Method Article

בידוד רציפה אופטימלי של קריפטות ותאי סטרומל מזנכימיים מרקמת מעי חזיר

DOI:

10.3791/69429

⸱

December 19th, 2025

 , 
1Department of Animal and Avian Sciences, University of Maryland

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה מספק פרוטוקול שלבי לבידוד רציף של קריפטות מעיים ותאי סטרומל מזנכימליים במעי (iMSCs) מרקמת חזיר ג'יונלית. השיטה מייצרת שכבות מונו-שכבות אנטרואידיות דו-ממדיות ו-iMSCs המתאימים לפיתוח מודלים קו-קולטורה אפיתליאלית-סטרומלית ניתנים לשחזור ורלוונטיים פיזיולוגית, לחקר שיחת צולב תאית במהלך הומאוסטזיס והתחדשות במעי.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

האפיתל של המעי מתקשר באופן הדוק עם תאי הסטרום המזנכימיים של המעי (iMSCs) כדי לווסת התפתחות, הומאוסטזיס והתחדשות. עם זאת, שיטות סטנדרטיות לבידוד רציף של שברי אפיתל וסטרום מרקמת חזיר מוגבלות. פרוטוקול זה מתאר תהליך אופטימלי שלב לבידוד קריפטות ו-iMSCs מאותו מקטע ג'ג'ונלי של חזירונים. השיטה משתמשת בבופר דיסוציאציה מבוסס אתילנדיאמין-טטראצטית/דיתיותרייטול (EDTA/DTT) לשחרור קריפטות, ולאחר מכן עיכול קולגנאז/דיספזה של מטריצת החוץ-תאית לבידוד iMSCs. גישה זו מצמצמת את השינויים המרחביים בתאים המבודדים. הקריפטות המבודדות גודלו בהצלחה ויצרו שכבות מונואידיות דו-ממדיות (דו-ממדיות) מתפשטות טיפוסיות על לוחות מצופים הידרוג'ל בקולגן. ה-iMSCs התורבתים דבקו בבקבוקי תרבית וביטאו סמנים סטרומליים כגון קולטן גורם גדילה אלפא (PDGFRα) שמקורם בטסיות דם ואשכול התמיינות 81 (CD81), כפי שנקבע על ידי צביעת חיסונית. בסך הכול, פרוטוקול הבידוד האופטימלי הזה מניב הן תאים אפיתליים ותאי סטרומל מאותו מקטע ג'ונלי של חזירון, ומספק בסיס שכפול למחקר עתידי הכולל אורגנואידים במעי ומערכות קו-קולטורציה של iMSC להבהרת מנגנונים השולטים באינטראקציות אפיתליאליות-סטרומליות בחזירים, מודל רלוונטי תרגומי לשכפול פיזיולוגיה אנושית ולקידום מדעי בעלי החיים.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

האפיתל המעי הוא רקמה דינמית העוברת התחדשות עצמית מתמשכת והבחנה כדי לשמור על הומאוסטזיס במעי ולהקל על התחדשות לאחר פגיעות ריריות 1,2. תאי אפיתל במעי מקורם בתאי גזע במעי (ISCs), והם מתקשרים עם גורמים מיקרו-סביבתיים מגוונים 3,4,5,6,7,8. התאים התת-אפיתליים, בעיקר הלמינה פרופריה ורירית השריר, מורכבים מאוכלוסיות תאים מגוונות משושלות שונות9. מבין אוכלוסיות התאים הללו, תאי סטרומל מזנכימליים במעי (iMSCs), כולל פיברובלסטים ומיופיברובלסטים, מייצרים גורמי גדילה וטרופיים המווסתים את גבעול, התרבות וההתמיינות של ISC כדי לווסת הומאוסטזיס אפיתל והתחדשות 6,7,10,11.

כדי לחקור אינטראקציות תאיות אלו, מחקרים עדכניים פיתחו גישות חדשניות לפענוח מנגנוני פעולה אפשריים המניעים את הדיבור בין תאי אפיתל במעי לבין תאי ה-iMSC. מערכות קו-קולטורה המשלבות אורגנואידים עם תאי סטרומל או חיסון קידמו את הבנתנו לגבי אינטראקציות תאיות אפיתליאליות-תת-אפיתל במהלך ההתפתחות, התחדשות, סקר תרופות ומידול מחלות 12,13,14,15,16,17. עם זאת, רוב מחקרי קו-קולטורציה אורגנואידית השתמשו ברקמות עכברים, שלעיתים קרובות אינן מצליחות לחקות ביעילות את הפיזיולוגיה האנושית ואת הפנוטיפים של המחלה, מה שמגביל את הרלוונטיות הקלינית שלהם לתרגום18.

