Method Article

טיהור יעיל של פוליפפטידים דמויי אלסטין (ELPs) מ-E. coli באמצעות שיטת חילוץ והשקעה מבוססת ממס אורגני

DOI:

10.3791/69465

⸱

January 9th, 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Bindley Bioscience Center, Department of Chemistry, Purdue Institute for Cancer Research, Purdue University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר שיטת חילוץ והשקעה מהירה וניתנת לשחזור מבוססת ממס אורגני לטיהור פוליפפטיד דמוי אלסטין (ELP) מ-Escherichia coli, ומספק חלופה ניתנת להרחבה פוטנציאלית לשיטות טיהור ELP קונבנציונליות.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פוליפפטידים דמויי אלסטין (ELP) הם ביופולימרים מהונדסים הנבנים מרצפי פנטאפפטיד חזרתיים המדמים מוטיבים שנמצאים בטרופולסטין ביונקים. המאפיינים הייחודיים שלהם הופכים אותם למועמדים אידיאליים למגוון רחב של יישומים ביו-רפואיים, החל מהעברת תרופות וגנים ועד להנדסת רקמות ודימות מולקולרי ממוקד. שיטות טיהור קונבנציונליות מביטוי Escherichia coli (E. coli) עלולות להיות לא יעילות עבור ELP בשל היווצרות גופי הכללה. שיטות אחרות, כמו מחזור מעבר הפוך (ITC), מנצלות את תכונות טמפרטורת התמיסה הקריטית (LCST) הנמוכה יותר של ELP כדי להפריד אותו מזהמים כמו ליפופוליסכרידים (LPS), אך בדרך כלל דורשות מספר שלבי חימום וקירור שגוזלי זמן ועלולים לגרום להתאוששות נמוכה בהתאם לרצף, ריכוז ומשקל מולקולרי של מבנה ה-ELP. כדי להתמודד עם אתגרים אלו, פיתחנו תהליך חילוק-משקעים מבוסס ממס אורגני שמנצל את ההידרופוביות הפנימית של ELP כדי לאפשר טיהור מהיר, חזק ורחב יישום ישירות מכדורי תאי E. coli . שיטה זו עושה שימוש בממסים אורגניים קוטביים כדי לסייע בהפרעה לתאים ולמסיס באופן סלקטיבי את ELP בשלב אחד. שלב המשקעים הבא מסיר למעשה ממססים אורגניים שאריתיים, זיהומים בעלי משקל מולקולרי נמוך ואנדוטוקסינים, ומניב ELP טהור מאוד עם רמות LPS מתחת ל-1 EU/mL בפחות מ-3 שעות. נתוני מיקרוסקופ כוח אטומי מצביעים על כך שחלבוני ELP-Fusion שטוהרו בדרך זו יכולים להתאסף למבנים דמויי מיצל הפוך ששומרים על תפקוד חלבוני המיזוג. שיטת טיהור מהיר זו מציעה לחוקרים דרך פשוטה ופוטנציאלית להרחבה לטיהור ELP, ויוצרת אפשרויות חדשות לשימוש ב-ELP ובחלבוני המיזוג שלו כאבני בניין גמישות ליישומים חומריים וביו-רפואיים.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פוליפפטידים דמויי אלסטין (ELPs) הם ביופולימרים המורכבים ממוטיבים חוזרים (VPGXG)n 1,2,3,4,5,6,7,8,9. שארית האורח X ביחידת הפנטפפטיד יכולה להיות כל חומצת אמינו שאינה פרולין. וריאציות ב-X יכולות לשמש לכוונון ההידרופוביות, התנהגות המעבר התרמי והמאפיינים הפונקציונליים של מבנה ELP ליצירת חומרים ביו-תואמים מודולריים שנחקרו רבות ביישומים ביו-רפ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת חומרים

  1. זן חיידקים: השתמש בתאים Escherichia coli BL21(DE3) בעלי כימיה כמארח ביטוי.
    הערה: הם נבחרו בשל יעילות הטרנספורמציה הגבוהה שלהם וההתאמה שלהם לייצור חלבונים רקומביננטיים.
  2. פלסמיד ביטוי: השתמש בוקטור pET21(+) המקודד לחלבון מיזוג ELP-I-Cm2 עם עמידות לאמפיצילין9. רכש את וקטור הפלסמיד מ-addgene. הכנס את גן ה-Cm2 באמצעות אתר BsrG I בסוף האינטאין.
    הערה: רצף ה-DNA של הפלסמיד של חלבון זה מסופק בקובץ משלים 1.
  3. מדיה לצמיחה: הכנת חומר Terrific Broth (TB) למדיה של 1200 מ"ל
    1. הכינו מדיה (חלק 1) על ידי הוספת 16 גרם טריפטון, 32 ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לאחר השלבים הסופיים של הפרוטוקול, השלב הבא הוא המחשת תוצאת ההוצאה-משקעים באמצעות ניתוח SDS-PAGE וצביעה כחולה של קומסי. כאשר יש שלב ליזיס לפני ההפקה אורגנית, יש להופיע רצועת ELP בולטת. במקרה של ELP-I-Cm2, תחום זה מופיע בעוצמה של 100 קילודאלטון (איור 3A).

