מאמר שיטה

מיקרו-ייצור של מצעים עם שיפועי קשיחות בקנה מידה מיקרו להנחיית נדידת תאי סטרומה של מח עצם

DOI:

10.3791/69473

⸱

14 בנובמבר 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Oral & Maxillofacial Reconstruction and Regeneration, Key Laboratory of Oral Biomedicine Ministry of Education, Hubei Key Laboratory of Stomatology, School & Hospital of Stomatology, Wuhan University, 2School of Power and Mechanical Engineering, The Institute of Technological Science, Wuhan University, 3Department of Oral Implantology, School and Hospital of Stomatology, Wuhan University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מפרט את הייצור של מצע דו-שכבתי של פולידימתילסילוקסן (PDMS) באמצעות ליתוגרפיה רכה. השיטה משתמשת במיקרו-מבנים מאופננים גיאומטרית בשכבה תחתונה קשיחה בשילוב עם שכבה עליונה שטוחה ורכה כדי ליצור שיפועי קשיחות יעילים בקנה מידה מיקרו, המאפשרים מחקרי מכניביולוגיה תאית ללא הפרעות טופוגרפיות.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הבנת האופן שבו תאים מגיבים לאותות מכניים היא חיונית להבהרת המנגנונים המעורבים בהתפתחות רקמות והתקדמות המחלה. עם זאת, מצעי תרבית תאים קיימים במבחנה לרוב אינם מצליחים לשכפל את שיפועי הנוקשות הפיזיולוגיים בקנה מידה תאי תוך ביטול רמזים טופוגרפיים מבלבלים. במחקר זה, אנו מציגים מודל קשיחות מנותק תוך שימוש במצע דו-שכבתי של פולידימתילסילוקסן (PDMS). מצע זה מורכב מסרט עליון רך ושטוח התלוי מעל שכבה תחתונה קשיחה הכוללת מיקרו-מבנים של רכס וחריץ. השכבה העליונה מעבירה ביעילות שינויים בנוקשות במבנה הבסיסי תוך שמירה על טופוגרפיה וכימיה אחידות במשטח המגע של התא. אפנון קשיחות מושג על ידי שינוי רוחב הרכסים והחריצים המתחלפים, המרווחים באופן שווה. מיקרוסקופ אלקטרונים סורק אישר את מורפולוגיה פני השטח השטוחים וטופוגרפיית מגע עקבית. מיקרוסקופ כוח אטומי הראה כי שינויים בקשיחות היו תלויים במיקרו-מבנה: עבור דפוסים של 20 מיקרומטר, המודולים האלסטיים היו כ-950 kPa עבור רכסים ו-850 kPa עבור חריצים; עבור תבניות של 50 מיקרומטר, ערכים אלה היו בסביבות 1070 kPa ו- 950 kPa, בהתאמה. תאי מח עצם ראשוניים של עכבר נדבקו היטב והתפשטו על המצע, והראו העדפה ללוקליזציה גרעינית לכיוון אזורי הרכס הנוקשים יותר בתבנית 50 מיקרומטר (61.49%, p < 0.05), ובכך אישרו תפיסה תאית יעילה של השיפוע המכני. לסיכום, פרוטוקול זה מציע שיטה הניתנת לשחזור לבניית מצע תרבית תאים עם שיפועי קשיחות בקנה מידה מיקרו, תוך מזעור ההפרעות הכימיות או הטופוגרפיות, ומאפשר חקירות של מכניקת תאים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לתאים יש את היכולת לחוש ולהגיב לגירויים מכניים בתוך המיקרו-סביבה החיצונית שלהם 1,2,3, שהם חיוניים לוויסות תהליכים תאיים שונים, כולל הידבקות, נדידה, התפשטות והתמיינות4. in vivo, התכונות המכניות של מיקרו-סביבת הרקמה מציגות הטרוגניות מרחבית משמעותית, עם שינויים בנוקשות המטריצה שנצפו הן בהקשרים פיזיולוגיים - כגון בצמתים של עצם ושריר - והן במצבים פתולוגיים, כגון בתוך גידולים 5,6,7. חקירה מקיפה של גורמים מכניים אלה חיונית להבנת מנגנוני הוויסות השולטים בהתנהגות התא. מנגנונים אלה הם מרכזיים בתהליכים כמו התפתחות רקמות, התקדמות המחלה ותהליך ההתחדשות והתיקון 8,9.

