תהליך עבודה מודולרי לניתוח כמותי, מבני ופונקציונלי של ביופילמים של לפטוספירה

Summary

פרוטוקול זה מספק תהליך עבודה מודולרי מסוג BSL-2 המשלב בדיקות ביומסה קריסטל-סגולה, קינטיקת פאזה-ניגודיות טיים-לאפס, מיפוי קונפוקלי תלת-ממדי/מטריצות, מבנה SEM אולטרה-סטרוקטיבי, ומודול זיהום אוגר ב-vivo לטיפוח, כמות, אפיון וחקר תפקיד פונקציונלי של ביופילם לפטוספירה , ומאפשר הערכה סטנדרטית של מוטנטים והתערבויות אנטי-ביופילם במעבדות.

Abstract

כאן, אנו מציגים חבילת פרוטוקולים משולבת לגידול, ניטור כמותי, אפיון מבני ותפקודי של ביופילמים מסוג Leptospira לאורך זמן. תהליך עבודה זה משלב בדיקות מיקרוטיטר קריסטל סגול למדידת ביומסה ביופילמית בנקודות זמן מרובות, עם גישת פרקציה בזמן שמבדילה בין אוכלוסיות חיידקים מחוברות (ביופילם) ולא מחוברות (בפאזה נוזלית), דימות פאזה-ניטרסט טיים-לפס לתצפית קינטית לא הרסנית, מיקרוסקופ לייזר קונפוקלי ליצירת שחזורים תלת-ממדיים מלאים עם קריאות מטריצה-פרוב, ומיקרוסקופיית אלקטרונים סורקת נתמכת ממברנה לניתוח אולטרה-מבוני. במקביל, אנו מפרטים הליך סטנדרטי לקטיף אגרגטים ביופילמים שלמים והכנתם להזרקה תוך-פריטוניאלית למודל האוגר הסורי הזהוב הרגיש, המאפשר הערכה ישירה של אלימות הקשורה לביופילם בחיות לצד בקרות פלנקטוניות תואמות.

מותאם לזן הפתוגני Leptospira interrogans Manilae L495, כל מודול ניתן להעברה בקלות למינים אחרים של לפטוספירה ולספריות מוטנטים כדי להשוות את יכולת יצירת הביופילם. יחד, מודולים מתואמים אלו מספקים בסיס איתן לסינון אסטרטגיות אנטי-ביופילם, חקירת גורמים גנטיים והבהרת תרומת הביופילמים להתמדה ולפתוגנזה של לפטוספירה .

Introduction

ביופילמים הם קהילות מיקרוביאליות מובנות שבהן תאים מוטמעים במטריצה של חומר פולימרי חוץ-תאי (EPS) המופרש מעצמו, המורכבת מפוליסכרידים, חלבונים, חומצות גרעין וליפידים¹. מטריצה זו מספקת יציבות מכנית, מתווכת הידבקות למשטחים ומשפרת את הישרדות המיקרובים על ידי הענקת סבילות ללחצים סביבתיים כגון ייבוש, לחץ חמצוני ואנטי-מיקרוביאליים ^2,3. בחיידקים פתוגניים, ביופילמים מסייעים בהתמדה, התחמקות חיסונית וזיהום כרוני ^4,5.

בהשוואה לתאי פלנקטוניים, שהם צפים חופשיים ובעלי מטבוליזם הומוגני יותר, תאים הקשורים לביופילם מציגים ביטוי גנים משתנים, קצב גדילה ופעילות מטבולית⁶. הבדלים אלו מעניקים סבילות מוגברת לאתגרים סביבתיים, אנטיביוטיקה והגנות מאכסן, תוך מתן התנהגויות מתואמות כגון חישת קוורום, שמירת חומרים מזינים וארגון מרחבי ^7,8.

היווצרות ביופילם אופיינה באופן נרחב באורגניזמים מודליים כמו Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus ו-Vibrio cholerae, אשר עיצבו יחד את הבנתנו את הבסיסים הגנטיים, המבניים והפיזיולוגיים של אורח החיים בביופילם. מחקרים על פסאודומונס גילו כי אקסופופוליסכרידים וחישה של קוורום פועלים יחד לעיצוב ארכיטקטורות ביופילם תלת-ממדיות מורכבות ^9,10. המחקר על סטפילוקוקוס הדגיש את תפקידי חלבוני פני השטח ו-DNA חוץ-תאי בשיפור האחידות של הביופילם והסבילות לאנטיביוטיקה^11,12. מחקרים על מיני ויבריו הדגישו עוד יותר את המגוון המרשים של מורפולוגיות ביופילם ואת חשיבותם האקולוגית בסביבות ימיות¹³. ביחד, מערכות אלו סיפקו מסגרת מושגית ומתודולוגית איתנה למחקר ביופילם, המחוזקת על ידי פרוטוקולים סטנדרטיים¹⁴ והערכות ביקורתיות של טכניקות^{קיימות 15,16}, אשר יחד מדגישות את הצורך בגישות מתואמות בחקירת היווצרות ביופילם בחיידקים פחות נחקרים כמו לפטוספירה.

חברי סוג הספירוכטה Leptospira, הגורמים ללפטוספירוזיס, נחשבו זמן רב בעיקר לפלנקטוניים. מחקרים עדכניים הראו בניסוי היווצרות ביופילם איתנה במספר מינים¹⁷. בעוד שמחקרים מסוימים מציעים היווצרות ביופילם בהקשרים סביבתיים^{18 ו-19} הקשורים למארח, אחרים הוכיחו בניסויים את יכולת הלפטוספירים ליצור ביופילם בצינורות הכליה של Rattus norvegicus²⁰ ואת הזגוגית של סוסים²¹, וכן זיהוי מיני לפטוספירלים בתוך ביופילמים סביבתיים^22,23. לכן, פענוח התנאים והמנגנונים השולטים בביופילמים של לפטוספירה הוא קריטי להבנת ההעברה הסביבתית, התמדה במאגר ופתוגנזה של מחלות^24,25.

בדיקות ביופילם לפטוספירה קיימות הן מפורקות, החל מתצפיות מיקרוסקופיות איכותניות^17,26 ועד צביעות סגולות או קריסטליות בנקודת קצה^27,28. בעוד שמחקרים אלו סיפקו תובנות חשובות על היווצרות ביופילם, לעיתים קרובות הם חסרים הן את הרזולוציה הקינטית הנדרשת למעקב אחר הבשלה ופיזור הביופילם בזמן אמת וגם את ההקשר האולטרה-מבני שמספק מיקרוסקופיה קונפוקלית או אלקטרונית. ניטור רציף וניתוח מבני תלת-ממדי נחשבים חיוניים ללכוד את האופי הדינמי של היווצרות ופיזור הביופילם^14,15. מגבלות אלו פוגעות בהשוואה בין מחקרים ומגבילים את ההערכה השיטתית של גורמים או התערבויות המשפיעים על היווצרות ופיזור הביופילם, מה שמדגיש את הצורך בזרימת עבודה סטנדרטית ורב-קריאה שתופסת הן את הדינמיקה המבנית והן את הפונקציונליות של לפטוספירוביופילם באופן שכפול ומקיף.

כדי להתמודד עם פערים אלו, פיתחנו תהליך עבודה משולב ומודולר שמאחד שישה קריאות משלימות שנלקחו מאותה סדרת תרבות. ראשית, בדיקת מיקרוטיטר CV בעלת תפוקה גבוהה מכמת את הביומסה המחוברת במספר נקודות זמן. שנית, מבחן פרקציה בפרק זמן בלוחות 96 בארות מחלק אוכלוסיות שלמות, נוזליות (לא מחוברות או מופרדות חלקית) ומחוברות (ביופילם) על ידי OD₄₀₅ כדי לעקוב אחר התפתחותן במהלך היווצרות ופיזור. המונח פאזה נוזלית משמש כאן לכלול גם תאים דמויי פלנקטוניים וגם תאים מנותקים, תוך הכרה ברצף הדינמי בין פנוטיפים חיים חופשיים לפנוטיפים הקשורים למשטחים ^29,30. שלישית, הדמיית פאזה-ניגודיות בזמן מספקת קינטיקה לא הרסנית של הידבקות, תנועתיות מצטברת והתלכדות. רביעית, מיקרוסקופיה סורקת לייזר קונפוקלית (CLSM) מניבה שחזורים תלת-ממדיים מלאים עם קריאות חיים/מתות וקריאות מטריצה-גשושית, המאפשרת חיותיות תלויה בעומק ומיפוי מטריצות. חמישית, מיקרוסקופיה אלקטרונית סורקת נתמכת בממברנה או כיסוי (SEM) מפרטת את הארכיטקטורה החוץ-תאית והקוטביות הבסיסית-אפיקלית ברזולוציה גבוהה. בנוסף, שולב מודול in vivo להערכת אלימות באמצעות הזרקה תוך-פריטונלית של אגרגטים ביופילמים למודל האוגר הסורי הזהוב הרגיש, מודל רגיש ומבוסס היטב ללפטוספירוזיס 31,32,33. גישה זו מקשרת בין פנוטיפים ביופילמים לפוטנציאל פתוגני, ומספקת הקשר פונקציונלי שמשלים ניתוחים במבחנה.

