הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

גישה רב-מודלית להערכת התחדשות עצם וביצועי פיגומים

332 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/69483

⸱

13 בפברואר 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Biomedical Sciences, Federal University of Rio de Janeiro, 2Department of Condensed Matter, Applied Physics and Nanoscience, Brazilian Center for Research in Physics, 3Alberto Luiz Coimbra Institute for Graduate Studies and Research in Engineering (COPPE), Federal University of Rio de Janeiro, 4Brazilian Synchrotron Light Laboratory (LNLS), Brazilian Center for Research in Energy and Materials (CNPEM)

במאמר זה

סיכום

אנו מציעים פרוטוקול להערכת התחדשות עצם ברמות היררכיות שונות. גישה רב-מודלית זו מאפשרת ניתוח מבני בקני מידה שונים לאורך זמן, תוך התמודדות יעילה עם אתגרים בהכנת הדגימה. הוא גם מספק תהליך עבודה אמין להערכת יעילות הביוחומרים בקידום התחדשות העצם.

תקציר

ההצלחה הקלינית של השתל תלויה במידה רבה ביכולתו לקדם תיקון עצם ולהקל על אוסטאואינטגרציה. למרות שנעשו התקדמויות משמעותיות בעיצוב פיגומים חדשים, הערכה מעמיקה של הצלחת השתלים בקני מידה שונים לאורך עצם לא נחקרה מספיק. עצם היא רקמה מאורגנת היררכית, עם מבנה מורכב הנע מארגון סיבי הקולגן ומינרליזציה שלהם בקני מידה של ננומטר ומיקרומטר ועד לסידור מקרוסקופי של עצם קומפקטית וקנסלוס. ארגון היררכי זה חיוני להבטחת תפקוד עצם וביצועים מכניים. בהקשר זה, הערכה מקיפה של השפעות הביוחומרים על תיקון עצם בקני מידה מרובים היא חיונית להערכת היעילות והבטיחות של חומרים מושתלים. עם זאת, הכנת דגימות לניתוחים מולטימודליים משולבים מציבה אתגר טכני. בעבודה זו אנו מציגים פרוטוקול שנועד להעריך התחדשות עצם ברמות היררכיות שונות ולנתח את הממשק בין עצם חדשה לבין הפיגום המושתל. גישה זו מספקת שיטה איתנה להערכת יעילות הפיגומים בעידוד תיקון עצם. השילוב של טכניקות הדמיה תלת-ממדית ודו-ממדית נבחרות הוא קריטי להערכה נכונה של הרקמה המינרלית המורכבת שנוצרת במהלך תהליך החלמת העצם

מבוא

עצם היא רקמה מורכבת ומסודרת היררכית 1,2. הבנת הארגון המבני שלה חיונית למענה על שאלות יסודיות הקשורות לאופן שבו תאים תורמים לארכיטקטורת הרקמה וכיצד שינויים מבניים משפיעים על תפקוד מכני3. בהקשר זה, שיפוץ עצם לאחר פציעה נותר נושא מרכזי לחקירה. ריפוי שבר הוא תהליך מורכב רב-שלבי, שמתחיל בתגובה דלקתית ראשונית, ואחריו התזיה והתמיינות תאי אב לכונדרוציטים ואוסטאובלסטים 4,5. רבות התקיימו ויכוחים בנוגע לתפקידם של חומרים ביולוגיים בעידוד אוסטאואינטגרציה, במיוחד לגבי תאימות ביולוגית ויכולתם למנוע עטיפה סיבית6.

שיטה נפוצה להערכת אוסטאואינטגרציה מונעת על ידי ביו-חומר היא מיקרוסקופיה אופטית, המאפשרת ניתוחים היסטולוגיים כמותיים ואיכותיים כאחד. גישה זו הוכחה כדרך אמינה ויעילה להערכת הצלחת שתלי עצם 7,8. עם זאת, מספר סוגיות הקשורות לארגון היררכי העצם אינן ניתנות לחקירה באמצעות גישת הדמיה אחת3, במיוחד זו ההיסטולוגית, שמוגבלת לפחות בחלקה על ידי הגבלת ההגדלה של השיטה.

התקדמות בהדמיה תלת-ממדית הוכיחה את עצמה כחיונית להבנת הארגון ההיררכי של העצם. טכניקות כמו טומוגרפיה מיקרוממוחשבת (microCT; או קרינת סינכרוטרון או מקורות רנטגן מעבדתיים קונבנציונליים)9,10,11, מיקרוסקופיית אלקטרונים סורקת דו-קרנית (FIB-SEM) הקשורה לטומוגרפיה חתירהוצפייה 12,13,14 וטומוגרפיית אלקטרונים משדרת 15,16 סיפקו תובנות חדשות לארכיטקטורת העצם בקני מידה שונים.

בהתבסס על גישות דימות תלת-ממדיות שונות, הוצע מודל של ארגון היררכי עצם, אשר זיהה בתחילה תשע רמות מובחנות של ארגון מבני עצם1. תכנית זו עודכנה והורחבה לאחרונה לכלול כ-12 רמות היררכיות, ומשמשת כנקודת ייחוס חשובה לחקר הקשר בין מבנה לתפקוד ברקמת עצם 2,17. חשוב לציין שמודל היררכי זה מספק בסיס להערכת הצלחת תיקון העצם לאחר פציעה. הערכת האם רקמת העצם המחודשת משחזרת את המבנה ההיררכי הטבעי היא סטנדרט מרכזי בהערכת איכות ריפוי העצם, במיוחד כאשר משתמשים בחומרים ביולוגיים בתוך האתר הפגוע.

למרות שהשימוש במספר טכניקות הדמיה לחקר ארגון עצם נדון ב-6,7,18,19,20, מעט מאוד נחקר לגבי תהליך עבודה שמשלב שיטות דימות שונות להערכת ארגון מינרלים של עצם בקני מידה מרחביים שונים. כאמור, עצם היא רקמה מורכבת ומורכבת, המורכבת משלב אורגני (תאים, קולגן ומקרומולקולות) וממטריצה מינרלית. מנקודת מבט של הכנת דגימה, מורכבות זו מציבה אתגרים טכניים בנוגע לחדירת ממס דרך הדגימה, חתך של דגימה קשה, ואינטגרציה של אסטרטגיות דימות שונות על אותה דגימה.

