מאמר שיטה

הדמיית סידן מבוססת פלואורסצנציה בתרביות אפיתל ראשוניות בדרכי הנשימה האנושיות באמצעות סגמנטציה אוטומטית של תאים

DOI:

10.3791/69470

⸱

22 במאי 2026

 ,  , 
1Molecular Medicine, Hospital for Sick Children, 2Department of Biochemistry, University of Toronto, 3Department of Physiology, University of Toronto

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הדמות תאים חיים של איתות סידן משמשת בהרחבה לחקר מוביליזציה של סידן בקווי תאים יציבים שגדלים בשכבות מונולייריות. פרוטוקול זה מתאר הדמיית פלואורסצנציה של תאים חיים של איתות סידן באמצעות צבעי תאים חיים על רקמות ראשוניות מורכבות, ומשתמש גם בתוכנת למידת מכונה לכמת עוצמת הפלואורסצנציה של אלפי תאים בודדים בו-זמנית, ובכך מייעל את הניתוחים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

איתות סידן הוא קריטי במגוון תהליכים ביולוגיים, ומחזק את הצורך לפתח שיטות לחקר שטף הסידן ברקמה הראשונית. חקר איתות סידן ברזולוציה של תא יחיד בתרביות אפיתל ראשוניות מורכבות הוא מאתגר ולכן עדיין נחקר בצורה לקויה. מחקר זה מציג שיטות מותאמות למעקב אחר איתות סידן חי בתרביות אפיתל ראשוניות בדרכי הנשימה וגישות חדשניות לניתוחים מבוססי למידת מכונה. באמצעות תרביות אפיתל ראשוניות של דרכי הנשימה שמקורם במטופל, שהובדלו במחברת ALI (ממשק אוויר-נוזל) שהיו טעונות בצבע אינדיקטור פלואורסצנטי חיצוני, נמדדה ניידת הסידן ברזולוציית תא יחיד באמצעות מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי. פיתחנו תוכנה חדשנית המשתמשת בסגמנטציה מבוססת למידת מכונה של תאים כדי להקצות עוצמות פלואורסצנציה לתאים נפרדים לאורך זמן. בסך הכול, מערכת ההדמיה המותאמת והתוכנה מאפשרות גישה מהירה ובלתי מוטה לניתוח תאים בודדים בתרביות האפיתל הראשוניות. הפרוטוקול שלב אחר שלב המוצג כאן יאפשר מחקר עתידי של סידן בתאים בודדים ובסוגי תאים המרכיבים את תרביות האפיתל הראשוניות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שינויים במוביליזציה התוך-תאית של הסידן מכתיבים מגוון רחב של תהליכים תאיים, כולל שינויים בביטוי גנים ובוויסות התגובות החיסוניות המולדות 1,2. רמות הסידן התוך-תאי יכולות להשתנות באמצעות שחרור מאגרי סידן תוך-תאי, כגון הרשתית האנדופלזמית והמיטוכונדריה 1,2,3. זרם סידן חוץ-תאי למרחב התוך-תאי יכול גם לשנות סידן ציטוזולי באמצעות הובלה פסיבית ואקטיבית2. הדמיית תאים חיים של מוביליזציה של סידן נבדקת בעיקר על ידי צבעים תוך-תאיים או צבעים מקודדים גנטית, GCaMP (Green Calcium-activated Multimer/Protein)4. נפוצים בספרות הם צבעי AM (אצטוקסימתיל) מצומדים, שמאפשרים לצבע לחדור לממברנת הפלזמה 5,6,7,8. בכניסה לתא, חתיכת ה-AM נחתכת על ידי אסטראזות תוך-תאיות אנדוגניות, והצבע מקבל מטען שלילי, הלכוד אותו במרחב הציטוזולי9. עקב המטען שנצבר, ניתן לשאוב את הצבע על ידי תעלות אניון אורגניות תושבות ממברנת הפלזמה. לכן, מתווסף פרובנסיד, מעכב של נשאי פליטת אניון אורגניים, כדי למנוע פליטה תאית של הצבע ולשמור על אות ציטוזולי מיטבי 10,11. מחקרים משתמשים בדרך כלל ב-Fura-2 AM, צבע רציונטרי, וב-Fluo-4AM, צבע אינטנסיטומטרי, כדי לבדוק אותות סידן על קווי תאים יציבים שגודלו במונולייר. מחקר זה עושה שימוש בפרוטוקול המותאם להדמיה אפיפלואורסצנטית של תרביות רב-שכבתיות שגודלו במשלב אוויר-נוזל באמצעות צבע סידן אינטנסיטומטרי שפותח לאחרונה, Cal-520 AM, אשר רגיש יותר בהשוואה ל-Fluo-4 AM. לכן, הוא מתאים להמחיש אותות עדינים ברזולוציה של תא יחיד מתרביות אפיתל ראשוניות מורכבות. הספרות הנוכחית עשירה בהדמיית סידן חיה של תגובות בתפזורת מקווי תאים יציבים. עם זאת, כיום ידוע כי בחי גוף, רקמות מהוות נוף תאי מגוון התומך בתפקידים שונים הספציפיים לסוגי תאים בשמירה על הומאוסטזיס רקמתי 12,13,14,15. למרות הידע המקובל הזה, המנגנונים שבאמצעותם סוגי תאים שונים מתאמים אותות סידן ומווסתים הומאוסטזיס של יוני סידן נותרו לא ידועים. לכן, השיטות המוצגות כאן יאפשרו זיהוי של איתות סידן בתאי יחיד וישפרו את קצב הניתוחים במורד הזרם ברקמות דרכי הנשימה הראשוניות.

