מאמר שיטה

In-vitro שיקום של יוביקוויטינציה חיידקית וחיסול בתיווך VCP/p97

DOI:

10.3791/69454

⸱

2 בינואר 2026

 ,  ,  , 
1Department of Biosciences and Bioengineering, Indian Institute of Technology Bombay

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר שיטה לאוביקוויטין של Streptococcus pneumoniae באמצעות ליזאט תאי יונקים או קומפלקס אנזימי יוביקוויטין טהור, ולאחר מכן טיפול בקומפלקס חלבון VCP/p97-UFD1-NPLOC4 מטוהר להערכת פעילותו הבקטריוליטית, ומאפשר חקר אפקטורים חיסוניים התלויים ביוביקוויטין.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

יוביקוויטינציה היא שינוי רב-תכליתי לאחר תרגום שממלא תפקיד קריטי במערכת החיסון הציטוזולית. עם פלישת תאי המארח, חיידקים פתוגניים כלואים תחילה בתוך אנדוזום, ממנו הם משתחררים ובורחים לתוך הציטוזול כדי להימנע מהתדרדרות ליזוזומה. ברגע שהם בציטוזול, החיידקים מתויגים במהירות בשרשראות יוביקוויטין על ידי ליגות E3 של המארח, ומסמנים אותם לפינוי דרך מסלולי אפקטור מרובים, כולל אוטופגיה והפרוטאזום. כדי להגדיר את תרומתם של מסלולים בודדים בהסרת חיידקים, שיקום חוץ גופני מציע גישה מבוקרת וחד-משמעית. כאן, תוך שימוש ב-Streptococcus pneumoniae (SPN) כפתוגן חיידקי מודל, אנו מציגים פרוטוקול מפורט לאוביקוויטינציה שלו באמצעות ליזטים של תאי יונקים או קומפלקס אנזימי יוביקוויטין טהור, ולאחר מכן טיפול במורכב VCP/p97-UFD1-NPLOC4 מטוהר להערכת פעילותו הבקטריוליטית ללא תלות בגורמים תאיים אחרים. בסך הכול, הליך זה עשוי להאיר את תפקידם של ליגות יוביקוויטין הקשורות לחיסון ואפקטורים בהקשר ללא תאים, שבו ניתוח מנגנונים כאלה עלול להיות מאתגר בתאים שלמים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

יוביקוויטין (Ub) הוא חלבון קטן בנפח 8.6 קילו-דלטון שמשנה את הסובסטרטים היעדיים על ידי היצמדות קוולנטית אליהם בגליצין הקצה C שלו, ויוצר קשר איזופפטידי עם קבוצת ε-אמינו של שאריות ליזין בתהליך הנקרא יוביקוויטינציה1. תופעה זו נשלטת על ידי סדרת שלבים מתוזמרים הכוללת אנזים מפעיל יוביקוויטין E1, אנזים קונוגטי E2 לאוביקוויטין, וליגז E3 יוביקוויטין 1,2,3. Ub יכול להיות מחובר כמונומור או כשרשראות באורכים שונים דרך שבעת שאריות הליזין שלו (ליניארי/M1, K6, K11, K27, K29, K33, K48, ו-K63). שרשראות Ub ייחודיות אלו משמשות כסמנים מולקולריים לפונקציות תאיות שונות, כגון פירוק פרוטאזומל, תנועת תאים, תיקון DNA ואוטופגיה סלקטיבית3.