ברוב פרוטוקולי בידוד המעי של עכברים, תאי אפיתל וסטרומל מתקבלים ממקטעי רקמה נפרדים, מה שעשוי להניב דגימות המשקפות תכונות מעט שונות, מה שעשוי להשפיע על השחזוריות בניסויים19,20. נכון להיום, אין פרוטוקולים מותאמים סטנדרטיים לבידוד קריפטות מעי חזיר ו-iMSCs מאותה דגימת רקמה. יתרה מזאת, מגבלות מעשיות בקבלת דגימות מעי אנושיות מתאימות הובילו חוקרים רבים להסתמך על סוגי תאים לא תואמים מאיברים שונים (כגון אנטרואידים אנושיים עם פיברובלסטים בעור) להערכת דיבור תאים אפיתלי-מזנכימלי, מה שעלול לבלבל את פרשנות הנתונים 21,22,23.

למרות שפרוטוקול ביופסיה מעי אנושי שפורסם לאחרונה בידד קריפטות וקיבל פיברובלסטים דרך התפתחות מרקמה שנותרה מחוסר אפיתל שנותרה, גישות סטנדרטיות דומות חסרות אצל חזירים24. חזירים משמשים כמודל בעלי חיים מתאים למחקר תרגומי בשל הדמיון האנטומי והפיזיולוגי שלהם לבני אדם 2,18,25,26,27,28,29. לכן, שיטה זו מציגה פרוטוקול בידוד רציף שמחזיר קריפטות מעיים ו-iMSCs מאותו מקטע חזיר ג'יונלי, בהתבסס על המבנה הפיזיולוגי, האנטומי והמורפולוגי של המעי 4,30. ההליך מספק מסגרת ניתנת לשחזור לבידוד קריפטות ו-iMSCs המתאימה למחקרים עתידיים של קו-קולטורציה של מעי חזיר.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

קטע באורך 5 ס"מ נחתך מהג'ג'ונום הפרוקסימלי שנכרך של גורי חזירים בני 21 יום שהיו מאוחסנים במתקן החזירים באוניברסיטת מרילנד, קולג' פארק. ההליך (R-JUN-22-30) ששימש להקרבת החזירון פעל לפי הנחיות למדיניות טיפול ושימוש בבעלי חיים שאושרה על ידי ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים של האוניברסיטה. לפני המשך שלבי הבידוד, מתווה הפרוטוקול מוצג באיור 1, ורשימת החומרים והציוד המשמשים לבידוד הסדרתי של קריפטות המעי החזיריות וה-iMSCs מוצגת בטבלת החומרים.

1. שלב ההכנה לפני הבידוד

  1. הכינו 30 מ"ל של בופר שטיפה לכל מקטע רקמה של 5 ס"מ בצינורות קוניים של 50 מ"ל.
  2. כוון את הנפח לפי מספר דגימות הרקמה שנאספו.
    הערה: בדוק את טבלה 1 להרכב בופר הכביסה. כל שלבי הכנת הרקמות ובידוד התאים מתבצעים על משטח עבודה.

