הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

תרבית שחלות עכבר יילודה וכימות זקיק שלם: גישה יעילה במבחנה לחקר ויסות זקיקים פרימורדיאליים

690 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/69498

⸱

19 בדצמבר 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Obstetrics, Gynecology, and Women's Health, University of Missouri School of Medicine, 2Division of Biological Sciences, University of Missouri

במאמר זה

סיכום

מחקר זה מציג פרוטוקולים לגידול שחלות עכברים לאחר הלידה על הכנסות ממברנה ולכימות זקיק שלם בשחלה שלמה. התוצאות הראו כי טיפול טכני במהלך תרבית שחלות משפיע משמעותית על ספירת הזקיקים הראשוניים, מה שמדגיש את החשיבות של שמירה על עקביות למזעור שונות לא-ביולוגית.

תקציר

ביונקים, זקיקים פרימורדיאליים נוצרים במהלך התפתחות השחלות העוברית ומשמשים כמקור היחיד לשימור תפקוד השחלה של הבוגרים. המנגנונים העומדים בבסיס האופן שבו זקיקים פרימורדיאליים מתאספים, שומרים על תרדמה, מופעלים להתפתחות זקיקים ועוברים מוות תאי חשובים להבנת הפיזיולוגיה של השחלות ומצבים פתולוגיים. מחקר זה מציג פרוטוקול לגידול שחלות עכברים לאחר הלידה על הכנסות ממברנה, גישה המאפשרת תרבית וטיפול תרופתי בשחלות שלמות למשך עד 10 ימים, בהתאם לשלב ההתפתחות של השחלה. שינויים בתנאי התרבית יכולים להתבצע על ידי העברת תוספות המכילות שחלות מתורבתות בין בארות על צלחת, ובכך להימנע מהפרעה פיזית לרקמות במהלך התרבית. שחלות P5 בודדו וגודלו על תבנית בגודל 12 מ"מ בלוח עם 24 בארות, לדוגמה. כל שחלה הופרדה בתוך טיפה של מדיום DMEM/F12 שהושלמה עם 10% FBS, 3 מ"ג/מ"ל BSA, 10 mIU/mL FSH ואנטיביוטיקה-אנטימיקוטית, ויוצבה בעדינות על הכנסת הממברנה. המדיום שונה כל יומיים, והתרבות נשמרה במשך חמישה ימים בסך הכל. לאחר התרבית, השחלות תוקנו ב-4% פאראפורמלדהיד במשך שעתיים ועברו עיבוד לצביעת נוגדנים מלאה של סמן הביציות DDX4. הזקיקים הוסדרו וכמותו בהתבסס על גודל הביציות והמורפולוגיה הגרעינית של תאי זקיק סומטיים. התוצאות הראו שמספר הזקיקים הראשוניים בכל שחלה הושפע משמעותית מהמיקום הנכון של הרקמות על הכניסה לממברנה. בנוסף, הבדלים במספר השחלות בכל אינסרט עלולים להכניס וריאציות לא ביולוגיות ויש להימנע מהם.

מבוא

אוגנזה היא תהליך מוסדר ומורכב מאוד שמוביל לייצור ביציות בוגרות. ביונקים, היווצרות מתחילה בשחלות עובריות, שם תאי נבט פרימורדיאליים (PGCs) מתמיינים לביציות ראשוניות. כל ביצית ראשונית מוקפת בשכבה של תאי פרה-גרנולוזה קשקשיים, היוצרים זקיק קדום. רוב הזקיקים הראשוניים הללו נכנסים לתרדמת לאחר היווצרות, ומשמשים כמאגר השחלות 1,2,3. בשחלה הבוגרת, הפעלה תקופתית של זקיקים פרימורדיאליים להתפתחות זקיקים, הידועה כפוליקולוגנזה, חיונית לשימור ייצור ביציות בוגרות והורמוני סטרואידים שחלתיים 4,5. בהיעדר אותות הפעלה, זקיקים פרימורדיאליים אנושיים יכולים להישאר שקטים עד 50 שנה. תרדמת ממושכת עשויה לתרום לירידה באיכות הביציות, וכן לקצב מוגבר של אובדן זקיקים פרימורדיאליים בשחלות מזדקנות. המנגנונים העומדים בבסיס הפעלת מאגר מסוים של זקיקים בעוד אחרים נשארים שקטים ועוברים מוות תקופתי של תאים נותרו שאלות פתוחות.