בעוד שהתפקיד הקנוני של יוביקוויטינציה קשור זמן רב לשמירה על הומאוסטזיס תאי, כגון פירוק חלבונים שמקופלים בצורה שגויה באמצעות פרוטאזומים או הפניית מטענים ספציפיים לאוטופגיה סלקטיבית 5,6, כיום ברור כי יוביקוויטין משמש גם כמנגנון חישה קריטי של מערכת החיסון הציטוזולית נגד זיהומים חיידקיים. חיידקים תוך-תאיים חודרים לעיתים קרובות לתאי המארח כדי להימנע מזיהוי על ידי התגובה החיסונית החוץ-תאית ומתרבים בסביבה מוגנת 7,8. לא מעט פתוגנים משתמשים במערכות הפרשה ורעלים כדי לפגוע באופן בלתי הפיך בוואקואולות הנושאות אותם, מה שמאפשר בריחה לציטוזול כדי לקבל חומרים מזינים 9,10. ברגע שהם נכנסים לציטוזול, חיידקים אלו מקושטים בשרשראות פוליאוביקוויטין על ידי ליגזים E3 ספציפיים, הפועלים כ"תג מוות" מולקולרי, שמכוון אותם להסרה סלקטיבית. לדוגמה, הליגז E3 SMURF1 מתמודד עם Mycobacterium tuberculosis על ידי התחלת פוליאוביקוויטינציה המקושרת ל-K48 ישירות על פני השטח שלו, מה שמוביל לפירוקו דרך הפרוטאזום11. פארקין מצטבר בוואקולות המכילות חיידקים ויוצר שרשראות יוביקוויטין12 הקשורות ל-K63, בעוד ש-ARIH1 ו-LRSAM1 משנים את פני השטח של חיידקים עם שרשראות K48 ו-K6, בהתאמה, ובכך מעכבים את צמיחת החיידקים13,14. בעוד שרוב הליגזות של E3 מכוונות בעיקר למצעי חלבון המארח, חלק מהליגזות מציגות ספציפיות בולטת לרכיבים מיקרוביאליים. RNF213 מזהה ומבצע יוביקוויטינציה של ליפופוליסכרידים (LPS) שנמצאים בסלמונלה אנטריקה סרובר Typhimurium15, ו-SCFFBXO2 קומפלקס מזהה גליקנים חיידקיים הנמצאים בסטרפטוקוקוס קבוצה A כמצע לאוביקוויטינציה16, ומסייע לזנופגיה. לעומת זאת, קומפלקסSCF FBXW7 מזהה מוטיבים של דגרון בתוך חלבוני שטח של Streptococcus pneumoniae (SPN). אלה כוללים את β-גלקטוזידאז A (BgaA) וחלבון פניאומוקוקי A (PspA), אשר לאחר תיוג עם שרשראות פוליוביקיטין הקשורות ל-K48, אושרו באמצעות נוגדן ייחודי ל-Ub המקושר ל-K48, כנראה מושכים את מערכת הפרוטאזום, מה שמאפשר חיסול חיידקי יעיל17.

למרות שהתהליך של סימון פולשים ציטוזוליים אלו ביוביקוויטין מובן היטב, המנגנון הבא שבו מערכת הפרוטאזומלית מסירה ישויות מיקרוביאליות גדולות כאלה נותר מוטל בספק. מחקרים עדכניים חשפו כי המארח AAA+ ATPase, VCP/p97 (חלבון המכיל ולוזין), ממלא תפקיד מרכזי בתהליך זה. בשיתוף פעולה עם קו-פקטורים כמו UFD1 ו-NPLOC4, VCP יכול לזהות חיידקים המסומנים בפוליאוביקוויטין ולחלץ פיזית חלבונים מאוביקוויטין מהממברנה החיידקית, ובכך לקרוע אותם ולסייע בהסרתם מהסביבה הציטוזולית מבלי להסתמך על מנגנון הפרוטאזום.

הציטוזול המארח מכיל רשת מורכבת של מסלולי חיסון הפועלים במקביל ובאופן בטוח כדי להבטיח הסרת פתוגנים. כפילות זו קריטית להגנה חזקה, אך היא מסבכת את המאמצים לזהות ולבחון את תפקידם של גורמי חיסון בודדים19. בהקשר זה, מערכות שיקום פנימי מספקות פלטפורמה שימושית לניתוח מסלולים ספציפיים בתנאים מבוקרים. כאן, אנו מציגים מערכת ללא תאים שמסכמת מחדש את תהליך האוביקוויטינציה ואובדן החיוניות של SPN באמצעות ליזטים של תאי יונקים או אנזימי E1-E2-E3-Ub יחד עם קומפלקסים אפקטור מארח מטוהרים. בפרוטוקול דו-שלבי זה, אנו מסייעים תחילה בהצמדת שרשראות הפוליאוביקוויטין על החיידקים, ולאחר מכן מעריכים את חיסולן על ידי VCP/p97 בשיתוף עם UFD1 ו-NPLOC4. על ידי שיקום מסלול זה במבחנה, אנו עוקפים מורכבות תאית וחוקרים במיוחד את יכולתו של VCP לנטרל את הפתוגן. הגדרה מדויקת זו מאפשרת חקירה מפורטת של זיהוי המצע, ספציפיות השרשרת, אופן הפעולה של האפקטור, והרכיבים החיוניים הנדרשים להתחלת תגובה יעילה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. תרבית תאים והכנת ליזאט