אנו מנצלים את מודלי התרביות האפיתליאליות הראשוניות שפורסמו בעבר ואומתרו בקפדנות של אפיתל האף האנושי ככלי להדמיית תאים חיים, סידן ציטוזולי, במודל ביולוגי רלוונטייותר 16,17,18. בקצרה, תאי האפיתל מבודדים ממברשות אף של המטופל ומותרצים על ממברנה חדירה למחצה בטרנסוול, התלוי בתוך באר תרבית כדי לשמור על ממשק אוויר-נוזל (ALI). ממשק זה, יחד עם מדיה מיוחדת, נבדק בקפדנות באמצעות טכניקות אורתוגונליות לנוכחות סוגי תאים שונים 16,17,18. יתרה מזאת, הוכח כי השיטות הנוכחיות ניתנות לתרגום לתרבויות ראשוניות של סימפונות המגודלות בדומה לתרבויות האף הראשוניותשלנו.

מאמר זה מציג שיטה מותאמת למדידה וניתוח איתות סידן חי ברזולוציה של תא יחיד בתרביות אפיתל ראשוניות אלו בדרכי הנשימה. תרביות רב-שכבתיות אלו קשות לדמיון באמצעות מיקרוסקופיה; עם זאת, ההגדרה הנוכחית מאפשרת לנו להתמקד באופן אמין בשכבות בודדות בתוך התרביות הרב-שכבתיות, מה שמאפשר לנו לזהות ניידות סידן מהשכבות הספציפיות הללו. למערכת זו יש מספר יתרונות, בכך שאינה דורשת מערכת פרפוזיה, שלרוב יקרה וקשה להתאמה אלא אם כן משתמשים במיקרוסקופים מיוחדים. מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי שימש, שמציע רזולוציה זמנית משופרת בהשוואה להדמיה קונפוקלית. השימוש בדיודות פולטות אור (LEDs) מפחית את הפוטוטוקסיות ביחס למערכות קונפוקליות מבוססות לייזר. צבעים אינטנסיומטריים חיצוניים משמשים בפרוטוקול המוצג כאן, שכן הם מאפשרים שינויים מהירים ויחסיים בסידן בכל אוכלוסיית התאים ותואמים לרוב מערכות המיקרוסקופיה הפלואורסצנטית. זה מועיל על פני צבעים רציומטריים נפוצים, שדורשים עירור אולטרה סגול עמוק (UV) שאינו זמין במיקרוסקופים רבים. יתרה מזאת, GCaMP דורשת טרנספקציה או טרנסדוקציה, שמחזקת את הטכניקה להדמיית סידן ממוקדת יותר בסוגי תאים מסוימים. עקב יעילות נמוכה של טרנסדוקציה וטרנספקטציה בתרביות אפיתל ראשוניות, הטכניקה אינה מתאימה למעקב אחר כלל אוכלוסיית התאים.

בנוסף, מחקר זה פיתח תוכנה חדשנית ומיוחדת מבוססת למידת מכונה המאפשרת סגמנטציה של תא יחיד בהתבסס על צביעה גרעינית חיה. התוכנה מסוגלת אז לתעד ערכי עוצמת פלואורסצנציה לכל תא לאורך זמן. קו תאים אפיתל יציב (Calu-3) שימש תחילה לאופטימיזציה של השיטה. לאחר מכן, שיטות אלו תורגמו לחקר מוביליזציה של סידן חד-תאי בתרביות אפיתל ראשוניות. משתנים כמו ריכוז צבע הסידן והפרובנציד, תזמון שלבי הדגירה, וכן הגדרת ההדמיה היו אופטימליים. כאן, איתות סידן נרשם בקצב פריימים של 0.2 fps (פריימים לשנייה), המתאים למעקב אחר איתות סידן. ניתן להעלות את קצב הפריימים כדי למדוד תנועות סידן מהירות יותר20. המשתנים האופטימליים יושמו לאחר מכן ואופטימיזם נוספים בתרבויות אף ראשוניות מורכבות יותר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

החומרים והציוד בהם משתמשים מופיעים בטבלת החומרים.