תהליך האוגנזה נשמר היטב ביונקים, מה שהופך את העכברים למודל אידיאלי לחקר ביוגנזה7 של יונקים. בעכברים, היווצרות זקיקים פרימורדיאליים מושלמת עד יום 4 לאחר הלידה (P4). חלק קטן מהזקיקים הקדומים עוברים התפתחות זקיקים מיד לאחר היווצרותם. במהלך התפתחות הזקיקים, הביצית גדלה בגודלה בשל אורגנוגנזה מוגברת, וסינתזת mRNA וחלבון4. תאי גרנולוזה קשקשיים עוברים לתאי גרנולוזה קובייתיים והופכים למתרבים8. הזקיקים המתפתחים הללו גדלים לשלב הביוץ סביב היום ה-21, שבו נקבות העכברים מגיעות לגיל ההתבגרות. שלב זה של התפתחות הזקיקים בשחלות שלאחר הלידה מכונה בדרך כלל 'פוליקולוגנזה בגל הראשון'. מכיוון שפוליקולוגנזה בגל ראשון משקפת באופן הדוק את תהליך התפתחות הזקיקים, שחלות עכבר לאחר הלידה מספקות מודל אידיאלי לחקר ויסות זקיקים פרימורדיאליים וזקיקי שחלה9.

הסיווג של זקיקי השחלה מבוסס בעיקר על מורפולוגיית הגרעין של תאי הסומטיקה של הזקיק וגודל הביצית. בשחלות העכבר, הזקיק הראשוני הרדום מזוהה על ידי שכבה אחת של תאי פרהגרנולוזה קשקשיים המקיפים ביצית ראשונית, שקוטרו כ-20 מיקרון. זקיקים מתפתחים ניתן לסווג לזקיקים ראשוניים, משניים, שלישניים ואנטרוליים. הזקיק הראשוני מכיל ביצית בקוטר של מעל 25 מיקרון ומוקף בשכבה אחת של תאי גרנולוזה קובייתיים (איור משלים 1). הזקיק המשני כולל שתי שכבות של תאי גרנולוזה, בעוד שהזקיק השלישי מורכב משלוש שכבות או יותר של תאי גרנולוזה. הזקיק האנטרי גדול יותר מהזקיק השלישוני, מכיל שכבות מרובות של תאי גרנולוזה, ויש לו חלל מלא בנוזל הנקרא אנטרום. כאשר הזקיקים מתפתחים, הביציות גדלות ומגיעה לכ-80 מיקרון בזמן הביוץ. בנוסף, הזקיקים המתפתחים מוקפים במספר שכבות של תאי תקה דקים, הממוקמים מחוץ לתאי הגרנולוזה 10,11,12.

הגודל הקטן יחסית של שחלות עכבר לאחר הלידה הופך את תרבית השחלות השלמה לגישה מעשית למחקר. שיטה זו מאפשרת ביעילות חקר התפתחות השחלות והזקיקים בתוך שחלה שלמה, שכן היא שומרת על המיקרוסביבות הפיזיות והפיזיולוגיות תוך מזעור הפרעות מהרקמות הסובבות12. גישה זו מאפשרת ניסויים שיהיה מאתגר לבצע במודלים ב-in vivo. דוגמאות כוללות הדמיה חיה של התפתחות השחלות, טיפולים מרובי תרופות מבוקרי זמן, וניתוח פעילות הפרשה של השחלות באמצעות פרופיל חלבונים של תרבית המדיה13,14. יתרה מזאת, גישה זו יכולה לשמש לחקר השפעת גורמי הפרשה ללא אינטראקציה ישירה בין תא לתא באמצעות ניסויים משותפים. בניסויים אלו, ניתן להניח סוגים שונים של רקמות על תוספות ממברנה נפרדות בתוך מדיום משותף15. בנוסף, שימוש בשחלות עכברוש מותנות עם הדחפה גנטית במבחנה יכול לסייע בהבהרת מנגנונים מרכזיים המעורבים בהפעלה וצמיחת זקיקים פרימורדיאליים.

