מאמר שיטה

הגדרה ניתנת לשחזור עבור הדמיה דו-פוטונית ב-In vivo של כיווץ כלי הלימפה הצווארי וזרימת הלימפה בעכברים

DOI:

10.3791/69482

⸱

10 באפריל 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, Saratov State University, 2Institute of Physics, Department of Optics and Biophotonics, Saratov State University, 3Department of Computer Science and Information Technology, Saratov State University, 4, Res Inst Intelligent Complex Syst, Fudan University, 5Potsdam Institute for Climate Impact Research

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כתב היד מדגים שיטה חדשנית למחקר in vivo של ההתכווצות של כלי הלימפה הצוואריים וזרימת הלימפה בעכברים, לבדיקת פונקציות פיזיולוגיות שונות של כלי הלימפה הצוואריים (cLVs) ואסטרטגיות טיפוליות לוויסות מנגנוני הוויסות הלימפתיים של ניקוז וניקוי מוח.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ההתכווצות של cLVs היא הכוח המניע לזרימת הלימפה ומנגנון מרכזי שמאחורי ניקוי רעלים במוח. כאן אנו מציגים שיטה חדשנית להדמיה דו-פוטונית ב-in vivo של ההתכווצות של cLVs ותצפית ארוכת טווח על הסרת תאי דם אדומים בזרימת לימפה ב-cLVs בעכברים. רכיבי ההתקנה כוללים כרית חימום קטנה מותאמת לצוואר העכבר, המאפשרת הגדלת חלון ההדמיה עד 5 שעות תוך שמירה על כיווץ cLV וזרימת הלימפה; שליטה בלחות; מעטפת מגן; ומערכת מיקום המאפשרת שמירה על ויזואליזציה אופטית יציבה של cLVs. השיטה מבטיחה שחזוריות ותאימות לסוגים אחרים של מיקרוסקופים דו-פוטוניים ומגוון רחב של מטרות, תוך שמירה על איכות גבוהה של תמונות בעומק של עד 500 מיקרון. הפרוטוקול כולל שלבים מפורטים של הכנת cLVs כירורגית לשמירה על הסביבה הפיזיולוגית, ומספק את ההתכווצות התקינה של ה-cLV.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ההתכווצות של כלי הלימפה הצוואריים (cLVs) ממלאת תפקיד מרכזי בניקוז המוח ובניקוי הלימפה של רקמותיו ממטבוליטים ורעלים 1,2,3. הפחתת הפונקציה העיקרית של cLVs מובילה לדיכוי ניקוי רעלים במוח, המלווה במחלות מוח רבות, כולל מחלת אלצהיימר, פגיעות מוח טראומטיות וסרטן מוח 4,5,6,7,8,9. לכן, חקר התכווצות ה-cLV הוא גישה חשובה בפיתוח אסטרטגיות טיפוליות חדשות לוויסות מנגנוני הוויסות הלימפתיים של ניקוז וניקוי מוח 10,11,12.

מחקר זה מציג שיטה חדשנית להדמיה בזמן אמת בשני פוטונים של כיווץ cLV וזרימת הלימפה בעכברים בגילאים שונים. המרכיבים החשובים של ההתקנה כוללים כרית חימום מיקרו, אשר כאשר מחוברת לצוואר בעל החיים, מאפשרת זמן הדמיה מוארך של עד 5 שעות תוך שמירה על פעילות ההתכווצות של כלי הלימפה ויציבות זרימת הלימפה.

ראוי לציין שבניגוד למערכת זרימת הדם, המלאה בדם הזורם במהירות מסוימת (מ-10 מ"מ/ש בעורקים ועד 13 ס"מ/ש בסינוס הסגיטלי בבני אדם) דרך סוגי כלי דם שונים, מילוי כלי הלימפה בלימפה תלוי בגרדיאנט הלחץ ההולך וגדל בין כלי הלימפה הריקים ונפח הנוזל הבין-תחומי הנוצר במהלך חילוף החומרים13, 14,15,16,17,18,19. במקביל, זרימת הלימפה בכלי הלימפה היא לסירוגין, ונעה בין 0 ל-1 מ"מ לשנייה 20,21,22. מחקרי MRI עדכניים בבני אדם הראו כי זרימת הלימפה בכלי הלימפה של קרום המוח (MLVs) היא 1-3 מ"מ23. עם זאת, יש לציין שגם אצל אדם אחד, זרימת הלימפה ב-MLV משתנה בזמנים שונים ביום ויכולה לרדת לאפס. לכן, זרימת הלימפה בכלי הלימפה אינה עקבית, שכן היא תלויה בקצב התהליכים המטבוליים, אשר תלוי בטמפרטורה24. למעשה, מהירות התגובה הביוכימית מושפעת עמוקות וישירות מהטמפרטורה, ולכן יכולה להשפיע משמעותית על התכווצויות ספונטניות של כלי הלימפה וכך לשנות את ניקוז הלימפה והובלה 24,25,26.

לכן, שמירה על טמפרטורת הגוף היא תנאי חשוב לשימור הסביבה הפיזיולוגית של כלי הלימפה לתמיכה בכיווץ תקין וזרימת הלימפה. עם זאת, השימוש בלוחות חימום מסחריים אינו מבטיח שמירה על הטמפרטורה הנדרשת באזורים העמוקים והנגישים אופטית של הצוואר שבהם נמצאים cLVs. דבר זה חשוב במיוחד להדמיה בשני פוטונים של כיווץ cLV וזרימת הלימפה, שכן זה מתבצע בחדרי ניסוי קרים עם טמפרטורת סביבה של 19 מעלות צלזיוס, הנדרשת לטכניקה אופטיתזו.

