מאמר שיטה

דימות סופר-רזולוציה של תא שלם באמצעות DNA-PAINT על דיסק מסתובב עם הקצאת פוטונים אופטית

1.3K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/69531

⸱

6 בינואר 2026

 ,  ,  , 
1London Centre for Nanotechnology, University College London, 2Department of Chemistry, University College London

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מפרט את ההליך לביצוע מיקרוסקופ לוקליזציה עמוק של תא שלם, עם מולקולה בודדת (SMLM) באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי בדיסק מסתובב עם הקצאת פוטונים אופטית, ובכך מאפשר הדמיית DNA-PAINT ללא צורך באופטיקה מותאמת אישית או תאורה מורכבת.

תקציר

מיקרוסקופ לוקליזציה חד-מולקולית (SMLM) מאפשר הדמיה בקנה מידה ננומטרי של מבנים תאיים, אך בדרך כלל מוגבל להדמיה סמוכה לכיסוי הכיסוי בשל מגבלות של פלואורסצנציה פנימית כוללת (TIRF) ותאורת יריעות אופטיות (HILO) עם נטייה גבוהה. כאן מוצג פרוטוקול המשתמש במיקרוסקופ קונפוקלי דיסק מסתובב המצויד בהקצאת פוטונים אופטית (SDC-OPR) לביצוע SMLM בתאים שלמים. שיטה זו מאפשרת הדמיה מדויקת של מולקולה בודדת בכל נפח התא המלא באמצעות צבירת נקודות DNA להדמיה בטופוגרפיה בקנה מידה ננומטרי (DNA-PAINT) ללא צורך באופטיקה מותאמת אישית או שיטות תאורה מורכבות. הפרוטוקול מספק מדריך שלבי להגדרת מיקרוסקופ דיסק מסתובב זמין מסחרית (למשל, CSU-W1 SoRA) להדמיית SMLM, כולל פרמטרי רכישה המותאמים להדמיה עמוקה. מפורטים שלבי הכנת דגימה לתיוג מטרות תוך-תאיות באמצעות גשושים מצומדים ב-DNA לביצוע הדמיית DNA-PAINT, כולל אסטרטגיות להדמיה רב-צבעונית של מספר מטרות. רכישת תמונה מלווה בלוקליזציה ושחזור של מולקולה אחת באמצעות חבילות תוכנה סטנדרטיות. שיקולים קריטיים למזעור רקע, אופטימיזציה של הרזולוציה הצידית והבטחת איכות הדמיה לאורך כל עומק התא נדונים גם הם. פרוטוקול נגיש זה מאפשר לחוקרים לבצע SMLM עמוק של תאים שלמים באמצעות ציוד קונפוקלי סטנדרטי, ולהרחיב את טווח השאלות הביולוגיות שניתן לטפל בהן באמצעות הדמיה במולקולה בודדת מעבר לאזורים הקרובים לממברנה.

מבוא

מיקרוסקופ לוקליזציה חד-מולקולית (SMLM)1 הוא משפחה של טכניקות סופר-רזולוציה שמשיגות רזולוציה בקנה מידה ננומטרי על ידי הפרדה זמנית של פליטת פלואורופורים בודדים ומיקומם בדיוק גבוה. SMLM מוצלח דורש יחס אות לרעש (SNR) גבוה לזיהוי אירועים של מולקולה בודדת, מה שהגביל באופן מסורתי את השימוש בו למערכות אופטיות המספקות עירור אינטנסיבי ומקומי. התצורות הנפוצות ביותר הן מיקרוסקופ פלואורסצנציה פנימית מלאה (TIRF)2 ותאורת יריעת אופטית למינציה (HILO) בעלת נטייה גבוהה3. TIRF מפחית פלואורסצנציה ברקע על ידי יצירת שדה חולף שמעורר באופן סלקטיבי פלואורופורים בתוך כמה ננומטרים מהמכסה, ובכך מדכא תאורה מחוץ למיקוד. עם זאת, הגבלה זו הופכת את TIRF לבלתי מתאים להדמיה של מבנים ביולוגיים עמוקים יותר, כגון אברונים המתפשטים לתחום החוץ-תאי. מיקרוסקופיית הילו מספקת עומקי חדירה גדולים יותר, ומאפשרת הדמיה של כמה מאות ננומטרים מעל מצע הזכוכית. זה בא על חשבון שדה ראייה מופחת (FOV)4 ותאורה לא אחידה עם מישורים גבוהים יותר ויותר, מה שמגביל את היישום שלו למבנים תאיים גדולים יותר. בשנים האחרונות, טכניקות מיקרוסקופיית יריעת אור (LSM) כגון יריעת אור רשת 5,6,7 ומיקרוסקופיית תאורה חד-מישורית (soSPIM)8 הרחיבו את SMLM להדמיה נפחית ובקנה מידה רקמתי. על ידי עיצוב קרן העירור ללוחות אור דקים ומובנים, LSM משיג חתך אופטי עם רקע ופוטוטוקסיות מופחתת. SoSPIM לוכדת מישורי מוקד אורתוגונליים לציר הזיהוי בחשיפה אחת, ומאפשרת דימות נפחי מהיר ברזולוציה כמעט איזוטרופית. יישום soSPIM הדגים SMLM תלת-ממדי בתאים שלמים ואברונים קטנים (עומק >20 מיקרון) ברזולוציה איזוטרופית של עד 40 ננומטר, ועם רקע מינימלי מחוץ לפוקוס9. למרות עוצמתן, שיטות אלו דורשות בדרך כלל דגימות שקופות, אופטיקה מיוחדת ויישור מורכב, ונשארות רגישות לסטיות ופיזור אופטי בדגימות עבות יותר.

מיקרוסקופיה קונפוקלית מציעה אלטרנטיבה על ידי דחיית אור מחוץ לפוקוס באמצעות חור סיכה מול הגלאי, בשילוב עם מראות סריקהקרן 10. יכולת חתך אופטי זו מאפשרת הדמיה נפחית עמוקה עם SNR גבוה. במיוחד, מיקרוסקופיית דיסק מסתובב (SDC) משלבת מהירות וזיהוי שדה רחב של הדמיה קונבנציונלית עם יכולת החתך של מערכות סריקה נקודתית. זה מושג ב-SDC קונבנציונלי באמצעות שילוב דיסק מסתובב עם חורים מקבילים, לעיתים משולב עם מערך מיקרועדשות מיושר. המיקרועדשות אוספות חלק ניכר מהפלואורסצנציה הנפלטת וממקדות אותו דרך החורים הסיניים, מה שמפחית את אות הרקע. תצורה זו מספקת חתך אופטי מהיר ללא צורך באופטיקה מיוחדת או הכנה נוספת להרכבת דגימות, מה שהופך אותה לבחירה חזקה שניתן ליישם ולהתאים בקלות לרכישת תמונות SMLM בנפח עמוק11.