בהשוואה לגישות חד-מודליות, פלטפורמה זו מציעה מספר יתרונות: (i) קריאות כמותיות מסונכרנות (CV ו-OD) ומבניות (CLSM/SEM); (ii) ניטור קינטי לא הרסני של הידבקות מוקדמת, גדילה, הבשלה ופיזור; (iii) כדאיות תלת-ממדית ואפיון מטריציוני באמצעות גשושים ממוקדים; (iv) הדמיה אולטרה-מבנית של ארכיטקטורת מטריצה חוץ-תאית ; ו-(ה) הערכה תפקודית ישירה של אלימות הקשורה לביופילם לעומת פלנקטוניה במודל אוגר רגיש, כל אחד מהם ניתן להשגה עם תשתית BSL-2 סטנדרטית. באמצעות פורמטים מרובי בארות ותת-זכוכית או פוליקרבונט נשלפים, זרימת העבודה תומכת בשכפול מסכים של משתנים סביבתיים, תרכובות אנטימיקרוביאליות או ספריות מוטנטיות, תוך שמירה על סטריליות, קצב העברה ואימות צולב בין מודולים.

מעבדות המתמקדות באקולוגיה, התמדה, אינטראקציות בין מארח-פתוגן או גילוי אנטי-ביופילם יכולות לאמץ מודולים בודדים או את כל הצינור. המשאבים הנדרשים מוגבלים לקורא לוחות, מיקרוסקופ הפוך עם שליטה סביבתית לטיימ-לפס, גישה למיקרוסקופ קונפוקלי ומתקן SEM, ומתקנים סטנדרטיים לבעלי חיים למודל האוגר, המאפשרים אימוץ רחב והשוואות שחזוריות בין מחקרים.

Protocol

הצהרת אתיקה:
מחקר זה אושר על ידי ועדת טיפול ושימוש בבעלי חיים של מכון פסטר של קלדוניה החדשה ובוצע בהתאם להנחיות שנקבעו על ידי ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים של מכון פסטר בפריז, וההמלצה האירופית 2007/526/EC. מספר רישום לניסוי מחקר בעלי חיים: IPNC-2018-ARE-001

הערה: כל ההליכים הכוללים תרביות לפטוספירה חיות חייבים להתבצע במעבדה ברמת בטיחות ביולוגית ברמה 2 (BSL-2), בהתאם להנחיות הבטיחות הביולוגית המוסדית. כל המניפולציות בתרבית חייבות להתבצע תחת ארון בטיחות ביולוגי כדי להבטיח את בטיחות המפעיל ולמנוע זיהום סביבתי.

זן Leptospira interrogans serovar Manilae L495 ששימש במחקר זה הושג במקור מאוסף Institut Pasteur (פריז, צרפת) ומתוחזק במכון הפסטר של קלדוניה החדשה. כדי לשמור על אלימות, הזן מבודד מחדש מעת לעת מאוגרים נגועים. בכל הניסויים במבחנה , התרביות לא נשמרו מעבר לשש תת-תרביות לאחר ההתאוששות מהמארח החייתי.

כל הליכי בעלי החיים חייבים להתבצע בהתאם להנחיות המוסדיות ומאושרים על ידי ועדות הטיפול והשימוש בבעלי חיים המתאימות. הניסויים צריכים לעמוד בתקנות האירופיות לרווחת בעלי חיים (הנחיית האיחוד האירופי 2010/63) ובהמלצות שירות הבריאות הציבורי, כדי להבטיח שהשימוש בבעלי חיים מוצדק ומוסדר מבחינה אתית.

1. הכנת החידון החיידקי

1. גדלו תאי לפטוספירה בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס ב-EMJH מדיום³⁴ בתנאים אירוביים וללא רעידות בצינורות זכוכית שטוחים עם מכסה בורג עד שהתרבית מגיעה לשלב האמצע של הלוג. בתנאים אלו, זן L . interrogans serovar Manilae L495, זן בעל מעבר נמוך שנשמר באופן קבוע בחיים דרך אוגרים, בדרך כלל מגיע לצפיפות התאים המתאימה בתוך 3-5 ימים. ודאו שהתרביות מגיעות ל-O.D. של 0.2-0.4 ב-405 ננומטר (2 עד 5 x 10⁸ תאים/מ"ל) לפני הדילול במדיום EMJH טרי, ואמת את התנועתיות והיעדר ההתלכדות באמצעות מיקרוסקופיה בשדה כהה בהגדלה של פי 20.
   הערה: ל-EMJH יש ספיגה פנימית. רוקן את הספקטרופוטומטר עם EMJH סטרילי והחסר ערך זה מכל הקריאות. ניתן לתקן את החיסון על ידי מדידת צפיפות אופטית או על ידי ספירת תאים ישירה באמצעות תא פטרוף-האוסר. דילול של 1:100 של תרבית בינו-לוגריתם מאומתת מניב בדרך כלל OD₄₀₅ = 0.02 (≈ 1 x 10⁶ תאים למ"ל). ערבב בעדינות באמצעות היפוך; אל תעשו מערבולת.
2. בדוק אליקווט של 10 מיקרוליטר תחת מיקרוסקופיית שדה אפל בהגדלה של פי 20. ודא ש-90% מהתאים ≥ ניידים מאוד ושאין גושים נראים לעין. מדלל את תרבית האמצע המאומת 1:100 ב-EMJH טרי כדי לקבל OD₄₀₅ = 0.02 (≈ 1 x 10⁶ תאים למ"ל). ערבב בעדינות באמצעות היפוך; אל תעשו מערבולת.
   הערה: אינקולום אחד עובד תומך בכל הבדיקות במורד הזרם המפורטות בפרוטוקול זה (איור 1). הכינו 36 מ"ל לזריעה של צלחת עם 24 בארות (1 מ"ל לבאר) או 20 מ"ל לזריעה של לוח עם 96 בארות (200 מיקרוליטר/באר). כוון את הווליום כך שיתאים למספר הלוחות הנדרשים.

איור 1. זרימת עבודה עולמית לניתוח ביופילם לפטוספירה . תרבויות לפטוספירה שגדלו באופן אקספוננציאלי נבחנות תחילה לצמיחה ומסטנדרטיות לפי צפיפות אופטית. התרביות מחולקות אז לצלחות זכוכית או ממברנה, מיקרוספינות מיקרוסקופיות, או לוחות עם 96 בארות. תהליך העבודה כולל שבעה מודולים: (1) הכנת אינוקולום; (2) צביעת סגול קריסטלי לכימות ביומסה; (3) הדמיה אולטרסטרוקטורלית באמצעות SEM; (4) ניטור ביופילם דינמי באמצעות מיקרוסקופיית פאזה-ניגודיות בזמן-לפס; (5) ויזואליזציה תלת-ממדית על ידי CLSM עם צביעה חיה/מתה; (6) כימות ברזולוציה בזמן של שברים מחוברים ולא מחוברים במהלך יצירת ביופילם באמצעות צפיפות אופטית; ו-(7) חקירת תפקיד הביופילם הפונקציונלי בזמן זיהום בחמוסים סוריים. גישה משולבת זו מאפשרת ניתוח רב-מודלי של התפתחות, מבנה ופתוגניות ביופילם. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

