצם. חזור על השלב הזה עד שהעצם הופכת לבנה. שטוף את הטיביה באותו אופן.
  7. הפיפט בעדינות פנימה והחוצה כדי לפזר את גושי התאים בצלחת הפטרי. באמצעות רשת סינון בקוטר 70 מ"מ, סנן את תליית התא כדי להסיר חלקיקי עצם. אסוף את הסינון וצנטריפוגה אותו בטמפרטורה של 230 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  8. השליכו את הסופרנטנט ותחזירו את הכדור עם מדיום מלא (DMEM, 10% FBS, 5% L-גלוטמין, פניצילין וסטרפטומיצין). מדדו את התפוקה והחיוניות של תאים באמצעות הדרת Trypan Blue וספירה על ההמוציטומטר.
  9. זרעו את התאים בבקבוק 75 ס"מ2 שטופל בתרבות רקמה עם צפיפות תאים של 5000 תאים/סמ"ר במדיה DMEMמלאה 13. הסרת תאים המטופואטיים שאינם דבקים לאחר 48 שעות של תרבית על ידי החלפת המדיום. החלף את המדיה במדיה חדשה כל 3-4 ימים לסירוגין.
    הערה: השתמש בבקבוק תרבית תאים במקום צלחת כדי למנוע זיהום. אל תוציאו את הבקבוקון מהאינקובטור לעיתים קרובות כדי לבדוק את התאים, כי זה מפריע לצמיחת התאים.
  10. כדי לנתק את התאים הדבוקים, שטוף את התאים פעם אחת עם PBS, מוסיפים 0.25% טריפסין-EDTA, והשאירו את התאים בטריפסין במשך 5 דקות. זה עוזר לנתק את התאים מהבאר.
  11. הוסיפו מדיה מלאה, החזירו את ההשעה והצנטריפוגה ב-230 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. זרוק את הסופרנטנט. הוסיפו מדיום DMEM מלא לכדור, תלויים מחדש וזרעו מחדש את התאים בצפיפות של 5,000 תאים/ס"מ רבוע.
  12. העבירו את התאים מדי שבוע על ידי החלפת המדיום כל 3-4 ימים. לאחר הקטע השלישי, יש לבדוק את תרבית ה-MSC באמצעות ניתוח ציטומטרי זרימה כפי שמתואר בשלב 6. השתמש בתאי מעבר 3-5 לכל ניסוי.
    הערה: כדי לשמר את התאים בקריוציה לשימוש ניסיוני עתידי, צנטריפוגה את התאים בנפח הרצוי, החזירו את התאים למדיום הקפאה, אחסן 1 x10 6 תאים ב-1 מ"ל של מדיום הקפאה בכל קירור בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס במהלך הלילה, ולאחר מכן העבירו את התאים לחנקן לשימוש ארוך טווח.
    הרכב מדיום ההקפאה: 70% DMEM, 20% FBS, 10% DMSO.

2. הכנת מדיום מותנה מ-MSCs מתורבתים

  1. זרע את התאים בצפיפות של 5000 תאים/סנטימטר 2 בלוח 6 בארות. MSCs בתרבות עד 80% מהתכנסות (MSCs).
  2. אסוף את המדיה המותאמת מלוח תרבית התאים והצנטריפוגה בעוצמה של 230 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, לסנן ולהשתמש בטיפול.

