Method Article

EasyFiji: ממשק גרפי לעיבוד תמונות פלואורסצנציה ידידותי למשתמש בפיג'י

DOI:

10.3791/69441

⸱

February 20th, 2026

 , 
1Center for Bioimage Informatics, St. Jude Children's Research Hospital, 2Cell and Tissue Imaging Center, St. Jude Children's Research Hospital

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

EasyFiji הוא תוסף ממשק משתמש גרפי לפיג'י (ImageJ) המספק חבילת כלים מוקפדת של ויזואליזציה ועיבוד תמונות פלואורסצנטיות, המשמשים לעיתים קרובות מדעני חיים.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פיג'י (Fiji Is Just ImageJ) היא חבילת עיבוד תמונה בקוד פתוח נרחבת ומורחבת הנמצאת בשימוש נרחב בקהילת ניתוח הביודימויות. עם זאת, עבור מדעני חיים שאינם חישוביים, אינטראקציה ידנית עם היכולות הרבות של פיג'י דורשת למידה וניווט במערכת תפריטים רב-שכבתית עמוקה. יתרה מזאת, התנהגויות ברירת המחדל של חלק מהפקודות אינן אידיאליות להצגת ועיבוד תמונות פלואורסצנטיות. כדי להגדיל את היעילות עבור מדעני חיים העובדים עם תמונות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, פיתחנו את EasyFiji, תוסף ממשק משתמש גרפי (GUI) שנבחר לפיג'י. כל פקודת EasyFiji מתבצעת באמצעות כפתורים ומחוונים משודרגים ב-tooltip ותמיד מציגה ביצוע ספציפי לערוץ, כפי שנדרש לתמונות פלואורסצנטיות. פקודות שמשנות עוצמות פיקסלים ניתנות גם לביטול בלחיצה אחת כדי לאפשר עיבוד אינטראקטיבי יותר, וניתן להקליט ולשמור אותן אוטומטית כטקסט לשמירת רשומות. לוח מידע תמונה מציג הגדרות קריטיות לפרשנות התמונה. מסופקות גם פונקציות חדשות של רינדור תמונה ותיקון הלבנה. התוסף זמין בחינם ב-GitHub וכאתר עדכון פיג'י. פרוטוקול זה מפרט את השלבים לשימוש בממשק של EasyFiji להמחשה ועיבוד של תמונות מיקרוסקופיה פלואורסצנטיות.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fiji (Fiji Is Just ImageJ) היא חבילת עיבוד תמונה בקוד פתוח נרחבת ומורחבת הנמצאת בשימוש נרחב בקהילת ניתוח התמונותהביולוגית 1,2. בסיס הקוד הגדול של אלגוריתמים כלליים בפיג'י, יחד עם שפת המקרו וממשק התוספים, יכולים להיות מנוצלים בנוחות על ידי אנליסטים חישוביים כדי לספק פתרון כמעט לכל בעיית עיבוד תמונה או ניתוח. עם זאת, עבור משתמשי מדעי החיים עם מעט ניסיון חישובי, >1,100 הפקודות של FIJI הפזורות על פני מערכת תפריט נפתח רב-שכבתית עשויות להיות מורכבות מאוד לניווט ולשימוש יעיל. ננקטו מספר גישות לפישוט השימוש הידני בפיג'י. סרגל החיפוש של פיג'י הוא חלופה לניווט בתפריטים, ומספק גישה לתיעוד עזרה מצוין, אך רק אם המשתמש יודע את שם האלגוריתם שהוא צריך. כפתורי סרגל הכלים של פיג'י ניתנים להתאמה אישית כדי לספק גישה מהירה לפקודות שהוגדרו על ידי המשתמש, אך הליך זה דורש כתיבת קוד מאקרו וחזון אילו פקודות יהיו שימושיות ביותר. תוסף ActionBar מספק חלון ממשק משתמש גרפי (GUI) עצמאי עם מערכי כפתורים שניתן להתאים ולארגון, אך שוב, נדרשים קידוד וניסיון כדי למלא את הכפתורים ביעילות3. אף אחד מהפתרונות הללו אינו מספק את צרכי מדעני החיים עם מעט ניסיון בעיבוד תמונה.