2. Crystal Violet - כימות מבוסס של ביופילמים על כיסוי או ממברנות

1. בתוך מכסה הבטיחות הביולוגית BSL2, יש להשתמש במלקחיים סטריליים כדי להניח כיסוי זכוכית סטרילי בקוטר 12 מ"מ או ממברנת פוליקרבונט הידרופילית סטרילית בקוטר 0.1 מיקרון, שטוחות בתחתית כל באר בלוח סטרילי של 24 בארות עם מכסה. השרה מראש של הממברנה/הזכוכית למשך שעתיים בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס עם 1 מ"ל EMJH סטרילי.
   הערה: למרות שזה לא הכרחי, השרייה מוקדמת של הסובסטרט ב-EMJH משפרת את ההרטבה ומגבירה מעט את ההידבקות החיידקית.
2. הסר את תמיסת ההשרייה והוסף 1.5 מ"ל מהמתנשא החיידקי המדולל (OD₄₀₅ = 0.02 ≈ 1 x^{10 6} תאים/מ"ל) לכל באר. ודא שהכיסוי או הממברנה נשארים ממוקמים היטב בתחתית.
3. דגרו את הצלחת בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס בתנאים סטטיים באטמוספירה לחה, תוך שמירה על ידי הנחת מגש מלא מים בתוך האינקובטור כדי למנוע אידוי של מדיום הגידול. לזנים שגדלים לאט, מומלץ דגירה של 3 שבועות כדי לאפשר יצירת ביופילם בוגר ודביק.
4. בנקודת הזמן הרצויה, הסר בזהירות כמה שיותר מדיום תרבית מכל באר מבלי להפריע לביופילם. שטפו בעדינות כל באר ב-1 מ"ל של מי מלח סטריליים עם בופר פוספט (PBS) להסרת תאים לא דביקים שנותרו, תוך שמירה על הכיסוי שטוח על תחתית הבאר כדי למנוע ניתוק תאי ביופילם שבריריים. בתנאים אלו, גידול הביופילם מתרחש בעיקר על פני השטח העליונים של הכיסוי, עם צמיחה מינימלית בתחתית, ולכן שטיפה ללא הרמה מספיקה להעשיר תאים מחוברים פני השטח לניתוחים במורד הזרם.
   הערה: ביופילמים רגישים מאוד בשלב זה ויכולים להישאף בטעות בקלות. יש לבצע פיפטינג לאט ובדיוק לאורך קיר הבאר כדי למנוע הפרעה לביופילם.
5. תקן דגימות ביופילם על ידי הוספת 1 מ"ל של 4% פאראפורמלדהיד (PFA) ב-PBS בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. הסר את המקבע ושטוף בזהירות פעמיים עם 1 מ"ל PBS.
   הערה: לצורך קיבוע הוכנה תמיסת פורמלדהיד 4% טרייה (מלאי 16% ללא מתנול מדולל ביחס 1:4 ל-PBS) והושלכה לאחר השימוש, שכן פולימריזציה לפרפורמלדהיד מפחיתה את פעילות הקישור החוצה.
6. הוסיפו 1 מ"ל של תמיסת Crystal Violet (CV) של 0.1% (עם וולט) לכל באר ודגרו בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות, כדי להבטיח שהממברנה או הכיסוי מכוסים במלואם.
7. זרוק את הצבע ושוטף פעמיים עם 1 מ"ל PBS.
   הערה: סיגלית קריסטלית ופארפורמלדהיד (PFA) רעילים ועלולים לגרות את העור והעיניים. תמיד ללבוש כפפות ולטפל בשני הכימיקלים בזהירות, עדיף עם מכסה אדים. השלכת פסולת במיכלים ייעודיים לצבע מסוכנ או פסולת כימית בהתאם להנחיות הבטיחות המוסדיות.
8. הטה את הפלטה ורוקן את הנוזל שנותר. ייבשו את הבארות בטמפרטורת החדר באוויר עד שהמצע נראה יבש לחלוטין (≥ 4 שעות, רצוי ללילה).
   הערה: בשלב זה, מבנים דמויי נקודות או רשתות עשויים להיות נראים על פני שטח הכיסוי או הממברנה (איור 2A).
9. הוסף 500 מיקרוליטר בופר שחרור (50% אתנול, 50% חומצה אצטית קרחונית, נפח/נפח)) לכל באר. דגר את הצלחת ל-15 דקות. פיפט למעלה ולמטה כדי להמיס לגמרי את הסגול הקריסטלי הקשור לביופילם.
10. העבר 200 מיקרוליטר מכל דגימה למיקרופלטת 96 בארות שקופה אופטית ומדד את הספיגה ב-570 ננומטר. הפחת ריק שמכיל רק תת-קרקע שהוכן על ידי עיבוד כיסוי או ממברנה לא מחוסנת באמצעות קיבוע, צביעת CV, שטיפות והסרה כדי להסיר את הקישור הפנימי/הרקע. רשום את סטיית התקן הממוצעת ± לפחות לשלושה שכפולים טכניים. מדלל דגימות עם בופר שחרור אם הספיגה חורגת מהטווח הליניארי של הספקטרופוטומטר.

3. הדמיית ביופילם באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים סורקת (SEM)

1. בתוך מכסה הבטיחות הביולוגית BSL2, יש להשתמש במלקחיים סטריליים כדי להניח כיסוי זכוכית סטרילי בקוטר 12 מ"מ או ממברנת פוליקרבונט הידרופילית סטרילית בקוטר 0.1 מיקרון, שטוחות בתחתית כל באר בלוח סטרילי של 24 בארות עם מכסה. השרה מראש של הממברנה/הזכוכית למשך שעתיים בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס עם 1 מ"ל EMJH סטרילי.
2. הסר את תמיסת ההשרייה והוסף 1.5 מ"ל מהמתנשא החיידקי המדולל (OD₄₀₅ = 0.02 ≈ 1 x^{10 6} תאים/מ"ל) לכל באר. ודא שהכיסוי או הממברנה נשארים ממוקמים היטב בתחתית.
3. דגרו את הפלטה בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס בתנאים סטטיים באינקובטור לבקרת לחות כדי למנוע אידוי של מדיום הגידול. לזנים שגדלים לאט, מומלץ דגירה של 3 שבועות כדי לאפשר יצירת ביופילם בוגר ודבק
4. בנקודת הזמן הרצויה, הסר בזהירות כמה שיותר מדיום תרבית מכל באר מבלי להפריע לביופילם.
5. לאחר מכן שטפו בעדינות כל באר ב-1 מ"ל של PBS סטרילי כדי להסיר שאריות תאים לא דביקו, תוך שמירה על הכיסוי שטוח על תחתית הבאר כדי למנוע ניתוק תאי ביופילם שבירים. בתנאים אלו, גידול הביופילם מתרחש בעיקר על פני השטח העליונים של הכיסוי, עם צמיחה מינימלית בתחתית, ולכן שטיפה ללא הרמה מספיקה להעשיר תאים מחוברים פני השטח לניתוחים במורד הזרם.
   הערה: ביופילמים רגישים מאוד בשלב זה ויכולים להישאף בטעות בקלות. יש לבצע פיפטינג לאט ובדיוק לאורך קיר הבאר כדי למנוע הפרעה לביופילם.
6. הוסיפו תמיסה של 4% פאראפורמלדהיד (PFA) ו-1% גלוטראלדהיד בבופר סודיום קקודילט (0.2 מ', pH 7.4) ישירות אל הבאר כדי לקבע את הביופילם.
7. דגרו 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, ואז הסרו את הקיבוע ושוטפים פעמיים את הכיסוי או הממברנה עם PBS. גישה זו שומרת על הביופילם המחובר לפני השטח תוך מזעור ההיפרדות, שכן רוב צמיחת הביופילם מתרחשת על פני השטח העליון של הכיסוי בתנאים שלנו.
   הערה: לצורך קיבוע הוכן תמיסה של 4% פורמלדהיד ו-1% גלוטראלדהיד (16% מלאי ללא מתנול מדולל ביחס 1:4 בבופר קקודילט נתרן) והושלכה לאחר השימוש, שכן פולימריזציה לפארפורמלדהיד מפחיתה את פעילות הקישור החוצה.
8. טבלו את המצע בטטרוקסיד אוסמיום (OsO₄) של 1% מדולל ב-PBS למשך שעה כדי לשפר את הניגודיות ב-SEM. שטוף פעמיים עם PBS.
9. ייבוש הדגימות על ידי הטבילה רציפה בסדרת אתנול מדורגת בריכוז עולה: 25%, 50%, 70%, 90% ו-100% (v/v), כל אחת למשך 10 דקות.
10. הוסיפו 500 מיקרו-ליטר של הקסמתילדיזילזאן ודגרו במשך 5 דקות, ואז החליפו ב-HMDS טרי ודגרו עוד 5 דקות. הסר את עודפי HMDS ותן לדגימה להתייבש באוויר לחלוטין מתחת למכסה האדים.
    הערה: גלוטראלדהיד, PFA, סודיום קקודילאט, אוסמיום טטרוקסיד והקסמתילידילזאן הם רעילים ויש לטפל בהם תחת מכסה אדים כימי עם ציוד מגן אישי מתאים.
11. התקן את הדגימות היבשות על חלקי SEM באמצעות סרט פחמן מוליך דו-צדדי. ציפוי את הדגימות בשכבה דקה (~10 ננומטר) של זהב או פלטינה, כדי לספק ניגודיות אלקטרונית מספקת להדמיית SEM. דבר זה מאפשר ויזואליזציה ברזולוציה גבוהה של ארכיטקטורת הביופילם, כולל מגעים בין תאים, מורפולוגיית מטריקות חוץ-תאיות, צפיפות והטרוגניות, ללא צורך בצבעים או כתמים נוספים.
12. טען את העמודים ל-SEM באמצעות מחזיק הדגימה המתאים. פנו את התא במהלך הלילה, כאשר ניתן, כדי לשפר את איכות ההדמיה, ואז לצלם תמונות אלקטרונים משניות בעוצמה של 5 - 15 קילו-וולט והגדלות מתאימות לחשיפת מבנה אולטרה-ביופילם (איור 2).