במחקר זה נעשה שימוש ביחידת הסורק הקונפוקלי של דיסק הסיבוב CSU-W1, המצוידת בהקצאת פוטונים אופטית (SDC-OPR). בניגוד ל-SDC סטנדרטי, SDC-OPR מציג מערך מיקרועדשות שני שמקרין את הפוטונים הנפלטים על תבנית סיכה משלים12, כדי לצמצם פיזור ולהחזיר פוטונים שהיו נזרקים אחרת. הקצאת פוטונים זו מחדדת למעשה את פונקציית פיזור הנקודות (PSF), ומגבירה את הרזולוציה הצדדית מעבר לזו של SDC קונבנציונלי תוך דחיית אור לא פוקוס13. באופן ספציפי, מערך המיקרועדשות SDC-OPR מפנה פוטונים מחוץ לציר לנקודות המקור הקרובות ביותר שלהם, ובכך מגביר למעשה את בהירות הפלואורסצנציה שזוהתה בהשוואה ל-SDC סטנדרטי. יתרה מזאת, יתרונות הרזולוציה של SDC-OPR יכולים להיות מוגברים באמצעות דה-קונבולוציה של תמונה. אלגוריתמים איטרטיביים של דה-קונבולוציה מחדדים חישובית את ה-PSF, מפחיתים רקע ומשפרים את יחס האות לרקע מבלי לדרוש שינויים בתצורה האופטית. גישה משולבת זו מספקת יתרון משמעותי מבחינת דיוק לוקליזציה על פני SDC סטנדרטי בניסויי לוקליזציה של מולקולה בודדת14.

כאן מוצג פרוטוקול עמיד וניתן לשחזור למיקרוסקופ לוקליזציה של מולקולה בודדת באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי בדיסק מסתובב המצויד בהקצאת פוטונים אופטית (SDC-OPR). גישה זו משלבת את הדיוק בקנה מידה ננומטרי של DNA-PAINT עם מהירות, שדה הראייה וחדירת העומק של הדמיית דיסק מסתובב. DNA-PAINT, התאמה של הצטברות נקודתית להדמיית טופוגרפיה ננומטרית (PAINT)15, מתבססת על היברידיזציה זמנית של גדילי "צילום" מסומנים פלואורסצנטית עם חוטי "עגינה" משלימים המעוגנים למטרות מולקולריות. אירועי קישור הפיכים אלו יוצרים אותות פלואורסצנציה סטוכסטיים שניתן למקם במדויק, ומאפשרים שחזור ברזולוציה גבוהה של אולטרה-מבנה תאי. DNA-PAINT מאפשר שימוש בפלואורופורים פוטוסטביליים מאוד, מספק קינטיקה קשירה מכווננת לשליטה מדויקת בתנאי הדמיה, ומפחית פוטובלינינג באמצעות מילוי רציף של גדילי המצלמה הפלואורסצנטיים16.

כדי להבטיח שחזוריות וספציפיות, הגישה מתבססת על קונוגטים מותאמים אישית של נוגדנים DNA, המקשרים גדילי עגינה לנוגדנים משניים. הוצגו שלבי הכנת דגימה מפורטים, כולל הצמדת נוגדנים-DNA, כדי לתמוך בתוצאות ניסוי איתנות. הפרוטוקול מאומת על מבנים תאיים מאופיינים היטב כגון קומפלקסים של נקבוביות גרעיניות (NPCs)17 ומיקרוטובולים בדגימות קבועות, ומספק נקודת ייחוס להערכת דיוק השחזור. שינויים ברזולוציה, המכומתים באמצעות דיוק לוקליזציה כפרוקסי, מוערכים עוד יותר כפונקציה של שדה ראייה ועומק הדמיה.

בנוסף, היעילות של תהליך עבודה זה בהדמיה מרוב-פלקסית מודגמת באמצעות Exchange-PAINT18, אסטרטגיה המאפשרת ויזואליזציה רציפה של מספר מטרות עם אותו צבע ומקור לייזר יחיד המבוסס על DNA-PAINT. תהליך העבודה של Exchange-PAINT מיושם על הדמיה רב-צבעונית ברזולוציה סופר של מיטוכונדריה, מיקרוטובולים ו-NPCs באותו מדגם.

ביחד, פרוטוקול זה מספק הנחיות מקיפות והערות מפתח להתאמה על הצמדת נוגדנים-DNA, הכנת דגימות, תנאי הדמיה וניתוח נתונים, ומאפשר לחוקרים לבצע הדמיה שכפולה של DNA-PAINT על SDC-OPR. על ידי הרחבת הדמיה ברזולוציה גבוהה מעבר למגבלות העומק ושדה הראייה של גישות מבוססות TIRF, שיטה זו מרחיבה את היישום של SMLM למגוון רחב של הקשרים ביולוגיים.

פרוטוקול

החומרים והציוד בהם משתמשים מופיעים בטבלת החומרים.

1. הכנת בופרים

  1. הכנת בופר שלד ציטוקלטון (CB):
    1. הכינו 10 מ"מ MES (pH 6.1) עם 150 מ"מ מ״ר נ״כל, 5 מ״מ EGTA, 5 מ״מ D-גלוקוז, ו־5 מ״מ מ״ר מ״ג2 בתמיסת בופר פוספט מסוננת (PBS).
    2. אחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס וסינון לפני השימוש.
  2. הכנת מלאי חומצה פרוטוקטכואית (PCA) 40x:
    1. המיס 154 מ"ג PCA ב-10 מ"ל מים מזוקקים ומסוננים.
    2. כוון את ה-pH ל-9.0 עם NaOH.
    3. עליקו ואחסנו בטמפרטורה של מינוס 20°C למשך מקסימום של 6 חודשים.
      הערה: אם כל אליקווט נראה חום, השליכו אותו, שכן זה מעיד על חמצון.
  3. הכנת מלאי של 100x פרוטוקטצ'ואט-3,4-דיאוקסיגנאז (PCD):
    1. הכינו תמיסה של 50% גליצרול עם 50 מ"מ KCl, 1 מ"מ EDTA, ו-100 מ"מ בופר טריס.
    2. המיס 2.2 מ"ג PCD ב-3.4 מ"ל של תמיסת גליצרול.
    3. אליקווט ואחסן בטמפרטורה של מינוס 20°C למשך מקסימום של 6 חודשים.
  4. הכנת מלאי טרולוקס 100x:
    1. המיס 50 מ"ג טרולוקס (6-הידרוקסי-2,5,7,8-טטרמתילכרומן-2-חומצה קרבוקסילית) ב-215 מיקרוליטר מתנול עד שהתמיסה הופכת לירוקה בתוך מכסה אדים כימי באמצעות ציוד מגן אישי (PPE) מתאים.
    2. הוסיפו 1.6 מ"ל מים מזוקקים ומסוננים. תן לתמיסה להפוך ללבן ולהתחיל להתגבש.
    3. הוסף 175 מיקרוליטר של 1M NaOH 1M. תן לתמיסה להתחיל להפוך שוב לנוזל.
    4. בנפחים של 10 מיקרוליטר, המשיכו להוסיף 1 M NaOH עד שהתמיסה מתבהרת לחלוטין (כ-40 מיקרוליטר).
    5. אליקווט ואחסן בטמפרטורה של מינוס 20°C למשך מקסימום של 6 חודשים. התמיסה הסופית נראית צהבהבה.
      הערה: התמיסה הסופית של 100x היא בעלת pH של 11, אך דילול ל-1x מביא ל-pH של 7-8.
  5. בופר C+
    1. הכינו 1 mM EDTA, 500 mM NaCl ותמיסה של 0.02% Tween-20 ב-1x PBS.
    2. כוון את ה-pH ל-7.4 עם HCl ו/או NaOH לפי הצורך.
    3. תוספת טרולוקס אופציונלית: הוסף כמויות נדרשות של מלאי PCA (40x), PCD (100x) וטרולוקס (100x) כדי לגרום לדילול פי 1, להשאיר את התמיסה לאיזון למשך שעה בטמפרטורת החדר (23°C) לפני השימוש.
      הערה: הכינו טרי מדי שבוע. אם אתה משתמש בטרולוקס, השתמש בזה בתוך 4 שעות מהערבוב.
  6. מאגרי צביעה חיסונית (פאראפורמלדהיד PFA, גליצין וטריטון):
    1. להכנה של 4% PFA מאפולה 10 מ"ל עם 16% PFA:
      1. בתוך מכסה אדים כימי, פתח בזהירות את האמפולה.
      2. שחרור 10 מ"ל של 16% PFA לתוך צינור צנטריפוגלי קוני של 50 מ"ל.
      3. בצע דילול של 1:4 ב-1x PBS כדי לקבל 4% PFA, תוך הוספת ~30 מ"ל של 1x PBS מסונן ל-16% PFA המכוון, כך שנפח סופי יהיה ~40 מ"ל.
      4. יש לחבר אליקווט לצינורות מיקרוצנטריפוגה בנפח 1 מ"ל ואחסן בטמפרטורה של מינוס 20°C עד שנדרש.
    2. עבור 60 מ"מ גליצין בהכנת PBS:
      1. שקול 225 מ"ג גליסין לתוך צינור צנטריפוגלי קוני של 50 מ"ל.
      2. הוסף 50 מ"ל של PBS מסונן 1x.
      3. מערבולות עד שהן מעורבבות ומסננות במלואן.
      4. אחסן ב-4 מעלות צלזיוס עד שנדרש.
    3. להכנת טריטון X-100 של 0.1%:
      1. ראשית, הכינו מלאי עבודה של 10% טריטון X-100 על ידי דילול 1 מ"ל של טריטון X-100 100% ל-9 מ"ל של PBS מסונן 1x (נפח סופי = 10 מ"ל), פיפטה וערבב לאט כדי למנוע בועות יתר. אחסן ב-4 מעלות צלזיוס עד שנדרש.
      2. מ-10% המלאי העובד, הוסיפו 0.1 מ"ל של 10% Triton X-100 ל-9.9 מ"ל של PBS מסונן פעמיים עבור המלאי הסופי של 0.1%, ושוב ערבבו לאט. אחסן ב-4 מעלות צלזיוס עד שנדרש.