2. שלב הכנת רקמת המעי

  1. הניחו את רקמת המעי שנכרתה בתוך 30 מ"ל של בופר שטיפה בצינורות חרוטיים של 50 מ"ל.
    הערה: ניתן להניח את הרקמות שנכרתו במשטח שטיפה קרה למשך שעה לפני השימוש.
  2. שטוף את הרקמה 3× עם בופר שטיפה מקורר באמצעות מזרק 21 גרם להסרת תכולת האור.
  3. מניחים את הרקמה על משטח קצף פוליסטירן מחוטא והסירו בזהירות את הרקמה המזנטרית והשומנית מהסרוזה.
  4. נתח את הרקמה לאורך באמצעות להב ניתוחי לפתיחת הלומן (איור 2A).
  5. העבר את הרקמה המנותחת חלקית לבופר שטיפה טרי ושטוף פעמיים, או עד שהבופר מתבהר.
  6. מניחים את הרקמה בתוך בופר הכביסה בצלחת פטרי בקוטר 100 מ"מ וחתכו אותה לחתיכות בגודל 10-15 מ"מ באמצעות להב ניתוחי חדש (איור 2B,C). שלב זה מגדיל את שטח הפנים החשוף לבופר העיכול.
  7. העבר את הרקמה הטחונה לצינור קוני חדש בנפח 50 מ"ל.
  8. שטפו בעדינות עם בופר שטיפה ותנו לרקמה הטחונה לשקוע בכוח הכבידה למשך כ-30 שניות (איור 2D).
  9. שואף בעדינות את הסופרנאנט, והשאירו רק מספיק בופר לכסות את חלקי הרקמה בצינור הקוני.
  10. שלב הדיסוציאציה האפיתליאלית
    1. הוסיפו 30 מ"ל של בופר דיסוציאציה אפיתל מחומם מראש (טבלה 2) ודגרו במשך 20-30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באמבט חרוזים סטטי או באמבט מים מנענע בכ-9 × גרם.
    2. נער בעדינות את הצינור כל 15 דקות כדי להגביר את שחרור הקריפטות מממברנת האפיתל.
    3. אפשרו לרקמה לשקוע ושאופים בעדינות את הסופרנטנט באמצעות פיפטה סרולוגית, תוך השארתם רק מספיק בופר לכסות את הרקמה השקעה בצינור הקוניקלי.
    4. הוסיפו 30 מ"ל של בופר שטיפה טרי לרקמה שהתיישבה ונערו בעוצמה כדי לשחרר את הווילים, הקריפטות והפסולת (איור 3A). תן לשאריות הרקמה לשקוע, ואז לשחרר בעדינות את סופרנאנט בופר השטיפה, המכיל את מקטעי הקריפטה התלויים, דרך מסננת תאים של 100 מיקרון לצינור קוני חדש בנפח 50 מ"ל.
      1. חזור על תהליך הוספת בופר שטיפה טרי לרקמה שנותרה ודקנטינג שלוש פעמים (3×). פיפט 10 מיקרוליטר של בופר שטיפה המכיל את הקריפטות לתוך צלחת פטרי בקוטר 100 מ"מ ובחן את צפיפות הקריפטה תחת מיקרוסקופ סטריאו.
        הערה: שמור על כל בופר כביסה עם קריפטות אחרי כל שטיפה.
    5. לאחר השטיפה השלישית, בופר הכביסה המכיל את הקריפטות צריך להיות נקי עם פסולת מינימלית (איור 3B).
      הערה: שמור את שאריות הרקמה עם המטריצה החוץ-תאית (ECM) בצינור הקוני לצורך עיבוד בידוד iMSC מאוחר יותר.
    6. צנטריפוגה את תליית הקריפטה ב-150 × גרם למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר כדי לפרוק את שברי הקריפטה.
    7. שאיפת והשיה מחדש את כדור הקריפטה במדיום תרבות אפיתלי.
    8. צנטריפוגה שוב את הקריפטות התלויה ב-150 × גרם למשך 2 דקות כדי לאסוף את כדור שברי הקריפטה.
    9. הוסף מדיום תרבית אפיתל כדי להחזיר את הקריפטות ופיפטה 5× באמצעות קצה פיפטה בנפח 1,000 מיקרוליטר.
    10. זרעו כ-100 קריפטות תלויות על לוחות שישה בארות מצופים הידרוג'ל מסוג 1 מוכנים מראש כדי לגדל ולהרחיב את הקריפטות לשכבות מונולרואידיות דו-ממדיות (2D).
      הערה: בדוק את הכנת הצלחות המצופה בקולגן הידרוג'ל בטבלה 3. הריכוז הסופי של קולגן סוג 1 צריך להיות 1.0 מ"ג/מ"ל. הימנעו מהצבת קריפטות צפופות מדי או שברי פסולת כדי למנוע זיהום שמרים או פטריות. אנטיביוטיקה-אנטי-מיקוטית (אנטי-אנטי) בבופר השטיפה ובמדיום התרבית אמור לספק הגנה.
    11. בדקו תאים תחת מיקרוסקופ ניגוד פאזה הפוך לפני דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור לח עםCO2 של 5%.
    12. החלפת מדיום התרבית תוך 12 שעות לאחר הזרעה כדי להסיר פסולת צפה ולהפחית זיהום חיידקים.
    13. גדלו את האנטרואידים באמצעות מדיום תרבית אפיתל (טבלה 4) והחליפו את המדיום כל יומיים עד בערך היום השמיני, כאשר השכבות המונו-שכבות הדו-ממדיות המורחבות מגיעות ל-≥85% מפגש לתת-תרבות.
  11. שלב הדיסוציאציה של מטריצה חוץ-תאית
    הערה: המשך בתהליך הבידוד עם חלקי הרקמה שנותרו המכילים את המטריצה החוץ-תאית בצינור הקוני (איור 3C ואיור 4A).
    הערה: למרות ש-EDTA בבופר הדיסוציאציה האפיתל יכול לעכב פעילות קולגנאז, שלושת שלבי השטיפה הקודמים מסירים את כל ה-EDTA וה-DTT. לכן, פעילות הקולגנאז לא צריכה להיפגע בתהליך הבא.
    1. טחנו שוב את הרקמה שנותרה לחתיכות קטנות לפני שממשיכים לבודד את ה-iMSCs בלמינה פרופריה.
    2. הוסיפו 25 מ"ל של בופר עיכול חוץ-תאי (טבלה 5) לרקמה ודגרו באמבט חרוזים סטטי למשך 15-20 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס (איור 4B).
    3. נער בעוצמה אחרי הדגירה.
      הערה: הסופרנטנט יהפוך לעכור עם פחות שברי רקמה צפים. פיפטה של 10 מיקרוליטר של הסופרנטנט תחת מיקרוסקופ הפוך לבחינת צפיפות ה-iMSCs בסופרנאנט. המשך לדגור את הרקמה באמבט החרוזים עוד 15 דקות אם צפיפות ה-iMSC הנצפית נמוכה.
    4. פנו בעדינות את הסופרנטנט (מיד לאחר ניעור חזק בשלב 2.2.3) דרך מסננת תאים בקוטר 100 מיקרון לצינור חרוטי חדש כדי למזער פסולת.
    5. צנטריפוגה את מתלי התא בטמפרטורה של 280 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי להוציא את ה-iMSCs.
    6. שאפו את הסופרנטנט והשהיינו מחדש את ה-iMSCs במדיום תרבית מזנכימלית (ראו מדיה תרבותית iMSC בטבלה 6).
    7. צנטריפוגה את ה-iMSCs המוחזרים שוב ב-280 × גרם למשך 5 דקות כדי לשטוף את בופר הדיסוציאציה.
    8. שאפו והשעו מחדש את ה-iMSCs במדיום תרבית מזנכימית.
    9. הצלח את ה-iMSCs בבקבוק תרבית T75 בכ-5 ×-10תאים בכל בקבוק.
      הערה: ודאו שהתאים המצופים מכסים כ-60% משטח הבקבוק, משום שתאי מזנכימיה דורשים צפיפות זריעה בינונית עד גבוהה לצמיחה מיטבית.
    10. החלפת מדיום התרבית תוך 12 שעות לאחר השריון כדי להסיר פסולת עודפת ולמנוע זיהום חיידקים.
    11. בדקו תאים דמויי פיברובלסטים תחת מיקרוסקופ ניטרסט פאזה הפוך ביום השני לאחר הזריעה.
      הערה: החליפו את מדיום התרבות המזנכימית כל יומיים. ה-iMSCs אמורים להגיע לכ-85% מפגש ולהיות מוכנים לתת-גידול עד היום הרביעי.

