הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

גישות ניסיוניות לניתוח ביוכימי של חלבון חומצי סיבי גליאלי ושל וריאנטים הקשורים למחלה

1.5K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/69523

⸱

28 בנובמבר 2025

 , 
1Institute of Molecular Medicine, College of Life Sciences and Medicine, National Tsing Hua University

במאמר זה

סיכום

מחקר זה מתאר שיטות ניסוי לאפיון ביוכימי של GFAP והמוטציות הגורמות למחלות, תוך התמקדות בהרכבת פילמנט, הצבירה ושינוי פוסט-תרגום. נבדקו בחלבוני GFAP טהור גבוה, וחשפו תובנות לגבי מנגנוני מחלת אלכסנדר שעשויים לספק מסגרת לחקר מטרות טיפוליות פוטנציאליות ולהבנת מוטציות GFAP והפרעות נלוות.

תקציר

חלבון חומצי סיבי גליאלי (GFAP) הוא חלבון סיבים ביניים מרכזי הקריטי לשמירה על שלמות ותפקוד האסטרוציטים במערכת העצבים המרכזית. מוטציות ב-GFAP הן הגורם השורשי למחלת אלכסנדר (AxD), הפרעה ניוונית נדירה ולעיתים קטלנית, המתאפיינת בעלייה ברמות GFAP והצטברות GFAP בצורת סיבי רוזנטל. כאן, אנו מציגים סט מקיף של גישות ניסיוניות לאפיון הביוכימי של GFAP ושל הווריאנטים הגורמים למחלות. באמצעות ביטוי אופטימלי וטכניקות טיהור מתקדמות, השגנו תפוקה גבוהה וטוהר של חלבוני GFAP מסוג בר ומוטנטים. בדיקות ביוכימיות שימשו להערכת השפעות מוטציות פתוגניות על הרכבת פילמנט, מסיסות ואגרגציה. בנוסף, חקרנו את תפקידם של שינויים פוסט-תרגומיים חריגים באגרגציה של GFAP והשפעתם על תכונות הפילמנט. עבודה זו מקדמת את הבנתנו את תפקיד GFAP ב-AxD ומניחה בסיס לפיתוח אסטרטגיות טיפוליות המתמקדות בתפקוד לקוי של GFAP. יתרה מזאת, המתודולוגיות המוצגות כאן משמשות ככלים חשובים לחקירת ההשלכות הביוכימיות של מוטציות GFAP ולקידום התערבויות להפרעות הקשורות ל-GFAP.

מבוא

מחלת אלכסנדר (AxD) היא הפרעה גנטית הנובעת ממוטציות דומיננטיות בגן המקודד לחלבון חומצי סיבי גליאלי (GFAP)1, חלבון סיב ביניים מסוג III (IF) הנמצא בעיקר באסטרוציטים בוגרים. AxD מאופיין בהגברת GFAP2, אסטרוגליוזיסתגובתי 3, והצטברות סיבי רוזנטל, שהם הכללות חלבון המורכבות בעיקר מ-GFAP יחד עם חלבונים נלווים כמו αB-קריסטלין4 ויוביקוויטין5. מוטציות בגן GFAP מפריעות להרכבה תקינה של פילמנט6, מה שמוביל להצטברות לא תקינה, להזרמת תגובות לחץ תאי7, ולחוסר יציבות נוסף באמצעות שינויים פוסט-תרגומיים חריגים (PTMs) כגון פוספורילציה8, חמצון9 ואוביקוויטינציה10.

למרות תפקידו המרכזי של GFAP בפתולוגיית AxD, המנגנונים המולקולריים שבאמצעותם GFAP מוטנטי משבש את הרכבת הפילמנט, מקדם הצטברות וגורם למתח תאי נותרו לא מובנים היטב. פער ידע זה מעכב את פיתוח טיפולים ממוקדים לטיפול בהצטברות וברעלנות של GFAP. חקר התכונות הביוכימיות של GFAP והווריאציות הקשורות ל-AxD הוא קריטי לחשיפת המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס התקדמות המחלה. עם זאת, תכונת הנטייה לאגרגציה של GFAP ושינוי התנהגות ההרכבה שלו בווריאנטים הקשורים למחלה מציבות אתגרים ייחודיים לניתוח ניסוי. מחקרים ביוכימיים מבוקרים דורשים GFAP מטוהרת, המושג ממודלים בעלי חיים או דרך ביטוי רקומביננטי, כדי לחקור את השפעות מוטציות AxD על הרכבה של חוטים, הצטברות ושינויים פתולוגיים.