החידוש המרכזי בעבודה זו הוא הקמת זרימת עבודה דימותית ניתנת לשחזור, קורלציה ורב-קנה מידה באמצעות דימות תלת-ממדי וטכניקות משלימות. כפי שמודגם באיור 1A, זרימת העבודה מעוצבת כך שניתן יהיה לבדוק את אותה דגימה באופן רציף באמצעות שיטות דימות שונות. מכיוון שחלק מהטכניקות הללו הרסניות או דורשות חתך, תהליך העבודה מתחיל בשיטות לא הרסניות ומתקדם לשיטות הכוללות חיתוך או הסרת חומרים.

תהליך ההכנה והניתוח הזה רלוונטי באופן רחב לדגימות קשות או מינרליות, כולל עצם קורטיקלית וטרבקולרית, פיגומים לפני השתלה, והערכת ממשק העצם/ביוחומרים לאחר ההשרשה. על ידי שילוב מודאליות הדמיה המשתרעת על פני שדות ראייה ורזולוציה שונים (איור 1B), זרימת העבודה מאפשרת ניתוח דגימות מהקנה מידה של סנטימטר ועד לסולמות מיקרומטר וננומטר. בעוד שהרצף מותאם לתמוך בניתוח קורלציה של דגימה בודדת, כל טכניקה יכולה גם להיות מיושמת באופן עצמאי בהתאם למטרה הניסויית. גישה זו מאפשרת הערכה מפורטת של האוסטאואינטגרציה של ביו-חומרים והערכת צמיחת העצם המתחדשת באזור ההחלמה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

התוצאות שהוצגו בפרוטוקול זה התקבלו מהליך ניסויי שנערך במחקר קודם21. כל ההליכים בוצעו בהתאם להנחיות האתיות של הוועדה האתית לשימוש וטיפול בבעלי חיים ניסיוניים באוניברסיטת פלומיננסה הפדרלית, ברזיל (CEUA/UFF: 779). בקצרה, 20 זכרים של עכברי ויסטאר במשקל שבין 300 ל-400 גרם חולקו באקראי לשתי קבוצות: השתלת שאם והשתלת מיקרוספירה cHA. כל בעלי החיים עברו ניתוח שבו נוצר פגם בגודל 2 מ"מ בדיאפיזיזה של השוקה. קבוצת שאם שימשה כבקרת קרישים להערכת התחדשות עצם בפגם לא קריטי, בעוד שקבוצת הניסוי קיבלה מיקרוספירות CHA37 שהושתלו באתר הפגם. לאחר 7 ו-21 ימים, בעלי חיים הושמתו באמצעות מנת יתר של הרדמה כללית, ונאספו בלוקים של עצם השוק מכל קבוצה ונקודת זמן (7 ו-21 ימים). איכות העצם והיקף העצם החדשה הוערכו באמצעות מיקרוסקופיה אופטית ומיקרו-CT.

1. קיבוע דגימה והטמעת שריון

  1. מיד לאחר המתת החסד, יש להסיר את הטיביה המכילה את החומר הביולוגי המושתל ולהעביר אותה לבקבוקון המכיל תמיסת קיבוע קרנובסקי (2.5% גלוטראלדהיד, 4% פורמלדהיד בבופר קקודילט של 0.1 מטר). אחסן את הדגימה בטמפרטורה של מינוס 4°C לפחות ליום אחד.
    הערה: הכינו וטפלו במקבע מתחת למכסה אדים כדי למנוע חשיפה לחומרים נדיפים. כל טיפול בכימיקלים חייב להתבצע באמצעות ציוד מגן אישי (PPE) מתאים, ויש ליישם אמצעי בטיחות טכניים נוספים לפי הצורך.
  2. העבר את הדגימה מהקיבעון לבקבוק המכיל בופר קקודילט של 0.1 M. שמור על הדגימה בסיבוב עדין, החלף את הבופר פעמיים במרווחים של 10 דקות. בשלב זה, יש לחתוך את קצוות הדגימה באמצעות מסור קטן כדי להקל על חדירת שרף. בעת חיתוך הדגימה, השאירו אותה רטובה בבופר קקודילט של 0.1 מטר כדי למנוע ייבוש.
    הערה: תמיד שמור את הדגימה בנפח בופר שהוא לפחות פי 2 מנפח הדגימה. יש לעקוב אחרי זה עבור כל התמיסות והשרף המשמשים בפרוטוקול זה. בעת טיפול ברכיבים הכימיים שהוזכרו לעיל, עבוד בתוך מכסה אדים ולבש ציוד מגן מתאים. אסוף את תמיסת הקיבוע וקקודיליט את פסולת הבופר במיכלים עם תוויות ברורות, תואמות כימית עם פקקים. פעלו לפי נהלי הפעולה הסטנדרטיים (SOPs) המוסדיים לאחסון וטיפול בטוח של פסולת כימית מסוכנת.
  3. התחל את תהליך ההתייבשות באמצעות ריכוזים הולכים וגדלים של אצטון (10%, 30%, 50%, 70%, 90% ו-100%). השאר את הדגימה בסיבוב למשך 30 דקות בכל ריכוז. חזור על שלב 100% אנהידרוס אצטון שלוש פעמים.
    הערה: בעת טיפול באצטון, עבוד בתוך מכסה אדים ולבש ציוד מגן מתאים. לאחר השימוש, אספו כל ממס שנותר במיכלי פסולת מתויגים בבירור ותואמים כימית עם מכסים מותאמים כראוי. פעלו לפי נהלי הנהלים המוסדיים לאחסון וטיפול בטוח של פסולת כימית מסוכנת.
  4. חדרו עם שרף ספרי על ידי העברת הדגימה דרך סדרה של יחסי אצטון לשרף מדורגים: 2:1, 1:1, 1:2, ולבסוף שרף טהור. כל שלב צריך להימשך 12 שעות ולהתבצע בסיבוב בטמפרטורת החדר. לאחר חדירת אצטון לשרף מדורגת, החלף את השרף הטהור פעמיים. לבסוף, העבר את הדגימה לתבנית המכילה שרף טהור ופולימר את הדגימה בטמפרטורה של 70 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.
    הערה: השרף הוכן לפי גיליון הנתונים כדי להשיג קשיחות בינונית. כשאתה מטפלים בשרף שדרן, עבוד בתוך מכסה אדים ולבש ציוד מגן אישי מתאים. לאחר השימוש, אספו כל שאריות במיכלי פסולת מתויגים בבירור ותואמים כימית עם מכסים מותאמים כראוי. פעלו לפי נהלי הנהלים המוסדיים לאחסון וטיפול בטוח של פסולת כימית מסוכנת.