  1. הפשיר את תאי A549 וגדל אותם בבקבוק T25 באמצעות DMEM מלא עם 10% סרום בקר עוברי (FBS). דגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בסביבה לחה עם 5%CO2. העבר את התאים דרך שלושה מעברים לתחזוקה, ואז העבר 2 ×-106 תאים לבקבוק T75. ממשיכים בתרבית עד שצפיפות התאים מגיעה ל-8-10 ×10-6 תאים.
  2. גרדו את התאים מבקבוק T75 בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס באמצעות בופר תגובה המכיל 200 מ"מ HEPES, 100 מ"מ MgCl2, 1 M KCl ו-5% גליצרול ב-pH 7.4. צנטריפוגה את התאים המגרדים ב-120 × גרם למשך 10 דקות כדי לשחק אותם, ואז החזירו אותם לבופר התגובה כדי להגיע לנפח סופי של כ-0.6 מ"ל בצינור צנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל.
    הערה: כל הדגימה חייבת לעבור עיבוד בקרח.
  3. סוניקט את תליית התא באמצעות גלאי צר (קצה הקוטר, 2 מ"מ) בעוצמה של 40 מיקרון עם פולסים של 2 שניות הפעלה/כיבוי למשך 2-2.5 דקות, תוך שמירה על התערובת על קרח. צנטריפוגה את הדגימות הסוניקיות ב-21,000 × גרם למשך 45 דקות, אספו את הסופרנטנט המתקבל, והוסיפו פי 2-3 של קוקטייל מעכב פרוטאז פי 50.
    הערה: או להשתמש בליזאט מיד לתגובה לאוביקוויטינציה באותו יום או להקפיא במהירות עם חנקן נוזלי ולאחסן בטמפרטורה של -80°C; עם זאת, חשוב להשתמש בו תוך 3 ימים לכל היותר כדי לקבל יוביקוויטינציה יעילה. ריכוז ליזאט הנע בין 2 ל-4 מ"ג/מ"ל מתאים לאוביקוויטינציה.

2. תרבית חיידקים

  1. לגדל את החיידקים, זן Streptococcus pneumoniae (SPN) R6 (Serotype II), בלילה בטמפרטורה של 37°C עם 5%CO2 במדיום THY המורכב מאבקת מרק טוד יוויט (3.7 גרם ל-100 מ"ל) ואבקת תמצית שמרים (1.5 גרם ל-100 מ"ל).
    הערה: הימנעו מהחיסון של החיידקים אם המדיום השתנה לצבע חום כהה. Streptococcus pneumoniae מסווג כפתוגן ברמת בטיחות ביולוגית 2 (BSL-2); יש לנקוט אמצעי זהירות ולעקוב אחר פרוטוקולי ההכלה הנכונים של BSL-2, כולל שימוש בארון בטיחות ביולוגית מוסמך.
  2. למחרת, יש לחסן מהתרבית הלילית למדיה טרייה של THY (1:10) בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5%CO2 ולהגדיל את ה-SPN עד שהצפיפות האופטית ב-600 ננומטר (OD600 ננומטר) תגיע ל-0.4. הכינו מלאי גליצרול של SPN (900 מיקרוליטר תרבית SPN ו-600 מיקרוליטר גליצרול (50%) ואחסנו אותו בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
  3. ביום ניסוי האוביקוויטינציה, הפשרו מלאי SPN חדש מ-80°C והחריסו אותו לחלוטין לתוך מדיום THY של 5 מ"ל ואפשרו לו לגדול עדש-OD 600 ננומטר מגיע ל-0.4.
    הערה: תרבית החיידקים גדלהל-OD של 600 ננומטר של 0.4, שזה מתאים לכ-108 תאי SPN למילילטר. קורלציה זו הוכחה על ידי מניית יחידות יוצרות מושבות (CFUs), שנקבעו על ידי דילול סדרתי של התרבית ב-1x PBS כדי להפחית את ריכוז תאי החיידקים כדי שניתן יהיה להשיג מושבות שניתן לספירה, וכתמים על לוחות אגר BHI, מדיום מועשר יותר מ-THY.