3. הכנת מדיום מותנה עם פריימר IFNγ מ-MSCs מתורבתים

  1. זרע את התאים ב-6 לוחות בארות בצפיפות של 5000 תאים/סנטימטר רבוע. טפל בתאים ב-25 ng/mL IFNγ למשך 48 שעות. בצע מחקר תלוי במינון כדי לקבל את ההשפעה האופטימלית של IFNγ על MSCs. לניסוי זה, בחרו טווח של ריכוזי IFNγ, 5, 10, 25, 50, 100 ng/mL, כדי לקבל רישיון מוקדם ל-MSCs. ריכוזי 5 ו-10 ng/mL היו פחות יעילים משמעותית בקיטוב מקרופאג'ים, ו-25 ng/mL זוהו כרכוז האופטימלי (איור משלים 1).
  2. לאחר ניקוז המדיה המכילה IFN-γ, שטוף את הבאר פעמיים עם PBS כדי להבטיח הסרה מלאה של IFN-γ. כל IFN-γ שנותר עלול להפריע לתוצאת המחקר.
  3. דגרו את התאים לעוד 24 שעות במדיה DMEM רגילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר 24 שעות, אסוף את המדיה המותנית לפי שלב 2.

4. בידוד ותרבות של מקרופאגים שמקורם בחלל פריטונאלי

  1. הזרקו 5 מ"ל של PBS קר (עם 3% FBS) לחלל הפריטונאלי של העכברים, ואחריהם עיסוי עדין של הבטן.
  2. לשחזר את תמיסת ה-PBS באמצעות מזרק סטרילי. אספו בצינור של 10 מ"ל. צנטריפוגה את התמיסה בעוצמה של 300 x g למשך 5 דקות.
  3. הסר את הסופרנטנט. המיס את הכדור במדיה RPMI מלאה (RPMI, 10% FBS, 1x פניצילין וסטרפטומיצין). לוחן את התאים ב-5000 תאים לס"מ 2.
  4. הסר תאים לא דביקים לאחר 24 שעות ותרבית עד המפגש. השתמש בתאים לצורך הליכים ניסיוניים נוספים לפי הצורך.

5. מבחן אימונוסורבנט המקושר לאנזימים

  1. לזיהוי IL-10 שמקורו במקרופאגים שטופלו ב-BMSCs-CM, עקוב אחר השלבים הבאים.
    1. טפלו במאקרופאגים עם BMSCs-CM במשך 24 שעות ואספו את הסופרנטנט ביום הבא.
    2. מדוד את כמות ה-IL-10 באמצעות ערכת ELISA של IL-10 בהתאם להוראות היצרן.
  2. לזיהוי CCL2 שמקורו ב-BMSCs או BMSCs שטופלו ב-IFNγ, השתמשו בערכת CCL2 ELISA בהתאם להוראות היצרן.

