הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

טיהור יעיל של פוליפפטידים דמויי אלסטין (ELPs) מ-E. coli באמצעות שיטת חילוץ והשקעה מבוססת ממס אורגני

2.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/69465

⸱

9 בינואר 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Bindley Bioscience Center, Department of Chemistry, Purdue Institute for Cancer Research, Purdue University

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר שיטת חילוץ והשקעה מהירה וניתנת לשחזור מבוססת ממס אורגני לטיהור פוליפפטיד דמוי אלסטין (ELP) מ-Escherichia coli, ומספק חלופה ניתנת להרחבה פוטנציאלית לשיטות טיהור ELP קונבנציונליות.

תקציר

פוליפפטידים דמויי אלסטין (ELP) הם ביופולימרים מהונדסים הנבנים מרצפי פנטאפפטיד חזרתיים המדמים מוטיבים שנמצאים בטרופולסטין ביונקים. המאפיינים הייחודיים שלהם הופכים אותם למועמדים אידיאליים למגוון רחב של יישומים ביו-רפואיים, החל מהעברת תרופות וגנים ועד להנדסת רקמות ודימות מולקולרי ממוקד. שיטות טיהור קונבנציונליות מביטוי Escherichia coli (E. coli) עלולות להיות לא יעילות עבור ELP בשל היווצרות גופי הכללה. שיטות אחרות, כמו מחזור מעבר הפוך (ITC), מנצלות את תכונות טמפרטורת התמיסה הקריטית (LCST) הנמוכה יותר של ELP כדי להפריד אותו מזהמים כמו ליפופוליסכרידים (LPS), אך בדרך כלל דורשות מספר שלבי חימום וקירור שגוזלי זמן ועלולים לגרום להתאוששות נמוכה בהתאם לרצף, ריכוז ומשקל מולקולרי של מבנה ה-ELP. כדי להתמודד עם אתגרים אלו, פיתחנו תהליך חילוק-משקעים מבוסס ממס אורגני שמנצל את ההידרופוביות הפנימית של ELP כדי לאפשר טיהור מהיר, חזק ורחב יישום ישירות מכדורי תאי E. coli . שיטה זו עושה שימוש בממסים אורגניים קוטביים כדי לסייע בהפרעה לתאים ולמסיס באופן סלקטיבי את ELP בשלב אחד. שלב המשקעים הבא מסיר למעשה ממססים אורגניים שאריתיים, זיהומים בעלי משקל מולקולרי נמוך ואנדוטוקסינים, ומניב ELP טהור מאוד עם רמות LPS מתחת ל-1 EU/mL בפחות מ-3 שעות. נתוני מיקרוסקופ כוח אטומי מצביעים על כך שחלבוני ELP-Fusion שטוהרו בדרך זו יכולים להתאסף למבנים דמויי מיצל הפוך ששומרים על תפקוד חלבוני המיזוג. שיטת טיהור מהיר זו מציעה לחוקרים דרך פשוטה ופוטנציאלית להרחבה לטיהור ELP, ויוצרת אפשרויות חדשות לשימוש ב-ELP ובחלבוני המיזוג שלו כאבני בניין גמישות ליישומים חומריים וביו-רפואיים.

מבוא

פוליפפטידים דמויי אלסטין (ELPs) הם ביופולימרים המורכבים ממוטיבים חוזרים (VPGXG)n 1,2,3,4,5,6,7,8,9. שארית האורח X ביחידת הפנטפפטיד יכולה להיות כל חומצת אמינו שאינה פרולין. וריאציות ב-X יכולות לשמש לכוונון ההידרופוביות, התנהגות המעבר התרמי והמאפיינים הפונקציונליים של מבנה ELP ליצירת חומרים ביו-תואמים מודולריים שנחקרו רבות ביישומים ביו-רפואיים שונים 10,11,12.

