פרוטוקול זה מתאר שיטת חילוץ והשקעה מהירה וניתנת לשחזור מבוססת ממס אורגני לטיהור פוליפפטיד דמוי אלסטין (ELP) מ-Escherichia coli, ומספק חלופה ניתנת להרחבה פוטנציאלית לשיטות טיהור ELP קונבנציונליות.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
טיהור יעיל של פוליפפטידים דמויי אלסטין (ELPs) מ-E. coli באמצעות שיטת חילוץ והשקעה מבוססת ממס אורגני
במאמר זה
סיכום
תקציר
פוליפפטידים דמויי אלסטין (ELP) הם ביופולימרים מהונדסים הנבנים מרצפי פנטאפפטיד חזרתיים המדמים מוטיבים שנמצאים בטרופולסטין ביונקים. המאפיינים הייחודיים שלהם הופכים אותם למועמדים אידיאליים למגוון רחב של יישומים ביו-רפואיים, החל מהעברת תרופות וגנים ועד להנדסת רקמות ודימות מולקולרי ממוקד. שיטות טיהור קונבנציונליות מביטוי Escherichia coli (E. coli) עלולות להיות לא יעילות עבור ELP בשל היווצרות גופי הכללה. שיטות אחרות, כמו מחזור מעבר הפוך (ITC), מנצלות את תכונות טמפרטורת התמיסה הקריטית (LCST) הנמוכה יותר של ELP כדי להפריד אותו מזהמים כמו ליפופוליסכרידים (LPS), אך בדרך כלל דורשות מספר שלבי חימום וקירור שגוזלי זמן ועלולים לגרום להתאוששות נמוכה בהתאם לרצף, ריכוז ומשקל מולקולרי של מבנה ה-ELP. כדי להתמודד עם אתגרים אלו, פיתחנו תהליך חילוק-משקעים מבוסס ממס אורגני שמנצל את ההידרופוביות הפנימית של ELP כדי לאפשר טיהור מהיר, חזק ורחב יישום ישירות מכדורי תאי E. coli . שיטה זו עושה שימוש בממסים אורגניים קוטביים כדי לסייע בהפרעה לתאים ולמסיס באופן סלקטיבי את ELP בשלב אחד. שלב המשקעים הבא מסיר למעשה ממססים אורגניים שאריתיים, זיהומים בעלי משקל מולקולרי נמוך ואנדוטוקסינים, ומניב ELP טהור מאוד עם רמות LPS מתחת ל-1 EU/mL בפחות מ-3 שעות. נתוני מיקרוסקופ כוח אטומי מצביעים על כך שחלבוני ELP-Fusion שטוהרו בדרך זו יכולים להתאסף למבנים דמויי מיצל הפוך ששומרים על תפקוד חלבוני המיזוג. שיטת טיהור מהיר זו מציעה לחוקרים דרך פשוטה ופוטנציאלית להרחבה לטיהור ELP, ויוצרת אפשרויות חדשות לשימוש ב-ELP ובחלבוני המיזוג שלו כאבני בניין גמישות ליישומים חומריים וביו-רפואיים.
מבוא
פוליפפטידים דמויי אלסטין (ELPs) הם ביופולימרים המורכבים ממוטיבים חוזרים (VPGXG)n 1,2,3,4,5,6,7,8,9. שארית האורח X ביחידת הפנטפפטיד יכולה להיות כל חומצת אמינו שאינה פרולין. וריאציות ב-X יכולות לשמש לכוונון ההידרופוביות, התנהגות המעבר התרמי והמאפיינים הפונקציונליים של מבנה ELP ליצירת חומרים ביו-תואמים מודולריים שנחקרו רבות ביישומים ביו-רפ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. הכנת חומרים
- זן חיידקים: השתמש בתאים Escherichia coli BL21(DE3) בעלי כימיה כמארח ביטוי.
הערה: הם נבחרו בשל יעילות הטרנספורמציה הגבוהה שלהם וההתאמה שלהם לייצור חלבונים רקומביננטיים. - פלסמיד ביטוי: השתמש בוקטור pET21(+) המקודד לחלבון מיזוג ELP-I-Cm2 עם עמידות לאמפיצילין9. רכש את וקטור הפלסמיד מ-addgene. הכנס את גן ה-Cm2 באמצעות אתר BsrG I בסוף האינטאין.
הערה: רצף ה-DNA של הפלסמיד של חלבון זה מסופק בקובץ משלים 1. - מדיה לצמיחה: הכנת חומר Terrific Broth (TB) למדיה של 1200 מ"ל
- הכינו מדיה (חלק 1) על ידי הוספת 16 גרם טריפטון, 32 ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
לאחר השלבים הסופיים של הפרוטוקול, השלב הבא הוא המחשת תוצאת ההוצאה-משקעים באמצעות ניתוח SDS-PAGE וצביעה כחולה של קומסי. כאשר יש שלב ליזיס לפני ההפקה אורגנית, יש להופיע רצועת ELP בולטת. במקרה של ELP-I-Cm2, תחום זה מופיע בעוצמה של 100 קילודאלטון (איור 3A).