3. בדיקת אוביקוויטינציה במבחנה מליזיט יונקי

  1. קחו כ-10תאי SPN באורך 7 ושטפו היטב לפחות שלוש פעמים עם בופר התגובה (200 mM HEPES, 100 mM MgCl2, 1 M KCl ו-5% גליצרול ב-pH 7.4) על ידי השעיית החיידקים בבופר הבא, לאחר מכן צנטריפוגה ב-21,000 × גרם למשך 5 דקות, ולבסוף הורדתם בצנטריפוגציה ב-21,000 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  2. החזירו את כדור ה-SPN עם ליזאט תאי יונקים A549 יחד עם יוביקוויטין מטוהר (350 מיקרומון) ו-1 mM ATP ודגרו במשך 1-2 שעות בטמפרטורה של 27 מעלות צלזיוס.
    הערה: הימנעו מהקפאה והפשרה של ליזאט תאי יונקים. הכי טוב אם הליזאט מוכן באותו יום של בדיקת האוביקוויטינציה.
  3. לאחר הדגירה, שטפו את החיידקים עם בופר תגובה המכיל 1 מ' אוריאה פעם אחת, לאחר מכן שתי שטיפות עם בופר תגובה בלבד, ולאחר מכן קיבוע עם 1% פאראפורמלדהיד (PFA). לאחר הקיבוץ, דגרו תאים עם PBS המכיל גליצין (1 מ"ג/מ"ל) למשך 15 דקות, ואחר כך שתי שטיפות של PBS פעמיים.
    הערה: שטיפה של 1 מיליון אוריאה משמשת להפרעה קלה לאינטראקציות לא קוולנטיות, ולהבטיח שרק חיידקים מקוואלינטיניים יישארו. לאחר מכן, חשוב לשטוף היטב עם בופר תגובה כדי להסיר שאריות אוריאה, שכן נוכחותה עלולה להפריע למבחן ההרג במבחנה .
    כבקרה שלילית, הכינו את כל תערובת התגובה ודגרו אותה עם חיידקים על קרח כדי לעכב פעילות אנזימטית. מיד לאחר הדגירה, שטוף את הדגימה ואז מקבע אותה באמצעות 1% PFA כדי לשמור על מצב התגובה.

4. בדיקת אוביקוויטינציה In-vitro מתוך קומפלקס האנזימים E1-E2-E3

  1. הכינו תחילה תערובת תגובה הכוללת יוביקוויטין (350 מיקרומון), UBE1 (400-800 ננומטר), UbE2C (3-5 מיקרומון), קומפלקס Rbx1-Skp1-Cul1-Fbxw7 (500 ננומטר) ו-2 mM ATP בבופר תגובה (200 מילימטר HEPES, 100 מילימטר MgCl2, 1 M KCl ו-5% גליצרול ב-pH 7.4), כדי להגיע לנפח התגובה הכולל של 100-150 מיקרוליטר.
    הערה: יש לאחסן את כל האנזימים בטמפרטורה של -80°C. כדי למנוע אובדן פעילות ממחזורי הקפאה-הפשרה מרובים, צור אליקווטים קטנים והשתמש בחדשים בכל תגובה לאוביקוויטינציה.
  2. החזירו את החיידקים (107 CFU) לתערובת התגובה המכילה את האנזימים של יוביקוויטין ודגרו במשך שעתיים בטמפרטורה של 27 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, שטפו את החיידקים עם בופר תגובה המכיל 1 מיליון אוריאה לפחות פי 3, ולאחר מכן קיבוע עם 1% פאראפורמלדהיד (PFA). לאחר הקיבוץ, דגרו תאים עם PBS המכיל גליצין (1 מ"ג/מ"ל) למשך 15 דקות, ואחר כך שתי שטיפות של PBS פעמיים.
    הערה: אם יש אובדן תאים מופרז, ניתן להפחית את מספר השטיפות.

5. הדמיה של חיידקים יוביקוויטיניים

  1. לאחר קיבוע הדגימה עם 1% PFA, דגר אותה ב-3% BSA למשך שעה אחת ב-27 מעלות צלזיוס, ואז בצע שתי שטיפות עם 1x PBS.
  2. החזירו את החיידקים המאוביקוויטינים באמצעות נוגדן ראשוני בריכוזים גבוהים יותר מאלו המשמשים בדרך כלל בבדיקות אימונופלואורסצנציה. השתמש בנוגדן ייחודי לחיידקים יחד עם נוגדן אנטי-יוביקוויטין (1:100), מדולל ב-PBS המכיל 1% BSA, לצביעה ב-27 מעלות צלזיוס למשך שעה.
    הערה: לצביעה מיטבית של נוגדנים, יש להשתמש בצינור צנטריפוגה קושר חלבון נמוך כדי למזער את אובדן הנוגדנים או להשתמש בריכוז נוגדנים גבוה יותר כדי לקבל את התוצאות הטובות ביותר.
  3. לאחר מכן, שטפו את החיידקים פעמיים עם 1x PBS ואז החזירו אותם עם הנוגדן המשני המתאים עם אלקסה פלואור 488 ו-555, בהתאמה, למשך שעה בטמפרטורה של 27 מעלות צלזיוס.
  4. מרחו כ-10-20 מיקרוליטר מהדגימה החיידקית המסומנת על ידי יציקה וטופה, מערבבים 5-10 מיקרוליטר של מדיום התקנה עם או בלי DAPI, ואז מניחים כיסוי מעליו והשתמשו בנייר טישו כדי לספוג נוזלים עודפים. לבסוף, צפו בדגימה תחת מיקרוסקופ קונפוקלי באותו יום.