6. ניתוח ציטומטריית זרימה עבור MSCs ופנוטיפינג של מקרופאגים

  1. זרע את התאים בלוח 6 בארות והפך אותו למפגש אחד. שטוף פעם אחת עם PBS (1 מ"ל) ואחריו טריפסיניזציה. הוסף טריפסין ב-0.25% ודגר 5 דקות בטריפסין כדי להרים את התאים לחלוטין מהצלחת.
  2. הוסף מדיה כדי לנטרל את פעילות הטריפסין. אסוף את התאים בצינור פוליסטירן בנפח 10 מ"ל. צנטריפוגה ב-300 x גרם ל-5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס למקרופאגים, ו-230 x גרם ל-5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס ל-BMSC.
  3. הסר את הסופרנטנט והחזיר את התאים ל-2 מ"ל של בופר צבע (PBS קר עם 2% FBS ו-0.05% אזיד). סובב ב-230 x g למשך 7 דקות. שחרור והפריע לכדור. הוסף 1 מ"ל צבע החיות Ghost red 780 ו-50 מ"ל של בופר FACS, תלווה אותו מחדש ומניח אותו בצינור הזרימה. תכתמו בחושך למשך 30 דקות.
  4. אחרי 30 דקות, שטוף את התאים עם 1 מ"ל של בופר צבעים. שחרור והפריע לכדור. הוסף נפח רצוי של נוגדן או איזוטיפ בקרה. דגר עוד 30 דקות בחושך. שטוף את התאים עם בופר צבע, דקנט, והחזיר את התאים ל-400 מ"ל של בופר צבע. צינור הדגימה מוכן לרכישה.
  5. כדי להכין שליטה בצביעת חיים ומתים, לאחר טריפסיניזציה וצנטריפוגה, יש להמיס את הכדור ב-2 מ"ל של בופר צבעים. הוצא 1 מ"ל מצינור מיקרוצנטריפוגה נוסף ולהוסיף לו 10 מ"ל DMSO כדי להרוג את התאים. מערבולת ודגירה למשך 10 דקות. עכשיו מערבבים זאת עם 1 מ״ל נוסף של תמיסה המכילה תא בצינור זרימה.
  6. הוסף 1 מ"ל של בופר צביעה וסובב ב-230 x גרם למשך 7 דקות. שחרור והפריע לכדור. הוסף 1 מ"ל צבע החיות Ghost red 780 ו-50 מ"ל של בופר FACS, תלווה אותו מחדש ומניח אותו בצינור הזרימה. תכתמו בחושך למשך 30 דקות. אחרי 30 דקות, שטוף את התאים עם 1 מ"ל של בופר צבעים. שחרור והפריע לכדור. תלה אותו ב-400 מ"ל של בופר כתמים. הדגימה המוכתמת בחיים מוכנה לרכישה.
    הערה: לצביעת מקרופאגים לעכברים, יש להוסיף שלב צביעה נוסף לפני פרוטוקול הצביעה הסטנדרטי. כדי למנוע אי-דיוק בנתוני הזרימה, חסימת קולטני FC היא שלב קריטי, שמונע קישור נוגדנים לא ספציפיים לקולטני Fc בתאים. כדי לחסום את קולטן ה-Fc, הוסף 1 מ״ל של תגובת חסימת Fc (נוגדן אנטי-עכבר מטוהר CD16/CD32) לתליית התא ודגירה למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. בצע את שלבי צביעת נוגדני הזרימה שנותרו מבלי לשטוף את תגובת חסימת ה-Fc.
  7. כדי לנתח את נתוני הזרימה, תחילה יש לבחור תאים בודדים בהתבסס על פרמטרי הפיזור הקדמי והפיזור הצדדי. שלב זה קריטי להסרת פסולת וחומרים של תאים. לאחר מכן התאים הבודדים יוסגרו על בסיס צביעת חיים ומתים. בצע ניתוח נוסף בהתבסס על אוכלוסיית התאים החיים (איור משלים 2).

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הסכמת הניסוי הכוללת מתוארת באיור 1. מח עצם העכבר נאסף הן מעצם הירך והן מהטיביה, נזרע, עובר וציטומטריית זרימה כפי שאופיין (איור 1A). נאספו מדיום מצב של BMSCs (BMSCs-CM) עם או בלי רישיון מוקדם IFNγ, וכמה מבחנות של BMSCs-CM אוחסנו בטמפרטורה של -80°C לצרכים ניסיוניים עתידיים (איור 1B).

תאים שמקורם במח עצם נספרו באמצעות המוציטומטר (איור 2A) וזרעו בצפיפות של 5000 תאים/סנטימטררבוע במדיה DMEM מלאה. לאחר 48 שעות, המדיום הראשון הוחלף, ואז המדיום הוחלף כל 3/4 ימים, עד לחיבור מלא. עברנו את התאים כאשר הם הגיעו ל-80% חיבור (איור 2B). בקטע 4, אפיינו תאים על בסיס ביטוי סמן ספציפי ל-MSC. התאים היו חיוביים ל-CD44, CD29 ו-CD90, ושליליים ל-CD45, CD11b ו-CD34 (איור 2C). BMSCs יכולים להתבדל לקווים אדיפוגניים, אוסטאוגניים וכונדרוגניים 14,27,28,29. זה שומר על הנחיות הזהות של האגודה הבינלאומית לטיפול תאי.