סקר של שילובי ממס אורגניים שונים הראה יעילות הפקה משתנה (איור 3B), כאשר כל שילוב מניב ריכוזים וטוהרים שונים. אנו בוחרים את השילובים הטובים ביותר למיצוץ-משקעים בהתבסס על טוהר ומבחן תפקו.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
ITC שימש בעבר לטיהור לא-כרומטוגרפי של ELP19; עם זאת, זו יכולה להיות שיטה גוזלת זמן ותהליך בעל תפוקה נמוכה. בשיטות המפורטות לעיל, אנו מתארים גישה לטיהור מהיר של חלבון מיזוג ELP-I-Cm2, ומדגימה כיצד ניתן להשתמש בשיטת חילוץ-משקע אורגנית מבוססת ממס אורגני לטיהור מגוון רחב של היתוך ELP ו-ELP. פרוטוקול הממס האורגני לא רק מהיר יותר מ-ITC, אלא גם יעיל הרבה יותר עבור רצפי ELP קצרים יותר שיכולים לאתגר את שיטת ה-ITC. ייתכן שהוא גם אלטרנטיבה ניתנת להרחבה יותר מ-ITC ליישומים תע.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
תודות
אנו מודים למכון למחקר סרטן של אוניברסיטת פרדו ולתוכנית ה-CCSG של NIH (CA23168) על התמיכה בעבודה זו.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 2-מרקפטואנול | ביו-ראד | 161-0710 | רכיב SDS-PAGE |
| 30% אקרילאמיד/ביס-אקרילאמיד | TCI | A3218 | רכיב SDS-PAGE |
| אצטון | פישר סיינטיפיק | A949 | ממס אורגני |
| אצטוניטריל | פישר סיינטיפיק | A996 | ממס אורגני |
| אמפיצילין | ביוטכנולוגיה ביולוגית זהב | A-301-25 | אנטיביוטיקה |
| APS (אמוניום פרסולפאט) | ביו-ראד | 1610700 | רכיב SDS-PAGE |
| בוטנול | פישר סיינטיפיק | L13171 | ממס אורגני |
| EDTA | ביוריאגנטים של פישר | BP118-500 | רכיב בופר Lysis |
| אתנול | דיקון לאבס | UN1170 | ממס אורגני |
| אתיל אצטט | פישר סיינטיפיק | E195 | ממס אורגני |
| גליצרול | Research Products International | G22020-0.5 | רכיב מדיה של Terrific Broth (TB) |
| חומצה הידרוכלורית | פישר סיינטיפיק | A144SI-212 | רכיב בופר Lysis |
| כתם קומאסי מיידי | אבקאם | AB119211 | רכיב SDS-PAGE |
| IPTG | ביוטכנולוגיה ביולוגית זהב | 12481C25 | רכיב ביטוי חלבון |
| איזופרופנול | פישר סיינטיפיק | A451-1 | ממס אורגני |
| K2HPO4 (פספט אשלגן מונובסיסי) | מדעי הוורדס | 470302-246 | חלק 2 רכיב מאגר |
| KH2PO4 (פוטזיום פוספט דיבאסיק) | מדעי הוורדס | 470302-254 | חלק 2 רכיב מאגר |
| L-פרולין | Research Products International | P5200-500.0 | רכיב מדיה של Terrific Broth (TB) |
| ליזוזים | ביוטכנולוגיה ביולוגית זהב | L-040-1 | רכיב בופר Lysis |
| מתנול | פישר סיינטיפיק | A452 | ממס אורגני |
| מאגר דגימה מקורי | ביו-ראד | 161-0738 | רכיב SDS-PAGE |
| סולם חלבונים | ביוטכנולוגיה ביולוגית זהב | P008-500 | רכיב SDS-PAGE |
| מאגר ג'ל מתפרק | ביו-ראד | 1610798 | רכיב SDS-PAGE |
| סודים דודציל סולפט (SDS) | תרמו-סיינטיפיק | J18220-36 | רכיב SDS-PAGE |
| נתרן הידרוקסיד | פישר סיינטיפיק | S318-500 | רכיב בופר Lysis |
| בופר ג'ל ערימה | ביו-ראד | 1610799 | רכיב SDS-PAGE |
| TEMED | ביו-ראד | 1610801 | רכיב SDS-PAGE |
| בסיס טריס | ביוריאגנטים של פישר | BP-152 | רכיב בופר Lysis |
| טריפטון | Research Products International | T60065-1000.0 | רכיב מדיה של Terrific Broth (TB) |
| תמצית שמרים | Research Products International | Y20025-1000.0 | רכיב מדיה של Terrific Broth (TB) |
מקורות
- Despanie, J., Dhandhukia, J. P., Hamm-Alvarez, S. F., MacKay, J. A. Elastin-like polypeptides: therapeutic applications for an emerging class of nanomedicines. J Control Release. 240, 93-108 (2016).
- MacEwan, S. R., Chilkoti, A. Applications of elastin-like ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