כדי לדמות מיקרו-סביבה מכנית מורכבת זו במבחנה, הידרוג'לים או אלסטומרים נמצאים בשימוש נרחב ליצירת מצעים בעלי קשיחות משתנה על ידי התאמת מידת הקישור הצולב או יחס הרכיבים 3,10,11,12,13. עם זאת, שיטות אלו גורמות לרוב לשינויי קשיחות בדידים שאינם מצליחים לשחזר את שיפועי הנוקשות הרציפים בקנה מידה מיקרו המחקים במדויק תנאים פיזיולוגיים 13,14,15,16,17. מחקרים אחרונים חקרו טכניקות כגון קישור צולב אופטי (למשל, שימוש במסכת פוטו לוויסות חשיפה ל-UV)18, ערבוב רב-ערוצי מיקרופלואידי19,20, ואמצעים מונעי דיפוזיה21 לבניית שיפועי קשיחות. למרבה הצער, גישות אלו יכולות להיות מורכבות מבחינה טכנית ולהציג משתנים נוספים, כגון גודל רשת22, נפיחות23,24 וטופוגרפיה25. הכנסת גורמי הפרעה מסבכת את הפירוש של תגובות תאיות לנוקשות. מערכת PDMS דו-שכבתית, המשתמשת במערכי מיקרו-עמודים או דפוסי לוח שחמט כמבנה תמיכה, אומצה ליצירת מצעי תרבית תאים עם שיפועי קשיחות26,27. גישות אלו מסתמכות על תומכים בסיסיים בדידים מתחת לממברנה הומוגנית כימית כדי להשיג אפנון קשיחות איזוטרופי, ומספקים פלטפורמות חשובות לחקירת הידבקות והתפשטות תאים. עם זאת, המיקרו-סביבה התאית הטבעית in vivo היא לרוב אנזוטרופית מאוד בתכונותיה המכניות28,29. ההנחה היא שהאיתות המכני הכיווני הזה משפיע עמוקות על אירועים ביולוגיים בסיסיים. לכן, אסטרטגיות הייצור הביולוגי הנוכחיות מוגבלות ביכולתן לשכפל את האינטראקציות העדינות של קשיחות התאים שנצפו in vivo, התלויות בחיקוי מדויק של שיפועי קשיחות בקנה מידה מיקרו והטרוגניות מרחבית בתוך מצעים טעוני תאים.

מחקרים קודמים הראו שתאים יכולים לתפוס את הנוקשות האפקטיבית של עצמים קשיחים גם כאשר הם אינםבמגע תאי ישיר. בהתבסס על מחקר זה, אנו מציגים מצע תרבית תאים דו-שכבתי דו-שכבתי פולידימתילסילוקסן (PDMS) המייצר שיפועי קשיחות מבוקרים בקנה מידה מרחבי הנע בין 5 ל-50 מיקרומטר, תוך יישור קו עם טווח הגודל הרלוונטי לחישה מכנית תת-תאית ותא בודד. המצע מורכב משתי שכבות נפרדות: שכבה תחתונה PDMS קשיחה הכוללת מיקרו-מבנים גיאומטריים ניתנים לכוונון ושכבת PDMS רכה אחידה ושטוחה המשמשת כמשטח המגע עם התא. תכנון זה מאפשר אפנון מכני אך ורק באמצעות שינויים בגיאומטריית התשתית, תוך שמירה על כימיה וטופוגרפיה עקבית של פני השטח. כתוצאה מכך, הוא למעשה מנתק את אות הנוקשות מרמזים פיזיקליים וכימיים אחרים, ומציע מערכת רלוונטית יותר מבחינה ביולוגית לאפנון נוקשות.

בניגוד למצעים מסורתיים מבוססי הידרוג'ל, הגישה שלנו מאפשרת מחקרים מכניים חד-משתנים ללא הפרעות מנפיחות, גודל רשת או טופולוגיית פני השטח. המצע פשוט לייצור באמצעות ליתוגרפיה רכה סטנדרטית וניתן לשחזור31. הוא גם תואם למיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה, מה שהופך אותו למתאים במיוחד להדמיה בזמן אמת ולמחקרים כמותיים של תגובות תאיות לרמזי נוקשות בקנה מידה מיקרו. כתב יד זה מציג את פרוטוקול הייצור המלא, מפרט את אסטרטגיית בקרת הפרמטרים ומדגים את התועלת של המצע עם ניסויים מייצגים בתרבית תאים. בסופו של דבר, גישה זו מספקת כלי חזק ונגיש במבחנה לחקר תגובות התאים לשיפוע קשיחות בקנה מידה מיקרו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאי סטרומה ראשוניים של מח עצם עכבר (mBMSCs) בודדו מעצם השוק ועצם הירך של עכברים (No. WP20230204, אושר על ידי ועדת האתיקה של המרכז לניסויים בבעלי חיים באוניברסיטת ווהאן).

1. הכנת עובש מאסטר

הערה: הפרוטוקולים שלנו ספציפיים לפוטו-רזיסט שלילי מבוסס אפוקסי המשמש במהלך מחקר זה.