2. הדמיית דגימות באמצעות טומוגרפיית רנטגן מיקרוממוחשבת (microCT)

הערה: מיקרו-CT משמש להערכת מיקום השתלים והתחדשות העצם. הוא גם מסייע לזהות אזורים פוטנציאליים לניתוח נוסף. שלב זה צריך להתבצע כאשר הדגימה מוטמעת בשרף.

  1. השתמשו במחזיק דגימות שסופק על ידי היצרן כבסיס, כדי להבטיח שהדגימה ממוקמת בצורה בטוחה כדי למנוע תנועה במהלך הסריקה. השתמש בחומרים בצפיפות נמוכה לתמיכה, כגון פוליסטירן, גזה או צינורות מיקרוצנטריפוגה.
  2. הצג באמצעות פרמטרי הסריקה האופטימליים הבאים: מתח/זרם צינור = 60 kV/133 mA; צעד זוויתי = 0.33°; ממוצע פריימים = 5; גודל ווקסל = 5 מיקרון; מצב סיבוב = 180°. לדגימות המכילות שתלים מתכתיים, השתמשו בסיבוב של 360° ובפילטר אלומיניום בקוטר 0.5 מ"מ.
    הערה: במהלך התחדשות העצם, עובי עצם ארוגה דמוית טרבקולר בדרך כלל נמצא בגבולות הרזולוציה של הדמיית מיקרו-CT קונבנציונלית. כדי לכמת במדויק פרמטרים מורפומטריים קונבנציונליים של עצם טרבקולרית, כגון עובי, הפרדה ומספר, מומלץ להשתמש בגודל הווקסל הקטן ביותר (5 מיקרון כפי שצוין). אם אזור העניין (ROI) חורג משדה הראייה (FOV) ברזולוציה הנומינלית הזו, תחילה השתמש בתכונת הרב-סריקות כדי לארץ את ה-ROI. שקול להגדיל את גודל הווקסלים רק כמוצא אחרון אם לא ניתן ללכוד את התשואה באמצעות multiscan.
  3. לאחר הסריקה, נתוני הרכישה הגולמיים מורכבים מסדרת קבצי תמונה ממוספרים. בצע שחזור באמצעות התוכנה שסופקה על ידי היצרן, עם דגש על מזעור ארטיפקטים באזור המעניין של הדגימה.
    הערה: נפוץ להיתקל בארטיפקטים של תמונות לאורך גבולות התמונות, במיוחד באזורים שלא ינותחו. הנפח הסופי ניתן לחתוך באמצעות תוכנת היצרן כדי להסיר אזורים אלו.
  4. נתחו את הנפח המשוחזר באמצעות תוכנות ויזואליזציה תלת-ממדיות שונות, כגון Avizo, VGStudio Max, CTVox ו-Dragonfly22. הפעילו פילטרים דיגיטליים לתמונה כדי להסיר ארטיפקטים. במקרה זה, השתמשו בשיטת ההנעה של האמצעים הלא-מקומייםלמטרה זו 19.
    הערה: ערכי החלקת מסננים לא-מקומיים Means Denoizing צריכים להישמר נמוכים ככל האפשר, כדי לא לפגוע בפרטים החשובים של הממשק.