בעוד שסינתזה כימית יכולה לשמש לייצור פפטידים קצרים, היא אינה מתאימה במיוחד ל-ELPs בעלי משקל מולקולרי גבוה או לשימור תפקוד חלבוני המיזוג13,14. מסיבות כאלה, ELPs בדרך כלל מבוטאים באופן רקומביננטי ב-E. coli, מה שמאפשר ייצור מוגדר לפי רצף בכמויות גדולות. עם זאת, גישה זו עלולה גם להביא אתגרים. במהלך הביטוי שלהם ב-E. coli, ELPs מצטברים לעיתים בתוך גופים צפופים, מה שדורש אסטרטגיות התאוששות יעילות להפקת חלבון פונקציונלי15. יתרה מזאת, ביטוי חיידקי מכניס מולקולות ביולוגיות לא רצויות כגון חלבוני תאי המארח, חומצות גרעין וליפופוליסכרידים (אנדוטוקסים) שיש להפריד מה-ELP במהלך הטיהור. אסטרטגיות מסיסות מסורתיות המשתמשות בדטרגנטים (למשל, סודיום דודציל סולפט (SDS) או טריטון X-100) או סוכנים כאוטרופיים כמו אוריאה זכו להצלחה מוגבלת עבור רצפי ההיתוך ELP שלנו. מניסיוננו, טריטון ואוריאה לא הצליחו להפיק ELPs משלב הפלט, בעוד ש-SDS אפשר מסיסות חלקית אך הפריע לטיהור הזיקה במורד הזרם והיה קשה להסיר אותו לחלוטין מרצף ה-ELP ההידרופובי.

עד היום, מחזור מעבר הפוך (ITC) נותר שיטת הטיהור הנפוצה ביותר עבור ELPs. טכניקה זו מנצלת את התנהגות ה-LCST שלהם כדי להשקיע ולמסיס את ה-ELP באופן סלקטיבי דרך גרדיאנטים של טמפרטורה ומלח16. עם זאת, עם חלבונים בעלי משקל מולקולרי נמוך יותר, ITC הוא תהליך רב-שלבי גוזל זמן רב שאינו מתאים במיוחד ל-ELPs הכלואים בגופי הכללה, ודורש מספר מחזורי ITC שיכולים להוביל לאובדן חלבונים בכל שלב 7,16.

כדי להתגבר על מגבלות אלו, אימצנו תהליך הפקה והשקעה מבוססת ממס אורגני. בעוד שיכנין ואחרים הדגימו לראשונה אסטרטגיית חלוקה מונעת הידרופוביות לטיהור GFP באמצעות גרדיאנטים של אתנול ומלח בשנת 1998, השיטה החדשה שפיתחנו עושה שימוש בתערובות ממס אורגניות כדי להפיק ישירות חלבוני מיזוג ELP מתאי E. coli 7. סוויט ואח' ודרג'י ואח' התאימו גישה זו למיזוג ELP, והראו כי הפקת ממס אורגני מאפשרת התאוששות מהירה של ELPים פונקציונליים תוך שמירה על שלמות מבנית וביואקטיביות 8,9. גישה זו משתמשת בסוניקציה ובממסים אורגניים כדי לפרק תאי חיידקים ולחילוץ ELPs בפעולה אחת, תוך השפעת רוב חלבוני המארח וחומצות גרעין. התאוששות של השלב האורגני העשיר ב-ELP, ואחריה השקעה מהירה לבידוד ה-ELPs מממסים וזיהומים מסיסים, מניבה ELPs טהורים מאוד. גישה זו מסוגלת גם להניב ELP טהור מכדורי E. coli עם רמות אנדוטוקסין מתחת ל-1 EU/mL בפחות משלוש שעות 7.8.