1. תחזוקה וטיפוח תאי Calu-3

  1. לשמור על תאי Calu-3 בבקבוקי T-25 במדיום תרבית EMEM בתוספת 20% FBS ו-1% פניצילין/סטרפטומיצין. חמם את המדיה מראש והחליף בימים מתחלפים (5 מ"ל לבקבוקון).
  2. כאשר התאים מתכנסים ב-70% בתוך הבקבוק, שאפו את המדיה שבבקבוק.
  3. שטוף את הבקבוק עם 5 מ"ל 1x סליין מפופר פוספט (PBS).
  4. הוסיפו 1 מ"ל TrypLE ישירות לתאים למשך 10-15 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5%CO2. ודאו שכל התאים התנתקו מתחתית הבקבוק והתנתקו לתלייה חד-תאית.
  5. נטרלו את התגובה עם 4 מ"ל מדיום תרבית טרי (שלב 1.1), ואז ערבבו היטב את התאים עם פיפטה סרולוגית כדי להבטיח זריעה אחידה.
  6. הנח את התאים על לוח של 96 בארות במפגש של 90%-100% (כ-40,000 תאים לבאר).
    1. לזריעת בארות, הוסף 200 מיקרוליטר/באר של תלייה תאית מעורבבת היטב.
    2. תן לתאים להיצמד לפלטת 96 בארות במהלך הלילה.
  7. החלפת מדיה כל יום (200 מיקרוליטר/באר) עד שתהיה מוכן לניסויים.
  8. יש לאפשר 2-5 ימים לאחר המפגש בתוך הבארות להתחיל בניסויים לפני ביצוע הניסויים כדי לאפשר התמיינות.

2. פרוטוקול לטעינת תאי Calu-3 עם Cal 520 AM או Fluo-4 AM

אזהרה: Fluo-4 AM ו-Cal-520 AM מומסים ב-DMSO, מה שנחשב למסוכן. פרובנסיד מוגדר כסיכון חריף. אנא לבשו כפפות וחלוק מעבדה בעת טיפול בכימיקלים כדי להימנע ממגע עם העור. השליכו את כל הכימיקלים לפחי פסולת כימית ייעודיים.

  1. ביום הניסוי, הסרת המדיה מהבארות על ידי פיפטינג ושטיפת תאים פעמיים (200 מיקרוליטר/באר) בבופר סידן מחומם מראש (140 מילימטר NaCl, 5 מילימטר KCl, 1 מילימטר מיגCl2 2 מילימטר CaCl2, ו-10 מילימטר Hepes, מותאם ל-pH 7.38 (NaOH) 291 mOsm), להסרת תאים מתים.
  2. דגרו תאים עם 200 מיקרוליטר לבאר של קוקטייל של 3 מיקרומום Cal-520 AM, 2.5 mM פרובנסיד ו-1:5000 הוכסט בבופר סידן (שלב 2.1) למשך שעה באינקובטור בטמפרטורה של 37°C ו-5%CO2.
    1. לניסויי Fluo-4 AM, דגרו תאים עם 200 מיקרוליטר לבאר של קוקטייל של 3 מיקרומום פלו-4 AM, 2.5 מ"מ פרובנסיד ו-1:5000 הוכסט בבופר סידן (שלב 2.1) למשך שעה אחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5%CO2.
      הערה: שמור את שפופרות הצבע בחושך על ידי כיסוי בנייר אלומיניום.
  3. במהלך הדגירה, הכינו את טפסיגרגין בבופר סידן (שלב 2.1). כוון את ריכוזי המלאי הביניים כדי להבטיח ריכוזים סופיים תקינים בתוך הבאר.
    הערה: כאן מוסיפים 50 מיקרוליטר של תרופה ל-100 מיקרו-ליטר של בופר הסידן הקיים. לכן, הוכן מלאי ביניים של 3x 6 מיקרומטר.
  4. לאחר שעה, שאיפת הצבע על ידי פיפטינג ושוטפת את הצבע החוץ-תאי עם בופר סידן (שלב 2.1) פעמיים (200 מיקרוליטר/באר).
  5. לאחר השטיפות, הוסף 100 מיקרוליטר/באר של 2.5 מ"מ מול פרובנסיד מדולל בבופר סידן (שלב 2.1) כדי לשמור על הצבע במרחב הציטופלזמי.
  6. עטוף את הפלטה בנייר אלומיניום כדי להגן עליה מהאור. התאים מוכנים כעת לצילום.

