מאמר שיטה

טכניקת מיקרואספירציה פשוטה לבידוד תאים סומטיים מזרע סוסי משומר כתורמים גרעיניים לשכפול

DOI:

10.3791/69404

⸱

19 בדצמבר 2025

 ,  ,  , 
1Doctorado en Ciencias Biológicas y de la Salud, Universidad Autónoma Metropolitana, 2Departamento de Producción Agrícola y Animal, División de Ciencias Biológicas y de la Salud, Universidad Autónoma Metropolitana-Xochimilco, División de Ciencias Biológicas y de la Salud, 3Integrated Cell Culture & Bioimaging Laboratory, Division of Science, Mathematics & Agribusiness, Mayville State University, 4Conservation, Genetics & Biotech, LLC, 5Laboratorio de Manejo de la Reproducción Animal, Departamento de Producción Agrícola y Animal, División de Ciencias Biológicas y de la Salud, Universidad Autónoma Metropolitana-Xochimilco

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מציג טכניקת מיקרו-שאיירה פשוטה לבידוד תאים סומטיים (SCs) חיוניים מזרע סוסי מוקפיא. בניגוד לגישות המסורתיות, טכניקה זו מונעת תרביות ממושכות במבחנה ומתגברת על זיהום זרע, ומאפשרת שימוש מיידי בשכפול תאים סומטיים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הזרע הוא נוזל מורכב שמכיל בנוסף לתאי זרע אוכלוסיות תאים נוספות, כולל תאי חיסון, תאי נבט זכריים צעירים, תאי אפיתל ופיברובלסטים. תאים אלו חולקים את תנאי הדיפלואידי, מה שהופך אותם למועמדים מתאימים כתורמים גרעיניים לשיבוט העברת גרעין של תאים סומטיים (SCNT). הוכח יצירת עוברים וצאצאים ברי קיימא באמצעות תאים אלו. שיטות יעילות לבידוד הזרע כוללות טכניקות צנטריפוגה וגרדיאנט אוסמוטי; עם זאת, תקופות ממושכות של תרביות חוץ-גופית הן הכרחיות כדי להקים תרביות ראשוניות מהתאים המבודדים הללו. יתרה מזאת, הדגימות שנאספו הכילו עומס גבוה של תאי זרע, מה שמפריע להקמה ולתחזוקה של תרביות במבחנה . עד כה, תרביות ראשוניות הוקמו בהצלחה רק מדגימות זרע טריות, בעוד שניסיונות להשתמש בזרע מוקפא נכשלו באופן עקבי. מגבלה זו מגבילה משמעותית את הפוטנציאל לייצר שיבוטים מדגימות זרע מוקפאות. המחקר הנוכחי מציע מתודולוגיה פשוטה מבוססת מיקרוספירציה לבידוד תאים סומטיים מזרע סוסי מוקפיא. גישה זו מאפשרת שחזור מהיר של מספר מספיק של תאים לשימוש מיידי בהליכי שיבוט SCNT.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שיבוט העברת גרעין של תאים סומטיים הוא כלי יקר ערך להצלה והתרבות של פרטים בעלי עניין גאוטכני ומדעי הזואוטכני. קווי תאים רבים שימשו כתורמים גרעיניים, כולל תאים שמקורם בעור, שריר, גרנולוזה, לימפוציטים ותאי שתן 1,2,3,4. מעניין לציין כי הזרע צמח כחלופה חדשנית לאיסוף תאים סומטיים (SCs) לשימוש כתורמים גרעיניים לשכפול 5,6. ממצא זה חשוב במיוחד להצלת אנשים שלמענם נשמר רק זרע. עם זאת, הקמת תרביות ראשוניות מ-SCs מבודדות מזרע קפוא נכשלה, ועד היום נותרה המכשול העיקרי להשגת בעלי חיים משוכפלים ממקור זה 7,8,9. תאים אלו ככל הנראה מקורם באפיתל בלוטי ובציפיית הצינורות, מהפרשות זרעיות, וחשוב מכך—מזיהום זרע בשתן, כאשר האחרון הוא מקור ידוע לתאים סומטיים בעלי פוטנציאל רבייה גבוה ובלתי ממוינת3.