  1. הניחו שני פרוסות סיליקון נקיות (50.8 ± 0.2 מ"מ, <100> מכוונות, 525 ± 25 מיקרומטר) על הפלטה למשך מספר דקות לייבוש.
  2. קח פרוסת סיליקון אחת מהפלטה וקרר אותה לטמפרטורת החדר לפני שתמשיך בציפוי הסיבוב. מרחו 3-5 מ"ל של פוטו-רזיסט על מרכז הוופל.
  3. כדי להשיג גובה תכונה של 20 מיקרומטר, החל את פרוטוקול הספין הבא: ספין למשך 10 שניות ב-7.1 × גרם, ואחריו ספין ב-410 × גרם למשך 30 שניות. כדי להשיג גובה תכונה של 30 מיקרומטר, החל את פרוטוקול הספין הבא: ספין למשך 10 שניות ב-7.1 × גרם, ואחריו ספין ב-170 × גרם למשך 30 שניות. השתמש באזמל בזהירות כדי להסיר כל חרוז קצה שעלול להיווצר במהלך ציפוי הסיבוב.
  4. אפייה רכה באופן הבא: כוונו את משטח החימום ל-95 מעלות צלזיוס, הניחו לוופל לשבת על פלטה חמה למשך 13 דקות. הסר את הוופל משטח החימום ואפשר לו להתקרר לטמפרטורת החדר באופן טבעי, תוך הימנעות מירידת טמפרטורה פתאומית.
  5. יישר את מסכת הפוטו על פרוסת הפרוסה המצופה באור ונחשוף לאור UV במינון כולל של 120 mJ/cm2.
  6. אופים לאחר החשיפה באופן הבא: בעזרת שתי פלטות חימום (65 מעלות צלזיוס ו-95 מעלות צלזיוס), הניחו לוופל המצופה בפוטו-רזיסט לשבת על הפלטה של 65 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת לפני העברתו לפלטה של 95 מעלות צלזיוס והשאירו אותו שם למשך 5 דקות. העבירו את הוופל לערימה של רקמות מיקרופייבר והניחו לו להתקרר לטמפרטורת החדר.
  7. פתחו את הוופל על ידי העברתו לצלחת פטרי מלאה ב-PGMEA, וטבלו את כל הוופל במפתח. להאיץ את הפיתוח על ידי תסיסה ידנית.
    הערה: PGMEA דליק ומגרה את העיניים ודרכי הנשימה. השלך אותו כ"פסולת אורגנית דליקה "במיכלים ייעודיים.
  8. לאחר הפיתוח, הוציאו את הוופל מהמפתח ושטפו אותו באיזופרופנול. אם נוצרת זרימה לבנה חלבית באיזופרופנול קרוב למשטח הדגימה (הפיתוח לא הושלם), טבלו את הדגימה בחזרה במפתח כדי להשלים את תהליך הפיתוח. שטפו את הדגימה המפותחת באיזופרופנול עד שלא נוצרת זרימה לבנה חלבית קרוב למשטח הדגימה. לאחר הפיתוח המלא, אופים קשה את הפוטורסיסט על ידי הנחת הוופל על פלטה של 150 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
  9. פלור את הוופל עבור תהליכי הליתוגרפיה הרכה הבאים: חשוף את הוופל לפלזמת חמצן בוואקום למשך 30 שניות (100 וואט) כדי להפעיל את פני השטח, ולאחר מכן הנח אותו במייבש ואקום. זרוק 30 מיקרוליטר של טריכלורו (1H,1H,2H,2H,2H-tridecafluoro-n-octyl) סילאן על מגלשת זכוכית המונחת בתוך מייבש הוואקום. פנה את חומר הייבוש למשך 2 דקות ושמור על מצב הוואקום למשך 30 דקות. אופים את הוופל בחום של 90 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת להשלמת תהליך הסילניזציה.
    הערה: שלוט בקפדנות על הלחות היחסית הסביבתית מתחת ל-60% לאורך כל התהליך. לחות מוגזמת עלולה לגרום להידרוליזה מהירה של הסילאן, המייצרת משקעי פוליסילוקסן לבנים לא נדיפים. המשקעים יפגעו באחידות התפלגות אדי הסילאן, וכתוצאה מכך סילניזציה כושלת. בצע את הטיפול במכסה המנוע מכיוון שטריכלורו (1H,1H,2H,2H-tridecafluoro-n-octyl) סילאן מגיב באלימות עם מים, ומשחרר אדי HCl רעילים. לנטרל עם אלקלי מדולל לפני השלכתו כפסולת אורגנית מופלרת/כלור. תהליך הסילניזציה משיג 90% הצלחה.

2. ייצור

הערה: ניתן לחלק את תהליך הליתוגרפיה הרכה המשמש לייצור המצע הדו-שכבתי של פולידימתילסילוקסן (PDMS) לשני שלבים נפרדים: 1) הכנת השכבה התחתונה המובנית והשכבה העליונה, 2) ההדבקה של שתי שכבות ה-PDMS. תפוקת הייצור הכוללת היא מעל 80%.

