מאמר שיטה

יצירת אורגנידים אלוואולריים A549/MRC-5 משובצים בקולגן בתלת-ממד באמצעות ביוריאקטור מכני המתיח תאים

DOI:

10.3791/69447

⸱

27 במרץ 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, University of British Columbia - Okanagan, 2Centre for Heart Lung Innovation, St. Paul's Hospital, University of British Columbia

* These authors contributed equally

במאמר זה

הודעת תיקון

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר את יצירת האורגנואידים מתאי אפיתל אלוואולרי A549 ופיברובלסטים ריאתיים MRC-5 על פיגום הידרוג'ל חוץ-תאי, ולאחר מכן הטמעה בג'לים קולגן תלת-ממדיים וחשיפה למאמץ מכני באמצעות ביוריאקטור מתיח תאים לחקר מכנוביולוגיה אלוואולרית.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למרות שדינמיקת הנשימה והמתח המכני ממלאים תפקידים קריטיים בביולוגיה האלוואולרית, תרומתם לפתוגנזה של מחלות נשימה לעיתים קרובות מתעלמים מהם. כדי להתמודד עם הפער הזה, פיתחנו מודל אורגנואידי שבו אורגנואידים אפיתליאליים-פיברובלסטים אלוואולריים נחשפים למאמץ מכני מבוקר באמצעות ביוריאקטור המתיחה של תאים. פלטפורמה זו משחזרת את הארגון המרחבי והמורכבות הרב-תאית של רקמת האלוואולר ומאפשרת חקירה של האופן שבו תקשורת תא-תא ומכנוטרנסדוקציה משפיעות על מבנה ותפקוד הרקמה בבריאות ובמחלות. בפרוטוקול זה אנו מתארים שיטות ליצירה וטיפוח אורגנואידים אפיתליים-פיברובלסטים באמצעות קווי תאים אפיתל אלוואולרי A549 וקווי תאי פיברובלסטים ריאתיים MRC-5 במטריצת הידרוג'ל חוץ-תאית ממברנת בסיס. אורגנואידים מבודדים לא-אנזימטית ומוטמעים בג'לים תלת-ממדיים של קולגן בלוחות מיוחדים בביוריאקטור. אנו מתארים נהלים ליישום מאמץ אקוויביאקסיאלי כדי לחקות דפוסי נשימה פתולוגיים הנראים בהחמרות נשימתיות. לבסוף, אנו מציגים תהליך אפיון סטנדרטי, הכולל צביעת חיסון לסמנים ספציפיים לתאים ואימונואסיי לשחרור מתווך חיסוני. יחד, ניתוחים אלו תומכים בהערכת מבנה ותפקוד אורגנואידים. פרוטוקול זה מספק פלטפורמה ידידותית למשתמש, ניתנת לשחזור והתאמה ללימוד ביולוגיה אלוואולרית תחת לחץ מכני, עם פרמטרים הניתנים לשינוי בקלות כדי לעמוד במטרות ניסוי מגוונות ולקדם מחקר במנגנוני מחלות ריאות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הנאדיות הן שקי הקצה של מערכת הנשימה ומשמשים כאתר העיקרי להחלפת גזים. הם מורכבים בעיקר מתאי אפיתל אלוואולריים מסוג I ו-II, האחראים על החלפת גזים, תפקודי מערכת החיסון ושמירה על שלמות מבנית, ופיברובלסטים בתוך הקירות, השומרים על הומאוסטזיס מטריצתי חוץ-תאי1. תאים אלו ותאים תושבים אחרים חשופים ללא הפסקה למתיחה מחזורית ולמתח גזירה במהלך הנשימה2. רמזים מכניים כאלה מועברים לאותות ביוכימיים המשפיעים על מבנה התא, התמיינות ותקשורת3.

מתח מכני פתולוגי נצפה במחלות ריאה כגון מחלת ריאות חסימתית כרונית (COPD). COPD הוא מצב מתקדם המאופיין בהרס פרנכימלי, דלקת כרונית והיצרותדרכי הנשימה הקטנות. במחלה זו, הרס דפנות אלוואולריות, אובדן אלסטין, עיצוב מחדש של מטריצת חוץ-תאית (ECM) שמוביל לפיברוזיס ודלקת כרונית פוגעים יחד ביכולת הריאה לעמוד בנזק מבני 5,6. דבר זה גורם לעיוות אלוואולרי הטרוגני וחריג במהלך הנשימה, שמחמיר עוד יותר במהלך התפרצויות מחלה 7,8.