שיטות שונות לבידוד SC מזרע יושמו, כולל צנטריפוגציה5, גרדיאנטים אוסמוטיים 7,8,10, וציטומטריית זרימה11. עם זאת, תאים סומטיים, לאחר בידוד בשיטות אלו, עדיין דורשים תנאים אופטימליים להיקשרות, גדילה והתרבות8. הדרישות הספציפיות של תאים אלו הופכות את תרבית החוץ-גופית למורכבת יותר, שכן נדרשות תקופות דגירה ממושכות להקמת תרביות תאים ראשוניות9. יתרה מזאת, הריכוז הגבוה של תאי זרע הנמצאים בדגימות מפריע הן להתחלה והן לתחזוקה של תרביות אלו.

בניגוד לגישות שתוארו קודם, טכניקת המיקרו-שאייפה הזו מציעה מספר יתרונות ברורים. היא מאפשרת בחירת גרעינים על פי גודל ומורפולוגיה12 ומאפשרת שיקום גרעינים מתאים בריאים ולא-קיימאים, אסטרטגיה שהוכחה בהצלחה עם רקמות קפואות ללא מגני קריופרוטציה13 ותאי רבייה מיובשיםבהקפאה 14,15,16. חשוב לציין כי ניתן להשתמש ב-SCs מיד לאחר הפשרת הזרע, ובכך מפחית את הסיכון לטעויות פלואידיות הקשורות בדרך כלל לתרבות ממושכת במבחנה של תאי סומטיקה ראשוניים המשמשים לשכפול בעלי חיים17,18. במיוחד, הטכניקה מתמקדת בזרע סוסי שמור בקירור, ומאפשרת איסוף מספיק של SCs לשימוש מיידי ב-SCNT12.

ייצור המיקרופיפטות ופיתוח טכניקות המיקרושאיציה התקדמו משמעותית בעשורים האחרונים. השימוש בכלים אלו מאפשר מניפולציה מדויקת של גמטות, עוברים ומבנים תאי שלהם, ויוצר אפשרויות חדשות בתחום הביוטכנולוגיה הרבייתית (https://www.jove.com). טכניקות מיקרומניפולציה מאפשרות הערכת תכונות מכניות תאיות ומספקות תובנות חשובותלגבי מצבם הפיזיולוגי, אך תחום זה עדיין יחסית לא נחקר.

עד כה, אף מחקר לא פירט טכניקה יעילה לבידוד SCs מזרע באמצעות כל וריאציה של הליכי מיקרומניפולציה. בהתחשב במגבלות של שיטות בידוד קונבנציונליות, מחקר זה מציע פרוטוקול מעשי מבוסס מיקרושאיציה לבידוד SCs מזרע סוסי מוקפיא, ומאפשר שימוש מיידי בהליכי שיבוט סומטי לאחר האיסוף.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דגימות זרע משומרות בקריופר, שנשמרו למעלה מ-19 שנים בחנקן נוזלי, הושגו ממפיצים מסחריים המורשים על ידי הרשויות הווטרינריות הרלוונטיות במקסיקו, בהתאם לתקן הרשמי המקסיקני NOM-027-ZOO-1995, אשר מסדיר את תהליך הזרע הזואוסניטרי של בעלי חיים ביתיים. כל דגימות הזרע, בין אם שימשו או לא מתאימות לניתוח, הושבתו והושמדו בהתאם לפרוטוקולי בטיחות ביולוגית מוסדיים ולתקנות רלוונטיות, כולל NOM-087-ECOL-SSA1-2002 לניהול פסולת ביולוגית-זיהומית במקסיקו. חומצה הידרופלואורית שנותרה (HF) נוטרלה בבטחה מתחת למכסה אדים על ידי העברתה האיטית למיכל פלסטיק והוספת בהדרגה חלקים קטנים של CaCO3 או Ca(OH)2 עד שהבעיה פסקה, ויצרה CaF2 בלתי מסיס. ה-pH של המתלה המנוטרל אושר כבין 6 ל-8 לפני שנוהל כפסולת כימית אנאורגנית לפי התקנות המקומיות. החומרים והציוד בהם משתמשים מופיעים בטבלת החומרים.