סקר של שילובי ממס אורגניים שונים הראה יעילות הפקה משתנה (איור 3B), כאשר כל שילוב מניב ריכוזים וטוהרים שונים. אנו בוחרים את השילובים הטובים ביותר למיצו.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ITC שימש בעבר לטיהור לא-כרומטוגרפי של ELP19; עם זאת, זו יכולה להיות שיטה גוזלת זמן ותהליך בעל תפוקה נמוכה. בשיטות המפורטות לעיל, אנו מתארים גישה לטיהור מהיר של חלבון מיזוג ELP-I-Cm2, ומדגימה כיצד ניתן להשתמש בשיטת חילוץ-משקע אורגנית מבוססת ממס אורגני לטיהור מגוון רחב של היתוך ELP ו-ELP. פרוטוקול הממס האורגני לא רק מהיר יותר מ-ITC, אלא גם יעיל הרבה יותר עבור רצפי ELP קצרים יותר שיכולים לאתגר את שיטת ה-ITC. ייתכן שהוא גם אלטרנטיבה ניתנת להרחבה יותר מ-ITC ליישומים תע.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים למכון למחקר סרטן של אוניברסיטת פרדו ולתוכנית ה-CCSG של NIH (CA23168) על התמיכה בעבודה זו.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
2-מרקפטואנולביו-ראד161-0710רכיב SDS-PAGE
30% אקרילאמיד/ביס-אקרילאמידTCIA3218רכיב SDS-PAGE
אצטוןפישר סיינטיפיקA949ממס אורגני
אצטוניטרילפישר סיינטיפיקA996ממס אורגני
אמפיציליןביוטכנולוגיה ביולוגית זהבA-301-25אנטיביוטיקה
APS (אמוניום פרסולפאט)ביו-ראד1610700רכיב SDS-PAGE
בוטנולפישר סיינטיפיקL13171ממס אורגני
EDTAביוריאגנטים של פישרBP118-500רכיב בופר Lysis
אתנולדיקון לאבסUN1170ממס אורגני
אתיל אצטטפישר סיינטיפיקE195ממס אורגני
גליצרולResearch Products InternationalG22020-0.5רכיב מדיה של Terrific Broth (TB)
חומצה הידרוכלוריתפישר סיינטיפיקA144SI-212רכיב בופר Lysis
כתם קומאסי מיידיאבקאםAB119211רכיב SDS-PAGE
IPTGביוטכנולוגיה ביולוגית זהב12481C25רכיב ביטוי חלבון
איזופרופנולפישר סיינטיפיקA451-1ממס אורגני
K2HPO4 (פספט אשלגן מונובסיסי)מדעי הוורדס470302-246חלק 2 רכיב מאגר
KH2PO4 (פוטזיום פוספט דיבאסיק)מדעי הוורדס470302-254חלק 2 רכיב מאגר
L-פרוליןResearch Products InternationalP5200-500.0רכיב מדיה של Terrific Broth (TB)
ליזוזיםביוטכנולוגיה ביולוגית זהבL-040-1רכיב בופר Lysis
מתנולפישר סיינטיפיקA452ממס אורגני
מאגר דגימה מקוריביו-ראד161-0738רכיב SDS-PAGE
סולם חלבוניםביוטכנולוגיה ביולוגית זהבP008-500רכיב SDS-PAGE
מאגר ג'ל מתפרקביו-ראד1610798רכיב SDS-PAGE
סודים דודציל סולפט (SDS)תרמו-סיינטיפיקJ18220-36רכיב SDS-PAGE
נתרן הידרוקסידפישר סיינטיפיקS318-500רכיב בופר Lysis
בופר ג'ל ערימהביו-ראד1610799רכיב SDS-PAGE
TEMEDביו-ראד1610801רכיב SDS-PAGE
בסיס טריסביוריאגנטים של פישרBP-152רכיב בופר Lysis
טריפטוןResearch Products InternationalT60065-1000.0רכיב מדיה של Terrific Broth (TB)
תמצית שמריםResearch Products InternationalY20025-1000.0רכיב מדיה של Terrific Broth (TB)

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Despanie, J., Dhandhukia, J. P., Hamm-Alvarez, S. F., MacKay, J. A. Elastin-like polypeptides: therapeutic applications for an emerging class of nanomedicines. J Control Release. 240, 93-108 (2016).
  2. MacEwan, S. R., Chilkoti, A. Applications of elastin-like ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Elastin Like PolypeptidesELP PurificationOrganic Solvent ExtractionProtein PrecipitationE Coli ExpressionInclusion BodiesEndotoxin RemovalSDS PAGE AnalysisFusion Protein ActivitySelf Assembling Nanoparticles

Related Articles