הגישות הניסיוניות שהוצגו במחקר זה מציעות מספר יתרונות על פני טכניקות חלופיות. לדוגמה, בעוד שמודלים מבוססי תאים11 ומחקרי אימונוהיסטוכימיה12 מספקים תובנות חשובות לגבי ביטוי ומיקום GFAP, הם לעיתים קרובות אינם מצליחים ללכוד את המנגנונים הביוכימיים המדויקים של הרכבת ואגרגציה של פילמנט בשל מורכבות הסביבה התאית. לעומת זאת, השיטות המתוארות כאן, כגון בדיקות הרכבת פילמנט במבחנה , ניתוחי שקיעה ואפיון PTM, מאפשרות חקירה מבוקרת של התכונות הביוכימיות הפנימיות של GFAP ושל הווריאנטים הקשורים למחלות. גישות אלו מאפשרות לחוקרים לנתח את התנהגות ההרכבה וההצטברות של הסיבים במערכת פשוטה, ומקלה על זיהוי המנגנונים המולקולריים שמאחורי תפקוד לקוי של GFAP. מחקרים קודמים הראו את התועלת של טכניקות ביוכימיות אלו לניתוח חלבוני IF, כולל דסמין13 וקרטינים14, מה שמדגיש את יישומם במחקר GFAP.

בנוסף, כתב יד זה מספק מידע המסייע לקוראים לקבוע האם השיטות המתוארות מתאימות ליישומים הספציפיים שלהם. חוקרים המתעניינים בחקר תכונות ביוכימיות של GFAP, התנהגות ההרכבה שלו, או PTMs, ימצאו את הטכניקות הללו מועילות במיוחד לחקר וריאנטים הקשורים למחלה והשפעותיהם הפתולוגיות. על ידי שילוב גישות ביוכימיות אלו עם מערכות ניסוי אחרות, כגון מחקרים מבוססי תאים או מודלים של בעלי חיים, החוקרים יכולים להשיג הבנה מקיפה יותר של תפקוד לקוי של GFAP ב-AxD ובאסטרוציטופתיה קשורה אחרת.

המטרה הכוללת של שיטה זו היא להציג גישות ניסיוניות לניתוח ביוכימי של GFAP והגרסאות הקשורות ל-AxD שלו, כולל טכניקות טיהור חלבונים, בדיקות הרכבת סיבים במבחנה , ניתוחי משקעים ואפיון PTM. שיטות אלו מספקות תובנות קריטיות לגבי הבסיס המולקולרי של תפקוד לקוי של GFAP ב-AxD, וסוללות את הדרך להתפתחות טיפולית. יתרה מזאת, יישום טכניקות ניסוי אלו יקדם את הבנתנו את הביוכימיה של GFAP ב-AxD וייתרום לתחום הרחב יותר של מחקר IF.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

בעלי החיים ששימשו במחקר זה הם חולדות מודל AxD עם מוטציית דחיפה R237H11. כל הניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים מוסדית של הפקולטה למדעי החיים ורפואה באוניברסיטת צ'ינג חואה הלאומית (אישור IACUC מס' 109088 ו-111060) ובהתאם להנחיות מדריך החקלאות לטיפול ושימוש בבעלי חיים במעבדה.

1. טיהור GFAP רקומביננטי מחיידקים (איור 1)