מעבר לבעיות בממשק המשתמש, מדעני חיים רבים העובדים עם תמונות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית דורשים תצוגה ועיבוד ספציפיים לתעלה. עם זאת, חלק מהפקודות הנפוצות בפיג'י אינן מודעות לערוץ כברירת מחדל. לדוגמה, משתמשים עשויים לרצות להציג ערוצים בצבעים פסאודו-צבועים יחד בצורה בולטת שווה, או להדגיש במיוחד אזורים בעלי עוצמה דומה בין הערוצים, או לשמר את הניגודיות האפורה של אות מורפולוגי תוך הצגת פלואורסצנציה. בכל אחד ממקרי השימוש הללו, טכניקת ההדמיה המורכבת RGB של פיג'י מסתירה את המידע הרצוי ברמה התפיסתית. בעת עיבוד תמונות רב-ערוציות, מסנני תמונות מקומיים בפיג'י (כלומר, תהליך | מסננים), או מעבדים רק את מישור הסיביות הדו-ממדי הפעיל או את כל מישורי הסיביות בחלון התמונה (כלומר, ה'מחסנית' כפי שמוגדרת על ידי המחלקה ImageStack). ההתנהגות הראשונה אינה מעובדת על פני ממד z או t- עבור ערוץ מסוים, בעוד שההתנהגות השנייה כמעט תמיד אינה תקינה, שכן כל ערוץ מכיל דפוס צביעה ייחודי ויחס אות לרעש ייחודיים, מה שמחייב שימוש בפרמטרי עיבוד ספציפיים לערוץ. פקודות תיקון האקונומיקה של ילידי פיג'י (תמונה | כוון | תיקון הלבנה) פועל בצורה לא נכונה כאשר הוא מיושם על תמונות פלואורסצנציה מרובות ערוצים, כי שוב, הם מתקנים את כל ImageStack, שם נתוני הערוצים משולבים, במקום לתקן את הממד z או ה-t בתוך כל ערוץ בנפרד.

כדי להתמודד עם סוגיות אלו עבור מדעני חיים העובדים עם תמונות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, פיתחנו את EasyFiji, תוסף ממשק משתמש גרפי מודרך ואוצר לפיג'י. EasyFiji הוא סט מאוזן של פקודות מאורגנות לפי נושא שמאפשרות רינדור ועיבוד מודעים לערוץ. ארבעה פאנלים מסודרים: תצוגה, תהליך, שמירה ומידע תמונה, כל אחד מכיל אוספים נושאיים של כפתורים וסליידרים המשודרים עם טיפים לכלים לביצוע פקודות. נוחות נוספת כוללת פונקציונליות ביטול לעיבוד אינטראקטיבי, מקליט פעולה פשוט בטקסט פשוט שיכול לשמור אוטומטית פעולות שמשנות פיקסלים יחד עם תמונה, ותצוגה מעוצבת של הגדרות רכישה החשובות לפרשנות תמונות. EasyFiji מציעה גם כלים חדשים להצגת תמונות ותיקון אקונומיק. EasyFiji אינה תומכת בניתוח כמותי של תמונות או פונקציות עיבוד אצווה, שכן יש לבצע פרוצדורות אלו רק בעזרת אנליסט ביודימוי מומחה. למרות ש-EasyFiji תמציתי בעיצובו, כל הפקודות המקומיות של פיג'י זמינות תמיד דרך מערכת התפריטים המקורית של פיג'י. אנו מאמינים שהעיצוב4 המיועד לקהל של EasyFiji יגביר את השימוש בפיג'י בקרב מדעני חיים. כאן אנו מציגים את העיצוב, היישום והיישום של EasyFiji לתמונות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. התוסף קל להתקנה דרך אתר עדכון פיג'י (https://imagej.github.io/list-of-update-sites/ ו-https://imagej.net/plugins/EasyFiji_plugin), בעוד שקוד קוד פתוח ניתן להורדה דרך GitHub; התוסף וקוד המקור זמינים בחינם (https://github.com/stjude/EasyFiji).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר כיצד להתקין ולהשתמש ב-EasyFiji.

1. להתקין את EasyFiji...

  1. הורידו את הגרסה העדכנית ביותר של פיג'י (>1.54g) המתאימה למערכת ההפעלה והתקינו אותה בתיקייה שאליה המשתמש קיבל גישה לקריאה/כתיבה (ראו טבלת חומרים לקישור לאתר ההורדה של פיג'י).
  2. השיק את פיג'י ונווט לעזרה | עדכון... בסרגל התפריטים.
  3. בחלון המעדכן , לחץ על ניהול עדכוני אתרים. בחר ב-EasyFiji מהרשימה, ולחץ על הגשה וסגירה. EasyFiji יותקן אוטומטית, ופיג'י תעודכן אוטומטית עם גרסאות עתידיות של EasyFiji.
  4. הפעל מחדש את פיג'י. בחר ב-EasyFiji מתפריט התוספים של פיג'י.
    הערה: EasyFiji תואם במלואו לגרסאות ישנות רבות של פיג'י ובעיקר תואם ל-ImageJ. מידע מפורט על תאימות ותלות ניתן למצוא בדף הוויקי של EasyFiji GitHub (https://github.com/stjude/EasyFiji) ובדף הוויקי של EasyFiji ImageJ.net (https://imagej.net/plugins/EasyFiji_plugin#quick-start). ניתן לספק משוב דרך דף GitHub או דרך שרשור EasyFiji בפורום Image.sc (https://forum.image.sc/t/announcing-easyfiji-a-user-friendly-gui-plugin-for-fiji/117617) (ראו טבלת חומרים לקישורים למשאבים אלו).