  1. הכנת PDMS
    1. עבור השכבה התחתונה המובנית, הכינו את מבשר ה-PDMS על ידי ערבוב הפרה-פולימר וחומר הריפוי ביחס של 10:1 לפי משקל, ולאחר מכן הסרת גז בוואקום. יוצקים 1.5 מ"ל של מבשר ה-PDMS (10:1) על תבנית המאסטר SU8, מכסה את כל המשטח, ולאחר מכן מסירים גז בוואקום ומנוחה למשך 30 דקות. מעבירים אותו בזהירות לתנור ומרפא בחום של 90 מעלות למשך שעה. הסר את שכבת ה-PDMS המובנית מתבנית המאסטר.
    2. עבור השכבה העליונה, הכינו את מבשר ה-PDMS על ידי ערבוב הפרה-פולימר וחומר הריפוי ביחס של 30:1 לפי משקל והסרת גז בוואקום. יוצקים את קודמן ה-PDMS על פרוסת סיליקון מופלרת. כדי להשיג עובי של 9 מיקרומטר, החל את פרוטוקול ציפוי הספין הבא: סיבוב ב-7.1 × גרם למשך 10 שניות, ואחריו סיבוב ב-2,300 × גרם למשך 60 שניות.
    3. לאחר ציפוי הסיבוב, בדוק ויזואלית את סרט ה-PDMS תחת אור הסביבה כדי לבדוק את האחידות - ובדוק במיוחד אם יש פגמים גלויים כגון פסים, בועות או הצטברות קצוות לא אחידה. אם הסרט נראה שקוף באופן אחיד עם רפלקטיביות עקבית על פני כל משטח הוופל, המשך לשלב הבא; אם לא, חזור על תהליך ציפוי הסיבוב עם רקיק חדש. הנח את הוופל המצופה על משטח ישר כדי להבטיח עובי סרט PDMS הומוגני. מעבירים אותו בזהירות לתנור ומרפא בחום של 90 מעלות למשך 3 שעות.
      הערה: התקבלו יריעות בעובי של 9.11 ± 0.34 מיקרומטר.
  2. מליטה
    1. הנח את שכבת ה-PDMS התחתונה המובנית (10:1) כשהצד המעוצב פונה כלפי מטה על סרט השכבה העליונה של ה-PDMS, ומבטיח מגע טוב בין שתי השכבות ללא בועות בממשק.
    2. מעבירים את המכלול לתנור ומרפאים בחום של 90 מעלות למשך 3 שעות.
    3. הניחו למכלול להתקרר לטמפרטורת החדר על ערימה של רקמות מיקרופייבר. נתק את המבנה הדו-שכבתי הסופי מהרקיק, ואחסן בצלחת פטרי לשימוש נוסף.
      הערה: אם נוצרות בועות בין השכבה העליונה לשכבה התחתונה במהלך הקילוף, זה בדרך כלל מעיד על הידבקות לא שלמה בין שתי השכבות. ודא הסרת גז יסודית של קודמן ה-PDMS לפני ציפוי הסיבוב, וודא שמשטח הסרט נקי מאבק או מזהמים לפני יישום השכבה התחתונה של PDMS למגע מלא. ודא שפרוסת הסיליקון מפולסת במהלך ציפוי סחיטה, הרכבה וריפוי. קריעת סרט עלולה להתרחש עקב סילאניזציה לא אחידה של הפרוסה או עובי PDMS לא אחיד. כדי לפתור את הבעיה, יש לשלוט בקפדנות על הלחות הסביבתית במהלך סילניזציה מתחת ל-60% לחות יחסית. תהליך הסילניזציה משיג 90% הצלחה.