  1. המרה של זן pLysS של E. coli BL21(DE3) עם וקטור pET 23b המכיל cDNA של WT או GFAP מוטנטי.
  2. תרבית חיידקים ב-1 ליטר של מדיום Luria-Bertani עם תוספת של 100 מיקרוגרם/מ"ל אמפיצילין ו-34 מיקרוגרם/מ"ל כלורואמפניקול בטמפרטורה של 37°C עד OD600 של ~0.2.
  3. הוסף איזופרופיל β-D-1-תיוגלאקטופירנוסיד (IPTG, 0.5 מ') לריכוז סופי של 0.5 מ"מ כדי לעורר ביטוי GFAP ב-37 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות.
  4. קציר חיידקים בצנטריפוגה ב-6,371x גרם למשך 30 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  5. חיידק ליז ב-50 מ"ל של בופר TEN (20 מ"מ טריס-HCl, pH 8, 5 מ"מ EDTA, 150 מ"מ NaCl) בתוספת 0.2 מ"מ פלואוריד פננילמתאנסולפוניל (PMSF) באמצעות הומוגניזציה בהומוגניזר Dounce.
  6. חיידקים בצנטריפוגה ליזטים ב-22,045x גרם למשך 20 דקות ב-4 מעלות צלזיוס, ואז מפיקים את הכדור בבופר טריטון X-100 (TEN עם 1% (v/v) טריטון X-100).
  7. לאחר הצנטריפוגה באותם תנאים, יש להוציא את הכדור המתקבל בבופר המלח הגבוה (TEN עם 1% (v/v) טריטון X-100 ו-1.5 M KCl).
  8. לאחר הצנטריפוגה באותם תנאים, שטפו את הכדור עם TEN בופר.
  9. המיס את הכדור הסופי ב-10 מ"ל של בופר אוריאה (8 מיליון אוריאה, 20 מ"מ טריס-HCl, pH 7.4, 5 מ"מ EDTA, ו-0.2 מ"מ PMSF) על ידי ערבוב למשך 3 שעות בטמפרטורת החדר.
  10. אוריאה בצנטריפוגה מוציאה בעוצמה של 80,000x גרם באולטרה-צנטריפוגה שולחנית בטמפרטורה של 4°C למשך 20 דקות.
  11. הוסיפו פוליאתילנאמין (1% (v/v)) לחלק המסיס באוריאה לריכוז סופי של 0.06% (v/v) ודגרו על קרח למשך 5 דקות.
  12. צנטריפוגה בעוצמה של 80,000x גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות, ואז דיאליזציה של שבר הסופרנטנט מול בופר A (6 מ' אוריאה, 20 מ"מ מ' MES, pH 6.0, 14.4 מ"מ מ' β-מרקפטואנול).
  13. טעינת דיאליזטים על עמודת חילוף יונים CM-Sepharose מאוזנת מראש בבופר A במערכת כרומטוגרפיה NGC.
  14. חלבוני אלוט עם גרדיאנט ליניארי של 0-0.5 M NaCl בבופר A מעל 1 שעה בקצב זרימה של 1 מ"ל/דקה.
  15. מאגר שברים המכילים GFAP ודיאליז נגד בופר B (6 M אוריאה, 10 mM Tris-HCl (pH 8.0), ו-1 mM EDTA).
  16. העמסת דיאליזטים על עמודת חילוף אניאונים מאוזנת מראש בבופר B. חלבוני אלוט עם גרדיאנט ליניארי של 0-0.5 M NaCl בבופר B במשך שעה בקצב זרימה של 1 מ"ל לדקה.
  17. נתחו שברי עמודה לפי SDS-PAGE וצביעת Coomassie כחולה. אסוף את המכילים GFAP מטוהר ואחסן בטמפרטורה של מינוס 80°C.
    הערה: ניתוק חיידקים יכול להתבצע באמצעות מספר מחזורי הקפאה והפשרה. הריכוז הסופי של פוליאתילנאמין לא צריך לעלות על 0.06% (v/v), ומעליו גם חלבונים משקיעים. בעת עבודה עם חומרים מסוכנים כמו PMSF ו-β-מרקפטואנול, חשוב לכלול הנחיות בטיחות ברורות והנחיות לפינוי פסולת מסוכנת. PMSF הוא רעיל מאוד ועלול לגרום לגירוי בעור, בעיניים ובדרכי הנשימה. הכינו פתרונות PMSF טריים בתוך מכסה אדים והימנעו ממגע ישיר. השתמש ב-β-מרקפטואנול באזור מאוורר היטב כי הוא פולט אדים חזקים ורעילים.

2. הרכבה במבחנה ובדיקת משקעים (איור 2)

  1. דילל WT מטוהר או GFAP מוטנטי ל-0.3 מ"ג/מ"ל ב-6 מיליון אוריאה בבופר מלח נמוך (10 מ"מ טריס-HCl, pH 8, 1 מ"מ EDTA, ו-14.4 מ"מ β-מרקפננול).
  2. דיאליז דגימות מול בופר מלח נמוך המכיל 4 M ואז 2 מיליון אוריאה למשך 4 שעות בטמפרטורת החדר.
  3. דיאליזציה של דגימות מול בופר מלח נמוך ללא אוריאה במהלך הלילה בטמפרטורה של 4°C.
  4. דיאליזציה של דגימות מול בופר ההרכבה (10 מ"מ טריס-HCl, pH 7, 50 מ"מ מ"מ NaCl ו-14.4 מ"מ מ' β-מרקפננול) בטמפרטורת החדר למשך 12-16 שעות.
  5. העבירו תערובות להרכבה על ראש כרית סוכרוז המכילה 0.2 מ"ל סוכרוז 0.85 מטר בבופר ההרכבה.
  6. במבחן השקיעה המהירה, יש לצנטריפוגה את התערובות בעוצמה של 80,000x גרם למשך 20 דקות בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס באמצעות מיקרו-אולטרה-צנטריפוגה שולחנית.
  7. ריכז את GFAP הלא מורכב בשבר הסופרנטנט על ידי ביצוע משקעים של מתנול/כלורופורם15. משקעים מחזירים ב-0.2 מ"ל של בופר דגימת Laemmli (25 מ"מ טריס-HCl (pH 6.8), 1% (עם v/v) סודיום דודציל סולפט (SDS), 12.5% (v/v) גליצרול, 0.01% (עם v/v) ברומופנוף כחול, ו-355 mM β-מרקפטואנול).
  8. החזירו את ה-GFAP המורכב בשבר הגלגלות בבופר הדגימה של Laemmli.
  9. הרץ גם חלקי סופרנטנט וגם פלט על ג'ל אלקטרופורזה של SDS (SDS-PAGE) וצבע עם 10 מ"ל ג'ל קומאסי בלו של 10 מ"ל.
  10. במבחן השקיעה במהירות נמוכה, תערובות צנטריפוגות בטמפרטורה של 3,000x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס באמצעות צנטריפוגה על שולחן.
  11. הוסף 0.2 מ"ל של בופר דגימה של Laemmli לצורות הלא-מצטברות של GFAP בחלק הסופרנטנטי.
  12. החזירו את ה-GFAP המצטבר ישירות לשבר הפלט בבופר הדגימה של Laemmli בנפח פרופורציונלי לשבר הסופרנטנטי.
  13. נתחו גם את חלקי הסופרנטנט וגם את הכדורים על ידי 10% (עם ג'ל SDS-PAGE), ואחריהם צביעת קומאסי כחולה.
    הערה: מתנול וכלורופורם הם ממסים רעילים ועלולים לגרום להשפעות בריאותיות חמורות. הימנעו ממגע עור ושאיפה. לטפל בזהירות במכסה אדים כדי למנוע שפיכות.