בהקשר זה, ברוב מוחלט של מחקרי invivo, ההתכווצות של כלי איסוף לימפה המשתמשים בלוחות חימום מסחריים מוגבלת ל-3-5 דקות (ההשפעה המקסימלית נצפית בדרך כלל תוך מספר שניות 3,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37 ,38, ולאחר מכן המילוי והכיווץ הלימפתי יורדים. גישה זו מגבילה משמעותית את זמן התצפית על פיזיולוגיית כלי הלימפה ומקשה על הערכת השפעות ארוכות טווח על ההתכווצות וזרימת הלימפה שלהם, מה שהניע אותנו לפתח כרית חימום מיניאטית מותאמת לצוואר העכבר במטרה להאריך את חלון הזמן להדמיה עד 5 שעות תוך שמירה על כיווץ ה-cLV וזרימת הלימפה היציבה.

מרכיב נוסף בהתקנה הוא מעטפת מגן עם מערכת בקרת לחות ומיקום, המאפשרת שמירה על ויזואליזציה יציבה של cLVs ללא טבילה במים, ועם שימור תמונות ברזולוציה גבוהה כאשר עדשות טבילה באוויר למרחקים ארוכים מתוקנים לזכוכית כיסוי בקוטר 0.17 מ"מ (למשל, CFI Plan Apochromat Lambda D 10x (MRD70170) ו-CFI Plan Apochromat Lambda D 20x (MRD70270).

השיטה המוצעת מבטיחה שחזוריות ותאימות לסוגים אחרים של מיקרוסקופים דו-פוטונים וטווחי מטרה שונים התואמים למארז, תוך התחשבות במאפיינים הסביבתיים, כולל בקרת טמפרטורה/לחות ומרחק עבודה מהעדשה, תוך שמירה על איכות גבוהה של תמונות עם עומק של עד 500 מיקרון וחלון זמן (עד 5 שעות) המאפשרים ניתוח ארוך טווח של כיווצי cLVs וזרימת לימפה באיכות גבוהה בעכברים.

חשוב לקחת בחשבון את המיקום האנטומי של cLVs בקרבת הפיצול של עורק התרדמות, שם ממוקמים הברורצפטורים. ההשפעה המכאנית על הברורצפטורים גורמת לחוסר יציבות בלחץ הדם ובקצב הלב. דבר זה עלול לגרום לשינויים משמעותיים בלחץ ההידרוסטטי וכתוצאה מכך להפרעה בזרימת הלימפה39. לכן, השיטה המוצעת כוללת תיאור מפורט של הפרוטוקול הכירורגי לבידוד עדין של cLVs באזור הצוואר העמוק, כדי למנוע פגיעה מכנית על פיצול עורק הקרוטיד הסמוך ושינויים בלחץ הדם, מה שעלול להוביל לפגיעה בזרימת הלימפה במוח וכתוצאה מכך לפגיעה בזרימת הלימפה בעורק הקרוטידי ולכיווץ שלהם.

התוצאות מראות את הירידה הקשורה לגיל בכיווץ ה-cLV ואת רגישותו להשפעות טיפוליות מעוררות אור בעכברים. יתרה מזאת, לראשונה בתצפיות ארוכות טווח (מעל 5 שעות), אנו מראים בבירור כי cLVs פועלים כמנהרות להסרת תאי דם אדומים מהחדר הצידי הימני, שהוא מסלול לימפה חשוב לניקוי רעלים במוח 1,2,3. בסך הכול, השיטה להדמיה דו-פוטונית של ההתכווצות וזרימת הלימפה ב-cLV ב-in vivo מיועדת למחקרים פרה-קליניים של פונקציות פיזיולוגיות שונות של cLVs, כולל ויסות ניקוז וניקוי מוח, הסרת מטבוליטים ורעלים מהמוח, וכן לבדיקת טכנולוגיות טיפוליות חדשות לוויסות הפיזיולוגיה של cLV.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל ההליכים בוצעו בהתאם למדריך לטיפול ושימוש בבעלי חיים במעבדה, הנחיה 2010/63/האיחוד האירופי להגנת בעלי חיים המשמשים למטרות מדעיות, ולהנחיות משרד המדע וההשכלה הגבוהה של הפדרציה הרוסית (מס' 742 מ-13.11.1984), שאושרו על ידי ועדת האתיקה הביולוגית של אוניברסיטת מדינת סראטוב (פרוטוקול מס' 7, 22.09.2022).

הערה: עיין בטבלת החומרים לפרטים לגבי כל החומרים המשמשים בפרוטוקול זה.