במאמר זה נציג שיטות לגידול שחלות עכבר לאחר הלידה באמצעות הוספות ממברנה וכימות זקיקים שלמים בשחלה שלמה (איור 1). הטכניקות המפורטות כאן כוללות: 1) ניתוח שחלות עכברים יילודים, 2) תרבית שחלות עכברים יילודים, 3) שינוי מדיה במהלך התרבית, 4) קיבוע רקמות וצביעת נוגדנים שלמים, ו-5) הדמיית רקמות וכימות זקיקים. בנוסף, מחקר זה השתמש בדוקסורוביצין כדי לגרום לאובדן זקיקים פרימורדיאליים באופן ניסיוני, ומספק מודל לחקר המנגנונים שמאחורי דלדול מאגר השחלות. התוצאות הראו שמספר השחלות בכל החדרה ומיקומן בתוך הכניסה במהלך התרבית השפיעו על ספירת הזקיקים הראשוניים. דבר זה מדגיש את החשיבות של שמירה על מבנה תרבית עקבי למניעת שינויים לא ביולוגיים בתוצאות הניסוי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

עכברים זכרים ונקבות CD-1 גודלו יחד ביחס של 1:1 כזוגות רבייה. תאריך הלידה של הגורים החדשים נקבע כיום 0 לאחר הלידה. כל הניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים המוסדית (IACUC) באוניברסיטת מיזורי (מספר פרוטוקול: 36647).

1. חומרים ומדיה תרבותית

  1. כל החומרים ששימשו במחקר זה מופיעים בטבלת החומרים. הכינו את כל החומרים והמדיה לפני תרבית השחלות.
  2. מדיית תרבית: הכירו ~5 מ"ל מדיום DMEM/F-12 עם 3 מ"ג/מ"ל אלבומין סרום בקר (BSA), 10% סרום בקר עוברי (FBS), ו-10 mIU/mL הורמון מגרה זקיקים (FSH).
    הערה: המדיה צריכה להיות מוכנה מחדש על ידי הוספת מניות BSA (30 מ"ג/מ"ל), FBS ו-FSH (10 IU/mL) למדיה DMEM/F-12. איזון את המדיה בצלחת פטרי למשך כ-30 דקות באינקובטור 5%CO2 בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. אחסן את המלאי בטמפרטורה של מינוס 20°C והפשר אותם מיד לפני השימוש. המלאי של Aliquot בכמויות נכונות כדי למנוע הקפאה והפשרה חוזרת של המלאי.