כדי להבין את ההשפעה המדכאת חיסון של MSCs-CM, טיפלנו במקרופאגים שמקורם בחלל הפריטונאלי (PMφ) וטיפלנו בהם ב-BMSCs-CM (איור 3A). ביצענו ניתוח ציטומטריית זרימה של מקרופאגים שטופלו ב-BMSCs-CM (איור 3B,C). מקרופאגים תושבים בחלל הפריטונאלי המותאמים לתרבות צוברו על ידי סמני משטח ספציפיים ל-M1 ו-M2. מנענו קשירת נוגדנים לא ספציפיים על ידי דגירה של מקרופאגים עם אנטי-עכבר מטוהר CD32/CD16 (Mouse Fc Block לפני הוספת נוגדני צביעה), לפני צביעת הסמנים התאיים בפועל. נחקרו ביטוי הסמנים הספציפיים ל-M1, CD86 ו-iNOS, ושל סמנים ספציפיים ל-M2, CD206 ו-CD163. התאים הוגדרו תחילה על בסיס הסמן ההמטופואטי CD45.2 (עבור C57BL6). IL-10 הוא הציטוקין המזוהה עם הפנוטיפ M2. IL-10 ששוחרר על ידי מקרופאגים שטופלו ב-MSCs-CM נמדד במחקר ELISA (איור 3D). מכיוון ש-LPS/IFNg גורמים לקיטוב M130, טיפול זה שימש כבקרה שלילית.

CCL2 הוא אחד הציטוקינים המזוהים בסקרטום של MSCs, שמפעיל קיטוב מקרופאגים13. CCL2 ששוחרר על ידי MSCs זוהה על ידי ELISA (איור 3E). כדי לאשר את תפקיד CCL2 בקיטוב המקרופאגים, טיפלנו במקרופאגים עם מעכב CCR2 ולאחר מכן בטיפול MSC-CM (איור 3F), וקיטוב המקרופאגים זוהה שוב במחקר ELISA של IL-10 (איור 3F).

התוצאות שלנו מראות בבירור שהסקרטום של ה-MSC יכול לגרום לקיטוב נוגד-דלקתי של מקרופאג'ים, כפי שניתן לראות בייצור מוגבר של IL-10 במקרופאגים שמקורם במעיים לאחר טיפול במדיה מותנית (איור 3).

איור 1
איור 1: תרשים זרימה למחקר. (A) עכברים C57BL/6 הושמתו. מח העצם נשטפ הן מהירך והן מהטיביה, עבר צנטריפוגה, וגודלו במשך שבוע עם מדיות שהחליפו כל 3 ימים. MSCs עברו ובמעבר 4 התאפיינו בציטומטריית זרימה ומחקר אדיפוגנזה. (B) MSCs במעבר 4 נזרעו בלוחות עם 6 בארות, בקבוצה אחת עם IFNγ בריכוז של 25 ng/mL, ובקבוצה אחרת נשמרו ללא טיפול. אחרי 48 שעות, החליפו במדיה DMEM מלאה וטרייה רגילה. אחרי 24 שעות, אסוף את המדיה מהצלחת, הצנטריפוגה ומהמסנן. אחסן את המדיה במצב ב-80 מעלות צלזיוס לשימוש עתידי. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 2
איור 2: אפיון פנוטיפי. (א) תאים שמקורם במח עצם נספרו באמצעות המוציטומטר לפני הזריעה. (ב) התאים הורשו לגדול עד למפגש של 80% לפני כל מעבר. (C) תאי מעבר 4 אופינו בניתוח ציטומטריית זרימה עם סמנים ספציפיים ל-MSC של העכברים. פס הסקאלה מייצג 100 מ"מ. איור 2C שונהמ-14. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 3
איור 3: ניתוח סיקרטום BM-MSC. (א) סכמטי הניסויים. (B) ניתוח ציטומטרי של גרף זרימה מייצגת של PMφ שטופל ב-MSC-CM. תאים שמקורם בפריטונאלי הוגדרו על בסיס אוכלוסיית הסמנים המטופואטיים החיוביים CD45.2. האוכלוסייה הנבחרת נצבעה עוד יותר בסמנים ספציפיים ל-M1 כמו CD86 או iNOS, סמנים ספציפיים ל-M2 CD206 או CD163, יחד עם צביעה כפולה של CD11b בכל מקרה. (ג) אחוז התאים של M1 או M2 נמדד. אוכלוסיית תאים שטופלה ב-LPS/IFNγ שימשה כביקורת שלילית. (D) ELISA בוצע לכימות IL-10 ששוחרר על ידי PMφ שמטופל ב-MSC-CM. ELISA בוצע לכימות (E) CCL2 ששוחרר על ידי MSC-CM, (F) IL-10 ששוחרר על ידי PMφ. כפי שמצוין באיור, סט אחד של ניסויים בוצע בנוכחות אנטגוניסט CCR2. פסי השגיאה מייצגים את הממוצע ± SEM. נתונים המייצגים 3 ניסויים עצמאיים עם 3 דגימות MSC לכל קבוצה. מבחן ה-t של הסטודנט שימש לביצוע ניתוח סטטיסטי של כל הניסויים. ∗p < 0.05, ∗∗p < 0.01, ∗∗∗p < 0.001, ∗∗∗∗p < 0.0001. איור 3B-F שונהמ-13. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור משלים 1: BMSCs קיבלו רישיון מוקדם עם 0, 5, 10, 25, 50, 100 ng/mL IFNG. מקרופאגים טופלו ב-MSCs-CM מורשים מראש IFNγ. ELISA בוצע לכימות IL-10 ששוחרר על ידי PMφ שטופל ב-MSC-CM. פסי השגיאה מייצגים את הממוצע ± SEM. נתונים המייצגים 3 ניסויים עצמאיים עם 3 דגימות MSC לכל קבוצה. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