3. הכנת דגימות למיקרוסקופיה אופטית

  1. בחר את כיוון החתך של הדגימה בהתאם למטרה הניסויית. הטיביה יכולה להיות חתוכה באופן רוחבי או אורכי לאורך הציר הארוך של העצם. השתמש בחתכים רוחביים ליצירת חתכים סדרתיים שמכסים את כל נפח הפגם. חתך אורך מתאים להערכת התחדשות עצם בכיוון הציר הארוך. עם זאת, גישה זו מספקת רק חלק אחד של הפגם.
    1. השתמש בדיסק מסור יהלום במהירות נמוכה כדי לחתוך את הדגימה לפרוסות של 1 מ"מ, בהתאם לאסטרטגיה הניסויית.
      הערה: מומלץ להשתמש בדיסק יהלום בעובי של 0.006 עד 0.012 אינץ'. להבים דקים מאפשרים חיתוכים מדויקים מאוד, עם אובדן חומר מינימלי עקב עובי הלהב.
    2. מלא את מיכל הנוזל עד שרמת הנוזל מכסה את הקצה התחתון של הלהב.
      הערה: מים מזוקקים מתאימים לדגימות עצם. עם זאת, אם צפוי חימום מופרז, כמו דגימות המכילות שתלים מתכתיים, השתמש בשמן שמספק יצרן הציוד למילוי המיכל.
    3. אבטח את הדגימה למחזיק הדגימה וחבר אותה לזרוע הכלי. ודא שהדגימה יציבה ואופקית לפני השטח של הדיסק. השתמש בכפתורי המיקום כדי לכוון את אזור החיתוך של הדגימה לדיסק.
    4. התחל לחתוך את הדגימה בהגדרות מהירות גבוהות יותר (210 - 250 סל"ד) ולהפעיל לחץ נמוך עד שנוצר שקע על הדגימה. לאחר מכן, להוריד את המהירות (ל-93 - 124 סל"ד) כדי להשלים את החתך בצורה חלקה ולמנוע רטט מופרז.
    5. עצור את המסור מיד לאחר סיום החיתוך. כוון את המערכת כראוי כדי להבטיח שהחיתוך ייפסק מיד עם ניתוק הדגימה מהבלוק המקורי.
  2. בדוק את הדגימה באמצעות סטריאומיקרוסקופ. התחל בהגדלה נמוכה (למשל, 5x-10x) כדי לבדוק את כל הדגימה, ואז הגבר את ההגדלה (למשל, 20x-40x) כדי לבחור את אזור העניין לפי השאלה המדעית. טווח ההגדלה המדויק עשוי להשתנות בהתאם למכשיר בו משתמשים. בעבודה זו נבחרו אזורים עם צפיפות גבוהה יותר של ממשקים בין עצם שנוצרה זה עתה לחומר הביולוגי לניתוח נוסף.
  3. התקנת דגימות לדילול
    1. התקן את הדגימה על תמיכה כדי להקל על טיפול נכון במהלך הליטוש. אם הדגימה מיועדת אך ורק לניתוח מיקרוסקופיה אופטית, יש לחבר אותה ישירות לכיסוי פלסטיק באמצעות דבק על הצד המלוטש מראש.
      הערה: מומלץ להשתמש במגלשות פלסטיק בשל שיפור ההידבקות שלהן. ניתן גם להשתמש במחסניות זכוכית (לאחר שטיפה נרחבת עם סבון נייטרלי). עם זאת, שקופיות זכוכית מגדילות את הסיכון להיפרדות דגימה במהלך הליטוש.
    2. לדגימות שייבדקו בהמשך בגישה קורלציאלית, יש להתקין על מכלול צינורות אלומיניום דו-חלקי. בפרוטוקול זה פותחה מערכת צינורות אלומיניום ביתית, שכללה גליל פנימי מוצק בקוטר 2.5 ס"מ וצילינדר חלול חיצוני המספק תמיכה מכנית במהלך הליטוש. הדגימה מחוברת לצילינדר המוצק הפנימי.
    3. מניחים את הצילינדר הפנימי מאלומיניום על פלטה חמה וחמם אותה לטמפרטורה המתאימה להמסה (בדרך כלל סביב 60-70 מעלות צלזיוס, תלוי בסוג השעווה שבה משתמשים).
      הערה: גם שעוות דבורים מתאימה. כשמטפלים בהתקנת שעווה, עבוד בתוך מכסה אדים ולבש ציוד מגן מתאים. לאחר השימוש, יש לאסוף את השאריות במיכלי פסולת מתויגים היטב ותואמים כימית עם פקקים מותאמים כראוי. פעלו לפי נהלי הנהלים המוסדיים לאחסון וטיפול בטוח של פסולת כימית מסוכנת.
    4. מרחו כמות קטנה של שעווה על פני הגליל ותנו לו להימס לחלוטין.
    5. לאחר ההמכה, מניחים את הדגימה עם פני השטח המעניינים על פני השטח המצופה בשעווה ולוחצים בעדינות כדי להבטיח מגע מלא.
      הערה: המשטח המעניין צריך להיות פונה אל פני הגליל כך שהדילול מתבצע בצד הנגדי. הימנע משימוש מופרז בשעווה, שכן זה עלול להוביל להרכבה לא אחידה ולהשפיע על איכות הליטוש.
    6. הסר את הצילינדר מהפלטה החמה ותן לשעווה להתגבש בטמפרטורת החדר.
  4. ניטור עובי הדגימה במהלך הליטוש
    1. כדי לנטר את עובי הדגימה במהלך תהליך הליטוש, יש להשתמש במיקרוסקופ החזרה בהגדלה נמוכה עד בינונית (למשל, 10x-20x). דיאגרמה המדגימה את כיול המיקרוסקופ ומדידת עובי הדגימה מוצגת באיור 2.
    2. כייל את ציר המיקרוסקופ Z עם כיסוי סטנדרטי, שבדרך כלל בעובי של כ-150 מיקרון. סמן צד אחד של הכיסוי עם טוש קבוע אדום ואזור סמוך בצד הנגדי עם טוש כחול. התקן את הכיסוי על מגלש זכוכית.
    3. באמצעות כפתור המיקוד הדק ובקנה המידה של המיקרומטר, פוקוס תחילה על המשטח התחתון של הכיסוי ואז על המשטח העליון.
    4. רשום את ערך ה-Z-displacement. ערך זה תואם לעובי הכיסוי (כ-150 מיקרון) ומשמש כנקודת ייחוס.
    5. בעת ליטוש הדגימה, משתמשים מדי פעם בכיול ציר Z כדי להעריך את עובי הדגימה מבלי להוציא אותו מהצילינדר האלומיניום.
      הערה: טכניקה זו מאפשרת הערכת עובי מהירה ולא הרסנית במהלך הליטוש. לחילופין, ניתן להסיר את הדגימה מהמתקן ולמדוד באמצעות קליפר דיגיטלי או מיקרומטר.
  5. דילול וליטוש
    1. התחילו את הליטוש הגס והבינוני באמצעות נייר זכוכית עם גדלי גריט 1200, 2500 ו-4100. מטרת שלב זה היא להקטין את עובי הדגימה לכ-0.15 מ"מ תוך הסרת אי-סדירויות משמעותיות על פני השטח.
    2. תתחיל עם נייר זכוכית 1200, ואז תתקדם לגריט 2500. הפעיל לחץ קל במהלך התהליך הזה. לעקוב מעת לעת אחרי עובי הדגימה באמצעות מיקרוסקופ החזרה בזמן הליטוש.
    3. לאחר השגת העובי הרצוי, יש ללטש את שני צידי הדגימה באמצעות נייר זכוכית בעובי 4100. הליטוש ניתן לבצע ידנית או באמצעות מכונת ליטוש חצי-אוטומטית שמכוונת למהירות סיבוב נמוכה. נקה את הדגימה היטב במים מזוקקים ברציפות בכל שלב ליטוש.
      הערה: שמירה על הדגימות וניירות השיוף רטובים במהלך הליטוש מסייעת להפחית חום ומונעת זיהום פני השטח מניירות השיוף המחוספסים.
    4. לליטוש סופי, יש למרוח כמות קטנה של משחת יהלום (למשל, 6 מיקרון או 3 מיקרון) על בד ליטוש לבד המותקן על דיסק ליטוש. בחר את גודל חלקיקי משחת היהלום בהתאם לגסות פני השטח של הדגימה.
      הערה: משחה של 6 מיקרון מתאימה לליטוש עדין ראשוני, בעוד שמשחה של 3 מיקרון מומלצת לליטוש מראה סופי. כאשר אפשר, שימוש בשתי המשחות ברצף מניב את התוצאות הטובות ביותר. עם זאת, ניתן להשיג ליטוש מספק באמצעות משחה של 6 מיקרון בלבד.
    5. ללטש בעדינות את שני צידי הדגימה בלחץ מינימלי. השתמש באוויר דחוס או כותנה לייבוש המשטח המלוטש של הדגימה לפני בדיקות מיקרוסקופיה.
    6. כדי לנתק את הדגימה מהגליל, חממו את השעווה באמצעות פלטת חימום ומנקים כל שעווה שנותרה מהדגימה באמצעות אצטון חסר מים.
      הערה: כאשר מטפלים בהתקנת שעווה ואצטון אנהידרואי, עבוד בתוך מכסה אדים ולבש ציוד מגן מתאים. לאחר השימוש, יש לאסוף את השאריות במיכלי פסולת מתויגים היטב ותואמים כימית עם פקקים מותאמים כראוי. פעלו לפי נהלי הנהלים המוסדיים לאחסון וטיפול בטוח של פסולת כימית מסוכנת.
    7. התקן את הדגימה בין סלייד זכוכית לכיסוי תוך שימוש בשמן טבילה כמדיום ההתקנה והעריך את כיוון סיבי הקולגן באמצעות מיקרוסקופ אור מקוטב. התחל בהגדלה נמוכה (למשל, 5x-10x) כדי לסקור את הדגימה והגדל להגדלה בינונית (למשל, 20x-40x) כדי לזהות אזורים פוטנציאליים לחקירה נוספת באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים.
      הערה: כדי להמשיך בזרימת העבודה המתואמת והניתוח הבא של הדגימה באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק, מומלץ לא לאטום את הדגימה.