3. אפיון

  1. מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM)
    1. חותכים את הדגימה בעזרת להב חד לקבלת קצוות נקיים.
    2. הרכיבו את הדגימות על שלבי SEM של 90° ו-0° באמצעות סרט פחמן מוליך כדי לאפשר אפיון חתך ופני השטח, בהתאמה.
    3. מקרטע ציפוי הדגימות בזהב למשך 120 שניות כדי לשפר את איכות ההדמיה של SEM ולאסוף תמונות SEM של הדגימות.
  2. מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM)
    הערה: בחר בדיקה ScanAsyst-Air למיפוי ננו-מכני כמותי של מודולוס.
    1. מקם את קצה שלוחת AFM במרכז שדה התצוגה. מקם את נקודת הלייזר על קצה השלוחה על ידי יישור מערכת הידית האופטית.
    2. לפני מדידות המיפוי הננו-מכני הכמותי של PeakForce (PeakForce QNM), כייל את שלוחת ה-AFM כדי לקבוע את הפרמטרים החיוניים הבאים: קבוע קפיץ שלוחה: 0.40135 N/m; רגישות סטיה: 28.993 ננומטר/וולט (נקבע על ידי ביצוע עקומת כוח על דגימת ייחוס קשיחה); רדיוס טיפ: ~21 ננומטר (מכויל בשיטה היחסית מול דגימת ייחוס עם מודול ידוע).
    3. בחלונית הסריקה של רשימת פרמטרי הסריקה, הגדר את הגדרות הסריקה הראשוניות הבאות: הגדר את גודל הסריקה ל-70 מיקרומטר עבור דגימות הכוללות פסים מחזוריים עם מרווח של 50 מיקרומטר. הגדר את גודל הסריקה ל-50 מיקרומטר עבור דגימות הכוללות פסים מחזוריים עם מרווח של 20 מיקרומטר. הגדר דגימות/קו וקווים על 256 (התוצאה היא תמונה בגודל 256 x 256 פיקסלים).
    4. פתח את הגדרות Engage במיקרוסקופ והגדר את נקודת ההגדרה המוגדרת כברירת מחדל של Peak Force Engage בפרמטרים של Engage.
    5. לחץ על הסמל Engage בסרגל הכלים של זרימת העבודה והמשך לנטר את האותות בזמן אמת במהלך הגישה האוטומטית.
    6. ודא שהבקרה האוטומטית של ScanAsyst מוגדרת למצב אינדיבידואלי. התאם את נקודת ההגדרה של PeakForce לערך מתאים כדי להשיג את טווח העיוות הרצוי: עבור השכבה העליונה, נקודת ההגדרה של PeakForce היא 0.020 nN; עבור השכבה התחתונה המובנית, נקודת ההגדרה של PeakForce היא 5 nN.
    7. התחל את הסריקה על ידי לחיצה על הלחצנים מלמעלה למטה או מלמטה למעלה .
    8. ניטור ותיקון עקומת כוח: אם עקומות הכוח נראות מעוותות או נצפות בעיות סנכרון (למשל, צורות לא סדירות, קווי בסיס לא עקביים), לחץ לחיצה ימנית בחלון צג הכוח ובחר תצורה אוטומטית כדי לתקן אוטומטית את יישור עקומת הכוח והרגישות.
    9. בתוך הגדרות ערוץ חישוב המודולוס , בחר במודל DMT כדי להתאים לחלק הנסיגה של עקומת הכוח לחישוב המודול האלסטי.
    10. לחץ על כפתור הלכידה כדי לרכוש ולשמור את מפת הטופוגרפיה והננו-מכניקה ברזולוציה גבוהה.
    11. בצע ניתוח לאחר הרכישה באמצעות תוכנת עיבוד וניתוח התמונה AFM. פתח את קבצי נתוני ה-AFM השמורים וחלץ ערכי מודולוס על ידי בחירת אזורים על פני משטח הדגימה; חשב מודול ממוצע, סטיית תקן ופרופילי התפלגות הן עבור השכבה העליונה והן עבור השכבה התחתונה באמצעות כלי הניתוח הסטטיסטי המובנים של התוכנה. ייצוא מפות מודולוס מעובדות ונתונים כמותיים.
    12. מספר סריקות AFM לדגימה: בצע שלוש סריקות עצמאיות של שטח מלא עבור כל דגימה. ודא שכל סריקה מכסה אזור התואם את גודל התכונה המבנית של הדגימה, 70 מיקרומטר × 70 מיקרומטר עבור דגימות עם פסים מחזוריים במרווח של 50 מיקרומטר, ו-50 מיקרומטר × 50 מיקרומטר עבור אלה עם פסים מרווחים של 20 מיקרומטר. עבור מדידות מודולוס של המבנה הבסיסי (10:1 PDMS) וסרט השכבה העליונה (30:1 PDMS), יישם את אסטרטגיית הדגימה הבאה כדי להבטיח אמינות נתונים.
      1. סרט שכבה עליונה (30:1 PDMS): מדוד את המודול פי 2 באופן עצמאי כאשר כל מדידה מורכבת משתי סריקות לא חופפות של 5 מיקרומטר × 5 מיקרומטר.
      2. המבנה הבסיסי (10:1 PDMS): בהתחשב בשתי תצורות הפסים המחזוריות השונות שלו (מרווח של 20 מיקרומטר ו-50 מיקרומטר), מדוד את המודול פי 2 באופן עצמאי עבור כל תצורה.

4. ניסוי תרבית תאים במבחנה

הערה: PDMS הוא חומר הידרופובי שצריך להיות מצופה כדי לקדם הידבקות תאים לפני תרבית תאים, ויש לבחור את שיטת הציפוי המתאימה בהתאם לסוג התא. יש לקבל אישור אתי אם משתמשים בתאים ראשוניים לניסוי התאי.