3. צביעה שלילית ומיקרוסקופיה אלקטרונית (איור 2)

  1. פריקת זוהר ברשתות נחושת מצופות Formvar/פחמן למשך 45 שניות בעוצמה של 20 mA במערכת ניקוי פליטת זוהר.
  2. להעביר תערובות הרכבה לרשת הזוהר ומאפשר לדגימות להיקשר לסרט התמיכה למשך 60 שניות.
  3. הסר נוזלים עודפים על ידי סיפוג קצה הרשת עם חתיכת נייר סילוק.
  4. שטוף רשתות במים מזוקקים, ואז צבע ב-20 מיקרוליטר של 1% (עם וולט) אורניל אצטט למשך 60 שניות.
  5. הסר את תמיסת הכתמים העודפת ותן לרשת להתייבש באוויר למשך 30 שניות.
  6. לבחון רשתות תחת מיקרוסקופ אלקטרוני שידור H-7600 (TEM) באמצעות מצב ברזולוציה גבוהה במתח מואץ של 100 קילו-וולט.
    הערה: פריקת הרשתות במאייד ואקום לפני הוספת דגימת החלבון משפרת את ספיחת הדגימה לרשת. אצטט אורניל הוא חומר כימי רדיואקטיבי ורעיל מאוד, הנפוץ במיקרוסקופיה אלקטרונית לצביעה שלילית. הטיפול בו דורש עמידה קפדנית בפרוטוקולי בטיחות והוראות לפינוי פסולת מסוכנת כדי למזער סיכוני חשיפה לאנשים ולסביבה. הכינו תמיסות אצטט אורניל רק במכסה אדים כדי למנוע שאיפת חלקיקים או אדים באוויר.

4. שינוי חמצוני (איור 3)

  1. דילל GFAP ל-0.3 מ"ג/מ"ל באוריאה של 6 מ' בבופר מלח נמוך (10 מ"מ טריס-HCl, pH 8, 1 מ״מ EDTA ו-14.4 מ״מ β-מרקפנתנול) בטמפרטורת החדר למשך 2 שעות.
  2. דיאליזציה נגד בופר מלח נמוך המכיל 4 מיליון אוריאה למשך 2.5 שעות בטמפרטורת החדר. ערבבו את הבופר בעדינות באמצעות ערבוב מגנטי כדי לשמור על פיזור אחיד ולמנוע שיפוקי ריכוז.
  3. לאחר 2.5 שעות, העבר את ממברנת הדיאליזה לבופר המלח הנמוך המכיל 2 מיליון אוריאה לעוד 2.5 שעות בטמפרטורת החדר, תוך הבטחת ערבוב עדין לאורך כל התהליך.
  4. דיאליז נגד בופר מלח נמוך ללא אוריאה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 18 שעות.
  5. לטפל בדגימות שעברו דיאליזה ב-10 מ"מ H2O2 למשך 15 דקות, ולאחר מכן בטיפול ב-10 או 100 מ"מ דיתיותרייטול (DTT) למשך 15 דקות נוספות בטמפרטורת החדר.
  6. ניתחו דגימות חלבון לפי SDS-PAGE סטנדרטי של 10% (עם צבע) ללא β-מרקפנתנול וצבעו ב-10 מ"ל של Coomassie Blue.
    הערה: בעת שימושב-H2O2, יש לטפל בו בזהירות כי הוא חומר מחמצן חזק ועלול לגרום לכוויות. לבשו ציוד מגן אישי כדי להימנע ממגע עם העור והעיניים. DTT עלול לגרום לגירוי בעור, בעיניים ובמערכת הנשימה. בעת עבודה עם DTT ו-H2O2, חשוב לעקוב אחרי נהלי בטיחות נכונים כדי למזער סיכונים.