2. הצמדת נוגדנים-DNA

  1. רכזו את הנוגדן באמצעות יחידת פילטר צנטריפוגלית אולטרה-פילטרציה של 100 קילו-דלטון:
    1. שטוף יחידת סינון צנטריפוגלי אולטרה-פילטרציה של 100 קילו-דלטון עם 100 מיקרוליטר של PBS מסונן 1x למשך 30 דקות בטמפרטורה של 14,000 x גרם, 4 מעלות צלזיוס.
    2. הוסף 100 מיקרוליטר נוגדן עם 200 מיקרוליטר של PBS מסונן 1x ליחידת המסנן הצנטריפוגלי אולטרהפילטרציה של 100 קילו-דלטון שנשטפה קודם לכן, סובב במשך 30 דקות בטמפרטורה של 14,000 x גרם, 4° צלזיוס. ודא שריכוז הנוגדנים גבוה מ-1.5 מ"ג/מ"ל לאחר הריכוז עם מסנן הצנטריפוגלי אולטרה-פילטרציה. בשיטה זו, מסנן הצנטריפוגלי של אולטרפילטרציה בדרך כלל מרכז את הנוגדן פי ~3.
    3. הפוך את יחידת הסינון הצנטריפוגלי אולטרה-פילטרציה של 100 קילו-דלטון לצינור נקי, סובב במשך 6 דקות בטמפרטורה של 1000 x g, 4 מעלות צלזיוס. זהו הנוגדן המרוכז ב-PBS.
    4. למדוד את נפח הנוגדן המרוכז (1 או 2 מיקרוליטר) לחישוב הריכוז החדש ולהריץ ספקטרום ספיגת UV-Vis עם ספקטרופוטומטר UV-Vis מיקרוווליום. הגדר רקע ל-1x PBS ושמור את הספקטרום.
  2. הפחתת גדיל העגינה של ה-DNA התיאולטי:
    1. המיס 7.7 מ"ג של DTT משוקלל מראש ב-100 מיקרוליטר מים מסוננים, והעבר לצינור טרי.
    2. הוסף 100 מיקרוליטר של 3 מ"מ EDTA ב-1x PBS לצינור המקורי של DTT, וורטקס, והעבר לאותו צינור כמו שלב 2.2.1, מה שמוביל ל-200 מיקרוליטר של 250 מ"מ מולר DTT ב-1.5 מ"מ EDTA ב-1x PBS.
    3. המיס את חוט העגינה של ה-DNA התיאולטי ל-1x PBS מסונן לריכוז סופי של 1 מ"מ. הקלט ספקטרום UV-Vis של תמיסת גדיל העגינה של ה-DNA (מדולל ל-10 מיקרומום ב-1x PBS) ושמור אותו באמצעות ספקטרופוטומטר מיקרו-ווליום UV-Vis.
    4. מערבבים 13 מיקרוליטר DNA תיאולטי (1 מ״מ) עם 30 מיקרוליטר DTT (250 מ״מ), ונערו במשך 2 שעות בטמפרטורת החדר (23 מעלות צלזיוס).
      הערה: יש לאחסן כל חוטי עגינה DNA שנותרו שלא נוצלו באליקוטים של 13 מיקרוליטר בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס לתגובות עתידיות.
  3. קונוגציית נוגדנים לקישור צולב:
    1. המיס את הקרוסלינקר אסטר מאלימיד-PEG2-סוקסינימידיל ב-DMSO ל-10 מ"ג/מ"ל (23.5 מ"מ). יש לאחסן ב-10 מיקרוליטר אליקווטים בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס עד שנדרש.
    2. מערבבים נוגדנים מרוכזים משלב 2.1 עם עודף מולר של פי 20 של הקרוסלינקר. דגרו במשך 90 דקות, עם ניעור, בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  4. טיהור סינון קרוסלינקר נוגדנים באמצעות עמודת הסרת מלח ספין של 7.0 KDa המכילה שרף עם הוצאת גודל (חיתוך משקל מולקולרי של 7 קילו-דלטון):
    1. הסר את הסגירה התחתונה של עמוד הספירת המלח של 7.0 kDa ושחרר את המכסה. הכניסו אותו לצינור מיקרוצנטריפוגה דלי חלבון. צנטריפוגה לדקה אחת בטמפרטורה של 1500 x g, 4 מעלות צלזיוס.
      הערה: סמן את הנטייה של השרף לאחר הסיבוב הראשון. לכל השימושים הבאים בעמוד, הניחו את השיפוע הפונה ישירות החוצה אל הצנטריפוגה. מרחו דגימות ושטיפות במרכז והימנעו ממגע עם מיטת השרף.
    2. הוסף 300 מיקרוליטר של PBS מסונן 1x למסנן עמוד הסרת מלח ספין של 7.0 קילו-דלטון, שחרר את המכסה, צנטריפוגה למשך דקה אחת בטמפרטורה של 1500 x g, 4 מעלות צלזיוס. חזור על זה עוד פעמיים.
      הערה: השאירו את עמודת הסרת המלח בספין של 7.0 KDa עם 300 מיקרוליטר של 1x PBS עד שתגובת הנוגדנים-קרוסלינקר מוכנה; אל תאפשר לעמוד להתייבש.
    3. הסר את 300 המיקרולטר האחרונים של שטיפה של PBS על ידי צנטריפוגה נוספת למשך דקה בטמפרטורה של 1500 x גרם, 4 מעלות צלזיוס.
    4. מרחו את תמיסת הנוגדנים-קרוסלינקר במרכז מיטת השרף, בכיוון הטיפה. הניחו את עמודת הסרת המלח הסיבובית של 7.0 kDa בצינור מיקרוצנטריפוגה נקי, צנטריפוגה למשך 2 דקות בטמפרטורה של 1500 x g, 4 מעלות צלזיוס. מוצר הנוגדנים-קרוסלינקר נמצא כעת בצינור המיקרוצנטריפוגה; שמור על 4 מעלות צלזיוס או על קרח.
  5. לטהר את תערובת ה-DNA-DTT באמצעות פירוק עמודות ספין עם Sephadex G-25 (שרף הוצאת גודל לטיהור DNA):
    1. מערבולות את עמודות הספין המפחיתות (טיהור DNA) כך שהשרף מתפזר באופן שווה. הסר את הסגירה התחתונה ושחרר את הפקק, והכניס אותו לצינור מיקרוצנטריפוגה נקי.
    2. הסרת עמודות ספין בצנטריפוגה (טיהור DNA) בטמפרטורה של 735 x גרם למשך דקה אחת להסרת בופר האחסון.
    3. הניחו עמודות סיבוב מסירות מלח (טיהור DNA) בצינור מיקרוצנטריפוגה טרי ומוסיפים לאט לאט את תערובת ה-DNA/DTT למרכז השרף. צנטריפוגה ב-735 x g למשך 2 דקות. ה-DNA המטוהר והמצומצם יהיה כעת בצינור המיקרוצנטריפוגה.
  6. שילוב של DNA ומוצרי נוגדנים-קרוסלינקרים:
    1. הוסף את ה-DNA המופחת למוצר הנוגדנים-קרוסלינקר בעודף מולר של פי 10 של DNA:נוגדן. ערבבו את ה-DNA המטוהר עם מוצר הנוגדנים-קרוסלינקר מיד לאחר הטיהור. זה מונע מה-DNA להיקשר מחדש.
    2. דגרו בלילה, ברעידה, בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
      הערה: ערבב את ה-DNA והנוגדן בשעות אחר הצהריים המאוחרות וטהר אותם מיד בבוקר שלמחרת. דגירה ממושכת של DNA ונוגדנים עלולה לגרום ליחסי DNA לנוגדנים גבוהים.
  7. הסר DNA עודף עם יחידת פילטר צנטריפוגלית אולטרה-פילטרציה של 100 קילודקאט בבוקר שלמחרת:
    1. שטוף את יחידת המסנן הצנטריפוגלי אולטרה-פילטרציה של 100 קילו-דלטון עם 300 מיקרוליטר של 1x PBS מסונן למשך 30 דקות בטמפרטורה של 14,000 x גרם ו-4 מעלות צלזיוס.
    2. הוסיפו את תערובת ה-DNA-נוגדנים עם 300 מיקרוליטר של PBS מסונן 1x ליחידת הסינון הצנטריפוגלי אולטרה-פילטרציה של 100 kDa וסובבו במשך 30 דקות ב-14,000 x g, 4 מעלות צלזיוס.
    3. הפוך את יחידת המסנן הצנטריפוגלי אולטרפילטרציה לצינור נקי, סובב 6 דקות בטמפרטורה של 1000 x g, 4 מעלות צלזיוס. זהו המוצר המרוכז ב-PBS.
    4. מדלל את המוצר ל-100 מיקרוליטר ב-PBS מסונן 1x.
    5. להקליט ספקטרום UV-Vis של המוצר (1 או 2 מיקרוליטר) באמצעות ספקטרופוטומטר UV-Vis מיקרוווליום, עם רקע של 1x PBS, ולשמור את הספקטרום.
    6. למדוד את הריכוז הסופי ואת יחס ה-DNA:נוגדנים מהספקטרום. שימו לב לשינוי בשיא הספיגה של הנוגדן מ-280 ננומטר ל-260 ננומטר, בשל הספיגה הנוספת מה-DNA. השתמש בשלב 2.8 כדי לקבוע את הריכוז ויחס ה-DNA:נוגדנים.
    7. אחסן את המוצר בתנאי האחסון המקוריים של הנוגדן בו השתמשו. אם אתה קופא, הימנע ממחזורי קיפאון-הפשרה.
  8. חישוב יחס DNA:נוגדנים מהספקטרום של UV-Vis:
    1. מהספקטרום של DNA טהור (10 מיקרומום ב-1x PBS), מדוד את ערכי הספיגה ב-260 ננומטר (משוואה 1) ו-280 ננומטר (משוואה 2). חלק אותם בריכוז ה-DNA (10 מיקרומון) כדי למצוא את מקדמי הספיגה המולרית של DNA (משוואה 3 ו משוואה 4- ).
    2. חזור על הפעולה כדי שהנוגדן ימצא משוואה 5 ו משוואה 6-, זכור לחלק בריכוז הנוגדן המשמש לספקטרום.
    3. מהספקטרום של המוצר, הספיגה ב-260 ננומטר ו-280 ננומטר תלויה הן בספיגה מה-DNA והן בנוגדן:
      משוואה 7
      משוואה 8
      כאשר cDNA ו-cAb הם הריכוזים של DNA ונוגדן, בהתאמה, בתוך המוצר הסופי. פתור את המשוואות האלה בו-זמנית כדי למצוא את הריכוז המולרי של DNA ושל נוגדן בתוך התוצר עצמו. חשב את היחס בין DNA:נוגדן באמצעות ריכוזים אלו.
      הערה: ניתן לחשב את ריכוז הנוגדן לספקטרום הראשון על ידי מדידת נפח הנוגדן שנותר לאחר הסינון באמצעות סינון יחידת סינון צנטריפוגלי אולטרה-פילטרציה של 100 קילו-דלטון, והשוואתו לנפח המקורי (בריכוז ידוע) של נוגדן בו השתמשו.