4. הכנת דגימה למיקרוסקופיה אלקטרונית סורקת

  1. הוציאו בזהירות את הדגימה מהמחסנית הזכוכיתית. החלק בעדינות את הכיסוי מהזכוכית בעזרת קצה פיפטה. השתמש בנייר פילטר כדי להסיר את עודף שמן הטבלה. שטוף את הדגימה עם סבון ניטרלי. בצע את הכביסה בתוך מיכל קטן כדי למנוע אובדן דגימה בטעות.
    הערה: אם שמן טבילה שאריתי עדיין קיים על הדגימה, נקו בעדינות את המשטח באמצעות מטלית כותנה רטובה קלות ב-70% אתנול.
  2. השאירו את הדגימה לייבוש באוויר על נייר פילטר. ניתן גם להשתמש באוויר דחוס או כותנה לייבוש הדגימה. לאחר התייבשות מלאה, התקן את הדגימה על גזע עם סרט פחמן. ציפוי את הדגימה בשכבת זהב של 10 ננומטר כדי למנוע טעינה במהלך ההדמיה.
  3. השתמש במיקרוסקופ FIB-SEM דו-קרני כדי לחקור את הדגימה בשיטות שונות.
    1. במצב SEM (מיקרוסקופיה אלקטרונית סורקת), באמצעות אלקטרונים משניים או אלקטרונים מפוזרים, מעריכים את מורפולוגיית הדגימה, הביוחומר וממשק העצם החדש באזורים שנבחרו קודם לכן במיקרוסקופיה אופטית.
    2. במצב מיקרוסקופ אלקטרונים סורק בקרן יונים ממוקדת (FIB-SEM), מבצעים טומוגרפיה של slice and view.
  4. במצב SEM עם גלאי אלקטרונים משני, בחרו אזורים שנותחו בעבר באמצעות מיקרוסקופיית אור מקוטב ו-SEM כדי להמשיך ברכישת טומוגרפיה ב-slice and view.
  5. כוון את הפרמטרים לנפח התעלה, גודל הפיקסלים ועובי הפרוסה בהתאם לתכונות המעניינות. במערכת שלנו, בוצעה טומוגרפיה של slice and-view בנפח תעלה של 15 מיקרון x 10 מיקרון x 10 מיקרון, גודל פיקסל של 20 ננומטר, ועובי פרוסה של 60 ננומטר. מומלץ להשתמש בגודל ווקסל איזומטרי ככל האפשר לשיפור איכות ההדמיה בכל שלושת הממדים (XYZ).
    הערה: פרמטרים אלו עשויים להשתנות בהתאם למערכת FIB-SEM הספציפית. התייעצו עם מפעיל הציוד כדי לקבוע את התנאים האופטימליים בהתבסס על דרישות האנליטיות שלכם ויכולות המערכת.