בעוד שמספר גישות in-vitro שימשו לחקר ביולוגיה אלוואולרית, לכל אחת מהן יש מגבלות בולטות. מערכות קו-קולטורציה דו-ממדית מסייעות בחקירת אינטראקציות תא-תא אך אינן מצליחות ללכוד את ארכיטקטורת הרקמה או דינמיקת המטריצות החוץ-תאיות, ומפחיתות את הרלוונטיות הפיזיולוגית. תרבויות תלת-ממדיות סטטיות שומרות טוב יותר על ארגון מבני ואינטראקציות מטריצות, אך אינן כוללות רמזים מכניים דינמיים הקיימים ב-vivo. פלטפורמות מיקרופלואידיות ואיבר על שבב יכולות לחקות זרימת נוזלים ועיווץ מכני, ולספק דיוק פיזיולוגי גבוה, אך לעיתים קרובות הן מורכבות טכנית, בעלות תפוקה נמוכהויקרות. לעומת זאת, המודל האורגני התלת-ממדי המורכב מכנית המוצג כאן משלב מורכבות מבנית, הטרוגניות תאית וגירוי מכני מבוקר, היבט שלרוב מתעלמים ממנו במודלים קיימים, בתוך פלטפורמה ניתנת לשחזור וניתנת להרחבה המציעה איזון בין רלוונטיות פיזיולוגית לנגישות ניסויית10,11.

כדי להבין את המנגנונים המורכבים התורמים למחלות כמו COPD ולגלות מטרות טיפוליות, הוקמו מודלים של מחלה. למרות חשיבותו, לעיתים קרובות מתעלמים מהמתח המכני במודלים אלוואולריים במבחנה המשמשים לחקר המנגנונים והפתוגנזה של מחלות ריאה כמו COPD. כדי להתמודד עם הפער הזה, אנו מציגים שיטה לגידול אורגנידים אפיתליים-פיברובלסטים אלוואולריים במטריצת בסיס, שליפת והטמעה בג'לים תלת-ממדיים של קולגן, יישום עיוות מכני מחזורי באמצעות ביוריאקטור המתיחת תאים, והערכת תוצאות מבניות ותפקודיות מרכזיות. מודלים אורגניים מכניים תלת-ממדיים אלו לוכדים טוב יותר אינטראקציות תאיות ומיקרוסביבה של נישת האלוואולריות האנושיות, ומאפשרים חקר חיבור אפיתלי-מזנכימי12.

הביוריאקטור מפעיל עיוות אקוויביאקסיאלי עם פרמטרים ניתנים להגדרה, ומאפשר הארכה של עד 30% ותדרים של עד 5 הרץ כדי למודל תנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים. במחקר זה יצרנו מודלים אורגנואידיים המוטמעים בהידרוג'לים של קולגן-I שנחשפו למאמץ של 18% ב-0.4 הרץ במשך 24 שעות כדי לחקות נשימה פתולוגית. הקמנו תהליך אפיון סטנדרטי הכולל צביעת חיסון לסמנים ספציפיים לתאים ואימונואסיי לכימות שחרור המתווך החיסוני לאחר מאמץ מכני. מטרת מחקר זה היא לספק פלטפורמה פיזיולוגית, ידידותית למשתמש וגמישה לחקר ביולוגיה אלוואולרית תחת לחץ מכני.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל השלבים דורשים טכניקה אספטית, חומרים סטריליים ומגבים, ומבוצעים בארון בטיחות ביולוגית כדי להפחית חשיפה לחומרים ביולוגיים מזהמים ולזיהום תרביות. החומרים והציוד בהם משתמשים מופיעים בטבלת החומרים.

1. תרבית תאים והקמת מלאי תאים

  1. לפני היווצרות אורגנואידים, תרביות A549 ותאי MRC-5 על בקבוקי פלסטיק סטנדרטיים שטופלו בתרבות רקמה (T75ס"מ 2) עד כ-70%-80% חיבור באמצעות מדיום הנשר המותאם של Dulbecco (DMEM) בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS) ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין, המכונה "DMEM מלא".
  2. עבור A549 ו-MRC-5, זרע ב-2 x 104 תאים לס"מ 2, בנפח כולל של 10 מ"ל DMEM מלא. תרבית תאים בטמפרטורה של 37°C עם 5%CO2 בסביבה לחה עד שמגיעים לכ-70%-80% מפגש גוף.
  3. החלף את מדיום התרבית כל 48 שעות כדי להבטיח תנאי גדילה מיטביים.
  4. תת-תרבות על ידי שאיפת כל המדיה מהבקבוק לאחר שמגיעים ל-70%-80% מתאחדים, שטוף פעם אחת עם מלח חמים עם פוספאט (PBS), ואז מוסיפים 4 מ"ל טריפסין-EDTA.
  5. דגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות וצפו את הבקבוקים עם מיקרוסקופ שדה בהיר כדי להבטיח ניתוק מוחלט. לנטרל על ידי הוספת 4 מ"ל DMEM מלא.
  6. ספרו את התאים בטכניקה המועדפת, כמו ספירת החרגה בכחול טריפן.
  7. צנטריפוגה את מתלי התא בעוצמה של 200 x g למשך 5 דקות.
  8. שאיפת הסופרנטנט כדי להשאיר כדור תא בתחתית הצינור הקוני. החזירו את כדור התא בנפח מתאים של DMEM מלא על ידי פיזור עדין.
  9. להקפאה, יש להשעות מחדש במדיה מלאה המכילה 10% DMSO כדי להניב 1 x 106 תאים למ"ל. ליצירת אורגנואידים, יש להשעות מחדש כדי לקבל 1 x 106 תאים למ"ל.