3. תרבית תאים

  1. תאי HeLa Kyoto mEGFP-Nup107.
    1. הכינו מלאי של מדיום תרבית תאים, Modified Eagle Medium (DMEM) של Dulbecco, בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS) ו-1% פניצילין/סטרפטומיצין (P/S), ואחסנו אותו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. חממו את המדיה מראש 30 דקות לפני השימוש באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. בהתאם לתנאי העבודה, מומלץ להפריד ולסנן את הכמות הנדרשת כדי למנוע זיהום.
    2. תאי זרעים ב-2 x 105 תאים/מ"ל ב-7 מ"ל של מדיום DMEM מחומם מראש בבקבוקי T25. הניחו את בקבוקי התאים באינקובטור מתאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס וסביבה של 5%CO2 .
    3. ודאו מעבר כל 48-72 שעות כדי למנוע צפיפות יתר.
      1. קחו לדוגמה את הבקבוקון T25 שמכיל את התרבות המשולבת ואת המדיה השאיפה מהבקבוק.
      2. פיפט 1 מ"ל של טריפסין EDTA (TE), ומבטיח כיסוי מלא על ידי הטיית הבקבוקון בעדינות. דגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 7 דקות כדי לאפשר ניתוק התאים מהבקבוקון.
      3. הוסיפו 2 מ"ל של מדיום DMEM מווסף וטריטורציה.
      4. העבר את תליית התא לצינור צנטריפוגלי קוני בקוטר 15 מ"ל עם תוספת של 7 מ"ל של מדיום DMEM מושלם.
      5. צנטריפוגה ב-400 x g למשך 5 דקות. בדוק בזהירות את היווצרות הכדורים בתחתית הצינור מבלי להפריע לו.
      6. שואף מדיום ותשהה מחדש את כדור התא במדיה DMEM שהושלמה.
      7. זרע 2 x 10תאים /מ"ל בבקבוק T25 חדש המכיל 7 מ"ל מדיום מחומם מראש. דגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5%CO2.
        הערה: אם אינך בטוח בצפיפות התאים, ניתן להשתמש בהמוסיטומטר כדי לקבוע את מספר התאים. מומלץ להתחיל עם השעיית כדורים של 1 מ"ל לפני הספירה.
  2. תאי U2OS CRISPR mEGFP-Nup96
    1. הכן 10% FBS ו-1% P/S משלים את המדיה 5A של McCoy's, בהתאם לשלב 3.1.1.
    2. תאי זרע בגודל 2 x 105 תאים/מ"ל ב-7 מ"ל של מדיום 5A של McCoy's בבקבוקי T25 שהושלמו. דגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5%CO2.
    3. מעבר כל 48 שעות כדי לשמור על גידול התרביות מתחת ל-80% מפגש מהר:
      1. שואבים מדיה מהבקבוק ושוטפים בעדינות את התרבית הדביקה עם 2 מ"ל של פילטר מסונן מראש (37 מעלות צלזיוס) 1x PBS.
      2. שאיפת PBS והוספה 2 מ"ל אקוטאז, הטתה את הבקבוק לאט כדי להבטיח כיסוי מלא, ואז דגרה ב-37 מעלות צלזיוס למשך 7 דקות.
      3. הוסף 2 מ"ל של מדיום 5A של McCoy's עם תוספת וטריטורציה.
      4. הוסיפו 7 מ"ל מדיה לתליית התא והעבירו אותה לצינור צנטריפוגלי קוני של 15 מ"ל או 50 מ"ל לצנטריפוגה. צנטריפוגה ב-400 x g למשך 5 דקות ובדוק אם יש יצירת כדורים בתחתית הצינור.
      5. להחזיר את כדור התא למדיום 5A של מקוי שהושלם.
      6. זרע ב-2 x 105 תאים/מ"ל בבקבוק T25 חדש עם מדיום חימום מראש של 7 מ"ל. דגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5%CO2.
        הערה: חמם את כל התמיסות שמוסיפות לתאים לטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באמבט מים או חרוזים. לגבי אקוטאז, חמם רק 2 מ"ל אליקוט לא יותר מ-5 דקות כדי למנוע התדרדרות.