5. יישור, עיבוד מסננים וסגמנטציה של טומוגרפיית חתירה וצפייה ב-FIB-SEM

  1. טומוגרפיית slice and-view יוצרת סדרת תמונות שממוספרות ברצף. כדי להמשיך ביישור, המר את הסדרה לקובץ MRC, המכונה בדרך כלל מחסנית.
  2. בצע יצירת קבצי MRC ויישור מחסנית תמונות באמצעות תוכנת IMOD.
    הערה: תוכנות אחרות, כמו Avizo ו-FIJI/ImageJ, מציעות גם הן תוספי יישור מחסניות. להכוונה מפורטת, יש לעיין בכל תיעוד ספציפי לתוכנה. בנוסף, עבודתם של פדי ואחרים23. מציע סקירה של הגישות שאומצו במהלך יישור המחסניות.
  3. כדי ליצור את קובץ ה-MRC, פתח את הטרמינל או שורת הפקודה, עבר לתיקייה המכילה את רצף התמונות, ובצע את הפקודה הבאה: tif2mrc imagerootfile*.tif stackname.mrc
    1. לתמונות שאינן בפורמט TIFF, השתמש ב-raw2mrc במקום. הוסף -g (למשל, tif2mrc -g) כדי להמיר תמונות RGB בגודל 24 ביט לגווני אפור של 8 ביט. זה יקטין משמעותית את זמן החישוב.
  4. הפעל את Etomo מהטרמינל ובחר באפשרות Align Serial Sections. עקבו אחרי הרצף ליישור המחסנית: (1) טעינו את המחסנית הלא מיושרת למסגרת אחת. (2) לשונית אלגין באמצעות יישור אוטומטי ראשוני. (3) ליצור לשונית Stack באמצעות Make Aligned Stack, ואז לפתוח את המחסנית המיושרת.
    הערה: תהליך זה עשוי להימשך מספר דקות, בהתאם לגודל הערימה ולביצועי המערכת.
  5. לאחר השלמה, בדוק את התוצאה. קובץ המחסנית המיושר ייקרא stackname_ali.mrc.
    הערה: פרוצדורה זו משתמשת בהגדרות ברירת המחדל של המערכת ליישור המחסנית. עם זאת, ניתן לשנות פרמטרים הקשורים ליישור הראשוני וליצירת המחסנית הסופית בהתאם להעדפות המשתמש. להכוונה מפורטת, ראו את התיעוד של IMOD: https://bio3d.colorado.edu/imod/doc/serialalign.html.https://bio3d.colorado.edu/imod/doc/serialalign.html.
  6. בצע סינון תמונות נוסף באמצעות תוכנת אביזו. פתח את המחסנית המיושרת והחל ברצף את המסננים הבאים: מסנן טרנספורם פורייה מהיר (FFT), זמין בתוסף מסנן Sandbox (בחר את האפשרות לכיוון פסים אנכיים, ערך סובלנות: 2), אשף תיקון הצללה (התאמת בחירת המסכה לכסות את כל אזור הצללים בתמונה, השתמש בפקטור נרמול של 100), איזון היסטוגרמה (קונפיגורציה ברירת מחדל), ואמצעים לא מקומיים (כוונון ערכים ל-5; 0.1; 10; 3).
    הערה: מסננים מקבילים זמינים בתוכנות ניתוח תמונות אחרות. ב-FIJI/ImageJ, אנו ממליצים על הרצף הבא: מסנן FFT, חיסור רקע, שיפור ניגודיות מקומית (CLAHE), ומסנן ממוצעים לא-מקומיים.
  7. המשך לסגמנטציה של תמונות ורינדור תלת-ממדי באמצעות התוכנה. קיימות אסטרטגיות סגמנטציה שונות, כולל סגמנטציה ידנית וסגמנטציה מבוססת סף. כלים נוספים, כמו אלגוריתם Watershed, יכולים לסייע באוטומציה של התהליך ולהפחית את הזמן הנדרש לסגמנטציה.

6. הכנת דגימה למיקרוסקופיה אלקטרונית במעבר

  1. הכנת למלות באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק בקרן יונים ממוקדת (FIB-SEM) להערכת ממשק העצם/ביוחומר.
    הערה: אם החומר הביולוגי המושתל אינו קרמי או מתכתי, כפי שנאמר במחקר זה, ניתן להכין חתכים דקים במיוחד המתאימים למיקרוסקופ אלקטרוני מעבר (TEM) באמצעות אולטרה-מיקרוטום. עם זאת, חשוב לציין כי חיתוך חומרים מינרליים יכול לקצר משמעותית את אורך החיים של סכין היהלום.
  2. לאחר הצביעה את החלקים הדקים מאוד למשך 20 דקות בתמיסה מימית של 5% אורניל אצטט.
    הערה: בעת טיפול באצטט אורניל, עבוד בתוך מכסה אדים ולבש ציוד מגן מתאים. לאחר השימוש, אספו כל ממס שנותר במיכלי פסולת מתויגים בבירור ותואמים כימית עם מכסים מותאמים כראוי. פעלו לפי נהלי הנהלים המוסדיים לאחסון וטיפול בטוח של פסולת כימית מסוכנת.
  3. נתח את החלקים באמצעות TEM. לניתוח מקיף, יש לשלב הדמיה עם דיפרקציית אלקטרונים באזור נבחר (SAED), ספקטרוסקופיית קרני רנטגן מפזרת אנרגיה (EDS) וטומוגרפיית אלקטרונים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

הניתוח הראשוני של דגימות משובצות בשרף מתבצע באמצעות מיקרוקומפוטד טומוגרפיה (microCT). טכניקה לא הרסנית זו מאפשרת הדמיה תלת-ממדית של כל אזור הפגם, ומאפשרת ניתוחים כמותיים ואיכותניים של הדגימה. הקונטרסט בהדמיית מיקרו-CT נובע בעיקר מהבדלי הצפיפות של החומרים הנמצאים בדגימה. איור 1 ממחיש את ניתוח המיקרו-CT של פגם לא קריטי בשוק העכברוש שהושתל בביוחומר CHA37. הדגימה נאספה 12 שבועות לאחר ההשתלה והוכנה בהתאם לפרוטוקול הטמעת השרף שתואר קודם. ניתוח המיקרו-CT יצר מודל ת...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

טכניקות הדמיה שונות שימשו לחקר ארכיטקטורת העצם ולהערכת יעילות הביומטריאלים בגרימת אוסטאואינטגרציה 7,21,22,23,24. בפרוטוקול זה, הקמנו תהליך עבודה הכולל מיקרוטומוגרפיית רנטגן, מיקרוסקופיה אופטית ומיקרוסקופ אלקטרונים לניתוח רקמת עצם מינרלית שנוצרה בפגם בשוק העכברוש לאחר השתלת חומר ביולוגי. ביצוע תהליך עבודה זה דורש מחויבות משמעות...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים ידועים או מערכות יחסים אישיות שיכולות להיראות כמשפיעות על העבודה המדוונת במאמר זה.