2. קביעת ואפיון הבשלות של מודל אורגנואיד תלת-ממדי אפיתליאלי-פיברובלסטים

הערה: יש להפשיר את מטריצת המרתף על קרח למשך הלילה ולשמור אותה על קרח במהלך שלבים אלה. טמפרטורות גבוהות עלולות לגרום להתמצקות של המטריצה.

  1. הכן תערובת 2:3 של מטריצת מרתף ו-DMEM מתקדם. הוסף 300 מיקרוליטר מהתמיסה הזו לכל באר של צלחת 24 בארות, כדי להבטיח שתחתית כל באר מצופה באופן שווה. דגרו את הפלטה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור לח למשך שעה כדי לאפשר למטריצה להתגבש.
  2. הכינו תמיסת מטריצת בסיס של 5% ב-DMEM מלא, שיהיה מדיום התרביות של האורגנואידים. לכל באר, יש ליצור 1.2 מ"ל של תמיסה זו על ידי דילול 60 מיקרוליטר של מטריצת בסיס ב-1,140 מיקרוליטר של DMEM שלם.
  3. בזמן שהתערובת של מטריצת הבסיס מתגבשת, ערבבו 300,000 תאי A549 עם 30,000 תאי MRC-5 ב-200 מיקרוליטר של תמיסת מטריצת בסיס 5% המיוצרת ב-DMEM מלא המתואר בשלב 2.2.
  4. לאחר שתערובת הבסיס ביחס 2:3 התקשה, הפיפטה של 200 מיקרוליטר מתערובת A549/MRC-5 על המטריצה הג'לית, ואז מחזירים את צלחת 24 הבארות לדגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂ במשך 21 ימים כדי לאפשר גדילה והבחנה של האורגנידים האלוואולריים.
  5. תדמיין את התרביות תחת מיקרוסקופ אור במשך 48 השעות הבאות. תאים אמורים להצטבר בתקופה זו.
  6. החליפו את תמיסת מטריצת הבסיס/DMEM של 5% כל 48 שעות ב-200 מיקרוליטר של תמיסת חומר מדיום טרי של 5%. כדי למנוע הפרעה לאורגנואידים הטבועים בהידרוג'ל, הטה בעדינות את הפלטה כך שהתמיסה הישנה תתאסף לאורך דופן הבאר לפני השאיבה.
  7. בימים 3, 9 ו-21 של ההבשלה, צילם את האורגנידים בהגדלה אובייקטיבית פי 10 וצלם ארבע תמונות מייצגות או שדות ראייה של כל באר. תמונות מייצגות של מורפולוגיית אורגנואידים מוקדמת בימים 3, 9 ו-21 מוצגות באיור 1.
  8. לכל שדה ראייה, סופרים את כל האורגנידים הגדולים מ-50 מיקרון בקוטר. באמצעות השטח הידוע של שדה הראייה, יש להסיק את המספר הכולל הממוצע של אורגנואידים לכל באר מהספירה הממוצעת לשדה, בהנחה של שטח פנים של 24 בארות של 1.9 ס"מ².
    הערה: ניתוחים אלו ניתנים לשימוש בתוכנות ניתוח תמונות כמו Fiji13.
  9. ניתן גם למדוד את הקוטר הממוצע והשטח של האורגנידים כדי לקבל מידע כמותי על מאפייני הגידול של האורגנידים בתרבית.

3. איסוף אורגנואידים תלת-ממדיים אפיתל פיברובלסטים אלוואולריים תלת-ממדיים

הערה: כל השלבים לקצירת האורגנואידים צריכים להתבצע על קרח.