  1. ציפוי פולי-D-ליזין (PDL)
    1. עקר את המצע על ידי טבילת אלכוהול למשך 10 דקות; לאחר מכן שטפו במשך 3 x 5 דקות עם PBS.
    2. ממיסים PDL (משקל מולקולרי 150,000 עד 300,000 Da) באמצעות PBS בריכוז של 0.1 מ"ג/מ"ל. עבור המצע בגודל צלחת 24 בארות, הוסף 1 מ"ל של תמיסת עבודה PDL והנח אותו בחממה של 37 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות כדי לצפות את משטח המצע במלואו.
    3. לאחר השלמת הציפוי, הסר את תמיסת העבודה PDL והסר את כל שאריות ה-PDL על ידי שטיפה פי 3 עם PBS. השתמש במצע לניסויי תאים עוקבים. אם לא נעשה שימוש מיידי בציפוי יש לייבש אותו ולאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
      הערה: ציפוי מוצלח הציג משטח הומוגני וחסר תכונות תחת מיקרוסקופ ניגודיות פאזה, ללא משקעים גבישיים גלויים או חפצי ייבוש. מצעים עם סימני התגבשות או ציפוי לא אחיד הושלכו.
  2. בידוד ותרבית של תאי סטרומה ראשוניים של מח עצם עכבר (mBMSCs)
    1. לבודד תאי סטרומה ראשוניים של מח עצם עכבר (mBMSCs) מהשוקה ועצם הירך של עכברים.
    2. תרבית התאים במצע גידול המורכב מ-α-MEM בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS), 1% אנטיביוטיקה-אנטי-פטריית ו-1% נתרן פירובט.
    3. תאי זרע במעבר 3 על המצעים המתקבלים בשלב 4.1.3 בצפיפות של 5,000 תאים/סמ "ר כדי למזער את ההשפעות המבלבלות הפוטנציאליות ממגע תא-תא.
  3. צביעה והדמיה אימונופלואורסצנטית
    1. לאחר 16 שעות של תרבית (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2), יש לתקן את התאים עם 4% פרפורמלדהיד למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר ולשטוף 3 פעמים עם PBS. לאחר מכן, יש לחדור לתאים עם 0.1% Triton X-100 למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר ולשטוף 3x עם PBS.
    2. להדמיה של השלד התא, צבעו את ה-F-actin באמצעות פלואידין (דילול של 1:500) למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר, ושטפו 3 פעמים עם PBS בשפע כדי להסיר שאריות צבע.
    3. הרכיב את המצע עם צביעה בו זמנית של גרעיני התאים. מרחו טיפת גליצרין עם DAPI כדי לכסות את התאים. לאחר מכן, הניחו בזהירות כיסוי על גבי המצע ואטמו את השוליים בעזרת לק. הימנע מבועות ככל האפשר.
    4. רכוש תמונות פלואורסצנטיות הלוכדות מורפולוגיה תאית ומיקום גרעיני באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פוטוליתוגרפיה שימשה לייצור תבניות מאסטר סיליקון לשימוש חוזר הכוללות מיקרו-מבנים מקבילים של רכס וחריץ. נוצרו שני עיצובים, הכוללים רוחב חריץ (רוחב הרכס זהה לרוחב החריץ) של 20 ו-50 מיקרומטר, בהתאמה. כל אזור מעוצב נמדד 7 מ"מ × 7 מ"מ. הדיוק והשימוש החוזר של תבניות הסיליקון פשטו משמעותית את תהליך ייצור המצע החוזר. לאחר מכן נעשה שימוש בתבנית המאסטר כדי לשכפל את המיקרו-מבנים ב-PDMS. נוסחת PDMS קשיחה נוצקה כנגד הסיליקון כדי ליצור את השכבה התחתונה, אשר לאחר מכן הודבקה עם סרט PDMS דק, רך ושטוח מלמעלה, וכתוצאה מכך נוצרה המערכת הדו-ש...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה מציג גישה חדשה להנדסת מצע דו-שכבתי מבוסס PDMS שנועד להציג וריאציות קשיחות מקומיות תוך שמירה על משטח חסר תכונות אחיד טופוגרפית. גישה זו מאפשרת אפנון מכני אך ורק באמצעות וריאציות בגיאומטריית התשתית, תוך שמירה על כימיה וטופוגרפיה עקבית של פני השטח. כתוצאה מכך, הוא למעשה מנתק את אות הנוקשות מרמזים פיזיקליים וכימיים אחרים, ומציע מערכת רלוונטית יותר מבחינה ביולוגית לאפנון נוקשות.

במחקר זה, אפנון קשיחות מושג על ידי התאמת הגיאומטריה של שכבת ה-PDMS התחתונה הנוק...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה נתמך כספית על ידי קרנות המחקר הבסיסיות של האוניברסיטאות המרכזיות של סין (מס' 2042024YXB018 ל-W. Ji).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
  4% פאראפורמלדהידטכנולוגיית ServicebioG1101
אצטוןשנחאי אלאדין10000418
אנטי-אנטיגיבקו15240-062אנטיביוטיקה-אנטימיקוטית
מדיום הרכבה נגד פייד עם DAPIביוטכנולוגיה ביוטייםP0131גליצרין עם DAPI 
לוח תרבית תאיםקן70200124 בארות
דסיקטורסצ'ואן שובו (קבוצה) בע"מ913354-30SNקוטר פנימי=180 מ"מ
סרום בקר עובריהייקלוןSV30208.02
מיקרוסקופ פלואורסצנציה הפוךאולימפוסDP74
איזופרופנולשנחאי אלאדין80109218GC≥ 99.7%
מיישר מסכהסצ'ואן נאנגואנג טכנולוגיית שואב אבק בע"מH94-37
שינוי MEM AlphaהייקלוןSH30265.01
ניתוח ננו-סקופיםברוקרגרסה 3.0תוכנת עיבוד וניתוח תמונות של AFM.
מערכת ההדמיה Opera Phenix Plus High Contentפרקין אלמר2400L23248 מצוידת ב-10 מטרה אווירית
PGMEAסוז'ואו ננו-מיקרו טכנולוגיה בע"מ171011-1פטורוזיסט שלילי למפתח; מפרט: UL; אחוז: מינימנט99.7%
פאלואידיןUelandy YP0052L594-פאלואידין
תמיסת מלח מפוספט ממוגנתהייקלוןSH30256.01
מנקה פלזמהטכנולוגיית פלזמה (גרמניה)Flecto 10 
פולי-די-ליזיןביוטכנולוגיה ביוטייםST508מספר CAS 27964-99-4
מיקרוסקופ סורקברוקראייקון הממדמשתמש בתוכנות בקרה לננוסקופ, כולל PeakForce Quantitative Nanomechanical Mapping (PF-QNM) ו-Point-and-Shoot Ramping ניסיוני.
טיפ סיליקון על מנוף ניטרידברוקרSCANASYST-AIRהגשושית כוללת קנטילבר יחיד בצורת V מצופה רפלקס אלו; k= 0.4 N/m (נומינלי), f0 = 70 kHz.
וופרים מסיליקוןחברת שנזן ריג'רוס טכנולוגיה בע"מ-50.8&ועוד; קוטר 0.3 מ"מ, (100) מכוון, 525 ומעלה; 25 & mu; עובי m
נתרן פירובאטגיבקו11360-070
מצפה ספיןמכון המיקרואלקטרוניקה של האקדמיה הסינית למדעיםKW-4A
SU-8 3025סוז'ואו ננו-מיקרו טכנולוגיה בע"מ-פוטוריסט שלילי; 72.3% מוצקים; צמיגות 4400; צפיפות 1.143 גרם למ"ל
ערכת סיליקון אלסטומר SYLGARD 184חברת דאו כימיקלים01673921
טריכלורו (1H,1H,2H,2H-טרידקפלואורו-נ-אוקטיל)סילאןשנחאי אלאדין78560-45-9
טריטון X-100BioFroxx1139ML1000.1% טריטון X-100 לחדירות
טריפסין-אדטהגיבקו25200-0720.25% טריפסין-EDTA (פעם אחת)
תנור ואקוםממרט (גרמניה) VO 200 