4. הדמיית ניגודיות פאזה בטיימ-לפס של ביופילם גדל

1. פיפט 500 מיקרוליטר של האינוקולום העובד (OD₄₀₅ = 0.02 ≈ 1 x 10⁶ תאים/מ"ל; ראה סעיף 1) אל צלחת Hi-Q4 סטרילית בתחתית זכוכית בקוטר 35 מ"מ, המצוידת במכסה מקביל מישורי להסרת עיוות המניסקוס. הימנעו מהוספת בועות וסגרו את המנה מיד.
   הערה: צלחת Hi-Q4 בתחתית זכוכית בגודל 35 מ"מ מכילה 4 אזורי תרביות מובחנים שניתן להשתמש בהם לצילום בו-זמנית של 4 תנאים שונים. הקצה תא אחד למדיום EMJH סטרילי כבקרה שלילית ושלושת האחרים לשכפולים טכניים או זנים/מוטנטים שונים.
2. הניחו את הצלחת על הבמה הסביבתית של מיקרוסקופ הפוך המצויד באופטיקה עם ניגוד פאזה, מנוע מיקוד ממונע (Biostation IMQ), ומארז לחות עם טמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס ולחות יחסית של 95%. תנאים אלו מסייעים למזער את האידוי במהלך הדמיה ממושכת (עד 8 ימים).
3. הפעל את אפליקציית BioStation IMQ, ובממשק הראשי פתח את חלון New Time-lapse Setting כדי לגשת לפאנל ההגדרות. לפני תחילת הניסוי, בדוק את הפרמטרים הסביבתיים בתצוגת המצב, כדי לוודא שגם מדדי הטמפרטורה של התא וגם המים מציגים יציבים כדי למנוע סטיית מסגרת במהלך הרכישה.
4. במסך הגדרת Time-lapse החדשה, בחר את לשונית Live והגדר את פרמטרי ההדמיה בפאנל תנאי התצפית על ידי בחירת Phase Contrast (Ph) כמסנן והגדרת ההגדלה ל-20 X.
5. במצב ידני, כוון את עוצמת האור וזמן החשיפה כדי למקסם את הניגודיות תוך הימנעות מרוויה. אמת זאת באמצעות כפתור Saturation Check. הגדר ארבע נקודות רכישה המתאימות למרכזי ארבעת התאים.
6. מקמו את הבמה ברצף מעל כל תא באמצעות מחוגת הג'וג או על ידי לחיצה ישירה בתוך תצוגת תצפית חיה .
7. לפרו את המיקוד עם כפתורי המיקוד, והקליטו כל עמדה על ידי לחיצה על כפתור רישום נקודת הניסוי ב-Time-lapse . הנקודות הרשומות מופיעות כמסגרות כחולות ממוספרות בתצוגת אימות נקודות התצפית ומאושרות בלשונית הנקודות.
8. תכנתו את לוח הזמנים לרכישה על ידי פתיחת לשונית הזמן ולחיצה על חדש כדי לגשת לתיבת הדו-שיח של Timelapse, שבה מחזור הרכישה מוגדר ל-30 דקות והזמן הכולל ל-7 ימים.
9. לאחר לחיצה על Apply, התוכנה מחשבת אוטומטית את מספר סבבי הרכישה. הפעל פוקוס אוטומטי על ידי לחיצה ימנית על שורת הכותרת, בחירת העדפות, והפעלת מצב AF כדי להבטיח מיקוד מחדש בכל מצב שלב. אמת את העקביות של הגדרות החשיפה, הרווח ועוצמת האור בכל הנקודות, ואז שמור את כל ההגדרות באמצעות כפתור השמירה .
10. התחל את הרכישה על ידי לחיצה על Start Time-lapse. התוכנה עוברת אוטומטית לתמונות Time-lapse, המאפשרת ניטור רציף של התקדמות הרכישה ויציבות התא לאורך כל הניסוי בן 7 הימים. כל התמונות נשמרות אוטומטית בפורמט TIFF בתוך תיקיית הניסוי שנוצרה על ידי התוכנה.
11. עיבוד וכימות סדרת התמונות על ידי ייבוא ערימות התמונות ל-FIJI (איור 3A, B, C).
12. פתח את ערימות התמונות המתאימות לכל מיקום באמצעות File > Import > Image Sequence, כדי להבטיח שהפריימים נטענים בסדר כרונולוגי.
13. המרו את הערימות המיושרות לגווני אפור של 8 ביט באמצעות Image > Type > 8 ביט כדי לתקן את עוצמת הפיקסלים.
14. החלת סף באמצעות תמונה > כוונן סף > לבידוד אזורי ביופילם חיידקיים. החלו הגדרות סף עקביות בכל הפריימים על ידי בחירת Apply, ואז שמרו את התוצאה כמסכה בינארית באמצעות Process > Binary > Make Binary.
15. בצע כימות באמצעות ניתוח > ניתוח חלקיקים, תוך תיעוד פרמטרים כמו שטח, אחוז שטח ועוצמה ממוצעת.
16. ייצא את התוצאות מכל פריים אוטומטית לגיליון אלקטרוני דרך חלון התוצאות (קובץ > Save As > .csv) לניתוח קינטי. הביטו את כל המדידות כיחס שטח השדה המכוסה בביופילם (כיסוי פני השטח).

5. הדמיית ביופילם באמצעות מיקרוסקופ לייזר סורק קונפוקלי (CLSM)

1. הזרקו 1.5 מ"ל מהחיסון העובד (OD₄₀₅ = 0.02 ≈ 1 x 10⁶ תאים/מ"ל; ראו סעיף 1) לתוך צלחת זכוכית סטרילית בקוטר 35 מ"מ. דגרו סטטית בקופסה לחה המכילה מאגר מים באינקובטור בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס עד לשלב ההתפתחות הרצוי (עד 21 ימים).
2. בנקודת הזמן שנבחרה, שאפו בזהירות את המדיום באיטיות לאורך קיר הצלחת מבלי להפריע לביופילם. שטוף פעם אחת עם 2 מ"ל של PBS סטרילי כדי להסיר תאי פלנקטוניים, תוך זהירות רבה שלא לנתק או להפריע לביופילם.
3. הכינו תמיסות צביעה שדורשות דגירה עם ביופילמים חיים (לא קבועים) (מבצעים לפני הקיבוע).
   1. לצביעה חיה/מתה, הוסף 3 מיקרוליטר SYTO9 צבע חומצה גרעין פלואורסצנטית ירוקה (1.67 מ"מ) ו-3 מיקרוליטר יודיד פרופידיום (18.3 מ"מ) ל-10 מ"ל PBS ליצירת תמיסת צביעה. הוסיפו 200 מיקרולטר מתמיסת הצביעה ישירות על החיידקים היוצרים ביופילם, ואז דגרו במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר בחושך, ושוטפים פעם אחת ב-PBS.
   2. ניתן גם להשתמש במעקב תאים חיים לצביעת התאים לפני הקיבוע שלהם. דגרו תאים חיים עם מעקב cfda/SE של 10 מיקרומטר למשך 30 דקות. לחלופין, ניתן להשתמש גם בתיוג הממברנות עם FM4-64 בריכוז של 5 מיקרוגרם/מ"ל. שטוף פעם אחת ב-PBS.
4. תקן את הביופילם על ידי הוספת 2 מ"ל של תמיסת פרפורמלדהיד 4% ב-PBS ודגירה למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. הסר את המקבע ושטוף פעמיים עם PBS.
5. הוסיפו טיפה של מדיום הרכבה נגד פייד כדי לכסות את הביופילם ולמנוע בועות.
6. רכוש ערימות Z על מיקרוסקופ קונפוקלי הפוך המצויד בלייזר אור לבן מכוון (WLL) ואובייקט טבילה בשמן HC PL APO CS2 63×/1.4 NA. עבור CFDA/SE, כוון את הגירוי ל-488 ננומטר ואסף פליטה בין 500-550 ננומטר, באמצעות חור קטן של יחידת איירי אחת (AU). עבור FM4-64, כוון את הגירור ל-561 ננומטר וגלה פליטה בין 630-700 ננומטר, גם כן עם חור סיכה של 1 AU.
7. רכוש ערימות Z במרווחים של 0.5-1.0 מיקרון לאורך כל עובי הביופילם. כוונן את עוצמת הלייזר ורווח הגלאי כדי למקסם את הטווח הדינמי תוך הימנעות מרוויה (<1% פיקסלים רוויים).
8. השתמש בממוצע קו (2-4×) כדי לשפר את יחס האות לרעש, ולשמור על כל פרמטרי ההדמיה (עוצמת לייזר, רוחב פס גלאי, גודל חור סיכה, מהירות סריקה) קבועים בין הדגימות.
9. שמור את ערימות התמונות כקבצים בגודל 12 ביט וייצא אותן בפורמט .lif לניתוח כמותי ב-FIJI (ImageJ).
   הערה: לפני ההדמיה, ודאו שהגדרות המיקרוסקופ (למשל, עוצמת לייזר, רווח גלאי, גודל חור סיכה) סטנדרטיות באמצעות דגימות בקרה המוצבעות באותם צבעים. שלב הכיול הזה חיוני למזעור שונות בין רכישות ולאפשר השוואה אמינה בין ניסויים.
10. עבד וכמת ערימות תמונות קונפוקליות באמצעות FIJI המצוידת בתוסף COMSTAT (או תוכנת ניתוח תלת-ממד מקבילה)¹⁰. מדדו נפח ביולוגי, עובי ממוצע ומקסימלי, כיסוי פני שטח, ויחס חיים/מת (או מדדים מוגדרים מראש). ייצוא תצוגות אורתוגונליות מייצגות והקרנות בעוצמה מקסימלית למטרות המחשה (איור 3D, E).