3. הקמת מיקרוסקופיה לקו התאים היציב Calu-3

  1. באמצעות מיקרוסקופ אפיפלואורסצנציה המצויד ב-SuperFluor Objective, מקור אור יציב במצב מוצק, ומצלמת פלואורסצנציה CMOS (גודל פיקסל 6.5 מיקרון). עוצמת התאורה מוגדרת על 500 מ"וואט.
  2. הנח את לוח התאים על הבמה באמצעות מתאם לוח 96 בארות. באמצעות Brightfield, תתמקד בשכבת התא בהגדלה נמוכה כדי למצוא את שכבת התאים המונו-שכבה (השתמש ב-5-10x air אובייקטיבי).
    הערה: שלב זה הוא אופציונלי, אך מועיל לקבלת מיקוד ראשוני בשכבת התא ביעילות.
  3. לאחר זיהוי שכבת התא, השתמש ב-Brightfield ועבור להגדלה גבוהה יותר (מטרה של 20 פעמים אוויר) ולהתמקד מחדש בשכבת התא.
    הערה: ודא מיקוד נכון במונולייר עם Brightfield; גבולות התאים צריכים להיות ברורים.
  4. זהה את אות צבע הסידן באמצעות GFP (נורית LED של 475 ננומטר). ודא שעוצמת ה-LED יורדת בין 5%-10% כדי למנוע הלבנת פוטו, וזמן החשיפה מתאים להצגת אות ירוק בסיסי מבלי לרוויה יתר על האות, בדרך כלל בין 300-500 מילישניות.
    הערה: כדי להבטיח שחזוריות ואפילו טעינת צבע, יש לנתח באופן איכותני את שכבת התא; רוב התאים אמורים להציג את אותה בהירות. התמקד בשדות ראייה עם תאים מתים מוגבלים, שיהפלו פלואורסציה חזקה לפני שמוסיפים כל ממריץ. ניתן למדוד את עוצמת הפלואורסצנציה היחסית בבסיס באמצעות פיג'י (שלב 7.9). שונות הפלואורסצנציה הבסיסית בין התאים צריכה להיות קרובה ל-10%-15% אם הצבע נטען באופן שווה (שלב 7.9).
  5. זהה את הצבע הגרעיני של Hoechst באמצעות נורית DAPI (405 ננומטר). עוצמת ה-LED צריכה להיות בין 2%-5% עם זמן חשיפה בין 50-100 מילישניות.
    הערה: אם התאים בפוקוס, הגרעינים אמורים להופיע עם קווי מתאר חדים. ודאו שהאות הגרעיני לא יגיע לרוויה, שכן הגרעינים עלולים להפריע לתעלה הירוקה.

4. רכישת וידאו סידן חי

  1. התחל וידאו חי עם מרווח של פריים אחד כל 5 שניות (0.2 פריימים לשנייה) למשך 10 דקות.
    הערה: תפסו כל ערוץ פלואורסצנטי (DAPI 405 ננומטר ו-GFP 475 ננומטר) בכל פריים.
  2. ברגע שהסרטון התחיל, אפשר קריאה בסיסית של 5 דקות לפני הוספת אגוניסטים.
  3. באמצעות פיפטת P200, הוסף 50 מיקרוליטר תפסיגרגין במלאי ביניים פי 3 לבאר המכילה 100 מיקרוליטר של 2.5 מ"מ מול פרובנסיד בבופר סידן (שלב 2.1). הרחק בעדינות 1-2 פעמים בתוך הבאר כדי לוודא שהסם מתפזר באופן שווה. המשיכו לקרוא במשך 5 דקות לאחר הוספת ה-thapsigargin.
    הערה: שלב הוספת התרופות הוא קריטי; קצה הפיפטה לא אמור לגעת בלוח כדי להזיז את מישור המיקוד. במקום זאת, הצף את קצה הפיפטה כך שיגע רק בבופר בתוך הבאר. אם מערבבים תרופות בעוצמה יתרה, התאים עלולים להתנתק מהפלטה ולהפריע לאות.
    הערה: הקפידו לשים לב למסגרת שבה מתווספת התרופה לצורך ניתוח במורד הזרם.
  4. שמור את הווידאו ואת התמונה שצולמה לפני הניסוי. המשך לניתוח נתונים.