6. ביטוי וטיהור חלבונים

  1. לצורך ביטוי של VCP/p97 מסוג פראי, המרו את הפלסמיד המכיל pET28a ב-VCP לזן E. coli BL21-DE3 באמצעות פרוטוקול טרנספורמציה סטנדרטי של E. coli 20. מושבות דגירה נוצרו לאחר השינוי במהלך הלילה במרק לוריה (LB) בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. ביום הבא, הזרקו תרבית של 1:50 לתוך בקבוק מאוורר היטב המכיל LB ואפשרו לו לגדול עדש-OD 600 ננומטר יגיע ל-0.7-0.8. הוסף 200 מיקרומטר של IPTG לתרבות ודגר במשך 5 שעות בטמפרטורה של 37°C עם ניעור ב-180 סל"ד; אשר את ביטוי החלבון באמצעות SDS-PAGE.
    הערה: לכל שלב הצמיחה והביטוי של החיידקים, קאנמיצין (50 מיקרוגרם/מ"ל) שימש כלחץ בחירה.
  2. לצורך ביטוי של UFD1 מסוג פראי, המרו את הפלסמיד המכיל pET41b ב-UFD1 לזן E. coli BL21-Rosetta באמצעות פרוטוקול הטרנספורמציה הסטנדרטי של E. coli 20. מושבות דגירה נוצרו לאחר השינוי במהלך הלילה במרק לוריה (LB) בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. ביום הבא, הזרקו תרבית של 1:50 לתוך בקבוק מאוורר היטב המכיל LB ואפשרו לו לגדול עדש-OD 600 ננומטר יגיע ל-0.7-0.8. הוסף 1 מ"מ של IPTG לתרבות ודגר במשך 5 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם ניעור ב-180 סל"ד; אשר את ביטוי החלבון באמצעות SDS-PAGE.
  3. כדי לבטא NPLOC4 מסוג פראי, יש להכניס את הפלסמיד המכיל NPLOC4 pET41b לזן BL21-רוזטה של E. coli באמצעות שיטת הטרנספורמציה הסטנדרטית של E. coli 20. דגרו את המושבות שנוצרות מהטרנספורמציה במרק לוריה (LB) בלילה בטמפרטורה של 37°C. למחרת, העבר דילול של 1:50 של התרבית לבקבוק מאוורר היטב מלא ב-LB, ותן לו לגדול עד שהצפיפות האופטיתב-OD 600 ננומטר תגיע ל-0.7-0.8. לאחר מכן, הוסף 1 מ"מ IPTG לתרבות והמשך דגירה במשך 16 שעות בטמפרטורה של 18°C תוך ניעור ב-180 סל"ד; אימות ביטוי החלבון על ידי ביצוע ניתוח SDS-PAGE.
    הערה: לכל שלב הצמיחה והביטוי של החיידקים שנעשה בזן E. coli BL21-רוזטה, נעשה שימוש בקאנמיצין (50 מיקרוגרם/מ"ל) וכלורמפניקול (20 מיקרוגרם/מ"ל) כלחץ בחירה. רצפים של pET28a-p97 ו-pET41b-NPLOC4 מסופקים בקובץ המשלים 1.