תודות

עבודה זו נתמכה במענקים למחברים מהסוכנויות הברזילאיות הבאות: Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq/Brazil) ו-Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ). אנו מודים ל-LABNANO/CBPF ול-CENABIO/UFRJ על מתקני מיקרוסקופיית אלקטרונים. שיפור השפה ותיקון דקדוק בוצעו באמצעות ChatGPT (OpenAI, GPT-5.1, 2025). כל העריכות נבדקו ואומתו על ידי המחברים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אצטון מרק67-64-1
גליל אלומיניוםתוצרת ביתלא זמין
גרסת אביזו 2022.1תרמופישרלא זמיןתוכנה לסינון, סגמנטציה ויזואליזציה תלת-ממדית של תמונות.
חומצה קקודילית, מלח נתרן, טריהידרטטד פלה18851אבקה ל-Cacodylate Buffer. הכינו תמיסה סטנדרטית של 0.2 מטר
תרכובת ליטוש יהלומים 3 ומיקרו; גודל mטד פלה895-8
תרכובת ליטוש יהלום 6 ומיקרו; גודל mטד פלה895-9
גלגל היהלום x.006טכנולוגיית סאות' בייDWH 3063
גלגל יהלום x.012טכנולוגיית סאות' בייDWH 4122
בד לבד מבריקטד פלה816-20
קפסולות הטמעה שטוחותEMS70021
כיסוי זכוכיתקניטללא זמין
סלייד זכוכיתקניטללא זמין
גלוטראלדהיד, דרגת EM של 25%טד פלה18426/18427
K550X מזהבEMITECHלא זמין
ImageJהמכונים הלאומיים לבריאות (NIH)תוכנה לאליגמנט תמונות, סינון, סגמנטציה והדמיה תלת-ממדית
גרסה 5.1 של IMODאוניברסיטת קולורדותוכנה לאליגנציה תמונת, סגמנטציה והדמיה תלת-ממדית
מכונת ליטוש אלקטרוניתטכנולוגיית סאות' ביידגם 910
מסור גלגל יהלום במהירות נמוכה  טכנולוגיית סאות' ביידגם 650
ערכת הטמעת צמיגות נמוכהEMS14300ערכה לשרף SPURR. הכן בהתאם למפרטי גיליון הנתונים  
Micro-CT Skyscan 1273 ברוקרלא זמין
מיקרוסקופ Jeol 2100F 200kV ג'וללא זמין
מיקרוסקופ אולימפוס BX51אולימפוסלא זמין
Microscope Tescan Lyra3טסקןלא זמין
מיקרוסקופ זייס אקסיופלןצייסלא זמיןמצוידת בפלטת למבדה מהזמנה ראשונה
פאראפורמלדהיד, דרגת EMסיגמאP6148אבקה לתמיסת פורמלדהיד. הכינו תמיסה מלאית של 16%
מחסנית פלסטיקבדיוק41500
שעווה להרכבת QuickStick 135טכנולוגיית סאות' ביילא זמין
ניירות זכוכית   גדלי גריט 1200לא זמיןלא זמין
ניירות זכוכית   גדלי גריט 2500לא זמיןלא זמין
ניירות זכוכית   גדלי גריט 4100לא זמיןלא זמין
סופר גלולוקטיטלא זמין
נוזל קירור מסיס במים  טכנולוגיית סאות' ביילא זמין
נייר מסנן דרגה 1 של WhatmannסיגמאWHA1001150