4. צביעת חיסון של Nup96, מיטוכונדריה ומיקרוטובולים

  1. הכנת תאי U2OS mEGFP-Nup96
    1. בהתאם לשלבים שפורטו בשלב 3.2, שאף מדיום מבקבוק T25 ושוטף בעדינות את התאים הדבוקים עם 2 מ"ל של 1x PBS מסונן.
    2. שאיפת PBS והוספה 2 מ"ל אקויטאז, הטתה את הבקבוק לאט למעלה ולמטה, ודגרה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 7 דקות כדי לעודד את התנתקות התאים.
    3. הוסף 2 מ"ל של מדיום 5A של McCoy's עם תוספת וטריטורציה.
    4. מתלה תא עליון עם 7 מ"ל של מדיום 5A של McCoy's והעבר לצינור צנטריפוגלי קוני של 15 מ"ל או 50 מ"ל לפני צנטריפוגה ב-400 x g למשך 5 דקות. שוב, בדוק אם יש יצירת כדורים בתחתית הצינור.
    5. להחזיר את כדור התא למדיום 5A של מקוי שהושלם.
    6. תאי זרע בגודל 1 x 105 תאים/מ"ל במיקרוסליידס עם 8 בארות ודגירה בתנור התאים (37 מעלות צלזיוס, 5%CO2) במהלך הלילה.
      הערה: תאי זרע 24 שעות לפני הליכי קיבוע וצביעת חיסונים, כדי לאפשר היצמדות.
  2. צביעת תאי U2OS mEGFP-Nup96 להדמיית Nup96
    1. לאחר דגירה לילית, החלף את מדיום ה-5A של McCoy's במיקרוסליידס עם 8 בארות ב-PBS מסונן 1x. ברצף מהיר, שאיפת ה-PBS והוספה את תמיסת הקיבוע 4% PFA המחוממת מראש (37°C) בתוך מכסה אדים כימיקלי.
    2. אפשר לתאים להתייצב למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר (23 מעלות צלזיוס), רצוי בתוך מכסה האדים הכימי, לפני שטיפה של ה-PFA והפסולת מושלכת. כעת ניתן לבצע את כל השלבים בטמפרטורת החדר אלא אם צוין אחרת.
    3. הסר את תמיסת הקיבוע של 4% PFA ושטוף את המחסנית 3 פעמים 3 דקות עם 1x PBS.
      זהירות: השתמש ב-PFA במכסה אדים כימי תוך לבישת ציוד מגן מתאים.
    4. לאחר הקיבוע יש לחדור את ממברנת התא על ידי הוספת 0.1% טריטון X-100 בתמיסת 1x PBS. תן לזה לשבת 5 דקות, ואז לשטוף 3 על 3 דקות עם 60 מ"מ גליקין ב-1x PBS, כדי להרגיע את הפלואורסצנציה של שאריות ה-PFA.
      הערה: תמיסת חדירות טריטון רגישה מאוד לזמן ועלולה לשנות את שלמות מבנה התא אם תשאירו לנוח יותר מדי זמן.
    5. הוסף 5% BSA ב-1x PBS לשעה אחת בחושך, כדי לחסום תאים לפני צביעת חיסונים.
    6. הכינו 20 ננומטר של ננו-גוף אנטי-GFP מצומד ב-DNA בתמיסת חסימה (5% BSA ב-1x PBS) כדי למנוע חסימה לא ספציפית. דגרו את הסלייד עם תערובת הננו-גוף למשך שעה בטמפרטורת החדר (23 מעלות צלזיוס), ואז שטפו את חוטי ה-DNA הלא קשורים 3 על 3 דקות עם 1x PBS מסונן.
      הערה: נקודת הפסקה: לאחר קיבוע מטוס, חסימה והוספת נוגדנים, ניתן לאחסן דגימות בטמפרטורה של 4°C במהלך הלילה. נקודת העצירה הזו נכללת בעיקר בגלל הזמן הנדרש להכנת הדגימה, ולא בשל הכרח מוחלט של הפרוטוקול. ניתן לבצע הדמיה מיד לאחר שלבים אלו אם מעדיפים אותה.
  3. צביעת חיסון של תאי U2OS mEGFP-Nup96 להדמיית מיטוכונדריה ומיקרוטובולים
    1. לאחר דגירה לילית, החליפו בו-זמנית את מדיום ה-DMEM במיקרוסליידי 8 בארות ב-200 מיקרוליטר של 0.3% גלוטראלדהיד ו-0.25% טריטון X-100 בבופר שלד ציטוסלטי (CB) והשאירו למשך 2 דקות לקיבוע מוקדם.
    2. החלף את תמיסת הפרה-קיבוע בבופר שלד ציטוסלטי (CB) בתוספת 2% גלוטראלדהיד. תן לזה לשבת 10 דקות כדי לתקן את התאים, ואז שטוף את הסלייד 3 על 3 דקות עם 60 mM גליצין ב-PBS, כמו בשלב 4.2.4.
      זהירות: השתמשו בגלוטראלדהיד במכסה אדים כימי תוך לבישת ציוד מגן אישי מתאים.
    3. הוסיפו DNA זרע סלמון גזוז ב-3% BSA ב-1x PBS למשך שעה בחושך, כדי לחסום תאים לפני צביעת חיסונים.
    4. הוסף 5 מיקרוגרם/מ"ל של אנטי-טובולין מצומד ב-DNA (מצורף כפי שתואר לעיל), להדמיית מיקרוטובולים, ו/או נוגדן TOM20 1:200 להדמיית מיטוכונדריה, ב-2% BSA למשך שעתיים בטמפרטורת החדר (23 מעלות צלזיוס). שטוף 3 פעמים 3 דקות עם 1x PBS.