3. בדיקת אימונוציטוכימיה

  1. תרב כ-5,000 iMSCs בכל באר בלוח של 96 בארות עם מדיום תרבית מזנכימלי למשך 2-3 ימים עד שהתאים מגיעים לכ-80% מפגש המים.
  2. שאפו בעדינות את המדיום ושטפו את ה-iMSCs המותרצים פעמיים עם 100 מיקרוליטר של 1× PBS לבאר בטמפרטורתהחדר 31. כל ההתייחסויות לערכות צביעת החיסון מופיעות בטבלת החומרים.
  3. הוסיפו 100 מיקרוליטר של 4% פרפורמלדהיד (PFA) לכל באר כדי לקיבע את ה-iMSCs המתורבתים ולדוגרים על שולחן סטטי בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
  4. שטפו את ה-iMSCs הקבועים פעמיים עם 100 מיקרוליטר של 0.1% Tween-20/PBS (PBST) למשך 5 דקות כל אחד, ואז חדירו 100 מיקרוליטר של 0.5% טריטון X-100/PBS למשך 30 דקות.
  5. הוסף 100 מיקרוליטר של 5% אלבומין סרום בקר (BSA)/PBST לכל באר כדי לחסום את הקשר הלא ספציפי על התאים הקבועים.
    הערה: השאירו בטמפרטורת החדר במשך שעה לפני שמכבסים פעמיים עם 100 מיקרולטר PBST למשך 5 דקות כל אחת.
  6. הוסף 100 מיקרוליטר של נוגדנים ראשוניים מדוללים (1:250; כלומר, 1 מיקרוליטר של נוגדן ראשוני ב-250 מיקרוליטר של מדלל נוגדנים) לכל באר ודוגר את התאים במהלך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. הנוגדנים העיקריים בהם משתמשים הם PDGFRα ו-CD81.
    הערה: כלול בארות בקרה שליליות על ידי הוספת מדלל נוגדנים בלבד ללא נוגדנים ראשוניים.
  7. ביום השני, שטפו פעמיים את הנוגדנים הראשיים עם 100 מיקרוליטר PBST למשך 5 דקות כל אחד.
  8. מדלל את הנוגדנים המשניים ב-1× PBS באמצעות היחסים הבאים: אלקסה פלואור פלוס 555 (1 מיקרוליטר:100 מיקרוליטר), אלקסה פלואור פלוס 647 (1 מיקרוליטר:100 מיקרוליטר), ו-DAPI (1 מיקרוליטר:800 מיקרוליטר).
  9. צבע נגד התאים בנוגדנים משניים מדוללים בטמפרטורת החדר למשך שעה.
  10. שטוף את התאים פעמיים עם 1× PBS למשך 5 דקות כל אחד.
  11. הוסיפו 100 מיקרוליטר מדיום התקנה לבאר, כסו את הלוח, עטפו אותה בנייר אלומיניום, ואחסנו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד 6 חודשים עד להדמיה פלואורסצנטית.