מחקרים עד כה מראים ששיטה זו מסוגלת לטהר מבני ELP וחלבוני מיזוג ELP במשקל מולקולרי ונקודת איזואלקטרי משתנים, ללא מחזורי ITC מרובים או שלבי מסיסה (איור 1). מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) ודימות מיקרוסקופ אלקטרוני העברה (TEM) מצביעים על כך שחלבוני ELP-פיוז'ן מטוהרים בדרך זו יוצרים מבנים דמויי מיצל הפוך (איור 2), ובכך מסייעים לשמר את המבנה והתפקוד של תחומי המיזוג של ELP במהלך הפקת הממס האורגני. תהליך עבודה יעיל זה מאפשר טיהור ELP מהיר ואמין יותר ליישומים ביורפואיים מגוונים 7,8. ראוי לציין כי Aayush ואחרים דיווחו שמבני ELP שטוהרו בשיטה זו שמרו על פונקציית קישור לקולטני גורם הגדילה האפידרמלי18, מה שמדגיש את הנקודה ששיטה זו לא רק מייצרת חומר ELP טהור, אלא גם שומרת על פעילות תחום חלבון המיזוג.

כהדגמה נוספת לשימושיות שיטה זו בבידוד מיזוג ELP-אנזים, אנו מתארים שיטה מפורטת מבוססת ממס אורגני לטיהור מבנה מוטאז ELP-Intein-Chorismate 2 (ELP-I-Cm2) (איור 3). שיטה זו עשויה להיות שימושית לטיהור מהיר של ELPs אחרים להעברת תרופות ויישומים של ננומטרים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. הכנת חומרים

  1. זן חיידקים: השתמש בתאים Escherichia coli BL21(DE3) בעלי כימיה כמארח ביטוי.
    הערה: הם נבחרו בשל יעילות הטרנספורמציה הגבוהה שלהם וההתאמה שלהם לייצור חלבונים רקומביננטיים.
  2. פלסמיד ביטוי: השתמש בוקטור pET21(+) המקודד לחלבון מיזוג ELP-I-Cm2 עם עמידות לאמפיצילין9. רכש את וקטור הפלסמיד מ-addgene. הכנס את גן ה-Cm2 באמצעות אתר BsrG I בסוף האינטאין.
    הערה: רצף ה-DNA של הפלסמיד של חלבון זה מסופק בקובץ משלים 1.
  3. מדיה לצמיחה: הכנת חומר Terrific Broth (TB) למדיה של 1200 מ"ל
    1. הכינו מדיה (חלק 1) על ידי הוספת 16 גרם טריפטון, 32 גרם תמצית שמרים, 16 גרם פרולין, 6.8 מ"ל גליצרול ל-1100 מ"ל מים אולטרה-טהורים. ערבבו היטב כדי להמיס את כל הרכיבים. כוון את הנפח הסופי ל-1200 מ"ל עם מים אולטרה-טהורים.
    2. הכינו את בופר האשלגן פוספט (חלק 2) על ידי ערבוב 23.1 גרם KH2PO4 ו-125.4 גרם של K2HPO4, ואז הביאו את הנפח ל-1 ליטר עם מים אולטרה-טהורים.
    3. אוטוקלב את הרכיבים (חלקים 1 ו-2) בנפרד. לאחר האוטוקלב, הרכיבו את המדיה על ידי חלוקת בסיס ה-TB לארבעה אליקווטים של 300 מ"ל. הוסף 33 מ"ל של בופר פוספט לכל אליקו בתנאים סטריליים.
  4. תוספים לביטוי
    1. IPTG: לבצע השראה באמצעות IPTG בריכוז סופי של 1.2 מ"מ (למשל, להוסיף 396 מיקרוליטר של 1 מיליון IPTG לתרבית של 330 מ"ל).
    2. אנטיביוטיקה: מוסיפים אמפיצילין לריכוז סופי של 100 מיקרוגרם/מ"ל כדי להבטיח ברירה של הפלסמיד.
  5. בופר ליזיס (pH 8.5): הכינו את בופר הליזיס עם 10 מ"מ טריס בסיס ו-22 מ"מ אתילנדיאמינטרטראאצטית (EDTA). כוון את ה-pH ל-8.5 באמצעות HCl או NaOH לפי הצורך.
  6. ממסים אורגניים למיצוי
    1. השתמש במגוון ממסים אורגניים (טבלה 1) להפקת חלבון המיזוג ELP-I-Cm2 מגופי הכללה. בדוק את הממסים הללו הן בנפרד והן בשילובים בינאריים (נפח 1:1) כדי להעריך יעילות וטוהר ELP.
      הערה: כל הממסים ששימשו היו בדרגת HPLC, למעט אצטוניטריל (דרגת אופטימה), אתנול (דרגת USP) ו-1-בוטנול (99% טהור).
      אזהרה: כל הממסים שצוינו לעיל נדיפים ודליקים. יש לטפל בהם בתוך מכסה אדים כימי באמצעות ציוד מגן מתאים (מעיל מעבדה, כפפות ניטריל והגנה על עיניים). סוגים רבים של כלי פלסטיק אינם תואמים לממסים אורגניים. כלי פלסטיק מפוליפרופילן מומלצים מאוד לניסויים בהפקה-משקעים עם ממסים אורגניים; אחרת, יש לבדוק את כלי הפלסטיק שיש להשתמש בהם ללא דגימה יקרת ערך כדי לוודא שהם מתאימים לשימוש. סילוק פסולת ממס צריך לעמוד בהליכים המפורטים במדיניות הפסולת המסוכנת המוסדית הרלוונטית.