5. פרוטוקול לטעינת תאי דרכי האוויר הראשיים עם Cal 520 AM או Fluo-4 AM

  1. ביום הניסוי, הסר את המדיה הבזולטרלית מהבאר הטרנס ושוטף פעמיים את הצד האפיקלי והבזולטרלי של האינסרט באמצעות 750 מיקרוליטר בזולטרלי ו-300 מיקרוליטר אפיקלי של בופר הסידן (שלב 2.1).
  2. דגרו את התאים עם 600 מיקרו-ליטר בזולטרלי ו-200 מיקרוליטר אפיקלי של צבעי Cal-520 AM או Fluo-4 AM למשך שעה אחת בטמפרטורה של 37°C ו-5%CO2. הכינו את הצבע באותו אופן כמו לתאי Calu-3, עבור Cal-520 AM, 3 מיקרומום Cal-520 AM, 2.5 mM פרובנסיד ו-1:5000 Hoechst בבופר סידן (שלב 2.1). ל-Fluo-4 AM, 3 מיקרומום Fluo-4 AM, 2.5 mM פרובנסיד ו-1:5000 Hoechst באותו בופר סידן.
  3. במהלך תקופת הדגירה, יש להכין את הטפסיגרגין במלאי ביניים של 3× לריכוז סופי של 2 מיקרומולר (6 מיקרומול).
  4. לאחר מכן, שאיפת הצבע ושוטפת את התאים פעמיים עם בופר אזוליטרלי של 300 מיקרוליטר אפיקלי ו-750 מיקרוליטר בזולטרלי המכיל סידן (שלב 2.1).
  5. לאחר השטיפות, הוסף 100 מיקרוליטר אפיקלי ו-500 מיקרוליטר בזולטרלי של 2.5 מ"מ מולר פרובנסיד בבופר סידן (שלב 2.1).
  6. כדי לשמור על תיבת ההילוכים היטב בתוך הצלחת, עטוף את הפלטה בנייר כסף. התאים מוכנים כעת להדמיה.

6. הקמת מיקרוסקופיה להכנסות האף הראשיות

  1. רכשו צלחת פטרי עם תחתית זכוכית המתאימה להדמיה, פינצטה וסרט דבק דק. ודא שצלחת פטרי נקייה על ידי ניגוב מהיר עם 70% אתנול ומתן להתייבש לחלוטין.
  2. הניחו את צלחת פטרי עם תחתית זכוכית בתוך המתאם המעגלי הקטן של מיקרוסקופ האפיפלואורסצנציה.
  3. באמצעות פינצטה, מניחים בזהירות את התוספת במרכז הקערת עם תחתית הזכוכית.
    הערה: יש להיזהר לא לשפוך את הבופר, שממוקם בתא האפיקלי של ההכנסה.
  4. כדי להבטיח שהתוספת לא תזוז בזמן הוספת תרופות, השתמשו בדבק דבק כדי להצמיד את החלק העליון של הפלסטיק של התוספת לדפנות התבנית עם תחתית הזכוכית.
  5. הניחו את המתאם עם האינסרט מחובר לשלב המיקרוסקופ והתחילו במיקוד על התאים באמצעות אובייקטיב שדה בהיר של 10x אוויר.
  6. זהה את אות צבע הסידן באמצעות GFP (נורית LED 475nm). ודא שעוצמת ה-LED יורדת בין 5%-10% כדי למנוע הלבנת פוטו, וזמן החשיפה מתאים להצגת אות הירוק הבסיסי מבלי לרוויה עליו מדי, בדרך כלל בין 300-500 מילישניות.
    הערה: אנא עיין בהערה תחת שלב 3.4 כדי להבטיח טעינת צבע סידן תקינה.
  7. זהה את הצבע הגרעיני של Hoechst באמצעות נורית DAPI (405 ננומטר). עוצמת ה-LED צריכה להיות בין 2%-5% עם זמן חשיפה בין 50-100 מילישניות.
    הערה: אם התאים בפוקוס, הגרעינים אמורים להופיע עם קווי מתאר ברורים ומוגדרים. התמקד בשכבה האפיקלית ביותר של התאים. כוון את ציר ה-z של המיקרוסקופ כדי לזהות את מישור המוקד הגבוה ביותר שבו התאים נשארים במיקוד חד. ודאו שהגרעינים לא מגיעים לרוויה של האות, שכן האות הגרעיני עלול להפריע לערוץ הירוק.
  8. כדי להשיג את סרטון הסידן החי, עקבו אחר שלבים 5.1-5.4. במהלך שלב הוספת התרופה, הוסיפו למרכז ההכנסה ותחזירו את הדחיפה לאט באמצעות פיפטת P200.
    הערה: הקפידו לשים לב למסגרת שבה מתווספת התרופה לצורך ניתוח במורד הזרם.