1. ייצור מחטי מיקרופיפטות לבידוד תאים סומטיים

  1. נבחרו נימי זכוכית בורוסיליקט (1.0 מ"מ O.D. × 0.78 מ"מ זיהוי × 100 מ"מ).
  2. השתמש במושך מיקרופיפטות כדי לייצר נימים עם קצה דק. כוון את נקודת החיתוך כדי לשנות את קוטר הקצה.
  3. הכנס את הניב לתוך המושך ונעל אותו היטב.
  4. הסר את המיקרופיפטה בזהירות לאחר המשיכה והנח אותה אופקית על המיקרופורג'.
  5. יישר את המחמם והמיקרופיפטה בשדה הראייה של המיקרוסקופ.
  6. אתר את נקודת החיתוך באמצעות רטיקל העינית (איור 1A,B).
  7. הביא את קצה המיקרופיפטה למגע עם חרוז הזכוכית (על חוט החימום).
  8. הגבירו בהדרגה את החום עד שהקצה נמס לתוך החרוז.
    1. כבה את התנור.
    2. תן לקצה להידבק לחרוז ולהתנתק.
      הערה: אין צורך לכופף את המיקרופיפטה; ניתן להשתמש בו בצורה ישרה. עם זאת, אם האופרטור מעדיף זאת, ניתן ליצור זווית (איור 1C).
  9. אין להחליק את הקצה, כי שלב זה אינו הכרחי לתהליך.
  10. נקה את קצות הפיפטה על ידי טבילה של כל קצה למשך ~10 שניות ברצף ב:
    1. 20% חומצה הידרופלואורית (HF).
      זהירות: חומצה הידרופלואורית היא רעילה מאוד וקורוזיבית. השתמשו בציוד המגן האישי שצוין על ידי הספק. הדגש על שימוש בהגנה מפני עיניים/פנים, כפפות ומעיל מעבדה, ותמיד לעבוד עם קפוצ'ון אדים.
    2. מים סטריליים עם זיקוק כפול.
    3. אתנול מוחלט.
      הערה: כדי להקל על שטיפת קצה הפיפטות, הכינו את התמיסות שהוזכרו לעיל בצינורות קורנינג סטריליים בנפח 15 מ"ל.
  11. ייבוש מיקרופיפטות בתנור בטמפרטורה של 50 מעלות צלזיוס.
  12. אחסן מיקרופיפטות במיכל סטרילי.

2. מערכת מיקרושאיירה

  1. בדוק שמערכת המיקרואפיריה פועלת כראוי, כאשר הג'ויסטיק המיקרואפירציה ממוקם במרכז לוח הבקרה.
  2. במערכות המשתמשות בשמן, יש לוודא שאין בועות אוויר בתוך המערכת, שכן הן עלולות להשפיע על דיוק התנועה.
  3. הכנס את מיקרופיפטת שאיבת התא הסומטי למניפולטור המחזיק בצד היד הדומיננטית של המפעיל.
    הערה: החלף את המיקרופיפטה בחדש אם הקצה נסתם במהלך איסוף תאים סומטיים.

3. הפשרה ודילול של זרע סוסי שמור בקירור

  1. הסר קשיות מחנקן נוזלי, חשף לאוויר למשך 10 שניות, והפשיר ב-37 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות.
  2. דילול זרע ראשון: קחו דגימה מהזרע המופשר (250 מיקרוליטר) ומדללים ב-1.0 מ"ל מדיום DMEM/F12 עם 10% סרום בקר עוברי, 0.1 מ"ג/מ"ל אלבומין סרום בקר, 12.5 מיקרומום β-מרקפטואנול, ו-1% אנטיביוטיקה-אנטימיקוטי.
    1. דגרו את התערובת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
  3. דילול זרע שני: קח 25 מיקרוליטר מהדילול הראשון, מדלל אותו ב-975 מיקרוליטר של 1x DPBS עם תוספת של 0.1 מ"ג/מ"ל פולי (אלכוהול ויניל) (PVA) או פוליווינילפירולידון (PVP) והטיל אותו בצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל, וערבב בעדינות.
    1. שמרו על תערובת זו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס לאורך כל תהליך איסוף התאים.