4. בידוד RNA ובדיקת qPCR

  1. הפקת mRNA כולל מ-iMSCs שגודלו בבקבוקי T75 באמצעות טכניקת הפרדת חומצה גואנידיניום תיוציאנאט-פנול-כלורופורם.
    הערה: קבעו את ריכוז וטוהר ה-RNA באמצעות ספקטרופוטומטר.
  2. תמלול הפוך של mRNA כולל ל-cDNA לשימוש כתבנית לבדיקת qRT-PCR (תגובת שרשרת פולימראז הפוכה כמותית) לאימות גרפים של הגברה עבור פריימר הגן של Sus scrofa, GAPDH (קדימה: ATCCTGGGCTACACTGAGGAC; הפוך: AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG), כפי שדווח במחקרים קודמים 2,28.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במהלך דיסוציאציה אפיתלית, אתילנדיאמינטטטראצאטית (EDTA) מכילה יוני סידן כדי לשבש הידבקות תאי תאי סידן, בעוד דיתיותרייטול (DTT) חותך קשרים דיסולפידיים בגליקופרוטאינים של מוצין כדי להקל על המוקוליזה. לכן, השימוש המשולב בתרכובת כילציה (EDTA) וסוכן מפחית (DTT) מאפשר שחרור יעיל של קריפטות מממברנת האפיתל מבלי לשבש את מבנה המטריצה החוץ-תאית (ECM) 2,32 (איור 3). קריפטות שוחררו בהצלחה מהשכבה האפיתלית עם הפרעה מינימלית ל-ECM (