7. ניתוח באמצעות תוכנת פיג'י

  1. פתח את אפליקציית Fiji ובחר קובץ \ פתח, העלה את קובץ הווידאו, ובחלון הקופץ שנוצר, שמור על כל ההגדרות ברירת המחדל.
  2. אם רוצים, תחת תמונה \ Adjust \ בהירות/ניגודיות, שנו את הבהירות והניגודיות של ערוצי הפלואורסצנציה הנפרדים כדי לקבל את התצוגה האופטימלית ביותר של התאים.
  3. כדי להקל על מעקב תאים, מזג את ערוצי הכתם הגרעיני או הבהיר באמצעות Image \ Colour \ Merge Channels ובחר את הקבצים המתאימים לכל ערוץ בנפרד בחלון הקופץ.
  4. כדי לעקוב אחרי תאים ספציפיים לפי גבולות תאים וצבע גרעיני, השתמש ב-Analyze \ Tools \ ROI Manager וסמן גם את הצג הכל וגם את התוויות בחלון הקופץ שנוצר.
  5. עקבו בזהירות אחרי תאים באמצעות כלי הבחירה החופשית ולחצו על t כדי להוסיף תא.
    הערה: ודאו שהתאים מסומנים בכל ארבעת הפינות ובמרכז הווידאו.
  6. לאחר שכל התאים סומנו במדויק, בתוך הלשונית הפתוחה עם כל ה-ROIs, לחץ על More \ Multi Measure, ולחץ OK על הפופ-אפ שנוצר.
  7. העתק את כל הגיליון בחלון הקופץ שנוצר בשם 'תוצאות' לקובץ אקסל.
    הערה: הגיליון המתקבל יכלול 6 כותרות משנה (Area1, Mean1, Min1, Max1, IntDen1, RawIntDen1) לכל ROI עם ערך מספרי אחרי כל אחד, התואם לתא המתאים שנמצא. הערך החשוב לניתוח במורד הזרם יהיה הממוצע של כל ROI.
  8. כדי לנטר את השונות בעוצמת הפלואורסצנציה, יש לחשב את הפלואורסצנציה הממוצעת במהלך קו הבסיס לכל תא, ולחשב את אחוז השנות. לניסויים בדרך כלל יש שונות בין 20%-30%.
    figure-protocol-1
  9. נרמל את כל הקריאות על ידי חלוקת ערכי העוצמה הממוצעת בקריאה הראשונה של קו הבסיס עבור כל אחד מהתאים שנעקבו.
  10. צור עמודה נוספת לזמן בשניות, כאשר הפריים הראשון המתאים לפריים 0 ונקודות הזמן הבאות עולות ב-5, שזה מתאים לטווח של 0.2 fps.
  11. העתק את הנתונים לתוכנת ניתוח וגרפים ויצר עקומת שינוי בפלואורסצנציה על פני קו הבסיס לאורך זמן.
    הערה: כדי ליצור גרפים מקסימיים של תא יחיד, השתמש בפונקציית =MAX() באקסל כדי למצוא את המסגרת שבה מושגת עוצמת פלואורסצנציה מקסימלית לכל תא וגרף באמצעות GraphPad Prism.