  4. לאחר ביטוי חלבון, צנטריפוגות את תאי החיידק ב-21,000 × גרם למשך 10 דקות ומשלים את הכדור בבופר פירוק המכיל 50 מ"מ טריס-קל, 300 מ"מ נל-קל, 5 מ"מ β-מרקפטואנול, 1 מ"מ PMSF, 5% גליצרול, pH 8.
  5. סוניקה של התאים למשך שעה אחת באמצעות גלאי צר (קוטר קצה, 6 מ"מ) בעוצמה של 50 מיקרון, ופולס של 20 שניות הפעלה/כיבוי ב-4°C. שחררו את הפסולת באמצעות 15,000 × גרם למשך שעה ואספו את הסופרנטנט.
    הערה: סוניקציה מלאה בוצעה במשך שעה אחת (30 דקות הפעלה ו-30 דקות הפסקה כפולסים של 20 שניות), והתהליך נמשך עד שהמתלה העכור של התא הפך לשקופ לשקוף. נדרש צנטריפוגציה במהירות גבוהה כדי להבטיח שפסולת התאים נשארת גלויה ולא תתנתק במהלך טעינת הליזאט על עמודת טיהור החלבון.
  6. העבר את הסופרנטנט דרך מסנן של 0.4 מיקרון וטען אותו על עמודה מלאה בחרוזי Ni-NTA לטיהור אפיניות, מאוזן מראש עם בופר טיהור (50 mM Tris-Cl, 300 mM NaCl, 5 mM β-מרקפטואנול, 5% גליצרול, pH 8).
  7. שטפו את עמודת החלבון העשירה בחלבון באמצעות בופר שטיפה שמכיל 50 מ"מ טריס-קל, 300 מ"מ נאקל, 5 מ"מ β-מרקפטואנול, 5% גליצרול, pH 8 ו-30-60 מ"מ אימידאזול של כ-400 מ"ל, ואז שחררו את החלבון עם בופר שכפול הכולל 50 מ"מ טריס-קל, 300 מ"מ NaCl, 5 מ"מ β-מרקפטואנול, 5% גליצרול, pH 8 ו-250 מ"מ אימידזול.
    הערה: ריכוז האימידאזול ונפח השטיפה עשויים להשתנות בהתאם לחלבון הספציפי הנבדק. כדי להעריך את הטוהר, יש לבצע SDS-PAGE. חשוב לשטוף את העמודה היטב עד שהנוזל מראה תגובה שלילית עם תגובת ברדפורד. החלק המוחלף מציג רצועה בולטת ומרוכזת של חלבון היעד, שצריכה לייצג בעיקר את הדגימה, עם רק עקבות קטנות, אם בכלל, של חלבונים אחרים.
  8. אסוף חלקים שונים, ניתח אותם עם SDS PAGE כדי לזהות אילו חלקים מכילים חלבונים טהורים, ואז לבצע חילוף בופר לבופר התגובה (200 mM HEPES, 100 mM MgCl2, 1 M KCl ו-5% גליצרול ב-pH 7.4) באמצעות עמודת PD-10.
    הערה: מדוד את ריכוז החלבון באמצעות תגובת ברדפורד (Coomassie Brilliant Blue G-250). כל החלבונים צריכים להיות מוקפאים במהירות בחנקן נוזלי ומאוחסנים בטמפרטורה של מינוס 80°C.