4. הכנת מנות לאוסף SCs

  1. אסוף את ה-SC באמצעות שני מכסים מכלי תרבית בקוטר 35 מ"מ.
  2. הכינו את המכסה הראשון כך (מכסה #1, איור 2A).
    1. קחו 100 מיקרו-ליטר מדילול הזרע השני ומניחים אותו במרכז המכסה (ראו איור 2A).
    2. יצרו מיקרודרופ שנייה (10 מיקרוליטר) של 1x DPBS עם תוספת של 0.1 מ"ג/מ"ל PVA או PVP מעל הטיפה הראשונה (ראו איור 2A).
    3. כסה את שתי המיקרודרופות לחלוטין בשמן פרפין כדי למנוע אידוי ולשמור על יציבות טמפרטורה במהלך שאיבת ה-SC.
  3. הכינו את המכסה השני להסרת פסולת תאית והזרע הנלווה (מכסה #2, איור 2B).
    1. הנח שלוש טיפות של 30-50 מיקרוליטר של 1x DPBS עם תוספת של 0.1 מ"ג/מ"ל PVA או PVP במרכז המכסה; אל תכסו אותם בשמן מינרלי.
      הערה: הכינו את תבנית התרבית הזו רק לאחר שכל התאים הסומטיים נבחרו כדי למנוע שינויים בתכונות הפיזיקוכימיות של תמיסת DPBS עקב חשיפה לאוויר.
  4. בצע את כל שלבי המיקרואספירציה תחת מיקרוסקופ הפוך בטמפרטורת החדר. הימנע משינויים פתאומיים בטמפרטורה.

5. הליך מיקרואפרישן לבידוד SCs מזרע סוסי שמור בקירור

  1. הניחו את המכסה הראשון (מכסה #1, איור 2A) על שלב המיקרוסקופ, מוכן לאיסוף ה-SCs.
  2. בחר מיקרופיפטה בקוטר המתאים לאיסוף ה-SC ולחבר אותו למערכת השאיפה המכאנית.
  3. הכנס בזהירות את המיקרופיפטה למיקרודרופ ויישר אותו עם תחתית מכסה הכלי. לאחר שהפיפטה קיבלה מדיום תרבות אספי, התחל בלכידת ה-SC בנפרד.
  4. בתחתית הצלחת, יש לראות מורפולוגיות תאיות שונות (איור 3).
  5. מקם את קצה המיקרופיפטה בסמוך לכל SC ושאוף אותם תחת לחץ שלילי. שואף תאים מסביב ומוארכים ללא קשר לגודלם. נפח השאיפה משתנה בין לכידות של SCs.
  6. לאחר לכידת 10 תאים, הניחו אותם למיקרודרופ הממוקם מעל (10 מיקרוליטר) (איור 2A). חזור על שלב זה עד שמספר ה-SCs הנדרש לניסוי השיבוט מתקבל.
  7. החזק את כל התאים הסומטיים שנלכדו בתוך המיקרודרופ הזה לאורך כל תהליך האיסוף.
  8. לאחר שהושג מספר ה-SCs הנדרש לשיבוט, בצע הליך שטיפה פשוט באמצעות מיקרודרופים להסרת זרע, פסולת תאית ומזהמים מיקרוביאליים.
  9. קחו את מכסה הכלים השני ובצעו שטיפה רציפה בת שלושה שלבים של ה-SC (מכסה #2, איור 2B):
    1. ללכוד את התאים הסומטיים עם מיקרופיפטה ומניח אותם בזהירות על פני השטח של הטיפה הראשונה. תן להם להירגע ל-3-5 דקות (איור 2B; טיפה #1).
    2. חזור על שלב 5.9.1, והפקיד אותם בטיפה השנייה (איור 2B; טיפה #2).
    3. חזור על שלב 5.9.1, והפקיד את התאים הסומטיים בטיפה השלישית (איור 2B; טיפה #3).
  10. כשלב אחרון, הפקדת התאים הסומטיים המבודדים במיקרודרופ סופי שהוכנה לשימוש מאוחר יותר בהליכי העברת גרעין של תאים סומטיים (איור 4D).
    הערה: שאיפת SCs בנפח הבינוני הקטן ביותר במהלך כל לכידה מחדש כדי למזער את הזרע, הפסולת ומזהמים מיקרוביאליים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טבלה 1 מראה שטכניקת המיקרואספיריה משחזרת ביעילות תאים סומטיים מזרע סוסי מוקפיא, עם קצב לכידה הנע בין 317.7 ± 9.60 ל-424.7 ± 33.65 תאים לשעה בשלושה סוסים. סוס #03 הציג את התפוקה הגבוהה ביותר, מה שהדגים את יעילות השיטה גם עם דגימות מאוחסנות לטווח ארוך. הנתונים מצביעים על כך שהטכניקה מבודדת באופן עקבי ויעיל תאים סומטיים מזרע, וקצב הלכידה הממוצע והסטיות התקן מספקים מדדים כמותיים ליעילות ועקביות, ובכך תומכים ביישומם בהעברת גרעין של תאים סומטיים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיקרומניפולציה של תאים וגמטות אפשרה פישוט טכניקות רבייה מסייעות מורכבות. דוגמאות לכך כוללות שיבוט סומטי באמצעות שיבוט ידני21, בקיעה בסיוע22, הזרקת זרע תוך-ציטופלזמית (ICSI)23, והזרקה פרו-גרעינית בזיגוטים24, בין היתר.