5. טיהור GFAP מהמוח של חולדות AxD (איור 4A,B)

  1. חילוץ רקמות מוח עם 10 מ"ל של בופר TEN (10 מ"מ טריס-HCl, pH 7.4, 100 מ"מ NaCl ו-5 מ"מ EDTA) באמצעות הומוגניזר דוס.
  2. בצנטריפוגה את המוח מתחבר ל-76,000x גרם בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות, ואז מוציאים את הכדור המתקבל עם 10 מ"ל בופר טריטון X-100 (1% (v/v) טריטון X-100 ב-TEN בופר).
  3. צנטריפוגה בעוצמה של 76,000x גרם בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות, ואז חילצו את הכדור המתקבל עם 10 מ"ל בופר סוכרוז (0.85 מיליון סוכרוז ו-0.5% (v/v) טריטון X-100 בבופר TEN).
  4. צנטריפוגה בטמפרטורה של 76,000 xגרם בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות, ואז חילצו את הכדור המתקבל עם 10 מ"ל של בופר מלח גבוה (1.5 מיליון KCl ו-0.5% (v/v) טריטון X-100 בבופר TEN).
  5. צנטריפוגה בעוצמה של 76,000x גרם בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות, ואז חילוץ את הכדור האחרון עם 10 מ"ל בופר אוריאה (8 מ' אוריאה, 10 מ"מ טריס-HCl, pH 7.4 ו-5 מ"מ EDTA).
  6. אספו את חלק הסופרנטנט ודיאליזם מול בופר עמודת Q (6 M אוריאה, 10 mM Tris-HCl, pH 8, 5 mM EDTA, ו-14.4 mM β-מרקפטואנול).
  7. טעין את הדיאליזטים על עמודת חילוף אניון במערכת כרומטוגרפיה NGC.
  8. שחרור את החלבון הקשור עם גרדיאנט ליניארי של 0-0.5 M NaCl בבופר Q בקצב זרימה של 1 מ"ל לדקה.
  9. בריכת שבר המכיל GFAP ודיאליזציה מול בופר עמודת S (6 מיליון אוריאה, 20 מ"מ מ' MES, pH 6 ו-14.4 מ"מ מ' β-מרקפטואנול).
  10. מרחים דיאליזטים על עמודת חילוף קטיון, ואז שחררו את החלבונים הקשורים עם גרדיאנט ליניארי של 0-1 M NaCl בבופר S בקצב זרימה של 1 mL/דקה.
  11. נתחו שברים שנשלחו על ידי צביעת SDS-PAGE ו-Coomassie Blue Staining, ואספו כאלה המכילים GFAP מטוהרת.

6. ניתוח יוביקוויטינציה של GFAP באמצעות אימונובלוטינג (איור 4C)

  1. הרץ GFAP מטוהר על ג'ל SDS-PAGE של 10% (בלי v).
  2. העבר את החלבונים מהג'ל לממברנת ניטרוצלולוז.
  3. חסמו את הממברנה על ידי דגירה ב-10 מ"ל של אלבומין סרום בקר של 3% (w/v) במי מלח טריס-בופר (TBS: 20 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl) המכיל 0.1% (v/v) Tween 20 (TBST) למשך שעה בטמפרטורת החדר.
  4. דגרו את הממברנה ב-5 מיקרוליטר אנטי-GFAP ו-5 מיקרוליטר נוגדנים ראשוניים אנטי-יוביקוויטין מדוללים ב-5 מ"ל TBST בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס במהלך הלילה. שטוף את הממברנה שלוש פעמים עם TBST.
  5. דגרו את הממברנה ב-5 מיקרו ליטר של נוגדנים משניים המשולבים עם צבעים פלואורסצנטיים, מדוללים ב-5 מ"ל TBST, בטמפרטורת החדר למשך לפחות שעה. שטוף את הממברנה שלוש פעמים עם TBST.
  6. לצלם תמונות באמצעות מערכת זיהוי תמונה פלואורסצנטית.
  7. נתחו הרכבה חוץ-גופית של GFAP טבעי באמצעות TEM ובדיקות משקעים (איור 5) באמצעות אותו הליך כפי שמתואר בשלבים 2.1 עד 2.13 ובשלבים 3.1 עד 3.6.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

כדי לחקור כיצד מוטציות הגורמות ל-AxD משפיעות על תכונות ההרכבה של GFAP, יצרנו חלבונים רקומביננטיים בחיידקים באמצעות מערכת ביטוי מבוססת PET. אנו מפרטים את הפרוטוקולים לביטוי וטיהור GFAP, תוך שימוש ב-WT GFAP כדוגמה. לאחר השראת IPTG (איור 1A, נתיב 2), GFAP טוהר בתהליך בן שלושה שלבים הכולל הכנת גוף הכללה (איור 1B) וכרומטוגרפיית חילוף יונים עם עמודת CM (איור 1C, נתיב 1) ועמודת Q (איור 1C, נתיבים 2 ו-3).