1. מכשיר טכני לתיקון העכבר

  1. השתמש במסילה אופטית מפלדה (SOR, אורך 270 מ"מ, רוחב 43 מ"מ; איור 1A) כבסיס למתקן.
  2. התקן שני מחזיקי עמודים (3PH-25) מעל ה-SOR במרחק של 175 מ"מ זה מזה (איור 1B). מקם את עמודי ההרכבה (3MP, קוטר 12 מ"מ) בתוך ה-3PH-25 ואז קבע אותם היטב עם בורג M6 (איור 1C).
  3. חבר את קולר העמוד (3PC) לשני עמודי ההרכבה (3MP; איור 1D). קולר פוסט-קולר נחוץ לקיבוע הקטטר עם אספקה קבועה של תמיסת מלח במהלך ניטור אופטי של כלי הלימפה הצווארי.
    הערה: זה הכרחי כדי לשטוף את אזור המחקר באופן תקופתי כדי להסיר דם מצטבר לאחר ניתוחים, מה שעלול להקשות על הניטור האופטי.
  4. חבר את מהדק העמוד הקבוע בזווית ישרה (3RPC-12) לאחד מעמודי ההרכבה של 3MP וקבע אותו היטב עם בורג M6 (איור 1H).
    1. הכנס את עמוד ההרכבה (קוטר 12 מ"מ) לחור הצדדי של ה-3RPC-12 (איור 2B).
      הערה: עמוד ההרכבה נחוץ לקיבוע הכיסוי המגן של עדשת פוטון שאינה טבילה במים.
    2. חבר את המחזיק שמודפס על מדפסת תלת-ממד לעמוד ההרכבה בצד ותקבע אותו היטב באמצעות שני זוגות ברגים M3 (איור 2C).
    3. באמצעות דבק שניתן לריפוי ב-UV, מחברים זכוכית כיסוי בקוטר 12 מ"מ מתחת למארז המגן המודפס במדפסת תלת-ממד (איור 2D,F). לאחר מכן, השתמש בזוג הברגים-אום M4 כדי לחבר את הכיסוי המגן למחזיק (איור 2).
  5. התקן את שולחן הפנטוגרף המדויק לתנועה אנכית 02TV004 (איור 1E) על בסיס ה-SOR באמצעות שני קליפסים (3TC5) וסטים של ברגים, אומים ווושרים M6 (איור 1F).
  6. הניחו מארז מודפס בתלת-ממד (אורך 155 מ"מ, רוחב 110 מ"מ) על משטח השולחן, המשמש כמאגר להצטברות תמיסת מלח (איור 1G).

2. גוף חימום

  1. הרכבת התקנים היקפיים.
    1. כסו את נקודת החיבור של החוטים לגוף החימום 1 בשכבה דקה של סיליקון (איור 3). מקבע את חיישן הטמפרטורה 1 למזרן ואטום אותו בסיליקון (איור 3B).
    2. הלחם את חוטי גוף החימום וחיישני הטמפרטורה לכבל רב-חוטי, מלאו את נקודת החיבור בסיליקון, וסגרו בניילון כיווץ (איור 3).
    3. הניחו את גוף החימום 2 ואת חיישן הטמפרטורה 2 בתוך גלגל הקצף (איור 4).
  2. הרכבת יחידת הבקרה
    הערה: קישור להורדת קבצים להדפסת מארז https://disk.yandex.ru/d/06BURfMlQpl0Jg הבקרה.
    1. הדפיסו את מארז יחידת הבקרה במדפסת תלת-ממד (איור 5B).
    2. תקן את המחברים לחיבור כבל החשמל וכפתור ההפעלה על קירות המארז, כפי שמוצג באיור 5C,D).
  3. התקן ספק כוח DC של 24 וולט, ממיר DC מדרדר ושני מודולי MOSFET בתוך המארז (איור 5A, G, H, I).
  4. כדי להרכיב את המעגל, יש לעקוב אחר השלבים הבאים (איור 6).
    1. חבר את הממיר הקטן למקור והגדר את המתח ל-9 וולט (איור 6).
    2. חבר את פין ה-VIN ב-Arduino UNO למחבר OUT+ בממיר ואת GND למחבר OUT, בהתאמה (איור 6).
    3. חבר את פין ה-V+ בספק הכוח לפיני VIN+ במודולי MOSFET, ואת פין ה-V לפיני ה-VIN, בהתאמה (איור 6).
    4. חבר את פין V+ בגוף חימום 1 ל-VOUT+ במודול MOSFET 1 ו-V- ל-VOUT, בהתאמה (איור 6).
    5. חזור על השלבים עבור אלמנט חימום 2 ו-MOSFET 2 (איור 6).
    6. חבר את פין ה-GND במודול MOSFET 1 ו-2 ל-GND ב-Arduino UNO, ואת PWM MOSFET 1 למחבר D11 ב-Arduino UNO, ואת PWM MOSFET 2 למחבר D10, בהתאמה (איור 6).
    7. חבר את פין ה-VIN של חיישן הטמפרטורה 1 למחבר GND ב-Arduino UNO, את VIN+ למחבר 5V ב-Arduino UNO, ואת SIG ל-D3 (איור 6).
    8. חבר את מגע ה-SIG של חיישן הטמפרטורה 2 ל-A1 ב-Arduino UNO, חבר את חיישן ה-GND ל-GND ב-Arduino UNO, וגם חבר את נגד המשיכה של 100 kΩ (איור 6).
  5. תקן את ה-Arduino UNO ואת מסך המקלדת במארז המכסה (איור 7I).