איור משלים 2: (A-C) תאים בודדים נבחרו על פי פרמטרי פיזור קדמי ופיזור צדדי. (D) תאים בודדים הוגדרו על בסיס צביעת חיים ומתים. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בידוד תאי סטרומל מזנכימליים שמקורם במח עצם העכבר הוא טכניקה קריטית להבנת התכונות המדכאות החיסונית והרגנרטיביות הפנימיות של תאי MSC במודלים של בעלי חיים בחיים בתוך החיים . למרות שהשיטה נראית פשוטה וקלה למעקב, יש לבצע מספר שלבים בדיוק כדי למנוע זיהום חיידקי ולהבטיח תפוקה מיטבית של התאים. כל שלב בהליך צריך להתבצע באופן אספטי בסביבה נקייה מאוד.

כדי למנוע תפוקה נמוכה של תאים, בחרו עכברים בקבוצת הגיל 6-8 שבועות. בעת חיתוך קצות הירך והטיביה, יש להגן על חלל מח העצם ככל האפשר, ותהליך השטיפה צריך להיות יציב אך עדין כדי להבטיח חילוץ מלא של מח העצם. התאים המבודדים צריכים להיות מודגרים בריכוז CO₂ מתאים ובתנאים לחות. במהלך החלפת המדיה, חיוני לשטוף בעדינות את התאים עם מלח מפוזר פוספט (PBS) לפני החלפת המדיה כדי למנוע תאים המטופואטיים מזהמים. כדי למנוע זיהום בתאי המטופואטיקה, בזמן המעבר המחודש, יש לא לעלות על 5 דקות של טריפסיניזציה. בשלב המוקדם, שינוי המדיה לא אמור להיות מהיר מדי, שכן החלפת מדיה תכופה עלולה לגרום לזיהום חיידקי.

בכל מעבר, יש צורך לשמר את התאים בקריושימור במספר אצולות כדי לשמור על עקביות וזמינות. לפריימינג IFN-γ, יש לבצע ניסוי תלוי במינון כדי לקבוע את תנאי הרישוי המוקדמים היעילים ביותר למדיה המותאמת על ידי MSC. בניסויים שלנו בדקנו טווח של ריכוזי IFNγ, כלומר 5, 10, 25, 50, 100 ng/mL, כדי לקבל רישיון מוקדם ל-MSCs. לאחר מכן, זוהה 25 ng/mL כרכוז האופטימלי.