<...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

פרוטוקול זה קובע מסגרת ניסויית מקיפה לאפיון הביוכימי של GFAP והמוטנטים הקשורים למחלות. על ידי מתן גישה אמינה וסטנדרטית, שיטה זו מהווה משאב חשוב שמעמיק את הבנתנו את התפקידים הביולוגיים של GFAP ואת השלכותיו הפתולוגיות, במיוחד בהקשר של AxD. בחלק זה נדון בכמה היבטים קריטיים של הפרוטוקול, כולל שינויים אפשריים ואסטרטגיות פתרון תקלות, מגבלות השיטה, חשיבותה בהשוואה לגישות קיימות, וחשיבותה הרחבה יותר ויישומיה בתחומי מחקר ספציפיים.

במחקר זה, קבענו פרוטוקול סטנדרטי לטיהו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

אנו מודים לד"ר טרייסי האגמן (מרכז וייסמן, אוניברסיטת ויסקונסין-מדיסון) על סיפוק חולדות R237H שנכנסות למים. ההצעה והתמיכה של פרופ' אלבי מסינג (מרכז וייסמן, אוניברסיטת ויסקונסין-מדיסון) במחקר זה מוערכות מאוד. עבודה זו נתמכה במענקים ממשרד המדע והטכנולוגיה (111-2320-B-007-008 ו-112-2320-B-007-006 ל-N.-H. L. ו-M.-D.P.). אנו גם מודים ל-BioTEM באוניברסיטת טינג חואה הלאומית (MOST-104-2731-M-007-002) על השימוש בציוד במחקר זה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
30% פתרון אקרילאמיד/ביס 37.5:1ביוראד1610158
אמוניום פרסולפט (APS)ביוראד1610700
אמפיציליןUSB11259
נוגדן אנטי-GFAPטכנולוגיית איתות סלולרי12389
נוגדן אנטי-יוביקוויטיןמיליפורST 1200שיבוט FK2
צנטריפוגה Avanti J-26S XPבקמן
כלורואמפניקולUSB23660
CM-ספרוזציטיבה1707 1901
צבע כחול קומאסיUSB32826
רשת נחושתטד פלה01753-F
CS 150 NX Micro אולטרצנטרפוג'היטאצ'יNA
הומוגנייזר Dounceוויטון
DTTURDTT
זן E. coli BL21(DE3) pLysSאג'ילנט
EasiGlowטד פלה
מגיב ECLפרקיןאלמרNEL 105001
EDTAUSB15699
H2O2סיגמא-אלדריץ'18312
עמודת HiRes Sציטיבה2927 5877
עמודת HiTrap Qציטיבה1711 5301
IPTGURIPTG
KClהוניוול12636
LB בינוני (LB אגר)USB75851
LB בינוני (LB Broth)BD Difco244620
מרקפטואנולסיגמא-אלדריץ'M3148
MESסיגמא-אלדריץ'M8250
NaClהוניוול31434S
מערכת כרומטוגרפיה NGCBioRad
אופטימה XE-90 אולטרה-צנטריפוגהבקמן
PMSFאקרוס אורגניקס215740050
פוליאטילנימיןסיגמא-אלדריץ'P3143
רוטורבקמן
רוטור S55Sהיטאצ'י
רוטור S80AT3היטאצ'י
SDSUSB75819
SDS-PAGEביוראד
StarBright Blue 520 נגד עכבר עזים IgG ביוראד12005867
StarBright Blue 700 עזים נגד ארנבים IgG BioRad12004161
סוקרוזהסיגמא-אלדריץ'S5391
TEMEDUSB76320
מיקרוסקופ אלקטרונים מעברית H-7700)היטאצ'יNA
טריסUSB75825
טריטון X-100סיגמא-אלדריץ'T9284
אצטט אורנילמדעי מיקרוסקופ אלקטרונים  22400
אוריאההוניוול15604H