3. מדריך תוכנה לבקרת טמפרטורה

  1. הורד את סקיצה של ארדואינו (קובץ .ino) ופתח אותה בסביבת הפיתוח של ארדואינו (גרסת IDE: 2.3.5-nightly-20241212).
  2. בחר את יציאת ה-COM הנכונה והורד את הקושחה. הממשק כולל שני כפתורים. כדי לעבור ביניהם, השתמשו בכפתורים השמאלי והימני (איור 7B,D). אינדיקטור הבחירה ממוקם משמאל לעמודה (איור 7F).
  3. שדה בחירת הטמפרטורה ממוקם בעמודה השמאלית של המסך (איור 7H). השתמש בכפתורי למעלה ולמטה כדי לכוון (איור 7C).
  4. שדה ההתחלה/כיבוי ממוקם בעמודה הימנית של המסך (איור 7G). כדי לבחור עמודה זו, לחץ על הכפתור הימני במקלדת, ואז לחץ על Select (איור 7A). כאשר התהליך פועל, אינדיקטור הפעילות יבהב, והתווית על כפתור ה-RUN תשתנה ל-OFF.

4. תיקון החיה במכשיר הטכני

הערה: הניסויים נערכו על עכברי BALB/c זכרים (25-28 גרם, 2, 18 ו-24 חודשים); בכל קבוצה היו 7 בעלי חיים.

  1. הכינו תערובת של קטמין וקסילזין (100 מ"ג/ק"ג; 10-156 מ"ג/ק"ג, בהתאמה) והזרקו אותה בהזרקה תוך-פריטוניאלית בהתאם למשקל העכבר.
  2. מרחו משחת עיניים על העפעפיים כדי למנוע התייבשות במהלך הניתוח. חזרו על התהליך הזה במידת הצורך.
  3. כאשר הרפלקסים של משיכת הרגליים האחוריות וקיפול הזנב מפסיקים, מניחים את העכבר על גוף החימום בגב כדי לאפשר גישה לחלק הבטני של הגוף.
  4. חבר את יחידת הבקרה לשקע (טווח מתח כניסה 175-240 וולט AC, טווח תדרים 50-60 הרץ, זרם AC 1.8A/230 V AC). הגדר את טמפרטורת ההפעלה במכשיר ל-37-38 מעלות צלזיוס.
  5. באמצעות סרט רפואי, מקבע את החיה כך שהגוף יהיה מקביל לפני השולחן, וממקם את הראש בזווית יחסית לציר הסגיטלי של הגוף כך שהצד הימני או השמאלי של הצוואר מונח על הגלגל (איור 8A).
    הערה: קיבוע זה של ראש העכבר הכרחי כדי שהצד הימני או השמאלי של הצוואר (בהתאם לתנאי הניסוי) יועלה לגובה של כ-5 מ"מ לכיוון עדשת המיקרוסקופ. לכן, שטח ה-dcLN וה-cLV יהיה כמעט באותו גובה כמו קנה הנשימה.
  6. עטוף את הרצועה סביב החותכות העליונות וחבר אותה לגב המכשיר כדי לשמור על טמפרטורת הגוף של בעל החיים באמצעות סרט רפואי.
  7. באמצעות מכונת גילוח, גזרו את אזור קו השיער באזור הצוואר. הסר את השיער שנותר לאחר הגילוח, ואז כסו את החיה כדי להגן על השדה הסטרילי. לניתוחים ולבקרה אופטית לאחר מכן, יש להזריק 0.5 - 1 מ"ל לידוקאין/בופיבאקאין (1 מ"ג/מ"ל ו-0.25 מ"ג/מ"ל, בהתאמה) תת-עורית לאתר החתך.
    1. לחיטוי ראשוני, יש להסיר שומן ולחטא חלקית את העור באמצעות מטוש אלכוהול, ולאחר מכן, לטיפול חיטוי, מרח תמיסה של כלורהקסידין 0.5% או יוד 2% על העור. חזור על כל שלבי החיטוי פעמיים נוספות.
  8. באמצעות מספריים ישרים לניתוח, מבצעים דרמטוטומיה של עור הצוואר עם חתך אורך מהלסת התחתונה לאזור עצם הבריח באורך של כ-2 ס"מ (איור 8B).
  9. ביצוע פאסיוטומיה עם מספריים מעוקלים מיקרוכירורגיים, באמצעות פינצטה מעוקלת, דוחפים את בלוטות הרוק והשרירים השטחיים של הצוואר, וחשפו את שריר הסטרנוקלידומסטואיד. הימנע מפגיעה בכלי דם גלויים כדי למנוע דימום. הרטיב כל הזמן את אזור הניתוח בתמיסת מלח כדי למנוע פגיעות רקמות מופרזות.
  10. באמצעות מספריים מיקרוכירורגיים, יש לבצע מיוטומיה של שריר הסטרנוקליידומסטואיד כדי לאפשר גישה לאזור שבין קנה הנשימה לעורק הקרוטיד של בעל החיים.
  11. בהמשך פיזור השרירים והפאשיה וביצוע מיו-פאסיוטומיה, מאתר את בלוטת הלימפה הצוואר העמוקה ואת כלי הלימפה האפרנטיים והיוצאים בעומק של 5-7 מ"מ (איור 8C).