  1. לאחר 21 ימי הבגרות, שואף את הסופרנטנט ושוטף בעדינות עם כ-1-2 מ"ל של PBS קר כקרח.
  2. הוסף 1-2 מ"ל של תמיסת קטיף אורגנואידים קרה ודוגר את הפלטה בטמפרטורה של 2-8 מעלות צלזיוס למשך 30-90 דקות עם ניעור מתון.
    הערה: עצור את הדגירה כאשר האורגנידים נראים צפים בתחתית הבאר.
  3. עקוב אחרי הדיסוציאציה באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר. דיסוציאציה נחשבת לשלמה כאשר מטריצת הבסיס בתחתית הבאר כבר אינה נראית והאורגנואידים תלויים. ניתן להשתמש במגרד תאים כדי לשחרר בעדינות את ההידרג'ל של מטריצת אורגנואיד-בסיס כדי להאיץ את התהליך.
  4. אסוף את תכולת כל הבארות לצינור קוני של 50 מ"ל על קרח.
  5. צנטריפוגה ב-500 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 2-8 מעלות צלזיוס. שואף את הסופרנטנט, שטוף את הכדור האורגנואידי עם 1-2 מ"ל של PBS קר כקרח, ואז צנטריפוגה שוב כדי לקבל כדור. שאפו את ה-PBS.

4. קביעת אורגנידים תלת-ממדיים של אלוואולא-פיברובלסטים המוטמעים בקולגן ויישום מאמץ מכני

הערה: השתמשו בלוחות תרבית קצף עגולים עם עוגני קצף התואמים לביוריאקטור למתיחת תאים. לפלטת הגידול המשמשת בפרוטוקול זה שטח גדילה של ~6.6 ס"מ רבוע.

  1. הכינו תמיסה עובדת של 2 מ"ג/מ"ל ג'ל קולגן I. התמיסה צריכה להכיל 1× PBS, 11.4 mM NaOH ו-2 mg/mL קולגן I, כאשר הנפח הסופי מכוון באמצעות מים סטריליים. הכינו 2 מ"ל של תמיסת הקולגן I הזו לכל באר של צלחת הקצף העגולה עם 6 בארות.
  2. הוסף 1 מ"ל מתמיסת הקולגן I של 2 מ"ג/מ"ל לעוגנים הקצף בשולי הפלטה, כדי להבטיח רוויה מלאה.
    הערה: עוגני הקצף חייבים להיות רוויים היטב בתמיסת קולגן I כדי להבטיח הידבקות נכונה. רוויה לא שלמה עלולה לגרום להיפרדות ג'ל הקולגן במהלך יישום מאמץ מכני, מה שמוביל להפחתת עווות אפקטיבי בהשוואה למטרה המיועדת.
  3. החזירו את הכדור האורגנואידי ל-6 מ"ל של 2 מ"ג/מ"ל של קולגן זנב עכברוש ופיפטה 1 מ"ל של התלייה במרכז פלטת קצף עגולה בעלת 6 בארות, כדי להבטיח שתערובת הקולגן המושרעת באורגנואידים מתערבבת עם הקולגן הראשוני ללא אורגנואידים שנוסף לעוגני הקצף העגולים.
    הערה: הימנעו מיצירת בועות בעת הוספת תליית האורגנואיד לכל באר.
  4. פולימרז את הקולגן-I למשך שעה על ידי השארת הלוחות באינקובטור (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2). לאחר הפולימריזציה, הג'ל אמור להיראות עכור.
  5. הוסף 2 מ"ל DMEM מלא מעל אורגנואידים A549/MRC5 מוטבעים בתלת-ממד עם קולגן תלת-ממדי והחזיר את הלוח לאינקובטור למשך 24 שעות.
  6. החלף את מדיום הגידול ב-DMEM + 1% FBS ודגר לילה לפני החשיפה למאמץ מכני.