כדי לשמור על שלמות הנתונים, יש להשתמש בתאים ממספר קטע מסוים בעקביות לכל בדיקות ניסוי. לצורך אפיון ציטומטרי זרימה של MSCs, יש להשתמש בתאים ממעבר 3 ומעלה כדי להבטיח זיהוי אמין של ביטוי קולטני שטח. הבחנה בין תאים חיים/מתים במהלך צביעת ציטומטריית זרימה היא חיונית, שכן היא מפחיתה את הסיכוי לתוצאות שליליות שגויות.

התוצאות מייצגות מנגנון מרכזי שבאמצעותו BMSCs המועברים חיצונית מפחיתים דלקת במעיים במהלך קוליטיס. פריימינג IFN-γ משפר את השפעת המדיה המותאמת על MSC על קיטוב המקרופאגים. CCL2 המשתחרר מ-BMSCs הוא כימוקין קריטי הפועל על מקרופאגים כדי לגרום לקיטוב M2. הממצאים הקודמים שלנו הראו כי כימוקינים CCL2 ו-CXCL12 פועלים בשיתוף פעולה על מקרופאגים כדי לקדם את הקיטוב שלהם. אירוע זה חיוני להפצת איתות אנטי-דלקתי באמצעות ויסות נוסף של פנוטיפים של תאי T ותאי B13.

במחקר שלנו, עקבנו במיוחד אחרי פרוטוקול פשוט לבידוד BMSC, המבוסס על תכונת ההדבקה הפלסטית של MSCs. ניתן להשתמש במיון ציטומטריית זרימה או מיון אימונומגנטי כדי לבודד BMSCs בהתבסס על סימני משטח ספציפיים ל-MSC. עם זאת, בשתי השיטות הללו, קיימת אפשרות לאבד הרבה תאים במהלך הכנת הדגימה. מכיוון שמח עצם העכבר מכיל מספר נמוך מאוד של MSCs (מוערך בכ-0.001% עד 0.08% מתאי מח העצם), העדפנו את שיטת הבידוד הסטנדרטית המבוססת על תכונות פלסטיק. עם זאת, לשיטה זו יש כמה חסרונות. הסיכון העיקרי הוא זיהום תאי המטופואטיקה, שעשוי להפחית את היכולת הטיפולית של תאי MSC. לכן, זיהוי מספר מעבר מסוים הוא קריטי, כאשר אוכלוסייה משמעותית של תאים מבטאת קולטני שטח ספציפיים ל-MSC.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מימון ממלגת DBT/Wellcome Trust India Alliance לקריירה מוקדמת ל-J.G. כתב היד נושא את קרן NIRRCH ID: REV/1502/02-2023 של מעבדת DM. עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות, המכון הלאומי לסוכרת ומחלות עיכול וכליות, R01DK109508 פרס ל-J. Galipeau. מחקר זה נתמך גם על ידי מענק התמיכה P30 CA014520 של מרכז סרטן קרבון של אוניברסיטת ויסקונסין.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מכסה תרבית תאים עם זרימה למינרית אנכית, מצויד באור UV ו-nbsp;
מספריים כירורגיים סטריליים
25/75 ס"מ<שאפ>2 בקבוק 
מזרקים בגודל 5/10 מ"ל עם מחטים של 27G
מנות תרבות 6-well 
אקוטאזקורנינג#AT104
Anit-Mouse F4/80 APCביולג'נד#123116
אנטי-עכבר CD 11b PEBD PharMingen#557397
אנטי-עכבר CD 45.2 APCBD PharMingen#558702
אנטי-עכבר CD163 Percp eFluor710מדעי הביולוגיה האלקטרוניים#46-1631-80
אנטי-עכבר CD206 PEביולג'נד#141706
אנטי-עכבר CD86 FITCBD PharMingen#553691
אנטי-עכבר iNOS PE-Cy7מדעי הביולוגיה האלקטרוניים#25-5920-80
ערכת CCL2 ELISAInvitrogen#554722
אנטגוניסט CCR2 (RS 102895)סיגמא#R1903
צנטריפוגה 
DPBSקורנינג#21-031-CV
מדיום הנשר המותאם של דולבקו (DMEM)קורנינג# 10-013-CV
סרום בקר עובריסיגמא#F8067
רשת פילטר (70 מ"מ) 
צבע כדאיות אדום רפאים 780ביולוגיה של טונבו#13-0865-T100
IL-10 אליסה קיטInvitrogen#88-7105-88
L-גלוטמיןקורנינג#25-005-CI
מיקרוסקופ עם ציוד ניגודיות פאזה
Murine IFN וגמא;R& מערכות D#485-MI-100
פניצילין-סטרפטומיציןקורנינג#30-002-CI
עכברים נגד עכבר CD16/CD32BD PharMingen#553142
RPMImediumקורנינג#10-040-CV
מלקחיים כירורגיים סטריליים (ישרים ומעוקלים)
חממה מבוקרת טמפרטורה והרכב גז
טריפסיןקורנינג#25052-cl
אמבט מים עם שליטה בטמפרטורה