מקורות

  1. Reznikov, N., Shahar, R., Weiner, S. Bone hierarchical structure in three dimensions. Acta Biomater. 10 (9), 3815-3826 (2014).
  2. Buss, D. J., Kröger, R., McKee, M. D., Reznikov, N. Hierarchical organization of bone in three dimensions: A twist of twists. J Str Biol: X. 6, (2022).
  3. Grandfield, K., Gustafsson, S., Palmquist, A. Where bone meets implant: The characterization of nano-osseointegration. Nanoscale. 5 (10), 4302-4308 (2013).
  4. Loi, F., Córdova, L. A., Pajarinen, J., Lin, T., Yao, Z., Goodman, S. B. Inflammation, fracture and bone repair. Bone. 86, 119-130 (2016).
  5. Einhorn, T. A., Gerstenfeld, L. C. Fracture healing: mechanisms and interventions. Nature Rev Rheumatol. 11 (1), 45-54 (2015).
  6. Shah, F. A., Thomsen, P., Palmquist, A. Osseointegration and current interpretations of the bone-implant interface. Acta Biomater. 84, 1-15 (2019).
  7. Palmquist, A. A multiscale analytical approach to evaluate osseointegration. J Mater Sci Mater Med. 29 (5), 60(2018).
  8. Sim, J. H., Yeo, I. S. Light Microscopy Analysis of Bone Response to Implant Surfaces. Microsc Today. 24 (4), 28-33 (2016).
  9. Reznikov, N., et al. Inter-trabecular angle: A parameter of trabecular bone architecture in the human proximal femur that reveals underlying topological motifs. Acta Biomater. 44, 65-72 (2016).
  10. Müller, R. Hierarchical microimaging of bone structure and function. Nat Rev Rheumatol. 5 (7), 373-381 (2009).
  11. Martinez-Zelaya, V. R., Archilha, N. L., Calasans-Maia, M., Farina, M., Rossi, A. M. Trabecular architecture during the healing process of a tibial diaphysis defect. Acta Biomater. 120, 181-193 (2021).
  12. Buss, D. J., Reznikov, N., McKee, M. D. Crossfibrillar mineral tessellation in normal and Hyp mouse bone as revealed by 3D FIB-SEM microscopy. J Str Biol. 212 (2), 107603(2020).
  13. Binkley, D. M., Deering, J., Yuan, H., Gourrier, A., Grandfield, K. Ellipsoidal mesoscale mineralization pattern in human cortical bone revealed in 3D by plasma focused ion beam serial sectioning. J Str Biol. 212 (2), 107615(2020).
  14. Reznikov, N., Almany-Magal, R., Shahar, R., Weiner, S. Three-dimensional imaging of collagen fibril organization in rat circumferential lamellar bone using a dual beam electron microscope reveals ordered and disordered sub-lamellar structures. Bone. 52 (2), 676-683 (2013).
  15. Reznikov, N., Bilton, M., Lari, L., Stevens, M. M., Kröger, R. Fractal-like hierarchical organization of bone begins at the nanoscale. Science. 360 (6388), 2189(2018).
  16. Grandfield, K., Vuong, V., Schwarcz, H. P. Ultrastructure of Bone: Hierarchical Features from Nanometer to Micrometer Scale Revealed in Focused Ion Beam Sections in the TEM. Calcified Tissue Int. 103 (6), 606-616 (2018).
  17. Micheletti, C., et al. mineral organization at the mesoscale: A review of mineral ellipsoids in bone and at bone interfaces. Acta Biomater. 142, 1-13 (2022).
  18. Micheletti, C., Shah, F. A. Bone hierarchical organization through the lens of materials science: Present opportunities and future challenges. Bone Rep. 22, (2024).
  19. Shah, F. A., Ruscsák, K., Palmquist, A. 50 years of scanning electron microscopy of bone-a comprehensive overview of the important discoveries made and insights gained into bone material properties in health, disease, and taphonomy. Bone Res. 7 (1), (2019).
  20. Georgiadis, M., Müller, R., Schneider, P. Techniques to assess bone ultrastructure organization: Orientation and arrangement of mineralized collagen fibrils. J Royal Soc Interface. 13 (119), (2016).
  21. Martinez-Zelaya, V. R., Archilha, N. L., Calasans-Maia, M., Farina, M., Rossi, A. M. Trabecular architecture during the healing process of a tibial diaphysis defect. Acta Biomater. 120, 181-193 (2021).
  22. Keklikoglou, K., et al. Micro-computed tomography for natural history specimens: a handbook of best practice protocols. Eur J Taxonomy. (522), (2019).
  23. Peddie, C. J., et al. Volume electron microscopy. Nat Rev Meth Primers. 2 (1), 51(2022).
  24. Costa De-Moraes, S. L., et al. Histomorphometric and microtomographic evaluation of hydroxyapatite coated implants and L-PRF in over drilled bone sites in sheep. Sci Rep. 15 (1), 14761(2025).
  25. Liu, Y., Xie, D., Zhou, R., Zhang, Y. 3D X-ray micro-computed tomography imaging for the microarchitecture evaluation of porous metallic implants and scaffolds. Micron. 142, (2021).
  26. Wee, H., Khajuria, D. K., Kamal, F., Lewis, G. S., Elbarbary, R. A. Assessment of Bone Fracture Healing Using Micro-Computed Tomography. J Vis Exp. (190), e64262(2022).
  27. Ramezanzadehkoldeh, M., Skallerud, B. H. MicroCT-based finite element models as a tool for virtual testing of cortical bone. Med Eng Physics. 46, 12-20 (2017).
  28. Shefelbine, S. J., et al. Prediction of fracture callus mechanical properties using micro-CT images and voxel-based finite element analysis. Bone. 36 (3), 480-488 (2005).
  29. O'Neill, K. R., et al. Micro-computed tomography assessment of the progression of fracture healing in mice. Bone. 50 (6), 1357-1367 (2012).
  30. Morgan, E. F., et al. Micro-computed tomography assessment of fracture healing: Relationships among callus structure, composition, and mechanical. Bone. 44 (2), 335-344 (2009).
  31. Reznikov, N., et al. Inter-trabecular angle: A parameter of trabecular bone architecture in the human proximal femur that reveals underlying topological motifs. Acta Biomater. 44, 65-72 (2016).
  32. Zaborowska, M., Shah, F. A., Trobos, M., Palmquist, A. Retrieval, sample processing, and analyses of bone-anchored implants. Bone Repair Biomater Regenerat Clin Appl Second Edition. , 447-466 (2018).
  33. Thorfve, A., Palmquist, A., Grandfield, K. Three-dimensional analytical techniques for evaluation of osseointegrated titanium implants. Mater Sci Technol. 31 (2), 174-179 (2015).
  34. Mastrogiacomo, M., Campi, G., Cancedda, R., Cedola, A. Synchrotron radiation techniques boost the research in bone tissue engineering. Acta Biomater. 89, 33-46 (2019).
  35. Raguin, E., Rechav, K., Shahar, R., Weiner, S. Focused ion beam-SEM 3D analysis of mineralized osteonal bone: lamellae and cement sheath structures. Acta Biomater. 121, 497-513 (2021).
  36. McMahon, G., Malis, T. Ultramicrotomy of nanocrystalline materials. Microscopy Res Tech. 31 (4), 267-274 (1995).
  37. Bassim, N. D., et al. Minimizing damage during FIB sample preparation of soft materials. J Microsc. 245 (3), 288-301 (2012).
  38. Witzke, K., et al. Comparative Sample Preparation Using Focused Ion Beam and Ultramicrotomy of Human Dental Enamel and Dentine for Multimicroscopic Imaging at Micro- and Nanoscale. Materials. 15 (9), 3084(2022).
  39. Carter, J. L. W., Karakulak Uz, T., Ibrahim, B., Pigott, J. S., Gordon, J. V. A comparison of energy dispersive spectroscopy in transmission scanning electron microscopy with scanning transmission electron microscopy. Ultramicroscopy. 270, 114106(2025).
  40. Grandfield, K., McNally, E. A., Palmquist, A., Botton, G. A., Thomsen, P., Engqvist, H. Visualizing biointerfaces in three dimensions: electron tomography of the bone-hydroxyapatite interface. J Royal Soc Interface. 7 (51), 1497-1501 (2010).
  41. Grandfield, K., Palmquist, A., Engqvist, H. Three-dimensional structure of laser-modified Ti6Al4V and bone interface revealed with STEM tomography. Ultramicroscopy. 127, 48-52 (2013).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

X
גישה רב-מודלית להערכת התחדשות עצם וביצועי פיגומים
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.