5. תיקון העכבר תחת מיקרוסקופ

  1. הנח את המכשיר עם החיה הקבועה על השולחן הנייד של המיקרוסקופ וחבר אותם היטב באמצעות בורג M6. זה הכרחי כדי להבטיח מיקום התקנה קבוע על השולחן הנייד.
  2. חבר את יחידת הבקרה לשקע (טווח מתח כניסה 175-240 וולט AC, טווח תדרים 50-60 הרץ, זרם AC 1.8A/230 V AC). כוון את טמפרטורת ההפעלה במכשיר ל-36-37 מעלות צלזיוס.
  3. חבר את הקטטר המלא בתמיסת מלח לעמוד ההרכבה באמצעות סרט רפואי.
  4. הניחו גלגל בקוטר 1 ס"מ מתחת לגוף החימום בצד ראש החיה כדי להבטיח זווית הטיה של 45° יחסית לשולחן המיקרוסקופ הנייד. דבר זה הכרחי כדי למקם את כלי הלימפה הצווארי במצב אופקי ולהפחית את הלחץ הבא על קנה הנשימה.
  5. הניחו את הקטטר הקבוע באזור הצוואר פתוח לאחר הניתוח כך שימוקם בצד עצמות הבריח של בעל החיים.
    1. הפעל את אספקת תמיסת המלח, חכה עד שהצוואר הפתוח יתמלא לחלוטין בתמיסת מלח.
    2. הורידו את המעטפת המגנה מעל אזור הצוואר המלא בתמיסת מלח כך שאזור כלי הלימפה יהיה ממוקם במרכזו, וקנה הנשימה של החיה לא יידחס (איור 9A).
    3. להתקנת מעטפת ההגנה מומלץ להשתמש במשקפת המחוברת למיקרוסקופ של שני פוטונים. הנח את המעטפת המגנה על קנה הנשימה כדי שלא תלחץ עליה. ודא שאין בועות אוויר שמצטברות מתחת למעטפת המגן בזמן ההורדה. ודאו שהפלטה המגנה ממוקמת על השרירים העליונים של הצוואר ואינה לוחצת על cLVs, מה שמאפשר לתמיסת המלח המחוממת לזרום לתוך הכלי ומונע עיוות מכני של cLVs.
  6. הורידו את עדשת הפוטון הדו-פוטוני שאינה טבילה במים לתוך מעטפת ההגנה לעומק התואם למרחק העבודה של עדשה זו ולאחר מכן לבצע ויזואליזציה דו-פוטונית של כלי הלימפה הצווארי (איור 9B).
    הערה: בעת ביצוע הסריקה הראשונה, יש לוודא שלכלי הלימפה יש מבנה שלם לאורך כל אורכו והוא נייד כאשר העכבר נושם. זה אומר שהוא לא מעוות או נלחץ על ידי מעטפת מגן.

6. ניטור שני פוטונים ב-vivo של כיווצי cLV

הערה: תמונות הפוטון הדו-פוטוני הושגו באמצעות מיקרוסקופ רב-פוטוני (לייזר פולס, אורך גל עירור 970 ננומטר). התמונה התקבלה ברזולוציה של 20x (f/0.75). כל תמונה כללה שדה ראייה אחד בגודל זום x 3.0 (212.13 × 212.13 מיקרון), הכולל 512 על 512 נקודות. התמונות של cLVs התקבלו על ידי צילום וידאו בקצב של 30 פריימים לשנייה, שנמשך דקה אחת. תמונות הפוטון הדו-פוטוני התקבלו בערוץ אחד עם עירור של LYVE-1 פלואורסצנטי ב-cLVs באורך גל של 488 ננומטר ופליטה באורך גל של 525 ננומטר.

  1. ניתוח קוטר cLV והערכת התכווצות אוטומטית
    1. מדוד את קוטר ה-cLVs באזור העניין (ROI) באמצעות סרטים של 30 דקות ב-30 פריימים לשנייה והגדלה פי 3. באמצעות קוד מותאם אישית בפייתון, מדדו את פרופיל הזמן של קוטר cLV עבור אותם מקטעים המשמשים לחישוב זרימת הלימפה.
    2. בחר ידנית שתי נקודות המתאימות לקירות הנגדיים של ה-сLVs. קבעו את מיקומם בפריימים הבאים באמצעות אלגוריתם הזרימה האופטית Lucas-Kanade (פונקציית calcOpticalFlowPyrLK ב-OpenCV), שמספק דיוק תת-פיקסלי למדידות. חשב את הקוטר כמרחק בין נקודות המעקב, מומר מפיקסלים למיקרומטרים. השתמש במסנן חציוני חלון הזזה כדי להסיר ארטיפקטים של תנועה. צריך להיות לפחות 20 מדידות בקוטר ב-ROI אחד.
    3. כדי לקבוע את התדירות הפנימית של הפולסים, השתמשו בסדרת הזמן המוחלקת בקוטר. מזהה אוטומטית את המקסימום והמינימום של האות באמצעות פונקציית find_peaks מספריית SciPy, שמזהה קצוות מקומיים של אות הזמן בהתבסס על ספי משרעת והמרחק המינימלי בין הפסגות.
    4. יש להוציא מהניתוח את התכווצויות cLV בעוצמה של פחות מ-3% מהקוטר הממוצע ורווח של פחות מ-2 שניות. חשב את התדירות הממוצעת לאורך מרווחי 30 דקות כתדירות ההתכווצויות לדקה.

7. ניתוח שני פוטונים של זרימת הלימפה ב-cLVs

הערה: ניתוח זרימת הלימפה נבדק על ידי תנועת תאי דם אדומים ב-cLVs במהלך 5 שעות לאחר הכנסת דם אוטולוגי לחדר הלטרלי הימני דרך הקטטר הכרוני.