2. ניתוק תאים והכנה (איור 4A)

  1. השעיה מחדש: שקלו 1 גרם של כדור תא ותלו אותו מחדש ב-4 מ"ל של בופר ליזיס טרי. מערבולת בעדינות עד שהכדור מתפזר לחלוטין ומתערבב עם הבופר.
  2. ניתוק אנזימטי: הוסף ~5 מ"ג ליזוזים כדי לסייע בעיכול דופן התא. אפשרו למתלה לדקור בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך שעה. זה מקל על עיכול אנזימטי חלקי כדי להגביר את פירוק התאים.
  3. סוניקציה: לאחר הדגירה, סוניקה את הדגימה להשלמת ניתוק התאים ו-DNA גנומי גזירה. השתמש בפרצי זמן קצרים של מיקרו-טיפ עם סוניקציה (מכשיר 350 וואט, רמת הספק 3) עם מרווחים כדי למנוע התחממות יתר (למשל, 5 שניות הדלקה/10 שניות כבוי, חזרה לפי הצורך). סוניקציה של הדגימות על הקרח והחלו את האנרגיה האולטרסונית עד שמתקבל ליזאט אחיד חופשי מחלקיקים גלויים, בדרך כלל למשך כ-5-8 דקות.
    הערה: לאחר סיום הסוניקציה, יש לאחסן 100 מיקרו-ליטר אליקווט של הדגימה (או הליזאט) לניתוח ביטוי ELP כדי לעקוב אחר התקדמות הטיהור לפני ואחרי שלבי החילוץ והמשקעים.
  4. צנטריפוגציה וניתוח ביטוי.
    1. הבהירו את הליזאט באמצעות צנטריפוגציה ב-10,000 גרם למשך 10 דקות בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס, ואז הפרדו בזהירות את הסופרנטנט (החלק הממסיס) מהפלט (שבר גוף בלתי מסיס/הכללה).
    2. הערכת ביטוי ELP בשני החלקים באמצעות SDS-PAGE: למשוך אליקו (למשל, 10-20 מיקרוליטר) של הסופרנטנט ולהחזיר מסה שווה ערך של כדור בבופר ליזיס (50 מ"מ טריס-HCl pH 8.0, 150 מ"מ NaCl, 1 מ"מ EDTA) לאותו נפח; מערבבים כל אחד עם 4x בופר Laemmli ל-1x אחרון, חממו ב-95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, ומעמיסים כמויות שוות כדי לאפשר השוואה ישירה.
    3. אם ה-ELP המטרה הוא בעיקר מסיס, יש להמשיך בהפקת הממס האורגני באמצעות הסופרנאנט המובהק. אם הוא בעיקר בלתי מסיס (גופי הכללה), השליכו את הסופרנטנט והמשיכו בתהליך ההכללה-גוף (שטיפה/מסיסות והפקה) על ידי עיבוד הכדור באמצעות חילוץ אורגני בממס.
  5. שטיפת וייבוש בפלט (רק ל-ELP בגופי הכללה): הפוך את צינורות הצנטריפוגה כדי לאפשר ניקוז בסיוע כבידה של כל בופר ליזיס שאריתי. לאחר שהנוזל הנראה נקז (~1-2 דקות), השאירו את הכדור להתייבש בטמפרטורת החדר למשך 5-10 דקות, כדי לוודא שהוא נקי מלחות עודפת לפני שממשיכים להפקה אורגנית.