2. שימוש בלוח התצוגה EasyFiji

הערה: כפי שמוצג באיור 1A, לוח התצוגה תומך בצביעה מדומה בערוץ פלואורסצנציה באמצעות כפתורי דוגמת צבע, בקרות קונטרסט אינטואיטיביות ואפשרויות חדשות להצגות תמונה מרובות ערוצים מכוילים תפיסתית. פקודות פיג'י מקומיות להקרנת תמונה בתלת-ממד/4D וחיתוך מחדש כלולות גם כן. טבלה 1 מתעדת את ההתכתבות בין פיקודי EasyFiji לפיקודי פיג'י המקומיים.

  1. הגדר את צבע או נראות הערוץ (לוח תצוגה , מדור צבעי ערוץ ).
    1. בחר את הערוץ הרצוי באמצעות מחוון הערוץ של חלון התמונה.
    2. לחץ על כפתור דוגמת צבע כדי להקצות טבלת חיפוש צבעים חדשה (LUT).
    3. לחץ על כפתור השחור כדי לכבות את התצוגה של ערוץ .
    4. לחץ על כפתור AllChs כדי להציג את כל הערוצים יחד בבת אחת.
    5. לחץ על כפתור EachCh כדי להציג כל ערוץ ברצף, על ידי גלילה של מחוון הערוצים בחלון התמונה.
  2. הגדר ניגודיות ערוץ בתוך או בין תמונות (לוח תצוגה , חלק ניגודיות ערוץ ).
    1. כדי לשנות את טווח התצוגה של ערוץ (קונטרסט), בחר את הערוץ באמצעות מחוון הערוץ בתחתית חלון התמונה בתמונה.
    2. הזז את מחוון רווח התצוגה כדי לציין את עוצמת פיקסל התמונה (הערך המוצג מימין) שתוצג כערך הבהיר ביותר על המסך.
      הערה: אנו משתמשים במונח רווח תצוגה כדי לתאר פעולה זו כי היא גורמת לערוץ להיות בהיר יותר ליניארית, בדומה לאפקט של שינוי הרווח בגלאי במהלך רכישת התמונה.
    3. לחץ על כפתור איפוס הגבר התצוגה כדי להציג את עוצמת הפיקסלים המקסימלית האפשרית של הערוץ (כפי שנקבעת על ידי עומק הסיביות שלו) כערך הבהיר ביותר על המסך.
    4. הזז את מחוון ההיסט של התצוגה כדי לציין את עוצמת הפיקסל של התמונה (הערך המוצג מימין) שתוצג כערך הכהה ביותר על המסך.
      הערה: השתמשנו במונח 'הזזת תצוגה' כדי לתאר פעולה זו כי היא מגדירה את רמת השחור של התמונה, בדומה לאפקט של הגדרת היסט בגלאי במהלך רכישת התמונה.
    5. לחץ על כפתור איפוס התצוגה כדי להגדיר את עוצמת הפיקסל של התמונה מאפס לערך הכהה ביותר במסך.
    6. לחץ על כפתור AutoCh כדי לכוון אוטומטית את הגיין והזזת התצוגה.
    7. לחץ על כפתור AutoAll כדי לכוון אוטומטית את הרווח וההזזה של התצוגה לכל הערוצים.
    8. לחץ על כפתור ה-Propagate כדי להעביר את הגדרות הרווח וההזזה של התצוגה מהתמונה הפעילה לכל שאר התמונות הפתוחות שמכילות את אותו מספר ערוצים.
  3. צור תצוגה רב-ערוצית (לוח תצוגה , מדור תצוגות ערוצים ).
    1. כדי להציג שני ערוצי פלואורסצנציה יחד כתמונה צבעונית, השתמשו בכפתורים עם קידומת FF (פלואורסצנציה עם פלואורסצנציה). כדי להציג ערוץ פלואורסצנציה וערוץ אפור מורפולוגי יחד כתמונת צבע, השתמשו בכפתור עם קידומת FG (פלואורסצנציה עם גווני אפור). הדמיות נוצרות בחלון תמונה חדש.
      הערה: לפני יצירת תצוגת ערוץ כלשהי, תחילה כוונן את הרווח וההזזה של התצוגה לכל ערוץ כך שהאות המעניין יגיע על טווח הדינמי של התצוגה (סעיף 2.2) ואז יישם את הרווחים וההזזות הללו באמצעות כפתורי Apply Gain ו-Offset בלשונית העיבוד (סעיף 3.2.3). ההדמיות יהיו לא אופטימליות אם הרווחים וההזזות לא מותאמים ומיושמים.
    2. לחץ על כפתור FFColoc כדי ליצור רינדור צבע משני ערוצי פלואורסצנציה שמדגיש כפיקסלים צהובים כאשר העוצמה דומה בשני הערוצים (בטווח של 25%).
      הערה: פיקסלים בעוצמות שונות בין הערוצים מוצגים בגווני אפור. פיקסלים צהובים מרמזים על קולוקליזציה מבוססת קורלציה5 כאשר האות המעניין בכל ערוץ חוצה את טווח הדינמי של התצוגה.