2. תרבות השחלות

  1. המית עכברים נקבות P5 באמצעות עריפת ראש. הסר את השחלות ורקמת הבורסה המחוברת באמצעות מספריים וכירורגיים ומלקחיים. הניחו את השחלות בצלחת פטרי בקוטר 60 מ"מ עם תמיסת מלח פוספטית (DPBS) מקוררת מראש המכילה אנטיביוטיקה-אנטימיקוטית (איור 2A,B).
  2. באמצעות זוג מזרקי אינסולין (1 מ"ל), יש לנתח ולהוציא את רקמת הבורסה מהשחלה תחת סטריאוסקופ (איור 2C,D). העבר את השחלות באמצעות פיפטה של 1 מ"ל לצלחת פטרי 30 מ"מ המכילה 3 מ"ל מדיום תרבית ומניח את הצלחת באינקובטורCO2.
    הערה: הימנעי מדקירה או לחיצה על השחלות. בצעו חתכים נקיים ואחידים דרך הבורסה השחלתית באמצעות מזרקי האינסולין לשחרור השחלה. מלא מראש את קצה הפיפטה בכ-50 מיקרוליטר של מדיה, הנח את קצה הפיפטה ליד השחלה, ושואף אותו לקצה לצורך העברה.
  3. מתחת למכסה הזרימה הלמינרי, יש להכין את הלוח על ידי הנחת 400 מיקרו ליטר של מדיה ותוספת בכל באר (איור 2E,E'). המדיה נמצאת מחוץ לתווך, והממברנה של ההכנסה הופכת אטומה לאחר שהיא נספגת על ידי המדיום.
  4. לתרבית עם טיפול דוקס של 24 שעות, יש להכין מדיום המכיל דוקס בריכוז 0.1 מ"ג/מ"ל טרי על ידי דילול מלאי דוקס (10 מ"ג/מ"ל) עם המדיום.
    הערה: יש לטפל במדיה המכילה Dox כראוי בהתאם להנחיות הוועדות המוסדיות לבטיחות ביולוגית ובריאות ובטיחות סביבתית.
  5. תחת סטריאוסקופ, יש להעביר עד שלוש שחלות להחדרה באמצעות פיפטה בנפח 1 מ"ל (איור 2F,G). מזער את כמות המדיה שהועברה לתוך התוספת והסר מיד כל מדיה עודפת לאחר ההעברה. לאחר שהשחלות מונחות בעדינות באינסט, השתמשו בפיפטה של 200 מיקרוליטר כדי להעביר כ-200 מיקרוליטר מדיום מהבאר אל תוך האינסרט, ולוודא שהממברנה מכוסה לחלוטין על ידי המדיום. העבר את המדיה חזרה לבאר ומרכז את השחלות על הממברנה. מלאו את קצה הפיפטה בחומר תרבית כדי למנוע מהשחלה להישאב לתוך הקצה בעת מרכז. ודאו להשאיר מרחק מספק בין השחלות ושהן מיוצבות על התוספת של הממברנה (איור 2H), ולא נשארות תלויה במדיום (איור 2I). היזהרו לא לדקור את השחלות ואת הממברנה.
  6. בתרבות של 5 ימים, החלפת מדיה כל יומיים על ידי הסרת 200 מיקרו-ליטר של מדיה (חצי מהכמות הכוללת) מהבאר והוספת 200 מיקרו-ליטר של חומר תרבית טרי חזרה לבאר (איור 2J).
  7. לתרבית עם טיפול תרופתי של 24 שעות, העבר את ההוספה עם השחלות לבאר חדשה עם 400 מיקרוליטר של חומר תרבית טרי לאחר 24 השעות הראשוניות, באמצעות השלבים הבאים:
    1. הסר את התוספת המכילה את השחלות מהבאר באמצעות זוג מלקחיים.
    2. שטפו בקצרה את תחתית התוספת על ידי טבילה בצלחת של 60 מ"מ עם מדיום תרבית טרי.
    3. טפחו בעדינות בתחתית האינסרט על צלחת ריקה בקוטר 60 מ"מ כדי להסיר עודפי מדיה מהאינסרט. הניחו את התוספת לבאר עם מדיום תרבית טרי.
      הערה: הסר עודף מדיום מההכנסה כדי לוודא שהשחלות יציבות על הממברנה מיד לאחר החלפת המדיום או העברת ההכנסה.