מקורות

  1. Brenner, M., et al. Mutations in GFAP, encoding glial fibrillary acidic protein, are associated with Alexander disease. Nat Genet. 27 (1), 117-120 (2001).
  2. Hagemann, T. L., et al. Gene expression analysis in mice with elevated glial fibrillary acidic protein and Rosenthal fibers reveals a stress response followed by glial activation and neuronal dysfunction. Hum Mol Genet. 14 (16), 2443-2458 (2005).
  3. Hagemann, T. L. Alexander disease: models, mechanisms, and medicine. Curr Opin Neurobiol. 72, 140-147 (2022).
  4. Iwaki, T., et al. Alpha B-crystallin and 27-kd heat shock protein are regulated by stress conditions in the central nervous system and accumulate in Rosenthal fibers. Am J Pathol. 143 (2), 487-495 (1993).
  5. Goldman, J. E., Corbin, E. Rosenthal fibers contain ubiquitinated alpha B-crystallin. Am J Pathol. 139 (4), 933-938 (1991).
  6. Yang, A. W., Lin, N. H., Yeh, T. H., Snider, N., Perng, M. D. Effects of Alexander disease-associated mutations on the assembly and organization of GFAP intermediate filaments. Mol Biol Cell. 33 (8), ar69(2022).
  7. Chen, Y. S., Lim, S. C., Chen, M. H., Quinlan, R. A., Perng, M. D. Alexander disease-causing mutations in the C-terminal domain of GFAP are deleterious both to assembly and network formation with the potential to both activate caspase 3 and decrease cell viability. Exp Cell Res. 317 (16), 2252-2266 (2011).
  8. Battaglia, R. A., et al. Site-specific phosphorylation and caspase cleavage of GFAP are new markers of Alexander disease severity. Elife. 8, e47789(2019).
  9. Viedma-Poyatos, A., Gonzalez-Jimenez, P., Pajares, M. A., Perez-Sala, D. Alexander disease GFAP R239C mutant shows increased susceptibility to lipoxidation and elicits mitochondrial dysfunction and oxidative stress. Redox Biol. 55, 102415(2022).
  10. Lin, N. H., Jian, W. S., Snider, N., Perng, M. D. Glial fibrillary acidic protein is pathologically modified in Alexander disease. J Biol Chem. 300 (7), 107402(2024).
  11. Kondo, T., et al. Modeling Alexander disease with patient iPSCs reveals cellular and molecular pathology of astrocytes. Acta Neuropathol Commun. 4 (1), 69(2016).
  12. Hagemann, T. L., et al. Antisense therapy in a rat model of Alexander disease reverses GFAP pathology, white matter deficits, and motor impairment. Sci Transl Med. 13 (620), eabg4711(2021).
  13. Bar, H., et al. Severe muscle disease-causing desmin mutations interfere with in vitro filament assembly at distinct stages. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (42), 15099-15104 (2005).
  14. Gu, L. H., Coulombe, P. A. Defining the properties of the nonhelical tail domain in type II keratin 5: insight from a bullous disease-causing mutation. Mol Biol Cell. 16 (3), 1427-1438 (2005).
  15. Wessel, D., Flugge, U. I. A method for the quantitative recovery of protein in dilute solution in the presence of detergents and lipids. Anal Biochem. 138 (1), 141-143 (1984).
  16. Ralton, J. E., Lu, X., Hutcheson, A. M., Quinlan, R. A. Identification of two N-terminal non-alpha-helical domain motifs important in the assembly of glial fibrillary acidic protein. J Cell Sci. 107 (Pt 7), 1935-1948 (1994).
  17. Nagai, K., Thogersen, H. C. Synthesis and sequence-specific proteolysis of hybrid proteins produced in Escherichia coli. Methods Enzymol. 153, 461-481 (1987).
  18. Vorgias, C. E., Traub, P. Isolation of glial fibrillary acidic protein from bovine brain white matter and its purification by affinity chromatography on single-stranded DNA-cellulose. Biochem Biophys Res Commun. 115 (1), 68-75 (1983).
  19. Vorgias, C. E., Traub, P. Nucleic acid-binding activities of the intermediate filament subunit proteins desmin and glial fibrillary acidic protein. Z Naturforsch C J Biosci. 41 (9-10), 897-909 (1986).
  20. Lin, N. H., Jian, W. S., Perng, M. D. Deletions in glial fibrillary acidic protein leading to alterations in intermediate filament assembly and network formation. Int J Mol Sci. 26 (5), 1913(2025).
  21. Herrmann, H., Kreplak, L., Aebi, U. Isolation, characterization, and in vitro assembly of intermediate filaments. Methods Cell Biol. 78, 3-24 (2004).
  22. Kim, B., Kim, S., Jin, M. S. Crystal structure of the human glial fibrillary acidic protein 1B domain. Biochem Biophys Res Commun. 506, 2899-2905 (2018).