    5. הוסיפו 25 ננומטר של sdAb נגד IgG ארנב עם דנ"א ודגרו במשך שעה בטמפרטורת החדר (23 מעלות צלזיוס). שטוף 3 פעמים 3 דקות עם 1x PBS.
      הערה: נקודת הפסקה: לאחר קיבוע מטוס, חסימה והוספת נוגדנים, ניתן לאחסן דגימות בטמפרטורה של 4°C במהלך הלילה. נקודת העצירה הזו נכללת בעיקר בגלל הזמן הנדרש להכנת הדגימה, ולא בשל הכרח מוחלט של הפרוטוקול. ניתן לבצע הדמיה מיד לאחר שלבים אלו אם מעדיפים אותה.
  4. הכנת תאי HeLa Kyoto mEGFP-Nup107
    1. שאפו את המדיה מבקבוק T25 של תאי HeLa Kyoto mEGFP-Nup107 ושוטפים בעדינות את הבקבוק עם 2 מ"ל של PBS מסונן 1x.
    2. שאופי PBS והוספי 2 מ"ל טריפסין EDTA (TE) והטי את הבקבוק לאט למעלה ולמטה, דגור ב-37 מעלות צלזיוס למשך 7 דקות.
    3. הוסיפו 2 מ"ל של מדיום DMEM מווסף וטריטורציה.
    4. הוסף תמיסת תאים לצינור צנטריפוגלי קוני של 15 מ"ל עם תוספת של 7 מ"ל של מדיה וצנטריפוגה DMEM בתוספת של 400 x גרם למשך 5 דקות. בדוק אם יש יצירת כדורים בתחתית הצינור.
    5. החזירו את כדור התא למדיית DMEM שהושלמה.
    6. תאי זריעה בגודל 1 x 105 תאים/מ"ל במיקרוסליידינג של 8 בארות.
      הערה: תאי זרע 24 שעות לפני ההדמיה.
  5. צביעת חיסון של HeLa Kyoto mEGFP-Nup107 עבור מיקרוטובולים
    1. לאחר דגירה לילית, החליפו בו-זמנית את מדיום ה-DMEM במיקרוסליידי 8 בארות ב-200 מיקרוליטר של 0.3% גלוטראלדהיד ו-0.25% טריטון X-100 בבופר שלד ציטוסלטי (CB) והשאירו למשך 2 דקות לקיבוע מוקדם.
    2. החלף את תמיסת הפרה-קיבוע ב-2% גלוטראלדהיד ב-CB ומשאיר ל-10 דקות לקיבוע התאים. שטוף 3 פעמים 3 דקות עם 60 מ"מ גליצין ב-1x PBS.
      זהירות: השתמש בגלוטארלדהיד במכסה אדים כימי תוך לבישת ציוד מגן אישי מתאים.
    3. הוסף 5% BSA ב-1x PBS לשעה אחת בחושך, כדי לחסום תאים לפני צביעת חיסונים.
    4. הוסף 5 מיקרוגרם/מ"ל של אנטי-טובולין מצומד ב-DNA (מצורף כפי שתואר לעיל), להדמיית מיקרוטובול ב-5% BSA ב-1x PBS למשך שעתיים בטמפרטורת החדר (23 מעלות צלזיוס). שטוף 3 פעמים 3 דקות עם 1x PBS.
      הערה: נקודת הפסקה: לאחר קיבוע מטוס, חסימה והוספת נוגדנים, ניתן לאחסן דגימות בטמפרטורה של 4°C במהלך הלילה. נקודת העצירה הזו נכללת בעיקר בגלל הזמן הנדרש להכנת הדגימה, ולא בשל הכרח מוחלט של הפרוטוקול. ניתן לבצע הדמיה מיד לאחר שלבים אלו אם מעדיפים אותה.
    5. הערה: בעת עבודה עם נוגדנים חלופיים או קווי תאים, מתאימים את גורמי הדילול עבור הנוגדן או הננו-גוף המקושר ל-DNA בהתאם להמלצות היצרן.
  6. הכנה להדמיה
    הערה: שלב זה משותף לכל פרוטוקולי הצביעה החיסונית.
    1. הוסף ננו-חלקיקי זהב של 90 ננומטר מדוללים ביחס 1:2 במים דה-יוניים ישירות לכל באר, תוך שימוש בנפח הבאר המלא. דגרו במשך 5 דקות כדי לאפשר תיקון הסחפה עתידי במהלך ההדמיה. שטיפת בארות 3 פעמים עם 1 PBS.
    2. להדמיית Nup96, הוסף את גדיל ההדמיה הרצוי ב-1 ננומטר בבופר C+ עם תוספת של 1x טרולוקס, 1 PCA ו-1x PCD.
    3. ל-Exchange-PAINT של מיטוכונדריה ו/או מיקרוטובולים, הוסף את גדיל ההדמיה הראשון הרצוי ב-1 ננומטר בבופר C+ בלבד. לאחר ההדמיה של הסבב הראשון, שטפו את הדגימה היטב אך בזהירות לאחר הסיבוב הראשון כדי להסיר את כל סיבי ההדמיה הנותרים מבלי להזיז את הדגימה. בדרך כלל, עם 5 שטיפות והמתנה של 30 שניות ביניהם מספיקים. לאחר מכן הוסף את חוט התמונה השני ב-1 ננומטר בבופר C+ רק לסבב ההדמיה השני.

5. הגדרת דימות ופרמטרי: מיקרוסקופיית לוקליזציה חד-מולקולית

הערה: התמונות המוצגות בפרוטוקול זה נרכשו במתקן המיקרוסקופיה הסופר-רזולוציה LMCB בקולג' האוניברסיטאי לונדון, בריטניה, באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי דיסק מסתובב זמין מסחרית, מצויד במצלמת sCMOS, והופעל באמצעות תוכנת NIS-Elements.