6. כימות מדויק של שברים מחוברים ולא מחוברים במהלך יצירת ביופילם במבחני מיקרוטיטר 96 בארות

1. הזרקו 200 מיקרוליטר מהאינקולום העובד (OD₄₀₅ = 0.02 ≈ 1 x 10⁶ תאים/מ"ל; ראו סעיף 1) לבארות של לוח עם 96 בארות. דגרו סטטית בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס עד לנקודת הזמן הרצויה (ימים 3, 5, 7, 10, 12, 14, 17 או 21).
   הערה: השפעות גבול ואידוי נפוצים כאשר משתמשים בלוחות 96 בארות, במיוחד אם האינקובטור אינו בוחן לחות. כדי למזער את ההשפעות הללו, הוסף 200 מיקרוליטר מים מזוקקים סטריליים לכל הבארות ההיקפיות. בנוסף, לוחות הונחו בתוך קופסה לחה המכילה מאגר מים, אשר ממוקם בתוך האינקובטור כדי להפחית עוד יותר את ההתאדות ולשמור על לחות אחידה בין הבארות.
2. בכל נקודת זמן, הכינו שלושה סוגי מדגם:
   1. השעיה כוללת - הומוגניזציה של כל תכולת באר אחת המכילה את הביופילם על ידי פיפטינג עדין למעלה ולמטה מספר פעמים, תוך הימנעות מהיווצרות בועות. חלק זה מייצג את כלל אוכלוסיית החיידקים, כולל גם לפטוספירים שאינם מחוברים והן כאלה שבביופילם החצי-דבק. שלב ההומוגניזציה הזה מסייע לפיזור אגרגטים של תאים שעלולים להפריע למדידות הספיגה הבאות.
   2. פאזה נוזלית - מבאר שנייה, הסר בזהירות 180 מיקרוליטר מהסופרנטנט מבלי להפריע לשכבת הביופילם. העבר לבאר ריקה והוסיף 20 מיקרוליטר של מדיום EMJH טרי. פיפט בעדינות למעלה ולמטה מספר פעמים כדי לפזר את האגרגטים של התאים. חלק זה מייצג את התאים הלא-מחוברים הנמצאים בשלב הנוזלי, שעשוי לכלול גם לפטוספירים תלויים חופשיים וגם אגרגטים ביופילמים מנותקים.
   3. ביופילם - באותו באר ששימשה לשלב 2.2, החזירו את הביופילם הנותר על ידי הוספת 180 מיקרול מדיום EMJH טרי ופיפטינג עדין למעלה ולמטה מספר פעמים. שבר זה מתאים ללפטוספירים בתוך הביופילם.
3. מדדו את הספיגה של כל תלייה ב-405 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר, לאחר הבטחה שכל באר הומוגנית לחלוטין, ושרטטו את הערכים ליצירת גרף מייצג (איור 4א).

7. חקירת התפקיד התפקודי של ביופילם במהלך זיהום במארח

1. הזרקו 200 מיקרוליטר מהאינקולום העובד (OD₄₀₅ = 0.02 ≈ 1 x 10⁶ תאים/מ"ל; ראו סעיף 1) לבארות של לוח עם 96 בארות. דגרו סטטית בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס עד לשלב ההתפתחות הרצוי (עד 21 ימים).
2. כדי לקבוע את ריכוז האינוקולום, יש להקדיש בארות "בקרת ביופילם" ייעודיות שישמשו רק לניטור גדילה ולא להזרקה לבעלי חיים. לאחר שהביופילם נראה מקרוסקופית, יש להסיר בעדינות 180 מיקרו-ליטר של סופרנטנט מבאר בקרה אחת מבלי להפריע לביופילם. החלף ב-180 מיקרוליטר של מדיום EMJH טרי, החזיר את אגרגטים הביופילם בזהירות ללא יצירת בועות, ומדד את ה-OD₄₀₅ להערכת ריכוז החיידקים.
   הערה: בעיקרון, שטיפת הבארות לפני הכימות יכולה לסייע בהסרת תאים שאינם דבקים. עם זאת, מכיוון שביופילמים של לפטוספירה מציגים הידבקות חלשה בלוחות של 96 בארות, שטיפה תוביל לאובדן בלתי מבוקר של חומר ביופילם. מסיבה זו, שלב ההשעיה מחדש בוצע ללא שטיפה מוקדמת כדי להבטיח שחזוריות בין בארות וריכוזי חיידקים עקביים.
   בארות בקרה ביופילם מכילות בדרך כלל ~2 x 10⁸ לפטוספירים, שנבחרו כחיסון הסטנדרטי לניסויים בזיהום אוגרים. ריכוז זה גם מגדיר את מספר היעד של לפטוספיירים פלנקטוניים המשמשים כבקרה. כאשר כוללים זאת, בקרות פלנקטוניות מוכנות על ידי תת-תרבית טרייה של לפטוספירה בתווך EMJH בתנאי רעידה בטמפרטורה של 30°C למשך עד 5 ימים, התואם לשלב הגדילה האקספוננציאלי באמצע עד מאוחר שמניב צפיפות תאים דומה.
3. לחיסון בעלי חיים, השתמש בבארות ביופילם נפרדות (לא בארות הבקרה). הסר בזהירות 180 מיקרוליטר של סופרנטנט מהבארות כדי להסיר את רוב הלפטוספירים בפאזה נוזלית.
4. אסוף את 20 המיקרוליטר הנותרים המכילים אגרגטים ביופילמים באמצעות קצה פיפטה בנפח 200 מיקרוליטר כדי למנוע הפרעה למבנה.
   הערה: הביופילם עדין. ודא שהאגרגטים נראים לפני ואחרי האיסוף. הכינו בארות נוספות למקרה שיהיה צורך בחזרה.
5. העבר את האגרגטים למזרק הממולא מראש ב-300 מיקרוליטר של מדיום EMJH טרי. אפשר לאגרגטים לשקוע על ידי כוח הכבידה.
6. חבר מחט של 21 G ושחרר בעדינות עודפי EMJH עד שמגיעים לנפח סופי של 200 מיקרוליטר. ודא שלא יישארו בועות אוויר ושהביופילם נשאר גלוי.
   הערה: המתנה לסכומים שיתייצבו מצמצמת את ההפסד במהלך התאמת הנפח. לפני השימוש ב-in vivo , יש לוודא שהאגרגטים נשארים שלמים לאחר מעבר דרך מחט 21G (איור 4C, D).
7. בצע הזרקה תוך-פריטוניאלית של 2 x 10⁸ לפטוספייר בתווך EMJH של 200 מיקרוליטר.
   הערה: השתמשו באוגרים סוריים זהובים בני 7-8 שבועות (שני המינים), המתוחזקים בתנאי מגורים סטנדרטיים. לביקורת שלילית, הזרקו 200 מיקרוליטר EMJH רק (חיה אחת לכל שכפול).
8. יש לעקוב אחרי בעלי חיים פעמיים ביום עד 21 ימים לאיתור סימנים קליניים של לפטוספירוזיס (פרווה מסודרת, השתחווה ותגובה מופחתת לגירוי). הורד מיד באמצעות שאיפת פחמן דו-חמצני אם נצפה סבל ורשום את זמן המתת האדמה כזמן המוות.
9. ביום ה-21, הרדימו את כל בעלי החיים ששרדו.
   הערה: בצע שלושה שכפולים ביולוגיים עצמאיים עם תרביות שהוכנו בתאריכים שונים. כל שכפול כולל שני בעלי חיים לכל מצב וחיה אחת עם שליטה שלילית.