3. הפקה אורגנית (איור 4B)

הערה: לכל ELP יש תנאי ממס מועדף משלו להניב חילוצים בטוהר גבוה (למשל, ביצועי AC באיור 1). לכן, יש לבדוק סקר ראשוני של 28 ממסים אורגניים ושילוביהם, ולנתח את הבודדים על ידי PAGE כדי לזהות את תנאי יעילות המסיסות האופטימליים למבנה הרלוונטי.

  1. סינון ממס. סרנו את הממסים הבודדים המוצגים בשלב 1.6 ואת תערובות הממס הבינאריות שלהם ביחס 1:1 (v/v). העריכו תערובות נוספות (למשל, 1:2, 2:1, 4:1) כדי לשפר את יעילות התהליך.
    הערה: נכון לעכשיו אין קווים מנחים לבחירה רציונלית של הממסים או השילובים היעילים ביותר, ולכן יש צורך בקמפיין סקר לבחירה מממסים שהצליחו בעבר להמיס את אגרגטים חלבונים הידרופוביים. הבחירה הסופית של מחלץ הממס האורגני שישמש לטיהור צריכה להתבסס על ניתוח SDS-PAGE של הבידוד שהתקבל ממסך זה.
  2. הליך חילוץ
    1. הוספת ממס: הוסף 4 מ"ל של ממס אורגני או תערובת ממס לכדור/סופרנטנט מיובש באוויר שמתקבל לאחר הליזה. לשילובים מעורבים, יש להבטיח יחס נפחי מדויק (למשל, 2 מ"ל מכל שילוב של 1:1).
    2. Vortexing: יש לסחרר את המתלה בעוצמה למשך דקה אחת כדי להבטיח ערבוב וחדירה יסודית של הממס לתוך הפלט.
    3. דגירה (זמן שמירה): אפשר למתלה לדגירה בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, כדי להבטיח זמן אינטראקציה מספק לחלבונים חוץ-תאיים להצטבר ולשקע בזמן שה-ELPs מתמוססים בשלב האורגני.
    4. צנטריפוגה: צנטריפוגה את התערובת ב-13,000 × גרם למשך 10 דקות בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס כדי להפריד חלבונים ממוססים משאריות של פסולת בלתי מסיסה.
    5. אוסף הסופרנטנט: אספו בזהירות את הסופרנטנט מבלי להפריע לכדור. הסופרנטנט מכיל את ה-ELP הממסיס, בעוד שהכדור מכיל חלבוני תאי מאכסן, חומצות גרעין וליפידים.
    6. מדידת נפח: רשמו בדיוק את נפח הסופרנטנט שהוחזר. יש להיזהר לוודא שהסופרנטנט נקי מכל חלקיקי פלט. מדידה זו קריטית לשלב המשקעים במורד הזרם.