      אזהרה: רינדור FFColoc מיועד אך ורק לחקירת נתונים או להמחשת נתונים. זה אינו תחליף לכימות קפדני של הקולוקליזציה בעזרת מומחה.
    3. לחץ על כפתור FFMerge כדי ליצור רינדור צבע משני ערוצי פלואורסצנציה, כאשר האות בכל ערוץ מורגש באופן שווה.
      הערה: בכל פיקסל, הבהירות נקבעת לפי האות בעוצמה גבוהה יותר, בעוד שהגוון הוא פונקציה של יחס העוצמות בין הערוצים (בהתאם למושגים שתוארו טיילור ואחרים). ראו גם את סעיף הדיונים.
    4. לחץ על כפתור FGMerge כדי ליצור הדמיית צבע מתעלה(ים) פלואורסצנציה ותעלה בגווני אפור, שבה הצבע של ערוצי הפלואורסצנציה נשמר, בעוד שהניגודיות של ערוץ הגווני האפור נשמרת.
      הערה: ערוץ הגווני האפור הוא בדרך כלל מודליות לא פלואורסצנטית המכילה מידע מורפולוגי, כגון DIC, ניגודיות פאזה או מיקרוסקופ אלקטרוני.
    5. לחץ על כפתור המונטאז' כדי לפצל את הערוצים לתמונות נפרדות, לסמן אותן אוטומטית על המסך, ולסנכרן את הוויזואליזציה שלהן.
    6. לחצו על כפתור SyncWins כדי לסנכרן את ההדמיה של מספר תמונות מאותו סוג.
  4. צור תצוגות דו-ממדיות של ערימת z- או t-stack תלת-ממדית (לוח תצוגה , חלק תצוגות המחסנית ).
    הערה: כל רינדור מוצג בחלון תמונה חדש.
    1. לחץ על כפתור MIP כדי ליצור הקרנה מקסימלית בעוצמה.
      הערה: העוצמה בכל מיקום בתמונה הדו-ממדית המתקבלת מתאימה לעוצמת הפיקסל האינטנסיבי ביותרלאורך הממד התלת-ממדי בתמונה התלת-ממדית. הליך זה יכול להדגיש רעש, ולכן יכול להיות שימושי להחליק את המחסנית (ראו לשונית עיבוד ) לפני יצירת MIP.
    2. לחץ על כפתור SIP כדי ליצור הקרנת עוצמה סכום.
      הערה: העוצמה בכל מיקום בתמונה הדו-ממדית המתקבלת תואמת לסכום העוצמותלאורך הממד התלת-ממדי בתמונה התלת-ממדית. הליך זה שומר על עוצמה כוללת, מה שמוביל לתמונה עם פחות רעש מכל פרוסה בודדת.
    3. לחצו על כפתור האורטו כדי ליצור צופה פרוסות אורתוגונליים, שמציג באופן אינטראקטיבי את שלושת המישורים האורתוגונליים של מחסנית תלת-ממדית (למשל, xy, xz, yz) שמצטלבים במיקום הסמן הנוכחי.
    4. לחץ על כפתור Kymo כדי ליצור קימוגרף.
      הערה: קימוגרף הוא תמונה דו-ממדית שבה הציר האנכי (y-) מתאים לממד השלישי של מחסנית (בדרך כלל t-), והציר האופקי (x-) מתאים למיקום לאורך קו שצייר המשתמש על מחסנית הקלט. כאשרהממד השלישי הוא זמן, משתמשים בקימוגרף להמחשה או לכימות התנועה.
      כפתור זה מסתמך על תוסף KymographBuilder7 שמגיע עם Fiji אך יש להוריד אותו בנפרד אם משתמשים ב-ImageJ.
  5. הגדר אפשרויות שונות (לוח תצוגה ).
    1. לחץ על כפתור DUP כדי לשכפל את חלון התמונה הפעיל בתוך פיג'י. חלון תמונה חדש יופיע.
      הערה: ציירו אזור מלבני מעניין (ROI) על התמונה באמצעות כלי Rectangle ROI של פיג'י, וכפתור Dup יחתוך לגבול התשואה (ROI). ציין טווחי ערוץ, z- ו/או t- כדי לעצב מחדש את הממדיות של התמונה המשוכפלת.
    2. לחץ על כפתור ToClip כדי להעתיק את התמונה הפעילה כפי שמוצגת כרגע על המסך ללוח המערכת של המערכת. כדי להדביק את התמונה לאפליקציה אחרת (להכנת שקופיות או עריכת תמונות), הפוך את האפליקציה השנייה לפעילה ובחר להדביק (Ctrl+V ב-Windows או Cmd+V במק).
    3. לחץ על כפתור |--אמ--| כדי להציג פס קנה מידה בתמונה כשכבה. החלף את כפתור |--אמ--| כדי להסיר את פס הסקאלה.