8. ניתוח באמצעות חבילת הסידן

  1. באמצעות Fiji, פתח את קובץ הווידאו ופעל לפי שלבים 8.1 ו-8.2.
  2. לאחר שהערוצים הגרעיניים והירוקים מותאמים לצפייה, שכפל פריים אחד של הווידאו על ידי לחיצה על Image \ Duplicate. בחלון הקופץ שנוצר, בטל את הבחירה ב-Duplicate Hyperstack. בתוך אותו פופ-אפ, תחת ערוצים, סוג 1. שמור את זה כקובץ תמונת PNG.
  3. חזור על שלב 9.2 ומתחת לערוצים, סוג 2.
    מיזוג שתי התמונות לפי שלב 8.3. העלה את התמונה לממשק המשתמש הגרפי (Cell-Pose FACE) כדי ליצור מסכת תא.
  4. העלה את התמונה לממשק המשתמש בתנוחת התא, וחלק באמצעות הצבע הגרעיני (ערוץ 1) וצבעי ציטופלזמה (ערוץ 2) על ידי בחירת מודל Cyto3.
  5. שמור את התמונה כקובץ PNG, ואז פתח את קובץ ה-PNG בפיג'י והמיר אותו לקובץ TIFF.
    הערה: ממשק משתמש תנוחת תא מפיק קובץ PNG בשחור-לבן.
  6. פתח גם את קובץ המסכה וגם את קובץ הווידאו ב-Calcium Suite על ידי גרירה ושחרור, ואז לחץ על ניתוח נתונים ליצירת גרף להורדה, וכן קובץ .csv להורדה המכיל ערכי עוצמה מנורמלים וגולמיים עבור כל התאים שנספרו על ידי התוכנה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדי למדוד ניידות סידן בתאים חיים, תאי Calu-3 או תרביות אף ראשוניות ממוינות מודגרים עם צבע תוך-תאי. השינוי היחסי באות התלוי בסידן נמדד כעלייה במוביליזציה של סידן, בין אם ממאגרי סידן תוך-תאיים או מהמרחב החוץ-תאי אל הציטוזול. עלייה מתמשכת בסידן לציטוזול מיוצגת על ידי עלייה בפלואורסצנציה לאחר הוספת טפסיגרין, מעכב בלתי הפיך מאופיין היטב של חלבון SERCA (Sarco/Endoplasmatic Reticulum Calcium ATPase) התושב ב-ER,21. כאן מוצג כי בדיקת הסידן פועלת היטב הן בקו התאים היציב של ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מאמר זה הציג שיטות לניתוח איתות סידן חד-תאי בתרביות אף וברונכיאלית ראשוניות חיות וכן קו תאי אפיתל יציב. גם מדווחי הסידן Cal-520 AM וגם Fluo-4 AM הם אינדיקטורים שימושיים לסידן בשתי ההגדרות. Cal-520 AM רגיש יותר כי יש לו תפוקה קוונטית גבוהה יותר של 0.75 לעומת Fluo-4 AM של 0.16 וזיקה מעט גבוהה יותר לסידן (ה-Kd של Cal-520 AM הוא 320 ננומטר ו-Fluo-4 AM הוא 345 ננומטר). יתרה מזאת, Cal-520 AM מדווח כבעל שיפור בשימור התאים בהשוואה ל-Fluo-4 AM22. עם זאת, שני הצבעים הציגו ב...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מבקשים להודות לעזרתו בגידול רקמת האף הראשית על ידי טריני גונווארדנה. כמו גם וו שו מאוניברסיטת איווה על גידול ומשלוח נדיב של תרבויות הברונכיאליות הראשוניות. כמו גם גבריאל לנגוולד ודיאן ליו לעזרה בניתוח ובעיצוב מתאמי הדמיה. אנו רוצים גם להודות למתקן ההדמיה בבית החולים לילדים חולים. אנו גם מכירים במימון של ארגון סיסטיק פיברוזיס קנדה וקרן הסיסטיק פיברוזיס האמריקאית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צלחת 24 בארות תרמופישר 142475
תוספות טרנסוול עם 24 בארים קורנינג CLS3470-48EA
פלטות מיקרו עם תחתית שטוחה שקופה, פוליסטירן שחור עם טיפול TC עם 96 באריםקורנינג 3603
קל-520 AMAAT Bioquest 21130ציטוט ואוחסן ב--20°ג; C, פורקה ב-DMSO
תוכנת Calcium Suiteניתן לבקש את הקוד על ידי יצירת קשר עם קבוצת המעבדה שלנו
EMEM, 1xsWisent 320-005-CLמאוחסן ב-4> C 
סרום בקר עוברי Wisent 080-450ציטוט ואוחסן ב--20°ג; C
Fluo-4 AM AAT Bioquest 20550ציטוט ואוחסן ב--20°ג; C, פורקה ב-DMSO
HEPESביושופHEP001.5מאוחסן בטמפרטורת החדר
Hoechst תרמופישר H3570מאוחסן ב-4> C 
קו תאי אדאונקרצינומה של אדיאונקרטלי אפיתל אנושי ATCCHTB-55
מגנזיום כלוריד  Sigma 7786-30-3מאוחסן בטמפרטורת החדר
מיקרו-צלחת 35 מ"מ, תחתית זכוכית נמוכהIbidi 80137מאוחסן בטמפרטורת החדר  
תמיסת פניצילין-סטרפטומיציןWisent 450-200-ELמאוחסן ב-4> C
מלח ממוגן בפוספט (PBS)Wisent 3111-010-CLמאוחסן בטמפרטורת החדר  
כלוריד אשלגן  Sigma 7447-40-7מאוחסן בטמפרטורת החדר  
Probenecid תרמופישרP36400ציטוט ואוחסן ב--20°ג; C, מסיס במים 
נתרן כלוריד Bioshop SOD004מאוחסן בטמפרטורת החדר  
תפסיגרגין תרמופישרT7458ציטוט ואוחסן ב--20°ג; C פורקה ב-DMSO 
TripLE Express Enzyme (1X), פנול אדום תרמופישר12605010מאוחסן ב-4> C