3. קיבוע וצביעת חיסון שלמה

  1. כדי לקבע את השחלות התורבתות, הסר את התוספת מהפלטה באמצעות זוג מלקחיים ומניח אותו בצלחת פטרי בקוטר 60 מ"מ המכילה 5 מ"ל DPBS. העבר כ-100 מיקרוליטר DPBS ליד השחלות ותשהה אותן מחדש באמצעות פיפטה של 1 מ"ל.
  2. באמצעות פיפטה של 1 מ"ל, העבר את השחלות מהאינסרט לצינור אפנדורף בנפח 1.5 מ"ל. הסר DPBS מהצינור והוסיף 500 מיקרוליטר של 4% פאראפורמלדהיד. קבע את השחלות בטמפרטורה של 4°C למשך שעתיים.
    הערה: ייתכן שיהיה צורך לקצר את קצה קצה הפיפטה רחב יותר כדי למנוע נזק לרקמות אם השחלות גדולות מדי כדי לעבור דרכן.
  3. שטפו את השחלות הקבועות ב-1 מ"ל PBST2 (PBS, 0.1% טווין [v/v], 0.5% טריטון [v/v]) לפחות שלוש פעמים, שעה כל אחת על שייקר מסתובב. מומלץ להשאיר את הרקמות ב-PBST2 ללילה (12-16 שעות) בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס כדי לשפר את חדירת הנוגדנים.
    הערה: זה יכול להיות נקודת עצירה; ניתן לאחסן את הרקמות ב-PBST2 עד שלושה ימים לפני דגירה ראשונית של נוגדנים.
  4. דגרו את השחלות עם הליקאז 4 נגד קופסה מתה (DDX4) ב-100 מיקרוליטר של בופר דילול נוגדנים (1% BSA [עם v], 10% סרום חמור [v/v], 0.1 M גליצין, 0.1% Tween, ו-0.5% טריטון ב-PBS) בדילול של 1/400 (2.3 מיקרוגרם/מ"ל) ב-4 °C למשך 12-16 שעות.
  5. ביום הבא, הסר את הנוגדן הראשי והוסף 1 מ"ל PBST2 לצינור. שטוף את הטישו לפחות שלוש פעמים, שעה כל אחת על שייקר מסתובב.
    הערה: זה יכול להיות נקודת עצירה; הרקמות יכולות להישאר ב-PBST2 עד שלושה ימים לאחר דגירה ראשונית של נוגדנים.
  6. דילל את הנוגדן המשני AF488 ב-1/500 דילול (1.5 מיקרוגרם/מ"ל) ב-PBST2. דגרו את הרקמה עם לפחות 100 מיקרוליטר של הנוגדן המשני המדולל בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 12-16 שעות.
  7. ביום הבא, שטוף את הרקמות היטב ב-PBST2 לפחות שלוש פעמים, שעה אחת כל אחת על שייקר מסתובב. מומלץ לשטוף את הרקמות עד 8 שעות כדי להפחית את הרקע. תוודא לכסות את הצינורות בנייר כסף כדי להגן עליהם מאור מהשלב הזה קדימה.
  8. הסר PBST2 והוסף 100 מיקרוליטר DAPI בדילול של 1/1000 (1 מיקרוגרם/מ"ל) ב-PBS לצינור. דגרו את הרקמות ב-DAPI למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
  9. שטפי את השחלות ב-PBST2 פעם אחת למשך 30 דקות והתקינו אותן על סלייד מיקרוסקופי עם מרווח הדמיה. העבר את השחלות למרכז המרווח באמצעות פיפטה של 1 מ"ל והסר עודף PBST2. הוסיפו כ-5 מיקרוליטר ממדיום ההרכבה של האנטי-פייד והניחו סלייד מיקרוסקופ על גבי המרווח. אטום את קצוות המרווח עם לק ציפורניים שקוף לאחסון ארוך טווח.
    הערה: לפני הדמיית השקופיות, ודאי שהלק יבש לחלוטין ושאין מדיום התקנה על החלק החיצוני של הכיסוי. חומרים אלו עלולים לפגוע במטרות המיקרוסקופ. בנוסף, הימנעו משימוש במדיות הרכבה מיותרות, שכן השחלות צריכות להישאר במקום במהלך ההדמיה.
  10. תדמיינו את השחלות עם מיקרוסקופ קונפוקלי בהגדלה של פי 10 וגודל Z של 10 מיקרון. התאימו הגדרות והשתמשו בפיצוי Z (רווח עוררות) כדי לצלם את כל השחלה. ניתן לעשות זאת באמצעות השלבים הבאים:
    1. כוונן את עוצמת העירור והגבר הגלאי על ידי ניטור רוויית האות באמצעות ההיסטוגרמה, שכן היא עשויה להשתנות בין רקמות. התחל בעוצמת לייזר נמוכה והגדל בהדרגה לפי הצורך.
    2. להדמיית אזורים עמוקים יותר, אפשר פיצוי Z לגלאי ההגבר, שכן עוצמת האות עשויה לרדת עם העומק. השתמש בממוצע פריים של לפחות 10 ואפשר סריקת X דו-כיוונית במהירות של 600 הרץ.
      הערה: בהגדרות אלו, ההדמיה לא צריכה לעלות על 10 דקות לשחלה (~200 מיקרון). צביעת אימונופלואורסצנטי מלאה של שחלות עם אנטי-DDX4 היא בדרך כלל עמידה ולעיתים נדירות פוטו-אקלוצ'ים.