4. משקעים חלבונים

  1. הוספת אנטי-ממס: הוסף אצטון או אצטוניטריל לסופרנטנט האורגני בעוצמה של פי 2.33 מהנפח הנמדד של הסופרנאנט.
  2. דגירה: דגרו את התערובת בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס למשך 5-7 דקות.
  3. צנטריפוגה: צנטריפוגה ב-10,000 גרם למשך 10 דקות בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס.
  4. טיפול בכדורים: לאחר הצנטריפוגה, זרקו בזהירות את הסופרנטנט וייבשו את הדגימה באוויר על ידי השארת הצינור פתוח תחת גז חנקן עדין למשך 10-15 דקות, או דגרו על ידי הנחת צינורות צנטריפוגה פתוחים הפוך על מגבונים ללא סיבים במכסה אדים למשך שעה בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס (אין לחמם).

5. טיפול בכדורי חלבון והשעיה מחדש

  1. השעיה מחדש: לאחר השקעה ויבוש באוויר, החזירו את כדור החלבון ל-50 מיקרוליטר של מלח מפוזר פוספט (PBS). פיפט בעדינות למעלה ולמטה כדי לוודא שהכדור מומס לחלוטין.
  2. אחסון: אחסן את החלבון התלוי בטמפרטורה של -20°C לשימוש קצר עד בינוני. הימנעו ממחזורי הקפאה והפשרה חוזרים כדי לשמור על שלמות תפקודית החלבון.

6. אימות באמצעות SDS-PAGE

  1. הכנת דגימה: ערבב את החלבון המטוהר עם בופר טעינה 4× SDS-PAGE ביחס 3:1 ומערבולת קצרה כדי להבטיח הומוגניות.
  2. תנאי אלקטרופורזה: טענו על ג'ל SDS-PAGE של 15% עבור ELP-I-Cm2 והריצו ב-100-120 וולט עד שצבע המעקב מגיע לתחתית.
    הערה: אחוז הקישוריות הצולב בג'ל צריך להתבסס על גודל מבנה ה-ELP הרלוונטי
  3. צביעה והדמיה: צבע את הג'ל באמצעות כתם Instant Blue Coomassie או כתם מתאים אחר לשעתיים בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס. הסרת צבע על ידי שטיפה במים דה-יוניים עד שנוצר רקע ברור. בדוק את החלבון המבודד במבחני פעילות כדי לאמת ששימור פעילות התרחש לאחר תהליך תהליך טיהור חילוץ ומשקעים אורגני בממס.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

לאחר השלבים הסופיים של הפרוטוקול, השלב הבא הוא המחשת תוצאת ההוצאה-משקעים באמצעות ניתוח SDS-PAGE וצביעה כחולה של קומסי. כאשר יש שלב ליזיס לפני ההפקה אורגנית, יש להופיע רצועת ELP בולטת. במקרה של ELP-I-Cm2, תחום זה מופיע בעוצמה של 100 קילודאלטון (איור 3A).

סקר של שילובי ממס אורגניים שונים הראה יעילות הפקה משתנה (איור 3B), כאשר כל שילוב מניב ריכוזים וטוהרים שונים. אנו בוחרים את השילובים הטובים ביותר למיצוץ-משקעים בהתבסס על טוהר ומבחן תפקו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

ITC שימש בעבר לטיהור לא-כרומטוגרפי של ELP19; עם זאת, זו יכולה להיות שיטה גוזלת זמן ותהליך בעל תפוקה נמוכה. בשיטות המפורטות לעיל, אנו מתארים גישה לטיהור מהיר של חלבון מיזוג ELP-I-Cm2, ומדגימה כיצד ניתן להשתמש בשיטת חילוץ-משקע אורגנית מבוססת ממס אורגני לטיהור מגוון רחב של היתוך ELP ו-ELP. פרוטוקול הממס האורגני לא רק מהיר יותר מ-ITC, אלא גם יעיל הרבה יותר עבור רצפי ELP קצרים יותר שיכולים לאתגר את שיטת ה-ITC. ייתכן שהוא גם אלטרנטיבה ניתנת להרחבה יותר מ-ITC ליישומים תע...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