פיתוח שיטות יעילות לבידוד תאים סומטיים מזרע הוא כלי יקר ערך לטכניקות רבייה מודרניות של בעלי חיים. עם זאת, היבטים ביולוגיים רבים נותרו לא ידועים, וגורמי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין להם ניגודי עניינים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מודים למעבדת ניהול הרבייה, המחלקה לייצור חקלאי ובעלי חיים, אוניברסיטת האוטונומה מטרופוליטנה-סוצ'ימילקו (UAM-X), על התמיכה הטכנית והלוגיסטית שלהם.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
2 בטא מרקפטואנולסיגמהM7522תרבית תאים סומטיים
1x DPBSGIBCOמקור 21600010מניפולציה של תאים סומטיים
אתנול מוחלטהייסלEL CRISOL 50181-1L73לייצור פיפטות
אנטיביוטיקה-אנטימיקוטיקה 100xINVITRO SA. Mé xicoתרבית תאים סומטיים
נימי בורוסיליקט (1.0 מ"מ O.D. & פעמים; 0.78 מ"מ זיהוי ו-100 מ"מ אורך)מכונות הרווארד, ארה"בEC1-30-0035לייצור פיפטות
BSAסיגמהA3311תרבית תאים סומטיים
DMEM/F12 בינוניGIBCOמקור 12500-062תרבית תאים סומטיים
דגימת זרע מוקפאת בסוסיםדגימות הזרע המוקפרות נרכשו ממפיץ מסחרי ונשמרו במשך יותר מ-19 שנים בחנקן נוזלי. כל דגימות הזרע הקפואות של סוסים הושגו ממפיצים מסחריים המורשים על ידי הרשויות הווטרינריות הרלוונטיות במקסיקו, בהתאם לתקן הרשמי המקסיקני NOM-027-ZOO-1995, תהליך זואוסניטרי של זרע מבעלי חיים ביתיים.
סימן עיניתכלי לייצור פיפטותציוד נדרש
סרום בקר עובריGIBCOמקור 26140-079תרבית תאים סומטיים
חומצה הידרופלוריתסיגמה-אלדריץ'339261לייצור פיפטות
מיקרוסקופ אופטי הפוךאקליפס, TE 200ניקוןמיקרומניפולציה של תאים סומטיים
מעבדה  תנור יבשכלי לייצור פיפטותציוד נדרש
מיקרופורג'כלי לייצור פיפטותציוד נדרש
סט מיקרומניפולטורים למיקרוסקופ הפוךמיקרומניפולציה של תאיםציוד נדרש
מושך מיקרופיפטותP-97, כלי סאטרכלי לייצור פיפטותהשתמש בהגדרות הבאות— חימום: 720; משיכה: 30; מהירות: 50; זמן: 220; לחץ
שמן מינרליסיגמהM8410מניפולציה של תאים סומטיים
Nunclon  מנות תרבית תאים, DIAM. &Times; H 35 מ"מ וכפול; 10 מ"מנונקלוןנונק 153066
PVAסיגמהP8136תרבית תאים סומטיים
PVPסיגמהP5288תרבית תאים סומטיים
תמיסת טרייפן בלו 0.4%GIBCOהפניה - 15250061צבע תאים