4. כימות זקיקים

  1. כדי לכמת זקיקים בכל שחלה, פתחו את התמונות באמצעות תוכנת ImageJ. בעת הפתיחה, ודא שמצב הצבע נבחר כצבעוני ושהערוצים המפוצלים מסומנים בתיבה שמתחת לחלונות נפרדים. בחרו את התמונה המעניינת, ואז השתמשו בכלי התמונה/טרנספורמציה/סיבוב כדי למקם את השחלה בצורה סימטרית בתמונה.
    הערה: התמונות שנרכשו על ידי קונפוקל ניתנות לצפייה וניתוח בתלת-ממד באמצעות תוכנת Imaris (איור 3A,B) או תוכנת ImageJ16.
  2. השתמשו בכלי ניתוח/כלים/רשת כדי לחלק את השחלה לרשתות (איור 3C,C').
  3. השתמשו בכלי התוספים/ניתוח/מונה התאים כדי לסמן את כל הרשתות שמכסות את השחלה (איור 3D, D', רשתות מסומנות ב-4). מתוך רשתות אלו, יש לסמן כל רשת שנייה בכל שורה לכימות זקיקים (איור 3E,E', רשתות מסומנות ב-8). רשתות בקצה השחלה עם פחות מ-10 ביציות אינן כלולות לכימות זקיקים.
    הערה: אתחל את מונה התאים ובחר את סוגי המונה שאתה רואה כקלים לקריאה.
  4. ניתן לזהות ביציות על ידי נוכחות מבנה טבעתי חיובי ל-DDX4 שמקיף גרעין חיובי ל-DAPI. זקיקים פרימורדיאליים מכילים ביציות בגודל של כ-20 מיקרון, מוקפים בתאים סומטיים קשקשיים. זקיקים מתפתחים מכילים ביציות בקוטר הגדול מ-25 מיקרון ומוקפים בשכבה אחת או יותר של תאי גרנולוזה קובייתיים (איור משלים 1).
  5. ספירו את הזקיקים הראשוניים בכל רשת מסומנת (כפי שניתן לראות באיור 3E,E' עם סוג 8). עברו על הזקיקים באמצעות מקטעים/ערימות אופטיות ברשת, וסמנו אותם באמצעות כלי מונה התאים, בהתאמה. ודאו שלא סופרים פעמיים זקיקים פרימורדיאליים בשני מקטעים/ערימות אופטיות רצופות. ספירת זקיקים מתפתחים בכל הרשתות המסומנות במונה סוג 4.
    הערה: השתמשו באפשרות הזום כדי לעזור להמחיש ולספור את הביציות דרך הערימות.
  6. חשב את מספר הזקיקים הראשוניים בכל השחלה (nf) על ידי הכפלת מספר הזקיקים הראשונים הממוצע בכל רשת (nfgrid) במספר הרשתות המקיפות את השחלה (ngrids). NF = רשת NF × NgridS.
    הערה: בוצעו ניתוחים סטטיסטיים, וגרפים נוצרו באמצעות תוכנת Prism 10.2.0 (GraphPad Software, גרסה 10, Inc., CA). ההבדלים בין הקבוצות הוערכו באמצעות ניתוח חד-כיווני של שונות (ANOVA) ואחריו מבחן ההשוואה המרובה של טוקי. המובהקות הסטטיסטית נחשבה ב-p < 0.05. הנתונים מוצגים כממוצע ± שגיאת תקן (SE).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

במאמר זה אנו מדגים את שיטות תרבית השחלות התינוקות, צביעת נוגדנים שלמה, הדמיה קונפוקלית וכימות זקיקים כדי להעריך האם מספר ומיקום השחלות בהחדרה במהלך התרבית משפיעים על תוצאת הניסוי, ובפרט על ספירת הזקיקים בשחלה. תרבתנו שחלות עם ההגדרות הבאות: שחלה אחת, שתיים או שלוש לכל אינסרט לתרבית מיוצבת, ושלוש שחלות לכל אינסרט לתרבות צפה. השחלות גודלו בשני מצבים: קבוצת ביקורת או קבוצת טיפול תרופתי עם טיפול Dox של 24 שעות ב-0.1 מיקרוגרם/מ"ל. לאחר 24 שעות של תרבית, השחלות מקבוצת הביקורת והקבוצות שטופלו בדוקס הועברו למדיה חדשה של תרבית לע...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