5. הגדרת ביוריאקטור למתיחה של תאים וחשיפה לעומס מכני

  1. הכנס תחנות טעינה לכל באר בלוח הבסיס. אלה מכילים שישה עמודי טעינה בקוטר 25 מ"מ, המאפשרים לממברנה הגמישה של לוחות רכבת הרקמה להתעוות סביבם ולחשוף את התרבית התלת-ממדית למתח שווה צירים.
  2. מרחו שכבה דקה של גריז סיליקון על ראש עמודי הטעינה.
  3. הנח אטמים אדומים בתחתית כל פלטה עם 6 בארות.
  4. הכנס את הלוחות המוכנים לפלטת הבסיס מעל עמודי הטעינה.
  5. העבר את המכשיר הזה לאינקובטור לח בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5%CO2 וחבר את חיבורי הניתוק המהיר ללוח הבסיס. חזור על שלבים 5.1 עד 5.6, אך השמיט את החיבורים כדי ליצור שליטה לא מתוחה.
    הערה: באופן אופציונלי, ניתן להחיל פקק אטימת צינור, שמונע הפעלת לחץ ואקום בתחתית באר BioFlex אחת, ומאפשר יצירת תרבית בקרה לא מתוחה על אותה פלטה.
  6. כסו עם יריעת פלקסיגלס והוסיפו ~5-10 פאונד משקל כדי להבטיח אטימה הדוקה.
  7. הפעל את מדחס האוויר ופתח את שסתום היציאה מהמדחס.
  8. הפעל את משאבת הלחץ בוואקום ופתח את שסתום מיכל הלחץ שמחובר לזרימת היציאה של מיכל הוואקום. ודא שלחץ הוואקום הוא סביב 90 קילופסקל.
  9. פתח את שסתום הזרימה מהמדחס האוויר שנמצא ליד בקר הביוריאקטור. כוון את הלחץ כך שהוא לא יעלה על 15 PSI ביציאת האוורור.
  10. הפעל את התוכנה המובנית והגדר את פרמטרי המאמץ המחזורי הרצויים. למחקר זה נעשה שימוש במשטר של 18% משרעת עיוות ב-0.4 הרץ למשך 24 שעות. כדי להגדיר זאת, ליצור שגרה חדשה, להגדיר את ההארכה המינימלית ל-0%, את ההארכה המקסימלית ל-18%, ולהתחיל את הפרוטוקול.
  11. התבוננו בצלחת ובממברנה כדי לוודא שהתנועה נראית לאורך כל האימון. הממברנה אמורה להתעוות סביב עמודי הטעינה.
  12. בדקו את מלכודת המים ללחות מדי פעם, וצפו במסך המחשב לזמן הפעלה, התקדמות ומורפולוגיה מתאימה של משטר המאמץ.
  13. נתק את מכלול לוח הבסיס לאחר סיום משטר העיוות, והחזר את התרביות המאומנות לדגירה למשך 24 שעות לפני ניתוחי האפיון בהמשך.
  14. כבה ופרק את המערכת בסדר ההפוך של ההפעלה: סגור או כבה את שסתום הזרימה של מדחס האוויר, אחר כך את שסתום מיכל הלחץ, משאבת הלחץ הוואקום, שסתום היציאה של מדחס האוויר, ולבסוף את מדחס האוויר, בסדר הזה.
  15. איסוף הסופרנטנט לאחר 24 שעות דגירה בעקבות חשיפה למאמץ מכני. אחסן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד לשימוש.

6. אפיון מורפולוגי של אורגנידים באמצעות אימונופלואורסצנציה

  1. שטפו את דגם ג'ל האורגני-קולגן שלוש פעמים עם PBS על ידי הוספת עדינות של 1 מ"ל PBS, תוך דגירה של 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  2. שאף בזהירות את ה-PBS וחזר על תהליך הכביסה שלוש פעמים בסך הכל.
  3. קבע את המודל על ידי דגירה של 2 מ"ל של 4% פאראפורמלדהיד למשך שעה אחת בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  4. שטוף את הדגמים שלוש פעמים עם PBS כפי שתואר למעלה.
  5. השתמשו בסקלפל כדי לחתוך בעדינות את עוגני הקצף העגולים בבארות הגמישות עם ג'ל הקולגן מחובר והניחו אותו בצלחת פטרי.
  6. חדיר את האורגנואידים על ידי דגירה עם 2 מ"ל של 0.1% טריטון X-100 ב-PBS למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  7. שטוף את הדגמים שלוש פעמים עם PBS.
  8. חסום קישור לא ספציפי על ידי דגירה של המודלים עם 3 מ"ל של 5% אלבומין סרום בקר (BSA) ב-PBS למשך שעה בטמפרטורת החדר. הסר את תמיסת החסימה והמשך לשלב הבא.
  9. דגרו את המודלים במהלך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עם קוקטייל צביעה המכיל זונולה אנטי-אנושית אוקלודנס-1 (ZO-1) בשילוב עם אלקסה פלור 594 בדילול של 1:100, פאלואידין עם אלקסה פלואור 488 בדילול 1:1000 להערכת F-אקטין, ואת הכתם הגרעיני, DAPI, ב-1:4000 דילול. המדלל הוא 1 מ"ל של 1% BSA ב-PBS. הדביקו את קצוות הפלטה לפני הדגירה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  10. שאפו את תמיסת הקוקטייל לצביעה ביום הבא ושטפו את הדגמים שלוש פעמים עם PBS.
  11. צילם באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי וצילמו ערימות Z באורך 5 מיקרון של פרוסות אורגנואידים מייצגים בהגדלה אובייקטיבית פי 40.
  12. ניתוח עוצמת הפלואורסצנציה באמצעות תוכנת ניתוח תמונות בפיג'י. נרמול עוצמת הפלואורסצנציה הממוצעת עם שטח האורגנואיד כדי להבטיח השוואה מדויקת בין תנאי סביבה שונים.