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vining, K. H., Mooney, D. J. Mechanical forces direct stem cell behaviour in development and regeneration. Nat Rev Mol Cell Biol. 18 (12), 728-742 (2017).
  2. Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. L. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. Science. 310 (5751), 1139-1143 (2005).
  3. Yeung, T., et al. Effects of substrate stiffness on cell morphology, cytoskeletal structure, and adhesion. Cell Motil Cytoskeleton. 60 (1), 24-34 (2005).
  4. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
  5. Deymier, A. C., et al. Micro-mechanical properties of the tendon-to-bone attachment. Acta Biomater. 56, 25-35 (2017).
  6. Wang, Z., et al. Multi-omics investigations revealed underlying molecular mechanisms associated with tumor stiffness and identified sunitinib as a potential therapy for reducing stiffness in pituitary adenomas. Front Cell Dev Biol. 10, 820562(2022).
  7. Stylianou, A., Voutouri, C., Mpekris, F., Stylianopoulos, T. Pancreatic cancer presents distinct nanomechanical properties during progression. Ann Biomed Eng. 51 (7), 1602-1615 (2023).
  8. Cambria, E., et al. Linking cell mechanical memory and cancer metastasis. Nat Rev Cancer. 24 (3), 216-228 (2024).
  9. Mittelheisser, V., et al. Evidence and therapeutic implications of biomechanically regulated immunosurveillance in cancer and other diseases. Nat Nanotechnol. 19 (3), 281-297 (2024).
  10. Sridharan, R., Cavanagh, B., Cameron, A. R., Kelly, D. J., O'Brien, F. J. Material stiffness influences the polarization state, function and migration mode of macrophages. Acta Biomater. 89, 47-59 (2019).
  11. Yi, B., Xu, Q., Liu, W. An overview of substrate stiffness guided cellular response and its applications in tissue regeneration. Bioact Mater. 15, 82-102 (2022).
  12. Engler, A., et al. Substrate compliance versus ligand density in cell on gel responses. Biophys J. 86 (1), 617-628 (2004).
  13. Song, Y., et al. Biphasic regulation of epigenetic state by matrix stiffness during cell reprogramming. Sci Adv. 10 (7), eadk0639(2024).
  14. Taufalele, P. V., et al. Matrix stiffness enhances cancer-macrophage interactions and M2-like macrophage accumulation in the breast tumor microenvironment. Acta Biomater. 163, 365-377 (2023).
  15. Xie, J., Bao, M., Hu, X., Koopman, W. J. H., Huck, W. T. S. Energy expenditure during cell spreading influences the cellular response to matrix stiffness. Biomaterials. 267, 120494(2021).
  16. Wu, B., et al. Stiff matrix induces exosome secretion to promote tumour growth. Nat Cell Biol. 25 (3), 415-424 (2023).
  17. Driscoll, T. P., et al. Integrin-based mechanosensing through conformational deformation. Biophys J. 120 (20), 4349-4359 (2021).
  18. Sunyer, R., Jin, A. J., Nossal, R., Sackett, D. L. Fabrication of hydrogels with steep stiffness gradients for studying cell mechanical response. PLoS One. 7 (10), 9(2012).
  19. Soliman, B. G., et al. Droplet-based microfluidics for engineering shape-controlled hydrogels with stiffness gradient. Biofabrication. 16 (4), 045026(2024).
  20. Kosmidis Papadimitriou, A., et al. Fabrication of gradient hydrogels using a thermophoretic approach in microfluidics. Biofabrication. 16 (2), 025023(2024).
  21. Isomursu, A., et al. Directed cell migration towards softer environments. Nat Mater. 21 (9), 1081-1090 (2022).
  22. Xia, J., et al. Regulation of cell attachment, spreading, and migration by hydrogel substrates with independently tunable mesh size. Acta Biomater. 141, 178-189 (2022).
  23. Caliari, S. R., Burdick, J. A. A practical guide to hydrogels for cell culture. Nat Methods. 13 (5), 405-414 (2016).
  24. Li, X., et al. 3D culture of chondrocytes in gelatin hydrogels with different stiffness. Polymers. 8, 269(2016).