במחקר זה הדגמנו שיטות לתרבות שחלות עכבר יילודה ולכימות זקיק השחלה השלם. גישת התרביות יכולה לשמר זקיקים פרימורדיאליים ומתפתחים מוקדמים במבחנה. שיטת הכימות של זקיקים בהרכב מלא דורשת עיבוד מינימלי של רקמות, מה שחוסך זמן ושומר על שלמות הרקמה ומבטיח כימות מדויק של הזקיקים.

מספר הזקיקים הראשוניים שנצפו בקבוצת הביקורת מצביע על כך שלמרות שיש ירידה קלה בהשוואה לספירות הזקיקים המדווחות בספרות בשחלות ביום 10 לאחר הלידה (כ-4,300 זקיקים לשחלה), התוצאות שלנו עדיין דומות

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

אין ניגודי עניינים שיש לחשוף.

תודות

המחקר שדווח בפרסום זה נתמך על ידי המכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית של המכון הלאומי לבריאות תחת פרס מספר R35GM158131. EADM נתמכה על ידי קרן ללור. המחברים מודים בהכרת תודה ל-Advanced Light Microscopy Core של אוניברסיטת מיזורי על תמיכתם וסיועו בעבודה זו

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
לוחות תרבית תאים עם 24 בארותפישר סיינטיפיק 09-761-146 
אלקסה פלואר 488 נגד ארנב לחמורמעבדות מחקר חיסוני ג'קסון711-546-152
אנטי-אנטי (100X)גיבקו15240-062
אלבומין סרום בקרסיגמא-אלדריץ'A1470-25G
עכבר CD-1 IGSמעבדות צ'ארלס ריבר 022עכברים
הוספות לתרבות תאיםמיליפורPICM01250
מזרק אינסולין Comfort Point עם מחט 1 סמ"ק 28G x 1/2אקסל26027
DAPIתרמו-סיינטיפיק62248
MDX4 Rabbit mAbאבקאםab13840
DMEM/F12 (1:1) (1X)גיבקו11320-033
דוקסורוביצין הידרוכלוריד  סיגמא-אלדריץ'PHR1789
DPBS (1X)גיבקו14190-144
סרום בקר עובריסיגמא-אלדריץ'F0926-500ML
Fiji-ImageJNIH, ארה"ב (https://imagej.net/ij/)ImageJ 1.52p
מיקסרי אגוז של פישרברנד - מהירות משתנהפישר סיינטיפיק 88-861-043שייקר
הורמון מגרה זקיקיםסיגמא-אלדריץ'F4021-10UG
פורמה סטרי-מחזור i160תרמו סיינטיפיק וטרייד;i160חממת CO2
גליציןפישר סיינטיפיק BP381-500
אימאריס אוקספורד אינסטרומנטס (https://imaris.oxinst.com/)אימאריס 10.2
לייקה TCS SP8לייקה מיקרוסיסטמסSN 8100001409קונפוקלי
סרום חמור רגילמעבדות מחקר חיסוני ג'קסון017-000-121
אולימפוס SZ61מיקרוסקופים של אולימפוסSZ61סטריאוסקופ
Paraformaldehyde פישר סיינטיפיק 15714
מרווח הדמיה SecureSealגרייס ביו-לאבס654002
טריטון X-100סיגמא-אלדריץ'X100-500ML
גיל 20סיגמא-אלדריץ'P1379-500ML
מדיום התקנת אנטיפייד VECTASHIELDמעבדות וקטורH-1000