Results

כאשר ההינקולום מוכן כראוי, התרביות נכנסות לשלב אמצע הלוגריתם תוך 3-5 ימים ומציגות ערכי OD₄₀₅ ~ 0.2-0.4 עם שדות בהירים וניידים מאוד תחת מיקרוסקופיית שדה אפל (≥ 90% מהתאים ניידים) וללא גושים נראים לעין. הכנות לא אופטימליות מופיעות כחיידקים איטיים ותנועתיות הטרוגנית בשדה; תרביות כאלה לעיתים קרובות מניבות ביופילמים חלשים ויש להשליך אותן. בפועל, אישור תנועתיות ו-OD זה לצד זה מיד לפני הזרעה ממזער כישלונות. הקמת שערי בקרת איכות אלו בשלב החיסון היא המנבא הטוב ביותר להצלחה ביישומים במורד הזרם. למרות שהמתודולוגיה הייתה מותאמת עבור L. interrogans serovar Manilae L495, אותן פרוצדורות יושמו גם על זן Leptospira biflexa Patoc כדי להוכיח יישום בין מינים. L. biflexa בדרך כלל יוצר ביופילמים פחות מלוכדים ודקים יותר בהשוואה ל-L. interrogans, אך רצף ההתפתחות האופייני והמאפיינים המבניים נשארים ניתנים לזיהוי עם התאמות פרמטרים מתאימות. שילוב שני המינים מדגיש את יכולת ההתאמה של תהליך העבודה הן ללפטוספירה פתוגנית והן לספרופירה.

לאחר 21 ימים של דגירה סטטית בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס בתא לח (או משך הזמן המתאים למין הלפטוספירה בו משתמש), הביופילמים נראים לעין בלתי הן על כיסויי זכוכית והן על ממברנות פוליקרבונט הידרופיליות. צמיחה מוצלחת יוצרת דפוסי CV אופייניים לאחר 2-3 שבועות, כגון טביעות רגל נקודתיות, הסתעפויות או רשתיות שמחוברות לפני השטח (איור 2א).

בריצה טיפוסית, Manilae L495 מסוג פראי L . interrogans מגיע ל-~ 50% כיסוי פני השטח עד שבוע 3, בעוד שהפלטפורמה של מוטנטים בעלי ביופילם נמוך קרוב ל~ 20% ופנוטיפים של ביופילם גבוה מתקרבים ~ 70-80%, מה שיוצר טווח דינמי מעשי לסקר. היקף היווצרות הביופילם עשוי להשתנות גם בהתאם למין ולזן של הלפטוספירה ; לדוגמה, זן L . biflexa Patoc מפתח ביופילמים נראים מהר יותר, כאשר מחקרים קודמים חשבו שמבנים כבר 120 שעות לאחר החיסון הם ביופילמים בוגרים³⁵.

צביעת סגולת קריסטל מספקת שיטה אמינה וניתנת לשחזור לכימות ביומסה ביופילמית. בביופילמים מפותחים היטב, צביעה גורמת לצבע סגול עמוק הממוקם באזור הכיסוי או הממברנה, מה שמעיד על רמות גבוהות של ביומסה מחוברת (איור 2א). רמזים ויזואליים במהלך שלבי הצביעה והמיסה מספקים גם הם אינדיקטורים שימושיים להצלחת הפרוטוקול. לדוגמה, פיזור CV לא אחיד או צביעה חיוורת עשויים להיגרם מתת-זריעה, אידוי או שטיפה אגרסיבית שמנתקת את הביופילמים המוקדמים.

קריאות הספיגה ב-570 ננומטר משקפות את כמות הצבע שנשמר, ולכן את צפיפות הביופילם היחסית (איור 2B). בניסויים מייצגים, תרביות של L. interrogans שגודלו בתנאים אופטימליים מראות קריאות OD₅₇₀ עקביות וניתנות לשחזור בין שכפולים, המשקפות היווצרות ביופילם יציבה. לעומת זאת, הבדלים גדולים בין השכפולים נצפים לעיתים כאשר הדגימות עוברות פיפטינג מופרז במהלך שינויים בתווך, מה שמעיד על הידבקות לקויה או היפרדות חלקית של ביופילם. שונות כזו צריכה להיחשב כסימן לבעיות טכניות, ויש להוציא את הדגימות המושפעות או לבדוק את הפרוטוקול בקפידה. ראוי לציין כי L. biflexa Patoc יוצר ביופילמים נרחבים יותר הן על כיסויי זכוכית והן על ממברנות פוליקרבונט בתנאים דומים, מה שמשתקף בערכי ספיגת CV גבוהים יותר, מה שמדגים כי הפרוטוקול גמיש ויעיל בקרב מיני לפטוספירה .

הכנה מוצלחת ל-SEM מצליחה לחשוף משקעים מטריצתיים חוץ-תאיים כבר ביום השלישי, ואחריה ארכיטקטורה מקוטבת באופן בולט בביופילמים בוגרים: פאה בסיסית גסה ומתועלת (לעיתים עם > תעלות של 5 מיקרון) שמעגנת מבנה פנימי נקבובי, ופאה אפיקלית חלקה יותר שבה הספירוכטים שזורים במטריצה צפופה (איור 2C, D, E, F). שדות בהגדלה גבוהה לוכדים לעיתים קרובות סיבים חוץ-תאיים מתפצלים ולעיתים בליטות דמויות פטריות; תכונות התואמות לדינמיקת ההתלכדות שנראית על ידי טיימלפס (וידאו משלים 1). בהכנות לא אופטימליות, ניתן לראות מטריצות קורסות, טעינה וקווי מתאר לא ברורים של תאים, בדרך כלל משקפים קיבוע לא מספק, ציפוי מוליך לא מספק או ייבוש לקוי. כאשר הקוטביות הבסיסית-קפית ותעלות חדירה ניכרות, קריאות SEM מתיישרות במדויק עם הערכות קונפוקליות של עובי ונקבוביות, ומאשרות ביצוע מוצלח של ההכנה וההדמיה.

בסדרות טיים-לאפס אפקטיביות, פנקטות מבודדות מופיעות בתוך 24-72 שעות ומתמזגות בהדרגה לאגרגטים גדולים יותר שמרחפים על פני השטח לפני שמגבלות המרחב מאטות את תנועתן (איור 3A, B, C). סגמנטציה כמותית מניבה עלייה מונוטונית בשטח הכולל המכוסה, בעוד שספירות המצטברות עולות, שיאו ואז יורדות כאשר התנגשויות ומיזוגים שולטות בין ~12 ל-216 שעות. הקינטיקה הזו (שטח כלפי מעלה, מספר האגרגטים למטה) מצביעה על הצטברות פעילה ולא רק שקיעה פשוטה. ריצות כושלות או גבוליות חסרות נקודות מוקדמות, מציגות עקומות שטוחות באזור לאורך זמן, או סובלות מסטיית מיקוד הקשורה לטמפרטורה/לחות לא יציבות. שמירה על סביבה יציבה של 30 מעלות צלזיוס עם לחות של 95% ושימוש בפוקוס אוטומטי בכל נקודת זמן בדרך כלל מחזירה מסלולים ברורים המתאימים להשוואת מוטנטים או טיפולים.

ערימות Z מייצגות מביופילמים בוגרים מציגות ארכיטקטורה רב-שכבתית דמוית קצף בעובי של מעל 50 מיקרון, כאשר רוב התאים צובעים חיים (SYTO 9-חיובי) ולעיתים חללים מרכזיים המעידים על סידור מחדש קולקטיבי במהלך הצמיחה (איור 3ד). ניתן להשתמש בגלאי מטריצה לחקר הרכב מטריצות: WGA מדגישה אפיטופים פוליסכרידים, תוויות BOBO-3 שפע DNA חוץ-תאי, וצבעים סלקטיביים לחלבון תורמים מעט מאוד אות חיצוני הקשור לתאים (איור 3E). תוצאות לא אופטימליות כוללות ערימות דקות או לא רציפות הנשלטות על ידי יודיד פרופידיום, הלבנה חזקה בפוטו, או הגדרות רווח לא עקביות, שכל אחד מהם פוגע בהשוואה כמותית. פירוש עובי, נפח ביולוגי ויחסי חיים/מתים יחד (תוך שמירה על עוצמת לייזר, רווח הגלאי וקבוע חור סיכה בין תנאים) מאשר את מצב הבגרות ותומך בהשוואות ישירות עם אולטרה-מבנה SEM וביומסה CV.