  1. השתמש במערכת קונפוקלית של דיסק מסתובב עם גירוי רב-מוקדי ומצלמת sCMOS.
  2. הפעל את המערכת 30 דקות לפני ההדמיה: הדלק את המיקרוסקופ, המצלמה והלייזרים, ואז הפעל את המחשב. חכה שתוכנת NIS-Elements תיטען במלואה.
  3. בחר את מצב ההדמיה המתאים ב-NIS-Elements: קונפוקל דיסק מסתובב סטנדרטי או SDC-OPR SoRA סופר-רזולוציה, לפני הגדרת פרמטרי רכישה.
  4. בחרו במטרה לטבילה בשמן 60× Apo NA 1.49 להדמיה SDC או SDC-OPR כדי למקסם זיהוי אירועים חד-מולקוליים לשיפור העיבוד לאחר הטיסה.
  5. בחר את ההגדלה המתאימה (1×, 2.8× או 4×) בהתבסס על האובייקטיביה, הגדרות המצלמה והדגימה שיש לחקור. כוון את ה-binning של המצלמה בהתאם: 1× binning ל-1× הגדלה, 2× binning ל-2.8×, ו-4× binning ל-4×. בהגדרה זו, זה מתאים לגודל פיקסלים אפקטיבי של 108 ננומטר ל-1× (ללא בינינג) או 4× (4× binning), ו-78 ננומטר ל-2.8× (2× binning). נדרש binning כדי לקבל גדלי פיקסלים המתאימים ל-SMLM, התואמים בערך לסטיית התקן PSF (בדרך כלל 100-150 ננומטר)19,20.
    הערה: הגדלות גבוהות יותר (2.8× או 4×) מגבירות את צפיפות הספק הלייזר, ומשפרות את אחידות התאורה. זה מפחית את שדה הראייה, ולכן יש להתאים את ה-binning באופן פרופורציונלי (כלומר, 2× binning להגדלה של 2.8×; 4× binning להגדלה של 4×) כדי לשמור על גודל הפיקסל.
  6. קבע את זמן החשיפה לרכישת DNA-PAINT וסנכרן אותו עם מהירות סיבוב הדיסק המסתובב (ניתן לכוונון ממשטח CSU-W1). ודא שמהירות הסיבוב היא כפולה מזמן החשיפה, או לחץ על כפתור הסינכרון כדי להתאים אוטומטית לסל"ד התואמת ביותר. בדוק את המסך לאיתור ארטיפקטים של פסים, כי זה מצביע על הגדרות לא מסונכרנות. לניסויים שהוצגו כאן, נעשה שימוש בזמן חשיפה של 300 מילישניות.
    הערה: מהירות הסיבוב של יחידת ה-SDC שמסתובבת ומסנכרנת דיסקים SoRa משודרגים במיקרועדשה משפיעה על פרופיל העירור של הקרן ומשפיעה על התפלגות צפיפות ההספק הממוצעת על פני האזור המואר. מסיבה זו, ייתכן שיהיה צורך בזמני חשיפה גבוהים יותר מאשר בהגדרות TIRF.
  7. הגדר את אורך הגל, ההספק וגלגל הסינון של הלייזר (NIS-Elements ימליץ על מסנן מתאים). אורך הגל של הלייזר ייקבע על ידי הספקטרום של צבע המצלם.
    הערה: בעבודה זו נעשה שימוש ב-Cy3B, שמעורר בצורה אופטימלית עם לייזר 561 ננומטר. Cy3B מספק את יחס האות לרקע הטוב ביותר עבור DNA-PAINT, מה שהופך אותו לבחירה המועדפת ליישום זה.
  8. כוון את עוצמת הלייזר דרך משטח הלייזר (0%-100%). להדמיית DNA-PAINT, כוון את הלייזר לעוצמה מקסימלית (100%). במערכת זו, זה מתייחס ל-1.75 מיליוואט (≈ 65 וואט/סמ"ר) שנמדד לאחר היעד להגדלה של 4×, 3 מיליוואט (≈ 50 וואט/סמ"ר) ל-2×, ו-5 מ"ג (≈ 15 וואט/סמ"ר) עבור 1×.
    1. כדי להקליט את ההספק לאחר המטרה, השתמשו במד כוח לייזר מכויל והניחו את החיישן על שלב המיקרוסקופ קרוב ככל האפשר למקום שבו אמור להיות מישור הדגימה. היזהר להימנע ממגע עם עדשת האובייקטיבית. רשום את ההספק עבור כל תצורה שהשתמשו בה.
  9. מרח טיפה של שמן טבילה על אובייקטיב השמן הנקי 60× Apo NA 1.49.
  10. אבטח את הדגימה המוכנה (מהשלבים 4.2-4.5) על הבמה באמצעות מתאם במה. זה חשוב למזעור סטייה במהלך רכישת התמונה ולמנוע תנועה במהלך חילופי בופר, במיוחד בניסויים רב-צבעוניים.
  11. עברו למצב שדה בהיר בתוך שיטת ההדמיה הנבחרת והתמקדו במישור הזכוכית תוך שימוש בננו-חלקיקים כהפניה. הפעל את מערכת המיקוד המושלם (PFS). ה-PFS או מערכת דומה לשמירת המיקוד לאורך כל זמן הרכישה היא קריטית כי הסטייה בכיוון הצירי אינה ניתנת לתיקון באמצעות עיבוד לאחר מכן.
    הערה: ה-PFS של ניקון שומר על הדגימה בפוקוס חד על ידי ניטור רציף והתאמה של המרחק בין מישור ייחוס קבוע למישור המוקד של הדגימה, באמצעות עדשת הסטה וגלאי CCD קווי. על ידי פעולה עצמאית מרכישת תמונה, המערכת מתקנת סטיית פוקוס בזמן אמת (~מילישניות).
  12. כאשר PFS פעיל, בחר את מישור ההדמיה הרלוונטי. לתאי U2OS mEGFP-Nup96 או תאי HeLa Kyoto mEGFP-Nup107, השתמשו באות 488 GFP מ-NPCs המסומנים ב-GFP כדי לזהות את התא השטוח ביותר ולקבוע את מישור המוקד האופטימלי. השתמש בעוצמת לייזר נמוכה (~10% מההספק המקסימלי של הלייזר) בשלב זה כדי למנוע הלבנת פוטו.
  13. הגדר את השם ומסלול השמירה של הניסוי. סמן את תיבת הזמן כדי להגדיר את המרווח, משך הזמן ומספר הלולאות. לרכישה רציפה, הגדר את המרווח ל-No Delay והזן רק את מספר הלולאות, התואם למספר הכולל של הפריימים.
    הערה: ודא שתיבת ה-PFS בתחתית נבחרה, ואז לחץ על Run. התוכנה תספק אוטומטית משך ניסוי משוער ותשמור את הנתונים עם סיום הניסוי. כדי לעצור את הניסוי לפני שהוא מסתיים, לחץ על סיים כדי לשמור את ההתקדמות הנוכחית, או ביטול כדי לסיים את הניסוי בלי לשמור.
  14. עבור החלבון הראשון, רכוש 17,000-20,000 פריימים עם זמן אינטגרציה של 300 מילישניות.
    הערה: יש לייעל את ריכוז גדיל המצלמה בשלב זה כדי להבטיח שאותות חד-מולקולריים לא חופפים זה לזה, ועדיין לספק מיקומים מספקים לשחזור. תהליך זה דומה לרכישת SMLM טיפוסית, שבה ריכוז המצלמה מותאם להשגת מספר מספיק של אירועים לשחזור תוך מזעור חפיפות. הריכוז האופטימלי תלוי במבנה המצולם. לדוגמה, מבנים עם תוויות גבוהות כמו מיקרוטובולים דורשים בדרך כלל ריכוזי תמונה נמוכים יותר (פחות מ-1 ננומטר).
  15. הסר בעדינות את בופר ההדמיה לחלבון הבא באמצעות פיפט, תוך זהירות לא להפריע לדגימה. בעת ניטור הדגימה דרך מצלמת המיקרוסקופ, הוסף בזהירות 200 מיקרוליטר של בופר C+ ללא המצלמה כדי לשטוף את הצבע הראשון.
  16. חזור על שלב זה עד שלא ניתן לזהות אות פלואורסצנציה מפתרון ה-DNA הראשון (בדרך כלל 5 שטיפות).
  17. הוסיפו תמיסה שנייה למכשיר הדמיה ובדוק שאירועים חד-מולקוליים מזוהים שוב.
  18. לרכוש 17,000-20,000 פריימים עם זמן אינטגרציה של 300 מילישניות לחלבון השני.
  19. חזור על השלבים 5.14-5.18 עבור כל חלבון נוסף שיש להצטלם.
  20. להדמיה תלת-ממדית, יש לרכוש ערימות z עם מרווח של 0.5-1 מיקרון לאורך גובה התא המלא. זה נעשה באמצעות פרוטוקול JOB21 ייעודי שתוכנן עבור תוכנת הרכישה (רכיבי NIS) שמצלם וידאו של מספר מוגדר מראש של פריימים במיקומים z ספציפיים, תוך שמירה על ה-PSF לאורך כל תקופת הרכישה.
    הערה: חבילת התוכנה, יחד עם הוראות מפורטות למשתמש, מסופקת במסגרת פרוטוקול JOB21. מצורף גם תיאור מלא של התפקיד. התוכנה, שנקראת "MultiZ_DNAPaint.bin", ניתנת להורדה מלשונית החומרים בפרסום. כדי להריץ את ה-JOB, הורד את הקובץ הזה וייבא אותו ל-NIS-Elements JOBS Explorer, בהתאם להוראות שלב אחר שלב שניתנו.