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בידוד קריפטות מעיים ו-iMSCs מאותו מקטע חזיר מציע גישה חדשנית לשימור תכונות תאיות ותפקודיות ספציפיות למקטע הרקמה. זה קריטי כי רקמות המעי מציגות זהויות אזוריות ומרחביות, כפי שהודגם במחקרים קודמים על חזירים 2,36,37,38. מחקרים אורגנואידים קודמים בחזירים או מינים אחרים, שהסתמכו על קריפטות מבודדות מקטע אחד ופיברובלסטים מאזור מרוחק או תרבית צמיחה חיצונית, סיכנו חוסר ה...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מעריכים תמיכה כספית מתוכנית המענקים התחרותיים של MAES באוניברסיטת מרילנד, קולג' פארק, ארה"ב.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.5 מיליון EDTAפרומגהPR-V4231
בופר HEPES בקוטר 1 Mתרמופישר15630080להכנת פלטות הידרוג'ל בקולגן
קצות פיפט 1000 uLאלקלי סיינטיפיק FT1000104027-530
10x PBSInvitrogenAM9624להכנת פלטות הידרוג'ל בקולגן
1N נתרן הידרוקסידתרמוSS266-1להכנת פלטות הידרוג'ל בקולגן
1x HBSSתרמופישר14025092
1X PBSהייקלוןSH30256FS
4% פאראפורמלדהיד (PFA)תרמופישרAAJ61899AK
צינורות קוניים של 50 מ"לתרמופישר12-565-271
6 לוחות בארפישרברנדFB012927
תמיסת נתרן ביקרבונט 7.5%קורנינגMT25035CIלהכנת פלטות הידרוג'ל בקולגן
Advance DMEM/F12 Gibco 12634-010
אלקסה פלואר פלוס 647InvitrogenA32728נוגדן משני
אלקסה פלוס 555 - A32732 InvitrogenA32732נוגדן משני
נייר אלומיניוםריינולדסhttps://www.amazon.com/dp/B00M8ZEAW4?ref=fed_asin_title&th=1
אנטי-אנטיגיבקו15240096
B27תרמופישר12587010
BSAפישרברנדBP1600-100
CD81 פרוטינינטק66866-1-igנוגדן ראשוני
מים בדרגת תרבית תאיםהייקלוןSH30529FSלהכנת פלטות הידרוג'ל בקולגן
קולגן, סוג 1קורנינג356236להכנת פלטות הידרוג'ל בקולגן
קולגנאז IVגיבקו17104019
צלחת פטרי קורנינג 100 מ"מקורנינג07-202-011
מדיה לשימור תאי קריוסטרטכנולוגיות תאי גזע7930
קריוביאלי לתאים  פישרברנד1050026
מדלל נוגדנים דאקודאקו/אג'ילנטמספר חלק: S302283-2מדלל נוגדנים ראשוני
מדיום הרכבה זוהר של דאקודאקו/אג'ילנטמספר חלק: S302380-2
DAPIפרומוסל/VWR10180-470צביעת DNA
Dispase IIרוש4942078001
DMEM, סוכר גבוהקורנינגMT10013CV
DTTסיגמא646563
EGFפפרוטק315-09
FBS (HI)אוונטור1300-500H
גסטריןאנאספקAS-64149
גנטמיציןביומדיקל MPICN1676045
גלוטמקסתרמופישר35050061
HEPESתרמופישר15630-080
מיקרוסקרופ פלורסנטי הפוךניקוןECLIPSE Ti2הדמיה פלורצנטית
מיקרוסקופ ניגודיות פאזה הפוךניקוןאקליפס TS100להדמיית תאים מתורבתים  
ערכת iScript Advanced CDNA Synthesisביו-ראד1725038ערכת RT-PCR
iTaq Universal SYBR Green Supermixביו-ראד1725122ערכת qPCR
מדיה מותנית של LWRNATCCCRL-3276המדיה של LWRN הוכנה פנימית בהתאם לנוהל ATCC
N-אצטיל ציסטאיןביוגרפיה של MP194603
ספקטרופוטומטר Nanodrop 2000תרמופישרND 2000
ניקוטינאמידסיגמאN0636-100G
לוחות אופטיים עם באר 384 עם ברקודמערכות ביולוגיות יישומיות4483285ערכת qPCR
PDGFRαאבקאםab230457נוגדן ראשוני
פרוסטגלנדין פרק 2 (PGE2)קיימן כימיקלים  14010
QuantStudio 5מערכת ביולוגית יישומיתA28570מכשיר qPCR
SB202190מעבדות LCS-1700
מיקרוסקופ סטריאוNikon SMZ745
בקבוק T 75פישרברנדFB012937
טריטון X100פישרברנדPI85111
תגובת טריזול Invitrogen15596026
גיל 20, 100% חומר ניקוי לא יוניביו-רד1706531
Y27632ApexBioA3008-200