7. אפיון פונקציונלי של אורגנואידים באמצעות בדיקת ציטוטוקסיטיות של ELISA ו-LDH (LDH)

  1. הפשרה של סופרנטנטים על הקרח ובדקו את הפרשת אינטרלוקין-6 (IL-6) ואינטרלוקין-8 (IL-8) באמצעות ערכות ELISA מסחריות בהתאם לפרוטוקול היצרן.
  2. הערכה לשחרור LDH, סמן לציטטוקסיות, באמצעות בדיקת ספיגת LDH זמינה מסחרית.
  3. יצירת עקומה סטנדרטית באמצעות חלבון LDH רקומביננטי בריכוזי חצי-לוגריתמים מ-0.5 מיקרוגרם עד 0.5 ננוגרם. אינטרפולציה של ריכוזי LDH מכל דגימה באמצעות עקומת הסטנדרט.

8. אופציונלי: בידוד דגימות לניתוח RNA או חלבון

  1. במקום להוסיף 4% פאראפורמלדהיד לצביעת אימונופלואורסצנציה, יש להוסיף בופר RLT מוכן המכיל β-מרקפטואנול ב-10 מיקרו-ליטר ל-1 מ"ל RLT.
  2. השתמש ב-300 מיקרוליטר לכל דגם והפיפטה למעלה ולמטה כדי לנתק ולייז תאים לחלוטין.
  3. העבר את הליזאט לצינור מיקרוצנטריפוגה ללא RNase ומניח את הצינורות על קרח יבש כדי להקפיא במהירות. העבר ל-80 מעלות צלזיוס לאחסון ארוך טווח.
    הערה: לחילופין, ניתן להשתמש בבופר RIPA להפקת חלבון על ידי הכנה: 50 mM Tris-HCl, pH 7.4-7.5; 150 mM NaCl; 1% NP-40 או טריטון X-100; 0.5% נתרן דאוקסיכולאט; 0.1% SDS במים דה-יוניים. בופר RIPA מוכן זמין גם מסחרית.
  4. מוסיפים 200 מיקרוליטר לכל דגם, סלעים על קרח למשך 5 דקות, ואז אספו את הליזאט.
  5. סובב ב-15,000 x גרם למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס לשאריות תאי כדור והעבר ל-80- מעלות לאחסון ארוך טווח.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אורגנואידים אפיתליים-פיברובלסטים אלוואולריים שמקורם בקו התאים הוקמו וגודלו במשך למעלה מ-21 ימים. שינויים מורפולוגיים נצפו לאורך תקופה זו, כאשר מספר האורגנידים, השטח והקוטר הוערכו בימים 3, 9 ו-21 כדי לעקוב אחר גדילה והתפתחות. מספר האורגנואידים הממוצע לבאר ירד משמעותית בימים 9 ו-21 בהשוואה ליום 3 (איור 2A). לעומת זאת, שטח וקוטר האורגנואיד הממוצעים עלו משמעותית בימים 9 ו-21, מה שמעיד על המשך גדילה והתרחבות (איור 2B,C