תהליך היווצרות הביופילם של לפטוספירה בדרך כלל עובר שלבים נפרדים, אם כי תזמנים וערכים מדויקים עשויים להשתנות בהתאם למין או לזן. בהתבסס על זן L . interrogans Manilae L495 כהפניה, ההתקדמות הצפויה לאורך 21 ימים כוללת שלב התחלתי (ימים 0-3) שבו החיידקים נשארים בעיקר פלנקטוניים עם ביופילם מינימלי (איור 4א). לאחר מכן מגיע שלב גדילה מעריכי (ימים 3-7) שבו גדלים גם חיידקים פלנקטוניים וגם חיידקים הקשורים לביופילם, ומגיעים לכ-9 x 10⁸ תאים למ"ל, בליווי היווצרות והתרחבות של אגרגטים ביופילם. בין הימים 7 ל-12, חיידקי הפלנקטון יורדים משמעותית, בעוד שתאי הביופילם מגיעים לשיא, ומהווים כ-80% מהאוכלוסייה. לבסוף, במהלך שלב הבגרות (ימים 12-21), מספר חיידקי הביופילם יורד ללא עלייה בתאי הפלנקטוניים, אך גודל הביופילם ומורכבותם ממשיכים לגדול. התבוננות ברצף השינויים הזה מצביעה על כך שהפרוטוקול תופס ביעילות את ההתפתחות הדינמית והבשלות של ביופילמים של לפטוספירה .

כאשר מבוצע כראוי, פרוטוקול הזיהום משתמש באינוקולה המכילה ~2 x 10⁸ לפטוספירים ב-200 מיקרוליטר EMJH, המוכנים מתרבויות פלנקטוניות מוגדרות היטב (5 ימים) או ביופילם (21 יום). למרות ששני סוגי התרביות הללו מייצגים מצבים פיזיולוגיים מובחנים, ההבדל הוא מכוון, שכן הניסוי שואף לקבוע האם ביופילמים של לפטוספירה — המאופיינים בפעילות מטבולית מופחתת ובהבדלים מבניים — שומרים על היכולת ליזום זיהום. ניגוד זה נתמך על ידי מחקרים טרנסקריפטומיים המראים שינויים משמעותיים בביטוי גנים בין לפלטוספירה פלנקטוני לביופילם ^35,36. אגרגטים ביופילם נקצרים בקפידה כדי לשמר את מבנם ולהישאר שלמים לאחר מעבר דרך מחט של 21 גרון, כפי שאושר לפני ההזרקה (איור 4C, D). לאחר הזרקה תוך-פריטוניאלית, אוגרים סוריים זהובים בדרך כלל מראים סימנים קליניים של לפטוספירוזיס תוך 3 עד 5 ימים (למשל, עייפות, פרווה מקומטת, השתחוות). ביקורות שליליות שהוזרקו רק בתווך EMJH אינן מראות סימני מחלה. ההתקדמות והחומרה של התסמינים הקליניים, כמו גם זמן ההגעה להמתת חסד, משתנים בהתאם לחיסון: חיידקים פלנקטוניים לעיתים גורמים לתסמינים מוקדמים וחריפים יותר, בעוד שמצברים שמקורם בביופילם עלולים לגרום לזיהום מאוחר אך מתמשך (איור 4ב'). מעקב פעמיים ביום למשך עד 21 ימים מאפשר לתעד את מלוא מהלך המחלה.

איור 2. צביעת סגול קריסטלי, כימות ודימות אולטרה-מבני של ביופילמים של לפטוספירה. (א) צביעת קריסטל סגול (CV) של ביופילמים שגודלו על מצעים שונים. צביעת CV מאפשרת המחשה של ארכיטקטורת הביופילם ודפוסי ההידבקות הראשוניים למינים ולתת-קרקעים שונים. i. L. interrogans על מסנן פוליקרבונט; ii. L. biflexa על מסנן פוליקרבונט; iii. L. interrogans על כיסוי זכוכית; iv. L. biflexa על כיסוי זכוכית. (B) דוגמה להיווצרות ביופילם כמותית שהוערכה על ידי ספיגת CV (OD570 ננומטר) לאורך זמן עבור L. interrogans ו-L. biflexa. קריאה קינטית זו לוכדת הן את הדינמיקה המוקדמת של הידבקות והן את דינמיקת הצטברות הביומאסה, ומדגישה את ההבדלים בצמיחת הביופילם בין מינים פתוגניים לסאפרופיטים. מספר זה שונה^מ-27. (C-E) מיקרוסקופיה אלקטרונית סורקת (SEM) של ביופילמים של L. interrogans: (c) ביופילם בן 3 ימים המציג היווצרות מיקרוקולוניות מוקדמת והפקדה ראשונית במטריצה חוץ-תאית; (ד) ביופילם בן 14 ימים המציג ארכיטקטורה בוגרת עם ארגון מטריצתי ותלת-ממדי נרחב; (E-F) ביופילם בן 3 שבועות שממחיש התבססות מבנית והתבגרות מטריצה לאורך תרבית ממושכת. שילוב זה של צביעת CV, מדידות OD כמותיות ודימות SEM מספק סקירה מקיפה של התפתחות הביופילם, מההתקשרות המוקדמת ועד לארגון אולטרה-מבני בוגר, המאפשר השוואה ישירה בין מינים ומשך תרבית. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 3. הדמיה של היווצרות ביופילם לפטוספירה . תמונות קונטרסט פאזה שצולמו עם BioStation מראות התפתחות ביופילם ב-(A) 48 שעות, (B) 96 שעות, ו-(C) 144 שעות. (D) שחזור CLSM של ביופילם לפטוספירה המציג את הנפח הביולוגי הכולל עם פרוסות אורתוגונליות להדמיה תלת-ממדית. (ה) צביעה קונפוקלית של ביופילם בוגר עם DAPI (ירוק) ו-WGA (אדום), תוך הדגשת תאי חיידק ורכיבי מטריצה חוץ-תאיים. מספר זה שונה^מ-37. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 4. כימות מפורק בזמן של שברי פלנקטוניים וביופילם והערכה פונקציונלית של ביופילמים של לפטוספירה . (א) קינטיקה של יצירת ביופילם שנמדדה על ידי ספיגה ב-405 ננומטר. לכל נקודת זמן נלקחו קריאות מהבאר הכוללת, מחלק הביופילם, ומהסופרנטנט המכיל לפטוספירים פלנקטוניים, מה שאפשר להבחין בין חיידקים מחוברים לחיידקים השוחים בחופשיות. (B) דוגמאות לעקומות הישרדות של אוגרים שהוזרקו בחומרים ביופילמיים, לפטוספירים פלנקטוניים, או בקרת EMJH. בעלי חיים שהוזרקו לביופילם מראים ירידה באלימות, כאשר חלקם שורדים 21 ימים, בעוד שלפטוספירים פלנקטוניים גורמים לתמותה מהירה. (C-D) אימות ראשוני של שלמות הביופילם: אגרגטים נראים במזרק לפני ההזרקה (C) ונשארים שלמים לאחר מעבר דרך מחט 21G (D, חיצים לבנים), מה שמאשר שמבנה הביופילם נשמר במהלך הטיפול. מספר זה שונה^מ-36. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

Discussion

פרוטוקול זה מציג תהליך עבודה מודולרי ואינטגרטיבי לחקר ביופילמים של לפטוספירה, הכולל ביומסה כמותית (קריסטל וויגל) ^9,27, דינמיקה (ניגודיות פאזה בזמן-זמן), הרכב תלת-ממדי (מיקרוסקופיית לייזר קונפוקלית עם גשושים ממוקדים)³⁸, אולטרסטרוקטור (מיקרוסקופ אלקטרוני סורק) והערכה פונקציונלית (זיהום אוגר). על ידי שימוש באותה סדרת תרביות בין מודולים, אפקטי אצווה ממוזערים ומופעלת אימות הדדי בתוך הניסוי, דבר שחשוב במיוחד לספירוכטים שבריריים וגדלים לאט. כל מודול משלים את האחרים: CV מכמת "כמה", טיים-לאפס מראה "כמה מהר", CLSM חושף "מה יש בפנים", SEM פותר "איך הוא בנוי", ובדיקות in vivo מספקות "הוכחת פונקציה." הכללת L. biflexa מדגימה גמישות בין מינים, מדגישה יצירת ביופילם מהירה וצפופה יותר ומדגישה גמישות מתודולוגית³⁵.

הצלחת כל מודול תלויה באיכות האינוקולום ובמצב הפיזיולוגי. תרביות פלנקטוניות באמצע הלוג (3-5 ימים), ניידות מאוד וללא אגרגטים, מניבות הידבקות שניתנת לשחזור והתפתחות ביופילם. יש להשתמש רק בבודדים בעלי מעבר נמוך כדי להבטיח היווצרות ביופילם חזקה ושחזוריות.

מבחן ה-CV עוגן את זרימת העבודה דרך מהירותה, יכולת הרחבה^וקצב התפוקה ^9,27. הוא מאפשר סינון מהיר של מוטנטים, מדיה או תרכובות אנטי-ביופילם. עם זאת, מכיוון שביופילמים של לפטוספירה שבריריים והטרוגניים, מניפולציה עדינה ואימות שכפול הם חיוניים. CV אינה מסוגלת להבחין בין ארכיטקטורות קומפקטיות לנקבוביות או לזהות הרכב מטריצות – ולכן תפקידה כשער סינון לניתוחים מבניים מעמיקים יותר.