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gehart, H., Clevers, H. Tales from the crypt: New insights into intestinal stem cells. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 16 (1), 19-34 (2019).
  2. Yin, L., et al. Changes in progenitors and differentiated epithelial cells of neonatal piglets. Anim Nutr. 8 (1), 265-276 (2022).
  3. Pastula, A., Marcinkiewicz, J. Cellular interactions in the intestinal stem cell niche. Arch Immunol Ther Exp (Warsz). 67 (1), 19-26 (2019).
  4. Mccarthy, N., Kraiczy, J., Shivdasani, R. A. Cellular and molecular architecture of the intestinal stem cell niche. Nat Cell Biol. 22 (9), 1033-1041 (2020).
  5. Beumer, J., Clevers, H. Cell fate specification and differentiation in the adult mammalian intestine. Nat Rev Mol Cell Biol. 22 (1), 39-53 (2021).
  6. Pasztoi, M., Ohnmacht, C. Tissue niches formed by intestinal mesenchymal stromal cells in mucosal homeostasis and immunity. Int J Mol Sci. 23 (9), 5181(2022).
  7. Kraiczy, J., et al. Graded BMP signaling within intestinal crypt architecture directs self-organization of the Wnt-secreting stem cell niche. Cell Stem Cell. 30 (4), 433-449 (2023).
  8. Niec, R. E., et al. Lymphatics act as a signaling hub to regulate intestinal stem cell activity. Cell Stem Cell. 29 (7), 1067-1082 (2022).
  9. Paerregaard, S. I., et al. The small and large intestine contain related mesenchymal subsets that derive from embryonic gli1(+) precursors. Nat Commun. 14 (1), 2307(2023).
  10. Maimets, M., et al. Mesenchymal-epithelial crosstalk shapes intestinal regionalisation via Wnt and Shh signalling. Nat Commun. 13 (1), 715(2022).
  11. Ayansola, H., Mayorga, E. J., Jin, Y. Subepithelial stromal cells: Their roles and interactions with intestinal epithelial cells during gut mucosal homeostasis and regeneration. Biomedicines. 12 (3), 668(2024).
  12. Wang, Y., et al. Long-term culture captures injury-repair cycles of colonic stem cells. Cell. 179 (5), 1144-1159 (2019).
  13. Xia, X., et al. Mesenchymal stem cells promote healing of nonsteroidal anti-inflammatory drug-related peptic ulcer through paracrine actions in pigs. Sci Transl Med. 11 (516), eaat7455(2019).
  14. Zhang, W., et al. Dietary calcium and phosphorus amounts affect development and tissue-specific stem cell characteristics in neonatal pigs. J Nutr. 150 (5), 1086-1092 (2020).
  15. Zhou, J. Y., et al. Zinc l-aspartate enhances intestinal stem cell activity to protect the integrity of the intestinal mucosa against deoxynivalenol through activation of the Wnt/beta-catenin signaling pathway. Environ Pollut. 262, 114290(2020).
  16. Yang, S., et al. Organoids: The current status and biomedical applications. MedComm (2020). 4 (3), e274(2023).
  17. Zhao, Z., et al. Organoids. Nat Rev Methods Primers. 2 (1), 94(2022).
  18. Gonzalez, L. M., Moeser, A. J., Blikslager, A. T. Porcine models of digestive disease: The future of large animal translational research. Transl Res. 166 (1), 12-27 (2015).
  19. Nieuwenhuis, T. O., et al. Patterns of unwanted biological and technical expression variation among 49 human tissues. Lab Invest. 104 (6), 102069(2024).
  20. Pastula, A., et al. Three-dimensional gastrointestinal organoid culture in combination with nerves or fibroblasts: A method to characterize the gastrointestinal stem cell niche. Stem Cells Int. 2016, 3710836(2016).
  21. Kraski, A., et al. Structured multicellular intestinal spheroids (SMIS) as a standardized model for infection biology. Gut Pathog. 16 (1), 47(2024).
  22. Darling, N. J., Mobbs, C. L., Gonzalez-Hau, A. L., Freer, M., Przyborski, S. Bioengineering novel in vitro co-culture models that represent the human intestinal mucosa with improved Caco-2 structure and barrier function. Front Bioeng Biotechnol. 8, 992(2020).
  23. Freer, M., Cooper, J., Goncalves, K., Przyborski, S. Bioengineering the human intestinal mucosa and the importance of stromal support for pharmacological evaluation in vitro. Cells. 13 (22), 1859(2024).
  24. Meran, L., Tullie, L., Eaton, S., De Coppi, P., Li, V. S. W. Bioengineering human intestinal mucosal grafts using patient-derived organoids, fibroblasts and scaffolds. Nat Protoc. 18 (1), 108-135 (2023).
  25. Burrin, D., et al. Translational advances in pediatric nutrition and gastroenterology: New insights from pig models. Annu Rev Anim Biosci. 8, 321-354 (2020).
  26. Lunney, J. K., et al. Importance of the pig as a human biomedical model. Sci Transl Med. 13 (621), eabd5758(2021).
  27. Barnett, A. M., et al. Porcine colonoids and enteroids keep the memory of their origin during regeneration. Am J Physiol Cell Physiol. 320 (5), C794-C805 (2021).