  1. הרדימו את העכבר עם 1% איזופלורן (ראו פרוטוקול שפורסםבסעיף 40). השתלו את הקטטר בחדר הצידי הימני בהתאם לפרוטוקול המתוארבסעיף 40.
  2. הכינו את העכבר להדמיה דו-פוטונית ב-vivo של cLVs בהתאם לשלבים 7.1, 7.3-7.5.
  3. איסוף דם מהווריד הזנבי באמצעות דקירה במחט בכמות של 10 מיקרו-ליטר בצינור מיקרו-צנטריפוגה סטרילי שמוצף מראש בהפארין כדי למנוע קרישה במהלך דגימת דם והזרקה.
  4. הזרקת דם לחדר הצידי הימני (AP = −0.5 מ"מ; ML= −1.06 מ"מ; DV = 2.5 מ"מ) באמצעות משאבת מיקרוהזרקה בקצב של 0.1 מיקרוליטר לדקה.
  5. בצע ניתוח דו-פוטוני של תנועת תאי הדם האדומים ב-cLVs. חשב את קצב זרימת הלימפה באמצעות פרוטוקולים שפורסמוב-41,22.

8. פוטוביומודולציה של כיווץ ה-cLV

  1. ל-PBM של cLVs, השתמש בטכנולוגיה ובפרוטוקולים שפורסמו קודםב-40.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השימוש במעטפת מגן מספק את היתרונות החשובים ביותר לניטור ארוך טווח של כלי הלימפה הצוואריים בחיי, כגון בידוד אזור הניתוח מהסביבה החיצונית, המאפשר שמירה על טבילה של כלי הלימפה והרקמות הסובבות בתמיסת מלח עם אספקה קבועה של תמיסת מלח דרך קטטר המחובר לגוף. בנוסף, בשל החיבור למחסנית המיקרוסקופ ומגע מכני הדוק עם הרקמות סביב כלי הלימפה, הכיסוי המגן מבטיח את היציבות המכאנית של שדה התצפית במהלך הנשימה הטבעית ופעילות הלב של בעל החיים, ומגביל את תנועות הכלי הנצפה ליותר מכמה עשיריות מיקרומטר ב...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חקר הפיזיולוגיה של כלי הלימפה דורש שימוש בשיטות לא פולשניות תוך שמירה על תנאי סביבה מיוחדים המאפשרים התכווצות תקינה וזרימת לימפה יציבה. רוב השיטות לחקר תפקודי כלי הלימפה מבוססות על ניטור אופטי של כיווצותם והערכת מהירות זרימת הלימפה 3,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה נתמך במענק מקרן המדע הרוסית (מס' 23-75-30001).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
3D printerBambu Lab, ChinaP1S
5pin connectorConnfly electronic (Zhenqin), ChinaDS1110-01
A set of heat shrinkable tubesJupiter, ChinaJP7230-01
Arduino IDEArduino LLC2.3.5-nightly-20241212
BALB/c mice"Andreevka" Branch FSBIS SCBT FMBA, Russia3-15-16Male, 6-month-old
Chlorhixedin BIOPHARMACEUTICAL PLANT, RussiaN/A
Dumont forceps Stoelting, USA52100-07 
Evans Blue dye Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USAN/A
Fine ForcepsStoelting, USA52102-02P
HamiltonHamilton Bonaduz AG, Switzerland29 G needle
Heating elementChinaLFH-9415sg
Insulin needleINSUPEN, Italy31G, 0.25mm*6mm
Ketamine MOSCOW ENDOCRINE PLANT, FSUE, RussiaGeneral anesthesia 
Keypad Shielddiymore, China1602 LCD Keypad Shield
Lidocaine ORGANICA, RussiaN/A Analgesic drug
Lockable switch buttonChinaN/A
Metal-film resistorsTZT, ChinaN/A
Micro Dissecting Vannas Spring ScissorsStoelting, USA52130-00P
MOSFET ModuleChinaMOSFET Module D4184
Mounting postStanda, Lithuania3MP, diameter 12 mm
Mounting wireAB retail, RussiaHB-1
Non-sharp tweezerStoelting, USA52108-83P 
Plastic for 3D printerBambu Lab, ChinaA00-D0-1.75-1000-SPL.
Post collar Standa, Lithuania3PC
Post holderStanda, Lithuania3PH-25
Power connectorRUICHI, ChinaAC-015
Power supplySANPU, ChinaPS200-H1V24
Precision pantograph table for vertical movement"Laser components", Russia02TV004 
Right-angle fixed post clamp Standa, Lithuania3RPC-12
Screw M3Standa, LithuaniaN/A
Screw M4Standa, LithuaniaN/A
Screw M6Standa, LithuaniaN/A
Shaving machine Braun, figure-materials-1Series 3310s
Sodium chlorideKraspharma, RussiaN/A
Solder Production of metal powders, Russiatin-lead solder 61
Soldering fluxSolins, RussiaLTI-120 22 ml with brush
Soldering stationAOYUE, ChinaN/A
Soldering station AOYUE, ChinaN/A
Steel optical rails (SOR)Standa, LithuaniaN/A
Step-down voltage converterRUICHI, ChinaEM-825
Straight dissecting scissors Stoelting, USA52132-10P 
Temperature sensorLiludin, ChinaDS1820
TetracyclineJSC Tatkhimfarmpreparaty, RussiaEye ointment 
The ControllerArduino, ChinaUNO R3
TweezerStoelting, USA52100-03 
Two-photon  microscopNikon, JapanA1R MP
WirePartner-Electro, RussiaP020G-0305-C050
Xylazine "Alfasan International B.V.", NetherlandsMuscle relaxant
CatheterScientific Commodities Inc., USAPE-10, 0,28 mm ID × 0,61 mm OD