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אורגנואידים תלת-ממדיים (תלת-ממדיים) של אפיתל פיברובלסטים אלוואולריים מהווים פלטפורמה פיזיולוגית רלוונטית מאוד למידול מבנה ותפקוד הריאה תחת מאמץ מכני. בניגוד למערכות קו-קולטורה דו-ממדית או אפילו תלת-ממדית, אורגנואידים שומרים על תכונות קריטיות של מיקרו-סביבת הריאות ב-invivo, כולל ארגון מרחבי, אינטראקציות אפיתליאלי-מזנכימליות ואינטראקציות מטריצה חוץ-תאית (ECM)14. מאמץ מכני ממלא תפקיד מרכזי בשיפוץ דרכי הנשימה במחלות כמו אסתמה, COPD ופגיעת ריאות הנגרמת על ידי ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי המחקר נערך בהיעדר קשרים מסחריים או פיננסיים שיכולים להיחשב כניגוד עניינים פוטנציאלי.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מודים לתמיכת מרכז האוויר פרובידנס ב-Providence Health Care, שתרומותיו אפשרו את השלמת כתב היד. עבודה זו מומנה על ידי MITACS (ID IT27789), בשיתוף עם מרכז הנתיב האווירי של פרובידנס (PAC) בפרובידנס הלת' קיר (PHC), ומועצת המחקר למדעי הטבע וההנדסה של קנדה (NSERC) (IDs AWD-024378 ו-AWD-0244440).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"לאפנדורף0030 125.215
צינור קוני בקוטר 15 מ"לפישר סיינטיפיק14-959-53A
16% פאראפורמלדהידתרמו פישר סיינטיפיק28908
2-מרקפטואנולמיליפור סיגמאM3148
צינור קוני בנפח 50 מ"לפישר סיינטיפיק14-432-22
לוח קצף עגול של Tissue Train עם 6 בארות (ממברנה גמישה)פלקסל אינטרנשיונלTTCF-5001
תאי A549אוסף תרבות הטיפוס האמריקאית (ATCC)CCL-171
מדחס אווירקליפורניה אייר טולס10020DSPCAD
אלבומין סרום בקרמיליפור סיגמאA9418
Buffer RLTקיאגן79216
חממת CO2PHCBIMCO-170AICUVL-PA
תמיסת קצירת אורגנואידים של Cultrexביו-טכנה3700-100-01
ערכת בדיקת ציטוטוקסיות CyQUANT LDHתרמו פישר סיינטיפיקC20300
DAPI (4′,6-דיאמידינו-2-פנילינדול)תרמו פישר סיינטיפיקD1306
דימתיל סולפוקסידסיגמא אולדריץ'D2650-100ML
דולבקו' s Modified Eagle' s medium (DMEM)תרמו פישר סיינטיפיק11965092
מיקרוסקופ ליבת EVOS XLתרמו פישר סיינטיפיקAMEX1200
סרום בקר עוברי (FBS)תרמו פישר סיינטיפיקA5209501
תוכנת ניתוח תמונות בפיג'יהמכונים הלאומיים לבריאות
מערכת Flexcell FX-6000 Tension and Tissue Train (כולל בקר מתח Flexlink FX-6000, מאגר לחץ, פלטת בסיס, חלון אקרילי, תחנות טעינה גליליות בקוטר 25 מ"מ, מלכודת מים, תוכנת FlexSoft FX-6000 V1.0, וצינורות שונים)פלקסל אינטרנשיונלFX6000T
אדם אינטרלוקין-6 דואוסט ELISAביו-טכנהDY206
אנטלוקין-8 דואוסט אנושי ELISAביו-טכנהDY208
מיקרוסקופ קונפוקלי Leica DMi8לייקה מיקרוסיסטמס11889122
מטריצת ממברנת בסיס מטריג'לקורנינג356237
תאי MRC-5ATCCCCL-185
פאראפילםמיליפור סיגמאP7793
פניצילין/סטרפטומיצין (עט/סטרפטוקוקוקה)תרמו פישר סיינטיפיק15140122
גלאי תיוג פאלואידין, אלקסה פלואר 488תרמו פישר סיינטיפיקA12379
סליין עם בופר זרחן (PBS)תרמו פישר סיינטיפיק14190-144
קולגן זנב עכברוש Iסיגמא-אלדריץ'C3867
חלבון דהידרוגנאז לקטט אנושי רקומביננטי (פעיל)אבקאםAb93699
מאגר ניתוק RIPAתרמו פישר סיינטיפיק89901
צינורות מיקרופוגה ללא RNaseתרמו פישר סיינטיפיקAM12400
T75 cm2 בקבוק תרבותגריינר658175
טריטון X-100סיגמא-אלדריץ'X100-5ML
נוגדן מונוקלונלי ZO-1 (ZO1-1A12), Alexa Fluor 594תרמו פישר סיינטיפיק339194