  28. Gonzalez, L. M., Williamson, I., Piedrahita, J. A., Blikslager, A. T., Magness, S. T. Cell lineage identification and stem cell culture in a porcine model for the study of intestinal epithelial regeneration. PLoS One. 8 (6), e66465(2013).
  29. Stieler Stewart, A., Freund, J. M., Blikslager, A. T., Gonzalez, L. M. Intestinal stem cell isolation and culture in a porcine model of segmental small intestinal ischemia. J Vis Exp. (135), e57647(2018).
  30. Meran, L., Baulies, A., Li, V. S. W. Intestinal stem cell niche: The extracellular matrix and cellular components. Stem Cells Int. 2017, 7970385(2017).
  31. Mahe, M. M., et al. Establishment of gastrointestinal epithelial organoids. Curr Protoc Mouse Biol. 3 (4), 217-240 (2013).
  32. Koliaraki, V., Kollias, G. Isolation of intestinal mesenchymal cells from adult mice. Bio-Protocol. 6 (18), 1940(2016).
  33. Chang, C. W., et al. Mesenchymal stem cell seeding of porcine small intestinal submucosal extracellular matrix for cardiovascular applications. PLoS One. 11 (4), e0153412(2016).
  34. Chen, J., et al. Human intestinal organoid-derived PDGFRα+ mesenchymal stroma enables the proliferation and maintenance of Lgr4+ epithelial stem cells. Stem Cell Res Ther. 15 (1), 16(2024).
  35. Beaumont, M., et al. Intestinal organoids in farm animals. Vet Res. 52 (1), 33(2021).
  36. Wiarda, J. E., Becker, S. R., Sivasankaran, S. K., Loving, C. L. Regional epithelial cell diversity in the small intestine of pigs. J Anim Sci. 101, skac318(2023).
  37. Vermeire, B., Gonzalez, L. M., Jansens, R. J. J., Cox, E., Devriendt, B. Porcine small intestinal organoids as a model to explore etec-host interactions in the gut. Vet Res. 52 (1), 94(2021).
  38. Wiarda, J. E., Trachsel, J. M., Sivasankaran, S. K., Tuggle, C. K., Loving, C. L. Intestinal single-cell atlas reveals novel lymphocytes in pigs with similarities to human cells. Life Sci Alliance. 5 (10), e202201442(2022).
  39. Uniken Venema, W. T. C., et al. Gut mucosa dissociation protocols influence cell type proportions and single-cell gene expression levels. Sci Rep. 12 (1), 9897(2022).
  40. Schaaf, C. R., et al. A lgr5 reporter pig model closely resembles human intestine for improved study of stem cells in disease. FASEB J. 37 (6), e22975(2023).
  41. Joo, S. S., et al. Porcine intestinal apical-out organoid model for gut function study. Animals (Basel). 12 (3), 372(2022).
  42. Gomez-Martinez, I., et al. A planar culture model of human absorptive enterocytes reveals metformin increases fatty acid oxidation and export. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 14 (2), 409-434 (2022).
  43. Jacob, J. M., et al. Pdgfralpha-induced stromal maturation is required to restrain postnatal intestinal epithelial stemness and promote defense mechanisms. Cell Stem Cell. 29 (5), 856-868 (2022).
  44. Modina, S. C., et al. Stages of gut development as a useful tool to prevent gut alterations in piglets. Animals (Basel). 11 (5), 1412(2021).
  45. Tang, W., et al. Ileum tissue single-cell mRNA sequencing elucidates the cellular architecture of pathophysiological changes associated with weaning in piglets. BMC Biol. 20 (1), 123(2022).
  46. Dong, X., et al. Identification of optimal reference genes for gene expression normalization in human osteosarcoma cell lines under proliferative conditions. Front Genet. 13, 989990(2022).
  47. Mccarthy, N., et al. Distinct mesenchymal cell populations generate the essential intestinal BMP signaling gradient. Cell Stem Cell. 26 (3), 391-402 (2020).
  48. Mussard, E., et al. Culture of piglet intestinal 3d organoids from cryopreserved epithelial crypts and establishment of cell monolayers. J Vis Exp. (192), e64917(2023).
  49. Zhang, M., et al. Long-term expansion of porcine intestinal organoids serves as an in vitro model for swine enteric coronavirus infection. Front Microbiol. 13, 865336(2022).
  50. Benz, P., Plenge, M., Wagner, S., Mazzuoli-Weber, G. Two-dimensional porcine intestinal organoids reflecting the physiological properties of native gut. J Vis Exp. (215), e67666(2025).
  51. Lee, B. R., Ock, S. A., Park, M. R., Lee, M. G., Byun, S. J. Establishing porcine jejunum-derived intestinal organoids to study the function of intestinal epithelium as an alternative for animal testing. J Anim Reproduction Biotechnol. 39 (1), 2-11 (2024).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Crypt IsolationMesenchymal Stromal CellsPorcine Intestinal TissueSequential IsolationEDTA DTT DissociationCollagenase DigestionEnteroid MonolayersCollagen HydrogelStromal MarkersEpithelial Stromal Interactions
Video Coming Soon

Related Articles