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pandey, A., Gupta, S. C., Gupta, N. Comparative potential of cultured skin fibroblast, cumulus, and granulosa cell to produce somatic cell nuclear transfer (SCNT) preimplantation embryos in buffaloes (Bubalus bubalis) in relation to gene expressions. Cell Reprogram. 12 (3), 357-368 (2010).
  2. Galli, C., Duchi, R., Moor, R. M., Lazzari, G. Mammalian leukocytes contain all the genetic information necessary for the development of a new individual. Cloning. 1 (3), 161-170 (1999).
  3. Olsson, P. O., Yeonwoo, J., Park, K., Yoo, Y. M., Hwang, W. S. Live births from urine derived cells. PLoS One. 18 (1), e0278607(2023).
  4. Vignon, X., et al. Developmental potential of bovine embryos reconstructed from enucleated matured oocytes fused with cultured somatic cells. C R Acad Sci III. 321 (9), 735-745 (1998).
  5. Nel-Themaat, L., et al. Isolation, culture and characterisation of somatic cells derived from semen and milk of endangered sheep and eland antelope. Reprod Fertil Dev. 19 (4), 576-584 (2007).
  6. Kjelland, M. E., Liu, J., Hyatt, D., Kraemer, D. Collection, isolation, and culture of somatic cells from avian semen. Avian Biol Res. 6 (4), 255-260 (2013).
  7. Nel-Themaat, L., et al. Cloned embryos from semen. Part 1: in vitro proliferation of epithelial cells on embryonic fibroblasts after isolation from semen by gradient centrifugation. Cloning Stem Cells. 10 (1), 143-160 (2008).
  8. Liu, J., et al. Evaluation of culture systems for attachment and proliferation of epithelial cells cultured from ovine semen. Anim Reprod Sci. 115 (1-4), 49-57 (2009).
  9. Liu, J., et al. Embryo production and possible species preservation by nuclear transfer of somatic cells isolated from bovine semen. Theriogenology. 74 (9), 1629-1635 (2010).
  10. Saini, M., et al. Isolation and culture of epithelial cells from stored buffalo semen and their use for the production of cloned embryos. Reprod Fertil Dev. 31 (10), 1581-1588 (2019).
  11. Brom-de-Luna, J. G., Canesin, H. S., Wright, G., Hinrichs, K. Culture of somatic cells isolated from frozen-thawed equine semen using fluorescence-assisted cell sorting. Anim Reprod Sci. 190, 10-17 (2018).
  12. Ramos, B., Rodríguez, A. A., Rosales, A. M., Montiel, A. J., Hernández, J. E. Identification of somatic cell populations in cryopreserved equine semen as a source of donor nuclei for somatic cloning: preliminary results. Reprod Fertil Dev. 37 (1), (2025).
  13. Moulavi, F., et al. Interspecies somatic cell nuclear transfer in Asiatic cheetah using nuclei derived from post-mortem frozen tissue in absence of cryo-protectant and in vitro matured domestic cat oocytes. Theriogenology. 90, 197-203 (2017).
  14. Wakayama, S., Ito, D., Ooga, M., Wakayama, T. Production of mouse offspring from zygotes fertilized with freeze-dried spermatids. Sci Rep. 12 (1), 18430(2022).
  15. Wakayama, S., Ito, D., Hayashi, E., Ishiuchi, T., Wakayama, T. Healthy cloned offspring derived from freeze-dried somatic cells. Nat Commun. 13 (1), 3666(2022).
  16. Loi, P., Fulka, J., Hildebrand, T., Ptak, G. Genome of non-living cells: Trash or recycle. Reproduction. 142 (4), 497-503 (2011).
  17. Wakayama, S., Wakayama, T., Wells, D. N. Encyclopedia of Life Sciences. , 1-10 (2023).
  18. Lanza, R., et al. Extension of cell life-span and telomere length in animals cloned from senescent somatic cells. Science. 288, 665-669 (2000).
  19. González-Bermúdez, B., Guinea, G. V., Plaza, G. R. Advances in micropipette aspiration: applications in cell biomechanics, models, and extended studies. Biophys J. 116 (4), 587-594 (2019).
  20. Hochmuth, R. M. Micropipette aspiration of living cells. J Biomech. 33 (1), 15-22 (2000).
  21. Vajta, G., et al. Production of a healthy calf by somatic cell nuclear transfer without micromanipulators and carbon dioxide incubators using the handmade cloning (HMC) and the submarine incubation system (SIS). Theriogenology. 62 (8), 1465-1472 (2004).