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Knudsen, L., Ochs, M. The micromechanics of lung alveoli: structure and function of surfactant and tissue components. Histochem Cell Biol. 150 (6), 661-676 (2018).
  2. Novak, C., Ballinger, M. N., Ghadiali, S. Mechanobiology of pulmonary diseases: a review of engineering tools to understand lung mechanotransduction. J Biomech Eng. 143 (11), 110801(2021).
  3. Shiraishi, K., et al. Biophysical forces mediated by respiration maintain lung alveolar epithelial cell fate. Cell. 186 (7), 1478-1492.e15 (2023).
  4. Hogg, J. C., et al. The nature of small-airway obstruction in chronic obstructive pulmonary disease. N Engl J Med. 350 (26), 2645-2653 (2004).
  5. Bidan, C. M., Veldsink, A. C., Meurs, H., Gosens, R. Airway and extracellular matrix mechanics in COPD. Front Physiol. 6, 346(2015).
  6. Burgess, J. K., Gosens, R. Mechanotransduction and the extracellular matrix: key drivers of lung pathologies and drug responsiveness. Biochem Pharmacol. 228, 116255(2024).
  7. Harris, C., et al. An in vitro investigation of the inflammatory response to the strain amplitudes which occur during high frequency oscillation ventilation and conventional mechanical ventilation. J Biomech. 88, 186-189 (2019).
  8. Xu, Y., et al. Strain analysis in patients at high risk for COPD using four-dimensional dynamic-ventilation CT. Int J Chron Obstruct Pulmon Dis. 17, 1121-1130 (2022).
  9. Huh, D., Hamilton, G. A., Ingber, D. E. From 3D cell culture to organs-on-chips. Trends Cell Biol. 21 (12), 745-754 (2011).
  10. Al Yazeedi, S., Guo, T. J. F., Sohd, J., Abokor, F. A., Osei, E. T. Dynamic mechanical stimulation of alveolar epithelial-fibroblast models using the Flexcell tension system to study lung disease mechanisms. Front Med. 12, 1552803(2025).
  11. Guo, T. J. F., Faiz, A., Osei, E. T., Pouwels, S. D. Editorial: Next generation in vitro models to study chronic pulmonary diseases, volume II. Front Med. 12, 1683514(2025).
  12. Lim, M. J., Kim, S. J., Jo, A., Kim, S. W. Enhanced application potential of alveolar organoids through epithelial and niche cell interactions. Sci Rep. 15 (1), 17538(2025).
  13. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  14. Purev, E., Bahmed, K., Kosmider, B. Alveolar organoids in lung disease modeling. Biomolecules. 14 (1), 115(2024).
  15. Manuyakorn, W., et al. Mechanical strain causes adaptive change in bronchial fibroblasts enhancing profibrotic and inflammatory responses. PLoS One. 11 (4), e0153926(2016).
  16. Kılıç, A., et al. Mechanical forces induce an asthma gene signature in healthy airway epithelial cells. Sci Rep. 10 (1), 966(2020).
  17. Tam, A., et al. Hedgehog signaling as a therapeutic target for airway remodeling and inflammation in allergic asthma. Cells. 11 (19), 3016(2022).
  18. Georas, S. N., Rezaee, F. Epithelial barrier function: at the front line of asthma immunology and allergic airway inflammation. J Allergy Clin Immunol. 134 (3), 509-520 (2014).
  19. Ivanov, A. I., Parkos, C. A., Nusrat, A. Cytoskeletal regulation of epithelial barrier function during inflammation. Am J Pathol. 177 (2), 512-524 (2010).
  20. Barnett, K. C., et al. An epithelial-immune circuit amplifies inflammasome and IL-6 responses to SARS-CoV-2. Cell Host Microbe. 31 (2), 243-259.e6 (2023).
  21. Li, Y., et al. HB-EGF-induced IL-8 secretion from airway epithelium leads to lung fibroblast proliferation and migration. BMC Pulm Med. 21 (1), 347(2021).
  22. Guo, T. J. F., Singhera, G. K., Leung, J. M., Dorscheid, D. R. Airway epithelial-derived immune mediators in COVID-19. Viruses. 15 (8), 1655(2023).
  23. Thomas, D., Choi, S., Alamana, C., Parker, K. K., Wu, J. C. Cellular and engineered organoids for cardiovascular models. Circ Res. 130 (12), 1780-1802 (2022).
  24. Li, K., He, Y., Jin, X., Jin, K., Qian, J. Reproducible extracellular matrices for tumor organoid culture: challenges and opportunities. J Transl Med. 23 (1), 497(2025).
  25. Vande Geest, J. P., Di Martino, E. S., Vorp, D. A. An analysis of the complete strain field within Flexercell membranes. J Biomech. 37 (12), 1923-1928 (2004).
  26. Mondoñedo, J. R., et al. A high-throughput system for cyclic stretching of precision-cut lung slices during acute cigarette smoke extract exposure. Front Physiol. 11, 566(2020).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תיקון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Generation of 3D Collagen-Embedded A549/MRC-5 Alveolar Organoids using a Mechanical Cell-Stretching Bioreactor
Posted by JoVE Editors on 8/19/2026. Citeable Link.

This corrects the article 10.3791/69447

תגיות

A549MRC 5
הסרטון יגיע בקרוב

מאמרים קשורים