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bootman, M. D., Bultynck, G. Fundamentals of cellular calcium signaling: A primer. Cold Spring Harb Perspect Biol. 12 (1), a038802(2020).
  2. Jairaman, A., Prakriya, M. Calcium signaling in airway epithelial cells: Current understanding and implications for inflammatory airway disease. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 44 (4), 772-783 (2024).
  3. Sammels, E., Parys, J. B., Missiaen, L., De Smedt, H., Bultynck, G. Intracellular Ca2+ storage in health and disease: a dynamic equilibrium. Cell Calcium. 47 (4), 297-314 (2010).
  4. Mao, T., O'Connor, D. H., Scheuss, V., Nakai, J., Svoboda, K. Characterization and subcellular targeting of GCaMP-type genetically encoded calcium indicators. PLoS One. 3 (3), e1796(2008).
  5. Ren, C., et al. Melatonin protects RPE cells from necroptosis and NLRP3 activation via promoting SERCA2-related intracellular Ca2+ homeostasis. Phytomedicine. 135, 156088(2024).
  6. Dwivedi, R., et al. The TMEM16A blockers benzbromarone and MONNA cause intracellular Ca2+ release in mouse bronchial smooth muscle cells. Eur J Pharmacol. 947, 175677(2023).
  7. Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. Calcium imaging of cortical neurons using Fura-2 AM. J Vis Exp. 23, e1067(2009).
  8. Hirst, R. A., Harrison, C., Hirota, K., Lambert, D. G. Measurement of [Ca2+]i in whole cell suspensions using fura-2. Methods Mol Biol. 114, 31-39 (1999).
  9. Tsien, R. Y. A non-disruptive technique for loading calcium buffers and indicators into cells. Nature. 290 (5806), 527-528 (1981).
  10. Di Virgilio, F., Steinberg, T. H., Swanson, J. A., Silverstein, S. C. Fura-2 secretion and sequestration in macrophages. A blocker of organic anion transport reveals that these processes occur via a membrane transport system for organic anions. J Immunol. 140 (3), 915-920 (1988).
  11. Liao, J., et al. A novel Ca2+ indicator for long-term tracking of intracellular calcium flux. BioTechniques. 70 (5), 271-277 (2021).
  12. Kageyama, T., Ito, T., Tanaka, S., Nakajima, H. Physiological and immunological barriers in the lung. Semin Immunopathol. 45 (4), 533-547 (2024).
  13. Quach, H., et al. Early human fetal lung atlas reveals the temporal dynamics of epithelial cell plasticity. Nat Commun. 15 (1), 5898(2024).
  14. Deprez, M., et al. A single-cell atlas of the human healthy airways. Am J Respir Crit Care Med. 202 (12), 1636-1645 (2020).
  15. Prescott, R. A., et al. A comparative study of in vitro air-liquid interface culture models of the human airway epithelium evaluating cellular heterogeneity and gene expression at single cell resolution. Respir Res. 24 (1), 213(2023).
  16. Gunawardena, T. N. A., et al. Correlation of electrophysiological and fluorescence-based measurements of modulator efficacy in nasal epithelial cultures derived from people with cystic fibrosis. Cells. 12 (8), 1174(2023).
  17. Laselva, O., et al. Functional rescue of c.3846G>A (W1282X) in patient-derived nasal cultures achieved by inhibition of nonsense-mediated decay and protein modulators with complementary mechanisms of action. J Cyst Fibros. 19 (5), 717-727 (2020).
  18. Terrance, M., et al. Primary human nasal epithelial cell culture. Methods Mol Biol. 2725, 213-223 (2024).
  19. Karp, P. H., et al. An in vitro model of differentiated human airway epithelia. Methods for establishing primary cultures. Methods Mol Biol. 115, 115-137 (2002).
  20. Perniss, A., et al. A succinate/SUCNR1-brush cell defense program in the tracheal epithelium. Sci Adv. 9 (31), eadg8842(2023).
  21. Sehgal, P., et al. Inhibition of the sarco/endoplasmic reticulum (ER) Ca2+-ATPase by thapsigargin analogs induces cell death via ER Ca2+ depletion and the unfolded protein response. J Biol Chem. 292 (48), 19656-19673 (2017).
  22. Cal 520® AM. , AAT Bioquest Inc. https://www.aatbio.com/products/cal-520-am (2025).
  23. Fluo 4® AM. , AAT Bioquest Inc. https://www.aatbio.com/products/fluo-4-am?unit=20552 (2025).
  24. Zaderer, V., Hermann, M., Lass-Flörl, C., Posch, W., Wilflingseder, D. Turning the world upside-down in cellulose for improved culturing and imaging of respiratory challenges within a human 3D model. Cells. 8 (10), 1292(2019).
  25. Becker, M. E., et al. Live imaging of airway epithelium reveals that mucociliary clearance modulates SARS-CoV-2 spread. Nat Commun. 15 (1), 9480(2024).
  26. Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Lechleiter, J. D. Chemical calcium indicators. Methods. 46 (3), 143-151 (2008).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Thapsigargin

מאמרים קשורים