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Li, D. Y., et al. Photostimulation of brain lymphatics in male newborn and adult rodents for therapy of intraventricular hemorrhage. Nat Commun. 14 (1), 6104(2023).
  2. Kunert, C., Baish, J. W., Liao, S., Timothy, P. P., Lance, L. M. Mechanobiological oscillators control lymph flow. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 112 (35), 10938-10943 (2015).
  3. Du, T., et al. Restoration of cervical lymphatic vessel function in aging rescues cerebrospinal fluid drainage. Nat Aging. 4 (10), 1418-1431 (2024).
  4. Mesquita, D., et al. Functional aspects of meningeal lymphatics in ageing and Alzheimer's disease. Nature. 560 (7717), 185-191 (2018).
  5. Bolte, A. C., et al. Meningeal lymphatic dysfunction exacerbates traumatic brain injury pathogenesis. Nat Commun. 11, 4524(2020).
  6. Hu, X., et al. Meningeal lymphatic vessels regulate brain tumor drainage and immunity. Cell Res. 30, 229-243 (2020).
  7. Song, E., et al. VEGF-C-driven lymphatic drainage enables immunosurveillance of brain tumours. Nature. 577 (7792), 689-694 (2020).
  8. Chen, J., et al. Meningeal lymphatics clear erythrocytes that arise from subarachnoid hemorrhage. Nat. Commun. 11, 3159(2020).
  9. Liu, X., et al. Subdural haematomas drain into the extracranial lymphatic system through the meningeal lymphatic vessels. Acta Neuropathol Commun. 8, 16(2020).
  10. Li, D. Y., et al. Photostimulation of brain lymphatics in male newborn and adult rodents for therapy of intraventricular hemorrhage. Nat Commun. 14, 6104(2023).
  11. Liu, S., et al. Neuro-lymphaphotonics opens new horizons of the future technologies for the therapy of brain diseases. Theranostics. 16 (2), 776-793 (2025).
  12. Lin, H., et al. Transcranial photobiomodulation for brain diseases: review of animal and human studies including mechanisms and emerging trends. Neurophotonics. 11 (1), 010601(2024).
  13. Bollmann, S., et al. Imaging of the pial arterial vasculature of the human brain in vivo using high-resolution 7T time-of-flight angiography. Elife. 11, e71186(2022).
  14. Jordan, J. E., Pelc, N. J., Enzmann, D. R. Velocity and flow quantitation in the superior sagittal sinus with ungated and cine (gated) phase-contrast MR Imaging. J Magn Reson Imaging. 4 (1), 25-28 (1994).
  15. Negrini, D., Fabbro, M. D. Subatmospheric pressure in the rabbit pleural lymphatic network. J Physiol. 520 (Pt 3), 761-769 (1999).
  16. Negrini, D., Moriondo, A., Mukenge, S. Transmural pressure during cardiogenic oscillations in rodent diaphragmatic lymphatic vessels. Lymphat Res Biol. 2 (2), 69-81 (2004).
  17. Moriondo, A., Mukenge, S., Negrini, D. Transmural pressure in rat initial subpleural lymphatics during spontaneous or mechanical ventilation. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 289 (1), H263-H269 (2005).
  18. Grimaldi, A., et al. Functional arrangement of rat diaphragmatic initial lymphatic network. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 291 (2), H876-H885 (2006).
  19. Gashev, A. A., Zawieja, D. C. Hydrodynamic regulation of lymphatic transport and the impact of aging. Pathophysiology. 17 (4), 277-287 (2010).
  20. Park, J. K., et al. Association of lymphatic flow velocity with surgical outcomes in patients undergoing lymphovenous anastomosis for breast cancer-related lymphedema. Breast Cancer. 29 (5), 835-843 (2022).
  21. Fischer, M., et al. Flow velocity of single lymphatic capillaries in human skin. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 270 (1), H358-H363 (1996).
  22. Dixon, J. B., et al. Lymph flow, shear stress, and lymphocyte velocity in rat mesenteric prenodal lymphatics. Microcirculation. 13 (7), 597-610 (2006).
  23. Kim, J. H., Yoo, R. E., Choi, S. H., Park, S. H. Non-invasive flow mapping of parasagittal meningeal lymphatics using 2D interslice flow saturation MRI. Fluids Barriers CNS. 20 (1), 37(2023).
  24. Solari, E., Marcozzi, C., Negrini, D., Moriondo, A. Temperature-dependent modulation of regional lymphatic contraction frequency and flow. American Journal of Physiology-Heart and Circ Physiol. 313 (5), H879-H889 (2017).
  25. Solari, E., Marcozzi, C., Negrini, D., Moriondo, A. Lymphatic Vessels and Their Surroundings: How Local Physical Factors Affect Lymph Flow. Biology (Basel). 9 (12), 463(2020).
  26. Angeli, V., Lim, H. Y. Biomechanical control of lymphatic vessel physiology and functions. Cell Mol Immunol. 20, 1051-1062 (2023).
  27. Chong, C., et al. In vivo visualization and quantification of collecting lymphatic vessel contractility using near-infrared imaging. Sci Rep. 6, 22930(2016).
  28. Weiler, M., Kassis, T., Dixon, J. B. Sensitivity analysis of near-infrared functional lymphatic imaging. J Biomed Opt. 17 (6), 066019(2012).