אנו מודים למכון למחקר סרטן של אוניברסיטת פרדו ולתוכנית ה-CCSG של NIH (CA23168) על התמיכה בעבודה זו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
2-מרקפטואנולביו-ראד161-0710רכיב SDS-PAGE
30% אקרילאמיד/ביס-אקרילאמידTCIA3218רכיב SDS-PAGE
אצטוןפישר סיינטיפיקA949ממס אורגני
אצטוניטרילפישר סיינטיפיקA996ממס אורגני
אמפיציליןביוטכנולוגיה ביולוגית זהבA-301-25אנטיביוטיקה
APS (אמוניום פרסולפאט)ביו-ראד1610700רכיב SDS-PAGE
בוטנולפישר סיינטיפיקL13171ממס אורגני
EDTAביוריאגנטים של פישרBP118-500רכיב בופר Lysis
אתנולדיקון לאבסUN1170ממס אורגני
אתיל אצטטפישר סיינטיפיקE195ממס אורגני
גליצרולResearch Products InternationalG22020-0.5רכיב מדיה של Terrific Broth (TB)
חומצה הידרוכלוריתפישר סיינטיפיקA144SI-212רכיב בופר Lysis
כתם קומאסי מיידיאבקאםAB119211רכיב SDS-PAGE
IPTGביוטכנולוגיה ביולוגית זהב12481C25רכיב ביטוי חלבון
איזופרופנולפישר סיינטיפיקA451-1ממס אורגני
K2HPO4 (פספט אשלגן מונובסיסי)מדעי הוורדס470302-246חלק 2 רכיב מאגר
KH2PO4 (פוטזיום פוספט דיבאסיק)מדעי הוורדס470302-254חלק 2 רכיב מאגר
L-פרוליןResearch Products InternationalP5200-500.0רכיב מדיה של Terrific Broth (TB)
ליזוזיםביוטכנולוגיה ביולוגית זהבL-040-1רכיב בופר Lysis
מתנולפישר סיינטיפיקA452ממס אורגני
מאגר דגימה מקוריביו-ראד161-0738רכיב SDS-PAGE
סולם חלבוניםביוטכנולוגיה ביולוגית זהבP008-500רכיב SDS-PAGE
מאגר ג'ל מתפרקביו-ראד1610798רכיב SDS-PAGE
סודים דודציל סולפט (SDS)תרמו-סיינטיפיקJ18220-36רכיב SDS-PAGE
נתרן הידרוקסידפישר סיינטיפיקS318-500רכיב בופר Lysis
בופר ג'ל ערימהביו-ראד1610799רכיב SDS-PAGE
TEMEDביו-ראד1610801רכיב SDS-PAGE
בסיס טריסביוריאגנטים של פישרBP-152רכיב בופר Lysis
טריפטוןResearch Products InternationalT60065-1000.0רכיב מדיה של Terrific Broth (TB)
תמצית שמריםResearch Products InternationalY20025-1000.0רכיב מדיה של Terrific Broth (TB)