7. בדיקת הרג חיידקים במבחנה

  1. מערבבים 6 מיקרומום VCP/p97 עם 1 מיקרומולר כל אחד מ-NPLOC4 ו-UFD1, ואז מלאים את הנפח בבופר תגובה לכ-90 מיקרוליטר. אפשרו לתערובת התגובה להתבגר על קרח למשך שעתיים.
  2. מוסיפים 1-2 mM של ATP לתערובת התגובה הכוללת p97-UFD1-NPLOC4, ואז משלבים אותו עם ה-SPN האוביקוויטיני (107 תאים) למשך 2 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
  3. כדי להעריך את שריריות החיידקים, מיד לאחר הטיפול, יש לקחת אליקו של 1 מיקרו-ליטר מתערובת התגובה, לבצע דילול סדרתי (1:1, 1:10, 1:100 ו-1:1000), ולמקם 10-2 מיקרוליטר מכל דילול על פלטות אגר של Brain Heart Inquest (BHI). חזור על ההליך באמצעות 1 מיקרוליטר אליקוט מהתגובה לאחר שעתיים של דגירה.
    הערה: אתר את כל הדילול לתוצאות טובות יותר.
  4. הערך את יחידות יצירת המושבה (CFUs) בין נקודות הזמן של 0 שעות ל-2 שעות. חשב את החיוניות של חיידקים (%) על ידי חלוקת ספירת ה-CFU ב-2 שעות בספירת ה-CFU ב-0 שעות, ואז הכפלת התוצאה ב-100.
    הערה: כדי להשיג תוצאות אמינות יותר, יש להשתמש ב-VCP/p97 עם פירוק חום, VCP/p97 ללא קומפלקס UFD1-NPLOC4, או בגרסה חסרת ATPase של VCP/p97 להשוואה כבקרה שלילית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול שלנו מפרט את השימוש בתאי A549 ביונקים לייצור ליזאט תא העשיר ברכיבים הדרושים להתחלת תהליך יוביקוויטינציה (איור 1A). ליזאט זה, בין אם במצב מרוכז או מוחלף ברכיבים מטוהרים כגון UBE1 (האנזים המפעיל את היוביקוויטין E1), UbE2C (אנזים מצמיד ל-E2 יוביקוויטין), והקומפלקס Rbx1-Skp1-Cul1-Fbxw7 (ליגאז האוביקוויטין E3), מעורבב עם יוביקוויטין ו-ATP מטוהרים כדי להקל על יוביקוויטינציה פנימית של חיידקים (איור 1B). כדי להעריך את ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בעוד שמערכת השיקום במבחנה המפורטת כאן מציעה מסגרת איתנה לחקר המורכבויות המולקולריות של יוביקוויטינציה והסרה של חיידקים, יש לקחת בחשבון מספר מגבלות משמעותיות. ההסתמכות על ריכוזים סופר-פיזיולוגיים של חלבונים מטוהרים, הכוללת את מנגנון האוביקוויטינציה (E1, E2, E3 ליגאז, יוביקוויטין) ואת קומפלקס אפקטור המארח (VCP/p97, UFD1, NPLOC4), מספקת תובנות מכניות מרכזיות לגבי יוביקוויטינציה ופינוי פתוגנים, אך ייתכן שאינה משקפת באמת את התנאים הפיזיולוגיים בתוך תא חי.

...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מביעים את תודתנו למתקן הבטיחות הביולוגית רמה 2 ולמתקן מיקרוסקופיה קונפוקלית ב-IIT בומביי. סורב גוש. (17/06/2018(i) EU-V), סומיט רקשיט (221610197857) ואודיט קומאר דאס (24D0061) קיבלו מלגות מ-CSIR, UGC, ממשלת הודו ו-IIT בומביי, בהתאמה. אנירבן בנרג'י קיבל מימון מחקר ממועצת המחקר למדע והנדסה, ממשלת הודו (מספר מענק SPR/2019/000808) ומקרן Ignite Life Science (מספר מענק IGNITE/FG-OC/2021/004). גופי המימון לא לקחו חלק בעיצוב המחקר, איסוף הנתונים וניתוחו, בהחלטה לפרסם או בהכנת כתב היד.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
קוקטייל מעכב פרוטאז 50Xפרומגה G6521
6x-His-UbiquitinUBPBioE1100
קו תאים A549 ATCCATCC CCL-185
אלקסה פלואר 488InvitrogenA21202 
אלקסה פלואר 555InvitrogenA-31572   
נוגדן אנטי-יוביקוויטיןאנזוBML-PW8810-0100
אנטי-יוביקוויטין K48 ספציפי, שיבוט נוגדן Apu2סיגמא אולדריץ'ZRB2150
ATPסיגמא אולדריץ'A6419
BHIHiMedia M210
DMEM (גלוקוז גבוה)HiMedia AL251
FBSגיבקו (מקור אמריקאי)38220090
גליצרולPureSynth PSR37325
HEPESסיגמא אולדריץ'H4034-100G
KClסיגמא אולדריץ'P3911
MgCl2סיגמא אולדריץ'TC006
Paraformaldehyde סיגמא אולדריץ'E6148
pET28a-p97 פלסמידהמעבדה שלנופלסמיד זמין לפי בקשה
פלסמיד pET41b-NPLOC4המעבדה שלנופלסמיד זמין לפי בקשה
פלסמיד pET41b-UFD1אדג'יןפלסמיד #117107
Rbx1-Skp1-Cul1-Fbxw7 סיגמא אולדריץ'23-030
זן R6 של Streptococcus pneumoniaeATCCATCC BAA-255פתוגן קבוצת סיכון -2, שיטופל במתקן BSL-2
אבקת מרק טוד היואיטHiMedia M313
UBE1UBPBioB1100
UbE2CUBPBioC1300
אוריאהHiMedia MB032
אבקת תמצית שמרים HiMedia RM027