מקורות

  1. Pepling, M. E. From primordial germ cell to primordial follicle: Mammalian female germ cell development. Genesis. 44 (12), 622-632 (2006).
  2. Ikami, K., Nuzhat, N., Lei, L. Organelle transport during mouse oocyte differentiation in germline cysts. Curr Opin Cell Biol. 44, 14-19 (2017).
  3. Pepling, M. E. Follicular assembly: Mechanisms of action. Reproduction. 143 (2), 139-149 (2012).
  4. Lintern-Moore, S., Moore, G. P. The initiation of follicle and oocyte growth in the mouse ovary. Biol Reprod. 20 (4), 773-778 (1979).
  5. Picton, H. M. Activation of follicle development: The primordial follicle. Theriogenology. 55 (6), 1193-1210 (2001).
  6. Smitz, J. E., Cortvrindt, R. G. The earliest stages of folliculogenesis in vitro. Reproduction. 123 (2), 185-202 (2002).
  7. Jagarlamudi, K., Rajkovic, A. Oogenesis: Transcriptional regulators and mouse models. Mol Cell Endocrinol. 356 (1-2), 31-39 (2012).
  8. Binelli, M., Murphy, B. D. Coordinated regulation of follicle development by germ and somatic cells. Reprod Fertil Dev. 22 (1), 1-12 (2010).
  9. Xu, M., Kreeger, P. K., Shea, L. D., Woodruff, T. K. Tissue-engineered follicles produce live, fertile offspring. Tissue Eng. 12 (10), 2739-2746 (2006).
  10. Bristol-Gould, S. K., et al. Postnatal regulation of germ cells by activin: The establishment of the initial follicle pool. Dev Biol. 298 (1), 132-148 (2006).
  11. Pedersen, T., Peters, H. Proposal for a classification of oocytes and follicles in the mouse ovary. J Reprod Fertil. 17 (3), 555-557 (1968).
  12. Eppig, J. J., O'Brien, M. J. Development in vitro of mouse oocytes from primordial follicles. Biol Reprod. 54 (1), 197-207 (1996).
  13. Levy, E. W., Leite, I., Joyce, B. W., Shvartsman, S. Y., Posfai, E. A tug-of-war between germ cell motility and intercellular bridges controls germline cyst formation in mice. Curr Biol. 34 (24), 5728-5738 (2024).
  14. Nagamatsu, G., Shimamoto, S., Hamazaki, N., Nishimura, Y., Hayashi, K. Mechanical stress accompanied with nuclear rotation is involved in the dormant state of mouse oocytes. Sci Adv. 5 (6), eaav9960(2019).
  15. Stefansdottir, A., Fowler, P. A., Powles-Glover, N., Anderson, R. A., Spears, N. Use of ovary culture techniques in reproductive toxicology. Reprod Toxicol. 49, 117-135 (2014).
  16. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  17. Bristol-Gould, S. K., et al. Fate of the initial follicle pool: Empirical and mathematical evidence supporting its sufficiency for adult fertility. Dev Biol. 298 (1), 149-154 (2006).
  18. Kawamura, K., et al. Hippo signaling disruption and Akt stimulation of ovarian follicles for infertility treatment. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (43), 17474-17479 (2013).
  19. Myers, M., Britt, K. L., Wreford, N. G., Ebling, F. J., Kerr, J. B. Methods for quantifying follicular numbers within the mouse ovary. Reproduction. 127 (5), 569-580 (2004).
  20. Sonigo, C., et al. High-throughput ovarian follicle counting by an innovative deep learning approach. Sci Rep. 8 (1), 13499(2018).
  21. Sarma, U. C., Winship, A. L., Hutt, K. J. Comparison of methods for quantifying primordial follicles in the mouse ovary. J Ovarian Res. 13 (1), 121(2020).
  22. Murphy, K., Carvajal, L., Medico, L., Pepling, M. Expression of Stat3 in germ cells of developing and adult mouse ovaries and testes. Gene Expr Patterns. 5 (4), 475-482 (2005).
  23. Luan, Y., Yu, S. Y., Abazarikia, A., Dong, R., Kim, S. Y. TAp63 determines the fate of oocytes against DNA damage. Sci Adv. 8 (51), eade1846(2022).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

תרבית שחלה ניאונטליתכימות של דגימה שלמה (Whole-Mount)דירוג שלבי התפתחות זקיקיםסמן לאוציט DDX4תרבית על תבנית ממברנהפיזיולוגיה של השחלההפעלת זקיקים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.