  22. Alteri, A., et al. Revisiting embryo assisted hatching approaches: A systematic review of the current protocols. J Assist Reprod Genet. 35 (3), 367-391 (2018).
  23. Briski, O., Salamone, D. F. Past, present and future of ICSI in livestock species. Anim Reprod Sci. 246, 106925(2022).
  24. Wall, R. J. Pronuclear microinjection. Cloning Stem Cells. 3 (4), 209-220 (2001).
  25. Selokar, N. L., et al. Hope for restoration of dead valuable bulls through cloning using donor somatic cells isolated from cryopreserved semen. PLoS One. 9 (3), e90755(2014).
  26. Selokar, N. L., et al. Buffalo (Bubalus bubalis) SCNT embryos produced from somatic cells isolated from frozen-thawed semen: Effect of trichostatin A on the in vitro and in vivo developmental potential, quality and epigenetic status. Zygote. 24 (4), 549-553 (2016).
  27. Guevorkian, K., Maître, J. L. Micropipette aspiration: A unique tool for exploring cell and tissue mechanics in vivo. Methods Cell Biol. 139, 187-201 (2017).
  28. Duah, E. K., et al. Production of hand-made cloned buffalo (Bubalus bubalis) embryos from nonviable somatic cells. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 52 (10), 983-988 (2016).
  29. Loi, P., et al. Nuclei of nonviable ovine somatic cells develop into lambs after nuclear transplantation. Biol Reprod. 67 (1), 126-132 (2002).
  30. Fahrudin, M., Otoi, T., Suzuki, T. Developmental competence of bovine embryos reconstructed by the transfer of somatic cells derived from frozen tissues. J Vet Med Sci. 63 (10), 1151-1154 (2001).
  31. Podico, G., et al. Single-layer colloid centrifugation as a method to process urine-contaminated stallion semen after freezing-thawing. J Equine Vet Sci. 87, 102910(2020).
  32. Zhang, Y. T., et al. Evaluation of porcine urine-derived cells as nuclei donor for somatic cell nuclear transfer. J Vet Sci. 23 (2), e40(2022).
  33. Mizutani, E., et al. Generation of cloned mice and nuclear transfer embryonic stem cell lines from urine-derived cells. Sci Rep. 6, 23808(2016).
  34. Long, S., Kenworthy, S. Round cells in diagnostic semen analysis: a guide for laboratories and clinicians. Br J Biomed Sci. 79, 10129(2022).
  35. Johanisson, E., Campana, A., Luthi, R., de Agostini, A. Evaluation of 'round cells' in semen analysis: a comparative study. Hum Reprod Update. 6 (4), 404-412 (2000).
  36. Graber, M., Lane, B., Lamia, R., Pastoriza-Munoz, E. Bubble cells: Renal tubular cells in the urinary sediment with characteristics of viability. J Am Soc Nephrol. 1 (7), 999-1004 (1991).
  37. Rahmanian, N., Bozorgmehr, M., Torabi, M., Akbari, A., Zarnani, A. H. Cell separation: Potentials and pitfalls. Prep Biochem Biotechnol. 47 (1), 38-51 (2017).
  38. Håård, M. Use of frozen stallion semen in Europe. Acta Vet Scand Suppl. 88, 123-127 (1992).
  39. Klug, E., Treu, H., Hillmann, H., Heinze, H. Results of insemination of mares with fresh and frozen stallion semen. J Reprod Fertil Suppl. 23, 107-110 (1975).
  40. Pukazhenthi, B., Comizzoli, P., Travis, A. J., Wildt, D. E. Applications of emerging technologies to the study and conservation of threatened and endangered species. Reprod Fertil Dev. 18 (1-2), 77-90 (2006).
  41. Swanson, W. F., Magarey, G. M., Herrick, J. R. Sperm cryopreservation in endangered felids: developing linkage of in situ-ex situ populations. Soc Reprod Fertil Suppl. 65, 417-432 (2007).
  42. Lagutina, I., Fulka, H., Lazzari, G., Galli, C. Interspecies somatic cell nuclear transfer: Advancements and problems. Cell Reprogram. 15 (5), 374-384 (2013).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Microaspiration TechniqueSomatic Cell IsolationCryopreserved Equine SemenNuclear Donor CellsSomatic Cell Nuclear TransferEquine CloningCell Morphology SelectionMicropipette AspirationSequential Cell WashingDiploid Cell Recovery

מאמרים קשורים