3. שימוש בפאנל EasyFiji Process

הערה: כפי שמוצג באיור 1B, סעיף תכונות ערוץ בפאנל התהליך מספק פקודות עיבוד תמונה מבוססות סליידר עם טיפים שניתן להשתמש בהם לשיפור תצוגת התמונה. כפתור ביטול Last מאפשר עיבוד אינטראקטיבי. ניתן לשנות את מידות התמונה באמצעות כפתורי שינוי המימדים. טבלת הפעולות משמשת לרישום פקודות עיבוד טקסט פשוט שמשנות את ערכי עוצמת הפיקסלים של התמונה. היומן יכול להישמר אוטומטית עם התמונה באותו כותרת (ראו לוח שמירה).

  1. שנו את התכונות המרחביות של תמונה (לוח תהליכים , סעיף שינוי תכונות ערוץ ).
    הערה: כל הפקודות חלות רק על הערוץ הפעיל, והתוצאות מוצגות אוטומטית בחלון התמונה המקורי. לא נוצר חלון תמונה חדש.
    1. הזז את מחוון ה-Smooth כדי להחיל טשטוש גאוסיאני, ובכך להפחית את השונות הרגילה בין פיקסלים לפיקסל (~רעש צילום ורעש קריאה).
      1. עבור תמונות דגימות ~Nyquist (גודל פיקסל xy של 70-150 ננומטר), התחל בערכי סליידר בין 1.0 ל-2.0.
      2. עבור גודל פיקסל נתון, הגדילו את ערך הסליידר ככל שיחס האות לרעש (SNR) של התמונה יורד.
      3. בהינתן SNR, הגדל את ערך הסליידר ככל שגודל הפיקסל קטן.
      4. עבור ערימות תמונות, יש ליישם החלקה תלת-ממדית, שבה רדיוס ה-z מוגדר אוטומטית לשליש מרדיוס ה-xy, בהתאם לנתונים שנדגמו על ידי נייקוויסט.
        הערה: ערך הסליידר מתאים לסטיית התקן של גרעין גאוסיאני הנמדדת בפיקסלים.
    2. הזז את מחוון ה-Denoise כדי להחיל פילטר חציון, ובכך להסיר חריגים קיצוניים (פיקסלים חמים במצלמה או פליטות תרמיוניות PMT).
      הערה: ערך הסליידר מתאים לרדיוס של ליבת קופסה בפיקסלים. ערכים בין 0.5 ל-1.0 הם נקודת התחלה טובה.
    3. הזז את מחוון ה-Sharpen כדי להחיל מסכה דו-ממדית לא חדה, ובכך להפחית טשטוש או ערפל, כפי שיכול להיגרם מאור לא מפוקוס. השחזה גם מדגישה רעש.
      הערה: ערך הסליידר מתאים לסטיית התקן של גרעין גאוסיאני (ביחידות פיקסלים) המשמשת להגדרת קנה המידה של הטשטוש. עבור תמונות ~Nyquist (גודל פיקסל xy של 70-150 ננומטר), ערכי סליידר בין 2.0 ל-4.0 הם נקודת התחלה טובה. פרמטר המשקל קבוע ב-0.6.
  2. לשנות את עוצמות הפיקסלים בתמונה (תהליך פאנל, שינוי עוצמות הערוץ הקטע).
    הערה: כל הפקודות חלות רק על הערוץ הפעיל, והתוצאות מוצגות אוטומטית בחלון התמונה. לא נוצר חלון תמונה חדש.
    1. הזז את מחוון Sub.Bkgd. כדי להחיל את אלגוריתם 'כדור מתגלגל', ובכך להסיר את הרקע (כלומר, שינויים הדרגתיים במרחב בעוצמה).
      הערה: ערך הסליידר הוא רדיוס הכדור המתגלגל בפיקסלים, ולכן ערכים גדולים יותר יפריעו פחות רקע כולל. הערך תלוי בתוכן התמונה, אך בדרך כלל צריך להיות גדול פי ≥פי 2 מהגודל (הנמדד בפיקסלים) של התכונות שיש לשמר. ערכים בין 10 ל-20 הם לעיתים נקודת התחלה טובה.
    2. הזז את מחוון הגמא כדי לשפר את ההמחשה של אותות חלשים מעורבים עם אותות בהירים יותר, כמו אלו שעשויים להידרש להדגשת מבנים עדינים כאשר הם משולבים עם מבנים גדולים.
      הערה: לאחר הנרמליזציה, ערך כל פיקסל מוגדל לעוצמה (אקספוננט) הניתנת על ידי ערך הסליידר. הערך תלוי בתוכן התמונה, אך ערכים בין 0.6 ל-0.8 הם לעיתים נקודת התחלה טובה.
      אזהרה: תמונות שבהן הוחל גמא אינן יכולות לשמש לכימות עוצמה.
    3. לחץ על כפתור Apply Gain and Offset: ToCh או ToAll כדי למפות את טווח התצוגה של התמונה (כפי שמוגדר על ידי מחווני הגבר וההזחה בפאנל התצוגה) לטווח העוצמות המלא שמספק עומק הסיביות של התמונה.
      הערה: תהליך זה ידוע גם כיישום טבלת חיפוש (LUTs). יש להחיל את רווח התצוגה וה-Offset בדרך זו לפני יצירת תצוגות ערוץ בפאנל התצוגה .