מקורות

  1. Despanie, J., Dhandhukia, J. P., Hamm-Alvarez, S. F., MacKay, J. A. Elastin-like polypeptides: therapeutic applications for an emerging class of nanomedicines. J Control Release. 240, 93-108 (2016).
  2. MacEwan, S. R., Chilkoti, A. Applications of elastin-like polypeptides in drug delivery. J Control Release. 190, 314-330 (2014).
  3. Jenkins, I. C., Milligan, J. J., Chilkoti, A. Genetically encoded elastin-like polypeptides for drug delivery. Adv Healthc Mater. 10 (13), e2100209(2021).
  4. Ju, Y., et al. Molecular targeting of immunosuppressants using a bifunctional elastin-like polypeptide. Bioconjug Chem. 30 (9), 2358-2372 (2019).
  5. Nettles, D. L., Chilkoti, A., Setton, L. A. Applications of elastin-like polypeptides in tissue engineering. Adv Drug Deliv Rev. 62 (15), 1479-1485 (2010).
  6. Meyer, D. E., Chilkoti, A. Purification of recombinant proteins by fusion with thermally responsive polypeptides. Nat Biotechnol. 17 (11), 1112-1115 (1999).
  7. VerHeul, R., Sweet, C., Thompson, D. H. Rapid and simple purification of elastin-like polypeptides directly from whole cells and cell lysates by organic solvent extraction. Biomater Sci. 6 (4), 863-876 (2018).
  8. Sweet, C., Aayush, A., Readnour, L., Solomon, K. V., Thompson, D. H. Development of a fast organic extraction-precipitation method for improved purification of elastin-like polypeptides that is independent of sequence and molecular weight. Biomacromolecules. 22 (5), 1990-1998 (1990).
  9. Darji, S., Aayush, A., Estes, K. M., Strock, J. D., Thompson, D. H. Unravelling the mechanism of elastin-like polypeptide-enzyme fusion stabilization in organic solvents. Biomacromolecules. 25 (1), 272-281 (2024).
  10. Urry, D. W. Physical chemistry of biological free energy transduction as demonstrated by elastic protein-based polymers. J Phys Chem B. 101 (51), 11007-11028 (1997).
  11. Guo, Y., Liu, S., Jing, D., Liu, N., Luo, X. The construction of elastin-like polypeptides and their applications in drug delivery system and tissue repair. J Nanobiotechnology. 21, 418(2023).
  12. Yi, A., Sim, D., Lee, S. -B., Sarangthem, V., Park, R. -W. Application of bioengineered elastin-like polypeptide-based system for targeted gene delivery in tumor cells. Biomater Biosyst. 6, 100050(2022).
  13. Clement, H., et al. Comparison between the recombinant expression and chemical synthesis of a short cysteine-rich insecticidal spider peptide. J Venom Anim Toxins Trop Dis. 21, 19(2015).
  14. Miranda, L. P., Alewood, P. F. Accelerated chemical synthesis of peptides and small proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (4), 1181-1186 (1999).
  15. Eweje, F., et al. Self-assembling protein nanoparticles for cytosolic delivery of nucleic acids and proteins. Nat Biotechnol. , (2025).
  16. Hassouneh, W., Christensen, T., Chilkoti, A. Elastin-like polypeptides as a purification tag for recombinant proteins. Curr Protoc Protein Sci. 6 (11), 1-16 (2010).
  17. Yakhnin, A. V., Vinokurov, L. M., Surin, A. K., Alakhov, Y. B. Green fluorescent protein purification by organic extraction. Protein Expr Purif. 14 (3), 382-386 (1998).
  18. Aayush, A., Darji, S., Estes, K. M., Yeh, E., Thompson, D. H. Development of an elastin-like polypeptide-based nucleic acid delivery system targeted to EGFR+ bladder cancer cells using a layer-by-layer approach. Biomacromolecules. 25 (9), 5729-5744 (2024).
  19. Christensen, T., et al. Fusion order controls expression level and activity of elastin-like polypeptide fusion proteins. Protein Sci. 18 (7), 1377-1387 (2009).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

טיהור ELPמיצוי בממס אורגנישקיעת חלבוניםביטוי ב-E. Coliגופי הכללה (Inclusion Bodies)הסרת אנדוטוקסיניםאנליזת SDS-PAGEפעילות חלבון היתוךננו-חלקיקים בהרכבה עצמית
טיהור יעיל של פוליפפטידים דמויי אלסטין (ELPs) מ-E. coli באמצעות שיטת חילוץ והשקעה מבוססת ממס אורגני
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.