  25. Yang, Y., Wang, K., Gu, X., Leong, K. W. Biophysical regulation of cell behavior-cross talk between substrate stiffness and nanotopography. Engineering. 3 (1), 36-54 (2017).
  26. Lee, S., Hong, J., Lee, J. Cell motility regulation on a stepped micro pillar array device (SMPAD) with a discrete stiffness gradient. Soft Matter. 12 (8), 2325-2333 (2016).
  27. Hong, J., Lee, S., Park, S., Lee, J. Micro checkerboard patterned polymeric surface with discrete rigidity for studying cell migration. J Micromech Microeng. 25 (4), 045012(2015).
  28. Mostert, D., Van Der Putten, C., Sahlgren, C. M., Kurniawan, N. A., Bouten, C. V. C. Bioengineering structural anisotropy in living tissues. Nat Rev Bioeng. 3 (9), 727-741 (2025).
  29. Khuu, N., Kheiri, S., Kumacheva, E. Structurally anisotropic hydrogels for tissue engineering. Trends Chem. 3 (12), 1002-1026 (2021).
  30. Buxboim, A., Rajagopal, K., Brown, A. E., Discher, D. E. How deeply cells feel: methods for thin gels. J Phys: Condens Matter. 22 (19), 194116(2010).
  31. Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft lithography in biology and biochemistry. Annu Rev Biomed Eng. 3, 335-373 (2001).
  32. Leong, P. L., Morgan, E. F. Measurement of fracture callus material properties via nanoindentation. Acta Biomater. 4 (5), 1569-1575 (2008).
  33. Grant, C. A., Twigg, P. C., Tobin, D. J. Static and dynamic nanomechanical properties of human skin tissue using atomic force microscopy: effect of scarring in the upper dermis. Acta Biomater. 8 (11), 4123-4129 (2012).
  34. Wang, Z., Volinsky, A. A., Gallant, N. D. Crosslinking effect on polydimethylsiloxane elastic modulus measured by custom-built compression instrument. J Appl Polym Sci. 131 (22), 41050(2014).
  35. Even-Ram, S., Artym, V., Yamada, K. M. Matrix control of stem cell fate. Cell. 126 (4), 645-647 (2006).
  36. Wang, D., et al. A novel approach for PDMS thin films production towards application as substrate for flexible biosensors. Mater Lett. 221, 228-231 (2018).
  37. Tonin, M., Descharmes, N., Houdré, R. Hybrid PDMS/glass microfluidics for high resolution imaging and application to sub-wavelength particle trapping. Lab Chip. 16 (3), 465-470 (2016).
  38. Zhu, M., Lerum, M. Z., Chen, W. How to prepare reproducible, homogeneous, and hydrolytically stable aminosilane-derived layers on silica. Langmuir. 28 (1), 416-423 (2012).
  39. Psarski, M., et al. Hydrophobization of epoxy nanocomposite surface with 1H,1H,2H,2H-perfluorooctyltrichlorosilane for superhydrophobic properties. Cent Eur J Phys. 10 (5), 1197-1201 (2012).
  40. Pham, J. T., Xue, L., Del Campo, A., Salierno, M. Guiding cell migration with microscale stiffness patterns and undulated surfaces. Acta Biomater. 38, 106-115 (2016).
  41. Miranda, I., et al. Properties and applications of PDMS for biomedical engineering: a review. J Funct Biomater. 13, 2(2022).
  42. Zhang, W., Choi, D. S., Nguyen, Y. H., Chang, J., Qin, L. Studying cancer stem cell dynamics on PDMS surfaces for microfluidics device design. Sci Rep. 3 (1), 2332(2013).
  43. Toworfe, G. K., Composto, R. J., Adams, C. S., Shapiro, I. M., Ducheyne, P. Fibronectin adsorption on surface-activated poly(dimethylsiloxane) and its effect on cellular function. J Biomed Mater Res A. 71 (3), 449-461 (2004).
  44. Wang, L., Sun, B., Ziemer, K. S., Barabino, G. A., Carrier, R. L. Chemical and physical modifications to poly(dimethylsiloxane) surfaces affect adhesion of Caco-2 cells. J Biomed Mater Res A. 93 (4), 1260-1271 (2010).
  45. Lu, M., Ding, L., Zhong, T., Dai, Z. Improving hydrophilicity and adhesion of PDMS through dopamine modification assisted by carbon dioxide plasma. Coatings. 13, 126(2023).
  46. Jiang, B., Guo, H., Chen, D., Zhou, M. Microscale investigation on the wettability and bonding mechanism of oxygen plasma-treated PDMS microfluidic chip. Appl Surf Sci. 574, 151704(2022).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

PDMS

מאמרים קשורים