    4. השתמשו בכפתורי תיקון עוצמה כדי לתקן שינויים ארטיפקטואליים בעוצמה בממדים z או t- של תמונות תלת-ממדיות, כמו שיכולים להיגרם מהלבנת פוטו, סטיות או פיזור אור.
      הערה: הפעולה מוחלת רק על הערוץ הפעיל. תיקונים מקומיים וגלובליים יכולים להיות מיושמים ברצף על אותו מערך נתונים. ראו את סעיף התוצאות להסבר נוסף על השיטות הבסיסיות.
    5. לחצו על כפתורי הגלובלי כדי לתקן אובדן עוצמת אות הדרגתי המתרחשים לאורך כל ממד z או t, תוך שמירה על רוב השינויים בעוצמה הביולוגית. ישנן שתי אפשרויות:
      1. לחץ על כפתור GlobalL כדי לתקן ערימות z-stack שבהן הפרוסות הראשוניות עשויות להיות כהות או שחורות, ואובדן העוצמה הכולל מהפריים הראשון לאחרון הוא קל (<50%). האלגוריתם מדמה את אובדן העוצמה כמגמה ליניארית ואז מפעיל מקדם תיקון על כל פרוסה כך שהשיפוע של קו ההתאמה הופך לאפס.
      2. לחץ על כפתור GlobalP כדי לתקן סדרות זמן שבהן הפריימים הראשונים הם הבהירים ביותר, ואובדן העוצמה הכולל מהפריים הראשון לאחרון משמעותי (50%-95%). האלגוריתם מדמה את אובדן העוצמה כמגמת פולינומיםמסדר שני ואז מיישם גורם תיקון לכל פרוסה כך שעקומת ההתאמה הופכת לקו עם שיפוע אפס.
    6. לחץ על כפתור המקומי כדי לתקן שינויים מקומיים ופתאומיים בעוצמת האות, תוך שמירה על שינויים הדרגתיים.
      הערה: שינויים כאלה עשויים להיגרם מהלבנה של כמה מישורים בתוך מחסנית z גדולה יותר או מתנודות בעוצמת עירור (הבהוב). האלגוריתם מדמה שינויים ביולוגיים רלוונטיים בעוצמה כפולינום מסדר רביעי ואז מיישם גורם תיקון כדי להבטיח שהעוצמה החציונית של כל מסגרת שווה לערך העקומה המותאמת.
    7. לחצו על כפתור האיזון כדי להפוך את עוצמת האות החציונית של כל פריים לשוויה, בדומה לשיטת תיקון הלבין 'יחס פשוט' בפיג'י.
      אזהרה: אקולייז עשוי להיות שימושי לצורכי ויזואליזציה כאשר כל שאר השיטות נכשלו, אך הוא ימחק שינויים ביולוגיים רלוונטיים בעוצמה החציונית ולכן לא ניתן להשתמש בו יחד עם כימות העוצמה.
  3. שנו את הממדיות של התמונה (לוח תהליכים , סעיף שינוי מידות ).
    הערה: פקודות אלו חלות על כל הערוצים בחלון התמונה ואי אפשר להפך אותן באמצעות כפתור הביטול .
    1. לחצו על כפתור הסיבוב כדי לסובב את התמונה, כפי שנדרש ליישור הצירים האנטומיים של עובר או רקמה עם הדף או המסך.
    2. לחץ על כפתור החיתוך כדי להקטין את מידות ה-xy של התמונה. חפש את כלי ה-ROI המלבני שנבחר אוטומטית, ותתבונן בהנחיה לצייר ROI על התמונה שתשמש לחיתוך.
    3. לחץ על כפתור Subset כדי ליצור ערימת תמונה חדשה מתוך תת-קבוצה של המידות הלא-xy של תמונת הקלט.
      הערה: זה משמש להסרת תעלות ו/או לחיתוך פרוסות ב-z או t.
  4. הקלט את פקודות העיבוד המופעלות על תמונה (לוחל תהליך, סעיף הקלטת פעולות).
    הערה: מטרת מקליט הפעולות היא לתעד אוטומטית פעולות כטקסט רגיל ואז לשמור את התמונה עם הפעולות שהוחלו, שמשנות את ערכי עוצמת הפיקסלים. היומן הוא נוחות כך שהמשתמש לא יצטרך לרשום הערות ידנית או לפענח את רשומות מקרו Fiji Recorder. פקודות שאינן משנות עוצמות פיקסלים אינן מתועדות.
    1. לחץ על כפתור Rec כדי להתחיל הקלטת פקודות.
      הערה: הפנים של הכפתור מופיעות 'ON' כאשר המקליט מקליט. פקודות שבוצעו והפרמטרים הנלווים יופיעו בטבלת הפעולות. פקודות ש'בוטלו' מוסרות מהטבלה.
    2. לחץ על כפתור ה-Clr כדי לנקות את טבלת הפעולות.
    3. לחץ על כפתור השמירה כדי לשמור את טבלת הפעולות כקובץ טקסט. אם הפעולות שהוחלו על מספר תמונות נרשמו, הפעולות יאוקצו לפי כותרת התמונה כאשר קובץ הטקסט נשמר.
      הערה: חלופה היא לשמור תמונה באמצעות לוח השמירה (סעיף 4 למטה). סמן את תיבת שמור פעולות וכל הפעולות שיחולו על התמונה יישמרו אוטומטית כקובץ טקסט באמצעות שם התמונה ונתיב הקובץ.