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Galipeau, J., Sensebe, L. Mesenchymal Stromal Cells: Clinical Challenges and Therapeutic Opportunities. Cell Stem Cell. 22, 824-833 (2018).
  2. Fan, X. L., Zhang, Y., Li, X., Fu, Q. L. Mechanisms underlying the protective effects of mesenchymal stem cell-based therapy. Cell Mol Life Sci. 77, 2771-2794 (2020).
  3. Pittenger, M. F., et al. Mesenchymal stem cell perspective: cell biology to clinical progress. NPJ Regen Med. 4, 22(2019).
  4. Kadri, N., Amu, S., Iacobaeus, E., Boberg, E., Le Blanc, K. Current perspectives on mesenchymal stromal cell therapy for graft versus host disease. Cell Mol Immunol. 20, 613-625 (2023).
  5. Premer, C., Hare, J. M., Yuan, S. Y., Wilson, J. W. Mesenchymal stem/stromal cells as a therapeutic for sepsis: a review on where do we stand. Stem Cell Res Ther. 16, 245(2025).
  6. Eiro, N., Fraile, M., Gonzalez-Jubete, A., Gonzalez, L. O., Vizoso, F. J. Mesenchymal (Stem) Stromal Cells Based as New Therapeutic Alternative in Inflammatory Bowel Disease: Basic Mechanisms, Experimental and Clinical Evidence, and Challenges. Int J Mol Sci. 23 (16), 8905(2022).
  7. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8, 315-317 (2006).
  8. Gonzalez-Gonzalez, A., Garcia-Sanchez, D., Dotta, M., Rodriguez-Rey, J. C., Perez-Campo, F. M. Mesenchymal stem cells secretome: The cornerstone of cell-free regenerative medicine. World J Stem Cells. 12, 1529-1552 (2020).
  9. Trigo, C. M., Rodrigues, J. S., Camoes, S. P., Sola, S., Miranda, J. P. Mesenchymal stem cell secretome for regenerative medicine: Where do we stand. J Adv Res. 70, 103-124 (2025).
  10. Giri, J., Modi, D. Endometrial and placental stem cells in successful and pathological pregnancies. J Assist Reprod Genet. 40, 1509-1522 (2023).
  11. Lu, D., Xu, Y., Liu, Q., Zhang, Q. Mesenchymal Stem Cell-Macrophage Crosstalk and Maintenance of Inflammatory Microenvironment Homeostasis. Front Cell Dev Biol. 9, 681171(2021).
  12. Galipeau, J. Macrophages at the nexus of mesenchymal stromal cell potency: The emerging role of chemokine cooperativity. Stem Cells. 39, 1145-1154 (2021).
  13. Giri, J., Das, R., Nylen, E., Chinnadurai, R., Galipeau, J. CCL2 and CXCL12 Derived from Mesenchymal Stromal Cells Cooperatively Polarize IL-10+ Tissue Macrophages to Mitigate Gut Injury. Cell Rep. 30, 1923-1934.e4 (2020).
  14. Giri, J., Galipeau, J. Mesenchymal stromal cell therapeutic potency is dependent upon viability, route of delivery, and immune match. Blood Adv. 4, 1987-1997 (2020).
  15. Kahrizi, M. S., et al. Recent advances in pre-conditioned mesenchymal stem/stromal cell (MSCs) therapy in organ failure: a comprehensive review of preclinical studies. Stem Cell Res Ther. 14, 155(2023).