  29. Semiachkina-Glushkovskaia, A., et al. NO-ergic mechanisms of age differences in photostimulation of lymphatic drainage, filtration and clearance. Biomed Opt Exp. , In press (2025).
  30. Davis, M. J., et al. Modulation of lymphatic muscle contractility by the neuropeptide substance P. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 295 (2), H587-H597 (2008).
  31. Bell, R. D., et al. iNOS dependent and independent phases of lymph node expansion in mice with TNF-induced inflammatory-erosive arthritis. Arthritis Res Ther. 21 (1), 240(2019).
  32. Bachmann, S., Detmar, M., Proulx, S. Visualization and Measurement of Lymphatic Function In Vivo. Methods Mol Biol. 1846, 197-211 (2018).
  33. Nelson, T. S., et al. Minimally invasive method for determining the effective lymphatic pumping pressure in rats using near-infrared imaging. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 306 (5), R281-R290 (2014).
  34. Proulx, S. T., et al. Use of a PEG-conjugated bright near-infrared dye for functional imaging of rerouting of tumor lymphatic drainage after sentinel lymph node metastasis. Biomaterials. 34 (21), 5128-5137 (2013).
  35. Kwon, S., Sevick-Muraca, E. M. Noninvasive quantitative imaging of lymph function in mice. Lymphat Res Biol. 5 (4), 219-231 (2007).
  36. Zhou, Q., Wood, R., Schwarz, E. M., Wang, Y. J., Xing, L. Near-infrared lymphatic imaging demonstrates the dynamics of lymph flow and lymphangiogenesis during the acute versus chronic phases of arthritis in mice. Arthritis Rheum. 62 (7), 1881-1889 (2010).
  37. Schmid-Schonbein, G., Zweifach, B. Fluid pump mechanisms in initial lymphatics. News Physiol Sci. 9, 67-71 (1994).
  38. Schmid-Schonbein, G. W. Mechanisms causing initial lymphatics to expand and compress to promote lymph flow. Arch Histol Cytol. 53 (Suppl), 107-114 (1990).
  39. Hughes, G. W., Moore, J. P., Lord, R. N. Barosensory vessel mechanics and the vascular sympathetic baroreflex: Impact on blood pressure homeostasis. Exp Physiol. 108 (10), 1245-1249 (2023).
  40. Blokina, I., et al. Photobiomodulation under Electroencephalographic Controls of Sleep for Stimulation of Lymphatic Removal of Toxins from Mouse Brain. J Vis Exp. (208), e67035(2024).
  41. Dixon, J. B., Zawieja, D. C., Gashev, A. A., Cote, G. L. Measuring microlymphatic flow using fast video microscopy. J Biomed Opt. 10, 064016(2005).
  42. Terskov, A., et al. Age as a limiting factor for effectiveness of photostimulation of brain drainage and cognitive functions. Front Optoelectron. 31 (3), 6(2025).
  43. Blivet, G., Relano-Gines, A., Wachtel, M., Touchon, J. A randomized, double-blind, and sham-controlled trial of an innovative brain-gut photobiomodulation therapy: safety and patient compliance. J Alzheimers Dis. 90 (2), 811-822 (2022).
  44. Herkes, G., et al. A novel transcranial photobiomodulation device to address motor signs of Parkinson's disease: a parallel randomised feasibility study. EClinicalMedicine. 66 (1), 102338(2023).
  45. Bullock-Saxton, J., Lehn, A., Laakso, E. L. Exploring the effect of combined transcranial and intra-oral photobiomodulation therapy over a four-week period on physical and cognitive outcome measures for people with Parkinson's disease: a randomized double-blind placebo-controlled pilot study. J Alzheimers Dis. 83 (4), 1499-1512 (2021).
  46. Lee, T. L., Chan, A. S. Photobiomodulation may enhance cognitive efficiency in older adults: a functional near-infrared spectroscopy study. Front Aging Neurosci. 20 (6), 1-10 (2023).
  47. Cardoso, F. S., et al. Effects of chronic photobiomodulation with transcranial near-infrared laser on brain metabolomics of young and aged rats. Mol Neurobiol. 58 (5), 2256-2268 (2021).
  48. Hosseini, L., et al. Effect of transcranial near-infrared photobiomodulation on cognitive outcomes in D-galactose/AlCl3-induced brain aging in BALB/c mice. Lasers Med Sci. 37 (3), 1787-1798 (2022).
  49. Lutfy, R. H., Essawy, A. E., Mohammed, H. S., Shakweer, M. M., Salam, S. A. Transcranial irradiation mitigates paradoxical sleep deprivation effect in an age-dependent manner: role of BDNF and GLP-1. Neurochem Res. 49 (4), 919-934 (2024).
  50. Bohlen, H. G., Gasheva, O. Y., Zawieja, D. C. Nitric oxide formation by lymphatic bulb and valves is a major regulatory component of lymphatic pumping. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 301 (5), H1897-H1906 (2011).
  51. Scallan, J. P., Zawieja, S. D., Castorena-Gonzalez, J. A., Davis, M. D. Lymphatic pumping: mechanics, mechanisms and malfunction. J Physiol. 594 (20), 5749-5768 (2016).
  52. Aspelund, A., et al. A dural lymphatic vascular system that drains brain interstitial fluid and macromolecules. J Exp Med. 212 (7), 991-999 (2015).
  53. Louveau, A., et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature. 523 (7560), 337-341 (2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

In Vivo

מאמרים קשורים