4. שימוש בפאנל השמירה של EasyFiji

הערה: כפי שמוצג באיור 1C, לוח השמירה נועד לסייע ללא-מומחים לבחור את פורמט קובץ התמונה המתאים לשימוש המיועד להם. כאשר תיבת הסימון Save Operations מסומנת, כל פעולות העיבוד המיושמות על תמונה, כפי שמופיע בטבלת הפעולות, נשמרות אוטומטית עם התמונה, תוך שימוש באותו שם קובץ ונתיב, למעט עם סיומת *.txt. אם מספר תמונות פתוחות ועובדו במקביל, כל הפעולות שבוצעו על כל התמונות מוצגות בטבלת הפעולות. עם זאת, רק הפעולות המופעלות על התמונה הנשמרת נשמרות עם אותה תמונה. קובץ הטקסט השמור מופיע במערכת הקבצים אך אינו נפתח בפיג'י. אם רוצים, ניתן לפתוח קבצי טקסט בפיג'י על ידי גרירת סמל הקובץ לסרגל הכלים של פיג'י.

  1. שמור תמונה (שמור פאנל, סעיף שמירה).
    1. לחצו על כפתור Raw Data כדי לשמור את התמונה כקובץ *.tif, שבו נשמרים ערכי פיקסלים מדויקים, מבנה ערוץ וחלק מהמטא-דאטה. השתמש באפשרות זו כאשר המטרה היא לכמת או לנתח תמונה לעומק.
    2. לחץ על כפתור השמירה להצגה כדי לשמור את התמונה כפי שמוצגת כיום באמצעות דחיסת jpeg לצורכי שליחת דוא"ל או שימוש במצגת שקופיות.
      אזהרה: אפשרות זו לעולם לא צריכה לשמש ליצירת נתונים או לניתוח כמותי.
    3. הזז את מחוון רמת האיכות כדי להגדיר את רמת הדחיסה ב-jpeg.
      הערה: ערכים גדולים יותר מתאימים לשימור טוב יותר של עוצמות ותכונות פיקסלים (וגודל קובץ גדול יותר), אך לעולם לא כל התכונות נשמרות.
    4. לחץ על כפתור Save for Figure כדי לשמור את התמונה כפי שמוצגת כיום בפורמט png התואמת לתוכנות גרפיקה אחרות (כגון Photoshop, Illustrator, Publisher או GIMP). התמונה נשמרת כפי שמוצגת על המסך, אך הערוצים והמטא-דאטה אינם נשמרים.
      אזהרה: אפשרות זו לעולם לא צריכה לשמש לכמות.
    5. לחץ על כפתור שמור כסרט כדי לשמור ערימת תמונות כסרט בפורמט mov שמתנגן בין הפרוסות ברצף (z או t).
      הערה: השמעת קבצי mov במערכת הפעלה מבוססת Windows דורשת את נגן המדיה VLC בקוד פתוח.

5. שימוש בפאנל המידע של תמונות EasyFiji

הערה: כפי שמוצג באיור 1D, לוח Image Info מציג הגדרות רכישה ספציפיות לספקים בטקסט פשוט, החיוניות לפרשנות התמונה. ראו טבלה 2 לרשימה של סוגי פורמטים של תמונות קונפוקליים הנתמכים כיום.