  23. Lin, N. H., Messing, A., Perng, M. D. Characterization of a panel of monoclonal antibodies recognizing specific epitopes on GFAP. PLoS One. 12 (7), e0180694(2017).
  24. Eliasson, C., et al. Intermediate filament protein partnership in astrocytes. J Biol Chem. 274 (34), 23996-24006 (1999).
  25. Jing, R., et al. Synemin is expressed in reactive astrocytes in neurotrauma and interacts differentially with vimentin and GFAP intermediate filament networks. J Cell Sci. 120 (Pt 7), 1267-1277 (2007).
  26. Thomsen, R., Pallesen, J., Daugaard, T. F., Borglum, A. D., Nielsen, A. L. Genome-wide assessment of mRNA in astrocyte protrusions by direct RNA sequencing reveals mRNA localization for the intermediate filament protein nestin. Glia. 61 (11), 1922-1937 (2013).
  27. Perng, M. D., et al. Intermediate filament interactions can be altered by HSP27 and alphaB-crystallin. J Cell Sci. 112 (Pt 13), 2099-2112 (1999).
  28. Tian, R., Gregor, M., Wiche, G., Goldman, J. E. Plectin regulates the organization of glial fibrillary acidic protein in Alexander disease. Am J Pathol. 168 (3), 888-897 (2006).
  29. Lin, N. H., Yang, A. W., Chang, C. H., Perng, M. D. Elevated GFAP isoform expression promotes protein aggregation and compromises astrocyte function. FASEB J. 35 (5), e21614(2021).
  30. Hagemann, T. L., Connor, J. X., Messing, A. Alexander disease-associated GFAP mutations in mice induce Rosenthal fiber formation and a white matter stress response. J Neurosci. 26 (43), 11162-11173 (2006).
  31. Eng, L. F. The glial fibrillary acidic protein: the major protein constituent of glial filaments. Scand J Immunol Suppl. 9, 41-51 (1982).
  32. Yen, S. H., Dahl, D., Schachner, M., Shelanski, M. L. Biochemistry of the filaments of brain. Proc Natl Acad Sci U S A. 73 (2), 529-533 (1976).
  33. Goldman, J. E., Schaumburg, H. H., Norton, W. T. Isolation and characterization of glial filaments from human brain. J Cell Biol. 78 (2), 426-440 (1978).
  34. Tsukita, S., Ishikawa, H., Kurokawa, M. Isolation of 10-nm filaments from astrocytes in the mouse optic nerve. J Cell Biol. 88 (1), 245-250 (1981).
  35. Rasmussen, S., Sensenbrenner, M., Devilliers, G., Schousboe, A., Bock, E. Isolation of intermediate filaments from rat astrocytes in culture. Neurosci Lett. 25 (2), 119-124 (1981).
  36. Yang, Z. W., Babitch, J. A. Factors modulating filament formation by bovine glial fibrillary acidic protein, the intermediate filament component of astroglial cells. Biochemistry. 27 (18), 7038-7045 (1988).
  37. Liem, R. K., Hutchison, S. B. Purification of individual components of the neurofilament triplet: filament assembly from the 70 000-dalton subunit. Biochemistry. 21 (13), 3221-3226 (1982).
  38. Dahl, D., Bignami, A. Glial fibrillary acidic protein from normal and gliosed human brain: demonstration of multiple related polypeptides. Biochim Biophys Acta. 386 (1), 41-51 (1975).
  39. Fukuyama, R., Fushiki, S., Fujita, S. Purification of glial fibrillary acidic protein (GFAP) from normal bovine brain. J Neurosci Methods. 40 (2-3), 133-137 (1991).
  40. Dahl, D., Crosby, C. J., Gardner, E. E., Bignami, A. Purification of the glial fibrillary acidic protein by anion-exchange chromatography. Anal Biochem. 126 (1), 165-169 (1982).
  41. Dahl, D., Bignami, A. Glial fibrillary acidic protein from normal human brain: purification and properties. Brain Res. 57 (2), 343-360 (1973).
  42. Perng, M., et al. The Alexander disease-causing glial fibrillary acidic protein mutant, R416W, accumulates into Rosenthal fibers by a pathway that involves filament aggregation and the association of alpha B-crystallin and HSP27. Am J Hum Genet. 79 (2), 197-213 (2006).
  43. Hsiao, V. C., et al. Alexander-disease mutation of GFAP causes filament disorganization and decreased solubility of GFAP. J Cell Sci. 118 (Pt 9), 2057-2065 (2005).
  44. Rueger, D. C., Dahl, D., Bignami, A. Purification of a brain-specific astroglial protein by immunoaffinity chromatography. Anal Biochem. 89 (2), 360-371 (1978).
  45. Bignami, A., Dahl, D. Isolation of GFA protein from normal brain-a comment. J Histochem Cytochem. 27 (2), 693-696 (1979).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

GFAPSDS Page
גישות ניסיוניות לניתוח ביוכימי של חלבון חומצי סיבי גליאלי ושל וריאנטים הקשורים למחלה
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.