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ciechanover, A. The unravelling of the ubiquitin system. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (5), 322-324 (2015).
  2. Ciechanover, A. Proteolysis: from the lysosome to ubiquitin and the proteasome. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (1), 79-87 (2005).
  3. Damgaard, R. B. The ubiquitin system: from cell signalling to disease biology and new therapeutic opportunities. Cell Death Differ. 28 (2), 423-426 (2021).
  4. Deol, K. K., Lorenz, S., Strieter, E. R. Enzymatic logic of ubiquitin chain assembly. Front Physiol. 10, 835(2019).
  5. Kikkert, M., et al. Human HRD1 is an E3 ubiquitin ligase involved in degradation of proteins from the endoplasmic reticulum. J Biol Chem. 279 (5), 3525-3534 (2004).
  6. Korac, J., et al. Ubiquitin-independent function of optineurin in autophagic clearance of protein aggregates. J Cell Sci. 126 (Pt 2), 580-592 (2013).
  7. Asmat, T. M., Agarwal, V., Saleh, M., Hammerschmidt, S. Endocytosis of Streptococcus pneumoniae via the polymeric immunoglobulin receptor of epithelial cells relies on clathrin- and caveolin-dependent mechanisms. Int J Med Microbiol. 304 (8), 1233-1246 (2014).
  8. Ercoli, G., et al. Intracellular replication of Streptococcus pneumoniae inside splenic macrophages serves as a reservoir for septicaemia. Nat Microbiol. 3 (5), 600-610 (2018).
  9. Chakravortty, D., Rohde, M., Jäger, L., Deiwick, J., Hensel, M. Formation of a novel surface structure encoded by Salmonella pathogenicity island 2. EMBO J. 24 (11), 2043-2052 (2005).
  10. Surve, M. V., et al. Heterogeneity in pneumolysin expression governs the fate of Streptococcus pneumoniae during blood-brain barrier trafficking. PLoS Pathog. 14 (7), e1007168(2018).
  11. Franco, L. H., et al. The ubiquitin ligase SMURF1 functions in selective autophagy of Mycobacterium tuberculosis and anti-tuberculous host defense. Cell Host Microbe. 22 (3), 421-423 (2017).
  12. Manzanillo, P. S., et al. The ubiquitin ligase Parkin mediates resistance to intracellular pathogens. Nature. 501 (7468), 512-516 (2013).
  13. Polajnar, M., Dietz, M. S., Heilemann, M., Behrends, C. Expanding the host cell ubiquitylation machinery targeting cytosolic Salmonella. EMBO Rep. 18 (9), 1572-1585 (2017).
  14. Huett, A., et al. The LRR and RING domain protein LRSAM1 is an E3 ligase crucial for ubiquitin-dependent autophagy of intracellular Salmonella typhimurium. Cell Host Microbe. 12 (6), 778-790 (2012).
  15. Otten, E. G., et al. Ubiquitylation of lipopolysaccharide by RNF213 during bacterial infection. Nature. 594 (7861), 111-116 (2021).
  16. Yamada, A., Hikichi, M., Nozawa, T., Nakagawa, I. FBXO2/SCF ubiquitin ligase complex directs xenophagy through recognizing bacterial surface glycan. EMBO Rep. 22 (11), e52584(2021).
  17. Apte, S., et al. An innate pathogen sensing strategy involving ubiquitination of bacterial surface proteins. Sci Adv. 9 (12), eade1851(2023).
  18. Ghosh, S., et al. Host AAA-ATPase VCP/p97 lyses ubiquitinated intracellular bacteria as an innate antimicrobial defence. Nat Microbiol. , (2025).
  19. Mitchell, G., Isberg, R. R. Innate immunity to intracellular pathogens: balancing microbial elimination and inflammation. Cell Host Microbe. 22 (2), 166-175 (2017).
  20. Hanahan, D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. J Mol Biol. 166 (4), 557-580 (1983).
  21. Blythe, E. E., Olson, K. C., Chau, V., Deshaies, R. J. Ubiquitin- and ATP-dependent unfoldase activity of p97/VCP-NPLoc4-UFD1L is enhanced by a mutation that causes multisystem proteinopathy. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (22), E4380-E4388 (2017).
  22. Ducker, C., Ratnam, M., Shaw, P. E., Layfield, R. Comparative analysis of protein expression systems and PTM landscape in the study of transcription factor ELK-1. Protein Expr Purif. 203, 106216(2023).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Streptococcus PneumoniaeUFD1 NPLOC4Super Resolution

מאמרים קשורים