  1. לחץ על כפתור Channel Info כדי לטעון את הגדרות הרכישה .
  2. ראו את סעיף מידע הערוץ להגדרות רכישה מותאמות לערוץ, כולל אחוז עוצמת לייזר, אורך גל לייזר, פס פליטה, רווח וגודל חור סיכה.
  3. ראו את סעיף תצורת המערכת להגדרות תמונה רחבות, כוללשם s-ystem, אובייקטיביה, מצב סריקה, זמן השהייה וגודל ווקסל.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הדמיות פסאודו-צבעוניות של תמונות פלואורסצנציה רב-ערוציות יכולות לשמש להמחשת הקשרים המרחביים או העוצמתיים בין אותות; עם זאת, פיג'י המקורית מציעה רק טכניקת רינדור RGB מורכבת שמבלבלת מטבעה צבע ובהירות ברמת התפיסה. להמחשת בעיה זו, איור 2 משתמש בתמונה דו-ערוצית של N-Myc ו-RNA פולימראז II (RNAPolII). באיור 2A, כל ערוץ מוצג בנפרד בגווני אפור כך שאין מידע כרומטי (אולי מבלבל). באיור 2B, הערוצים מוצגים יחד כה...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פיג'י היא תוכנה לעיבוד וניתוח תמונות בקוד פתוח, פופולרית מאוד בקרב אנליסטים של תמונות. עם זאת, ממשק התפריט המורכב שלו ולעיתים התנהגויות לא אינטואיטיביות ביחס להצגת ועיבוד תמונות פלואורסצנטיות מציבים אתגרים למדעני חיים שאינם חישוביים. EasyFiji מציעה למדעני החיים סט מאוזן של כפתורים וסליידרים מאורגנים נושאית ומשופרים לפי טיפים שמציגים באופן עקבי התנהגויות ספציפיות לערוץ, כפי שנדרש בעבודה עם תמונות פלואורסצנטיות. כל פקודות העיבוד אינן ניתנות לביצוע, ומאפשרות אינטראקטיביות וניתן גם להקליט ול...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים או ניגודי עניינים אחרים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לחברי מרכז הדמיית תאים ורקמות סנט ג'וד וממרכז לאינפורמטיקה ביואימג'ית על תגובותיהם לכתב היד. תמונות ביולוגיות סופקו בנדיבות על ידי: איור 2: מליסה מרזאן וטניה מיטאג; איור 3: פנג ווי וג'יימס מורגן; איור 4א: אהרון פיטרה; איור 4B: אהרון פיטרה וו ג'ונג צ'ו; איור 5A: הלן צ'ן והית'ר מפורד; איור 5B: סאוראדיפ סינה וגיידרה קרנצ'יוטה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
אתר EasyFiji GitHubקוד פתוחhttps://github.com/stjude/EasyFiji
פורום EasyFiji Image.scקוד פתוחhttps://forum.image.sc/t/announcing-easyfiji-a-user-friendly-gui-plugin-for-fiji/117617
אתר EasyFiji ImageJ.netקוד פתוחhttps://imagej.net/plugins/EasyFiji_plugin#quick-start
תוכנת פיג'יקוד פתוחhttps://imagej.net/software/fiji/downloads
נגן המדיה VLCקוד פתוחhttps://www.videolan.org/vlc/

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  2. Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529(2017).
  3. Mutterer, J. Custom toolbars and mini applications with Action Bar. Figshare. 10 (m9), (2017).
  4. Levet, F., et al. Developing open-source software for bioimage analysis: opportunities and challenges. F1000Res. 10, 302(2021).
  5. Aaron, J. S., Taylor, A. B., Chew, T. L. Image co-localization-co-occurrence versus correlation. J Cell Sci. 131 (3), (2018).
  6. Taylor, A. B., Ioannou, M. S., Watanabe, T., Hahn, K., Chew, T. L. Perceptually accurate display of two greyscale images as a single colour image. J Microsc. 268 (1), 73-83 (2017).
  7. Mary, H., Brouhard, G. KymographBuilder. , https://imagej.net/plugins/kymograph-builder (2016).
  8. Schanda, J. Colorimetry: understanding the CIE system. , Wiley Interscience. Hoboken. (2007).
  9. Dunn, K. W., Kamocka, M. M., McDonald, J. H. A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy. Am J Physiol Cell Physiol. 300 (4), C723-C742 (2011).
  10. Miura, K. Bleach correction ImageJ plugin for compensating the photobleaching of time-lapse sequences. F1000Res. 9, 1494(2020).
  11. Reid, R. C. Jr, Shapley, R. Brightness induction by local contrast and the spatial dependence of assimilation. Vision Res. 28 (1), 115-132 (1988).
  12. Stauffer, W., Sheng, H., Lim, H. N. EzColocalization: an ImageJ plugin for visualizing and measuring colocalization in cells and organisms. Sci Rep. 8 (1), 15764(2018).
  13. Taylor, A. B., Ioannou, M. S., Aaron, J., Chew, T. L. Model-free quantification and visualization of colocalization in fluorescence images. Cytometry A. 93 (5), 504-516 (2018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Fluorescence Image ProcessingFiji PluginGraphical User InterfaceBioimage AnalysisChannel AdjustmentBleach CorrectionMaximum Intensity ProjectionColocalization AnalysisImage MetadataGaussian Blur

Related Articles