הדמיית טיים-לאפס מגשרת על הפער הזה על ידי חשיפת קינטיקה של ביופילם בזמן אמת. הוא לוכד את הופעתם, התלכדות וקיבוע של אגרגטים ניידים, וחושף תופעות חולפות שמבחני קצה מפספסים. יציבות סביבתית (טמפרטורה, לחות, פוקוס אוטומטי) היא קריטית. התיעוד הללו הראו שגם כאשר ביומסה של CV נראית יציבה, הדינמיקה יכולה להתפצל – מה שמעיד על סידורים מבניים או אובדן חיוניות בשכבות עמוקות יותר.

CLSM מספק תובנות נפחיות וכימיות ללא ארטיפקטים של התייבשות³⁹. צביעה חיה/מת מגלה גרדיאנטים של קיום תאים בתוך הביופילם, בהתאם לדיווחים על דיפוזיה מוגבלת של חמצן ושכבות מטבוליות ^6,40. לקטינים וצבעי חומצות גרעין חושפים DNA חוץ-תאי ודגמי גליקן ספציפיים בשפע, ומאפשרים לכמת ולאפיון של רכיבי מטריצה^41,42. נתוני CLSM חושפים לעיתים קרובות חללים פנימיים, המזכירים את הסידור הקולקטיבי שנראה ב-Time-lapse³⁸. עם זאת, מגבלות כוללות ספציפיות של פרוב, הלבנת פוטו, ורזולוציה אקסיאלית מוגבלת בדיפרקציה; לכן, הגדרות מיקרוסקופ וביצועי הצבע צריכים להיות סטנדרטיים ולבדוק מראש כדי להבטיח תוצאות אמינות וניתנות להשוואה בין הניסויים.

SEM מציע רזולוציה אולטרסטרוקטורלית משלימה⁴³. בשלבים מוקדמים, הוא פותר מצברים מתחילים; בבגרות (≈ 15-21 ימים), הוא חושף ארכיטקטורה מקוטבת: שכבת בסיס גסה ומועוצרת לעיגון והחלפה, ומשטח חלק יותר עשיר במטריצות אפיקליות³⁷. קיבוע זהיר, ייבוש HMDS וקורלציה עם נתונים קונפוקליים מפחיתים ארטיפקטים הנגרמים מהתייבשות או קריסה⁴⁴.

יחד, ארבעת המודולים הללו מאפשרים אימות פנימי: כאשר CV, CLSM ו-SEM מתכנסים, המסקנות הן יציבות; כאשר הם מתפצלים, ההבדלים עצמם הם אינפורמטיביים – חושפים, למשל, ביומסה מוגברת עם ירידה בחיוניות או ביומסה ללא שינוי עם הרכב מטריצות משתנה.

נותרו מספר מגבלות מהותיות. ביופילמים של לפטוספירה הם הטרוגניים ועדינים, מה שהופך אותם לרגישים לטיפול ולהתייבשות. CV משלבת ביומסה כוללת אך לא חיוניות¹⁶; CLSM לא יכול לעבור את הגבולות האופטיים³⁸; SEM מסכן חפצי הכנה. תמותה בשכבות עמוקות יותר צפויה בשל גרדיאנטים של חמצן⁶, אך הטיה זו שיטתית וניתנת להשוואה בין תנאים. הבשלה של ביופילם מגיעה לרמת קיפאון בסביבות 15-21 ימים, הקשורה לחתימות שעתוק של הגבלת חומרים מזינים³⁶. השלבים המאוחרים נותרו מאופיין בצורה לקויה.

בדיקות in vivo מספקות הקשר פונקציונלי. הזרקת אגרגטים תוך-פריטונית בודקת האם תאים שמקורם בביופילם שונים באלימות או בהתמדה לעומת תאי פלנקטוניים. למרות שחיסון תוך-פריטוניאלי אינו מסלול טבעי, הוא מציע מודל השוואתי מבוקר³⁶. הטרוגניות מצטברת יוצרת שונות מסוימת, אך טיפול עקבי וגודל החיסון תואם מפחיתים זאת. חשוב לציין, תכונות התמדה של ביופילם (למשל, סבילות ללחץ מתווכת ECM) אינן בהכרח מתורגמות לאלימות חריפה מוגברת, ומדגישות את התפקיד האקולוגי ולא הפתוגני של יצירת הביופילם²⁴.

העיצוב המודולרי מאפשר שימוש ניתן להרחבה. לסינון מהיר, CV ו-Time-lapse מספיקים. לתובנות מכניות, CLSM ו-SEM מוסיפים רזולוציה קומפוזיציונית ואדריכלית. מודולים יכולים לשלב הפרעות אנזימטיות או כימיות (DNase, גליקוזידאז), גלאים חלופיים לגליקנים או חומצות גרעין, או מערכות מיקרופלואידיות לבדיקת תגובות זרימה. אותה אינקולום יכול להזין ניתוחים טרנסקריפטומיים או פרוטאומיים, ומקשרים ישירות את פנוטיפ הביופילם לוויסות (למשל, איתות c-di-GMP, תגובת רעב). מסגרת זו כוללת גם סקר מוטנטים, בדיקות הפרעה סביבתית, והערכת תרכובות אנטי-ביופילם או אנטי-אלימות.

תהליך עבודה משולב זה הופך תצפיות מבודדות להבנה רב-ממדית קוהרנטית של ביופילמים של לפטוספירה. על ידי שילוב קצב העברה (CV), דינמיקה (טיים-לפס), כימיה ועומק (CLSM) ואולטרה-מבנה (SEM), הגישה לוכדת בנאמנות את האופי הנייד, הנקבובי והמקוטב של קהילות לפטוספירה. בהרחבת מחקרים קודמים 17,35,36, הוא מראה שניסויים מתואמים ומודולריים חושפים תופעות שאינן נראות למחקרים חד-שיטותיים – כמו עליית ביומסה למרות ירידה ביכולת הקיימות, או קינטיקה שונה בין מינים. בסופו של דבר, גישה זו תומכת בניתוחים השוואתיים, ניתנים לשחזור ורלוונטיים פונקציונלית בין מינים, מוטנטים ותנאים, ומספקת בסיס למיקרוביולוגיה מכנית, עמידות אקולוגית ועיצוב אסטרטגיות אנטי-ביופילם.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 ומיקרו; ממברנת פוליקרבונט הידרופילית סטרילית	it4IP	1000M25/861N101/13
כיסוי זכוכית סטרילי בקוטר 12 מ"מ	SPL	330164
16% פאראפורמלדהיד (PFA)	תרמו-סיינטיפיק	28908
מחט 21G	BD Medical	304432
מיקרופלטת 24 בארים	NUNC	143982
צלחת תחתית זכוכית בקוטר 35 מ"מ	איבידי	81218-200
צלחת Hi-Q4 בתחתית זכוכית בקוטר 35 מ"מ	איבידי	81156
מיקרופלטה עם 96 בארות	NEST	701001
מדיום הרכבה נגד פייד	ביוראד	29410
ציפוי פחמן	לייקה מיקרוסיסטם	Em ACE600
מעקב CFDA/SE	ביולג'נד	423801
דבק קרבון מוליך	מדעי מיקרוסקופיית אלקטרונים	77816
קריסטל ויולט (CV)	סיגמא	C3886
מיקרוסקופ שדה אפל	לייקה מיקרוסיסטם	11888846	Leica DM4000 B מצוידת במעבה פיאל כהה (קטגוריה n° 11505142)
אתנול	VWR כימיקלים	83813.36
FM4-64	Invitrogen	T3166
חומצה אצטית קרחונית	סופלקו	1.00063
תמיסת גלוטראלדהיד	סיגמא-אלדריץ'	G5882
הקסמתילדיזילזאן	אקרוס אורגניקס	120581000
חממה	ממרט	IN30
מיקרוסקופ קונפוקלי הפוך	לייקה מיקרוסיסטם	לייקה DMI6000 TCS SP8 X	מיקרוסקופ קונפוקלי SP8
מיקרוסקופ הפוך המצויד באופטיקה בניגודיות פאזה	ניקון	CELL-S2	BioStation IM-Q
Leptospira Medium Base EMJH	בקטון דיקינסון	BD  279410	מדיום EMJH עבור לפטוספירה
טטרוקסיד אוסמיום (OsO4)	סיגמא	BCCG9181
פרופידיום יודיד	ביוטיום	40017
מיקרוסקופ אלקטרוני סורק	ג'אול	JSM-IT300
בופר קקודילאט נתרן	תרמו-סיינטיקה כימיקלים	15453149
ספקטרופוטומטר Varioskan Lux	תרמו-סיינטיפיק	VLBL00GD0
סליין סטרילי עם מאגר פוספט	ביוסולב	0016232301BS
מזרק (1 מ"ל)	צ'ירנה	CH03002L
צביעת חומצה גרעין ירוקה של SYTO9	Invitrogen	S34854