  16. Lee, J. H., Yoon, Y. M., Lee, S. H. Hypoxic Preconditioning Promotes the Bioactivities of Mesenchymal Stem Cells via the HIF-1alpha-GRP78-Akt Axis. Int J Mol Sci. 18 (6), 1320(2017).
  17. Carrero, R., et al. IL1beta induces mesenchymal stem cells migration and leucocyte chemotaxis through NF-kappaB. Stem Cell Rev Rep. 8, 905-916 (2012).
  18. English, K., Barry, F. P., Field-Corbett, C. P., Mahon, B. P. IFN-gamma and TNF-alpha differentially regulate immunomodulation by murine mesenchymal stem cells. Immunol Lett. 110, 91-100 (2007).
  19. Sheng, H., et al. A critical role of IFNgamma in priming MSC-mediated suppression of T cell proliferation through up-regulation of B7-H1. Cell Res. 18, 846-857 (2008).
  20. Chinnadurai, R., et al. Cryopreserved Mesenchymal Stromal Cells Are Susceptible to T-Cell Mediated Apoptosis Which Is Partly Rescued by IFNgamma Licensing. Stem Cells. 34, 2429-2442 (2016).
  21. Fernandez-Santos, M. E., et al. Optimization of Mesenchymal Stromal Cell (MSC) Manufacturing Processes for a Better Therapeutic Outcome. Front Immunol. 13, 918565(2022).
  22. Mastrolia, I., et al. Challenges in Clinical Development of Mesenchymal Stromal/Stem Cells: Concise Review. Stem Cells Transl Med. 8, 1135-1148 (2019).
  23. Van Vlasselaer, P., Falla, N., Snoeck, H., Mathieu, E. Characterization and purification of osteogenic cells from murine bone marrow by two-color cell sorting using anti-Sca-1 monoclonal antibody and wheat germ agglutinin. Blood. 84, 753-763 (1994).
  24. Baddoo, M., et al. Characterization of mesenchymal stem cells isolated from murine bone marrow by negative selection. J Cell Biochem. 89, 1235-1249 (2003).
  25. Siclari, V. A., et al. Mesenchymal progenitors residing close to the bone surface are functionally distinct from those in the central bone marrow. Bone. 53, 575-586 (2013).
  26. Huang, S., et al. An improved protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse bone marrow. J Orthop Translat. 3, 26-33 (2015).
  27. Rafei, M., Birman, E., Forner, K., Galipeau, J. Allogeneic mesenchymal stem cells for treatment of experimental autoimmune encephalomyelitis. Mol Ther. 17, 1799-1803 (2009).
  28. Krakenes, T., et al. The neuroprotective potential of mesenchymal stem cells from bone marrow and human exfoliated deciduous teeth in a murine model of demyelination. PLoS One. 18, e0293908(2023).
  29. Kannan, S., Gokul Krishna, S., Gupta, P. K., Kolkundkar, U. K. Advantages of pooling of human bone marrow-derived mesenchymal stromal cells from different donors versus single-donor MSCs. Sci Rep. 14, 12654(2024).
  30. Muller, E., et al. Toll-Like Receptor Ligands and Interferon-gamma Synergize for Induction of Antitumor M1 Macrophages. Front Immunol. 8, 1383(2017).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

IFN GammaELISAM2

מאמרים קשורים