6. עיבוד וניתוח תמונה

הערה: התמונות עובדו תחילה באמצעות דה-קונבולוציה באמצעות תוכנה תואמת, ולאחר מכן ניתוח לוקליזציה של מולקולה בודדת באמצעות תוכנת פיקאסו שפותחה על ידי מעבדת יונגמן16.

  1. פתח את ערימות התמונות של ND2 בתוכנת AR של NIS-Elements.
  2. לתמונות דו-ממדיות, בחרו דה-קונבולוציה דו-ממדית. לתמונות תלת-ממדיות, חזרו על הליך זה עבור כל ערימת z בודדת.
  3. בחר דה-קונבולוציה עיוורת, חור סיכה אפקטיבי של 0.01, וקבע את רמת הרעש לרעש. לאחר מכן, הזן את קצב הגירוי והפליטה של הלייזר, כאן 560 ננומטר ו-571 ננומטר, בהתאמה. פרמטרים נוספים מתקבלים אוטומטית מהמטא-דאטה של ND2 כדי לספק הערכה גסה של פונקציית הפיזור של נקודת התמונה המקורית (PSF).
  4. ציין את מספר האיטרציות (כאן, 12), בחר יצירת מסמך חדש, ולחץ על דה-קונוולב. שמור את הקובץ שנוצר לאחר העיבוד.
    הערה: האלגוריתם משפר באופן איטרטיבי את איכות התמונה על ידי ביצוע פעולות קונבולוציה שמחדדות את ה-PSF עד שמגיעים להתכנסות או למספר האיטרציות שנקבע. מומלץ לבצע בדיקה ויזואלית של התמונה המנותקת (deconvolved). נדרש התאמת מספר האיטרציות בהתאם למגבלות החישוב ולאיכות התמונה.
  5. טען את ערימת התמונה המפורקת למודול Picasso Localize.
  6. משורת התפריט, בחר ב-Analyze → Parameters, והזן את הפרמטרים הספציפיים למצלמה בהתאם למפרט היצרן. למצלמת sCMOS ששימשה במחקר זה (Hamamatsu ORCA-Fusion BT): רווח EM: 1, קו בסיס: 100, רגישות: 0.23 (מקדם המרה, אלקטרונים/ספירה), יעילות קוונטית: 0.95 (תלוי באורך גל העירור בשימוש).
    הערה: יעילות קוונטית אינה בשימוש מאז גרסת פיקאסו 0.6.0 ונשמרת רק לתאימות לאחור.
  7. הגדר את אורך הצד של הקופסה ל-7. אורך הקופסה נקבע באמצעות הנוסחה [6 × σPSF + 1], כאשרσ PSF הוא סטיית התקן של PSF. אופטימיזציה זו משפרת את דיוק הלוקליזציה, ומשפרת את הרזולוציה של התמונה המשוחזרת.
  8. בחר את גודל הפיקסל המתאים לקונפיגורציית ההדמיה, בהתאם לשלב 5.5 של החלק.
  9. לאחר מכן, בחרו גרדיאנט מינימום נטו מתאים (למשל, ~1000, תלוי בדגימה) ואפשרו תצוגה מקדימה להמחשת הלוקליזציות שזוהו. בדוק את התוצאות והתאים את סף הגרדיאנט לפי הצורך כדי למזער גילויי רקע ולהבטיח מיקום מדויק.
  10. מהתפריט, בחרו בניתוח → לוקליזציה (זיהוי והתאמה) כדי להתחיל בזיהוי נקודות ולהתאים את כל פריימים של הסרטים. לאחר התחרות, תהליך זה שומר אוטומטית קובץ .hdf5 וקובץ .yaml.
    הערה: קובץ .hdf5 מאחסן את מיקום הלוקליזציה של כל התאמה גאוסית ועוד פרמטרים. קובץ .yaml שומר מידע על הווידאו ותהליך הניתוח וניתן לבדוק אותו באמצעות עורך טקסט.
  11. טען את קובץ ה-.hdf5 במודול Picasso Render כדי להמחיש את מפת הלוקליזציה המחודשת ולבצע תיקון סטייה.
  12. ב-Picasso Render, בחר Postprocess → Undrift של RCC. הזן ערך סגמנטציה, החל מ-1000. עם סיומו, יופיע תרשים הסטייה המחושב של xy. חזור על התהליך ברצף עם ערכי סגמנטציה נמוכים יותר (למשל, 500, ואז 250), תוך הבחנה בשיפורים הדרגתיים בסטיית הזמן.
    הערה: ניתן לבצע תיקון הסחפה באמצעות ננו-חלקיקים כסמנים פידוציאליים; עם זאת, בעת הדמיה של מישורים מוגבהים, אות הננו-חלקיקים עשוי שלא להיות נראה. במקרים אלו, רק תיקון הסחפה של קורלציה צולבת מיותרת (RCC) מיושם.
  13. ודא שאתה שומר את קובץ ה-Drift שתוקן, בחר בקובץ → שמור לוקליזציות לפני סגירת חלון Picasso Render.
  14. טען את קובץ התוקן של הסחפה משלב 6.13 למודול פילטר פיקאסו לשלב עיבוד נוסף, על ידי הטלת סף על מדדי האיכות של לוקליזציה של מולקולה בודדת, כגון: (i) דיוק לוקליזציה (lpx, lpy); (ii) רוחבי PSF (sx, sy); (iii) ספירת פוטונים; ו-(iv) כל קריטריון נוסף להסרת רעש, חריגים או נקודות שנפתרו בצורה לקויה.
    הערה: lpx ו-lpy (דיוק לוקליזציה ב-x ו-y) מעריכים את אי-הוודאות במיקום הנקודתי המקומי לאורך צירי x ו-y ומחושבים על בסיס הגבול התחתון של קרמר-ראו (CRLB).
  15. לסינון תכונה אחת, בחר את העמודה המתאימה בכותרת הטבלה, ובחר Plot → Histogram מהתפריט.
    הערה: בחירת שתי עמודות מציגה היסטוגרמה דו-ממדית.
  16. כדי לסנן לפי טווח תכונות מסוים, לחצו וגררו את האזור הרצוי בתוך היסטוגרמה חד-ממדי או דו-ממדית. האזור הנבחר יופיע מוצל בירוק, וכל אירוע לוקליזציה עם ערכים מחוץ לטווח זה יוחרג מיד מרשימת הלוקליזציה.
  17. סנן את הנתונים לפי פוטונים, sx, sy, lpx ו-lpy, תוך שמירה רק על טווח החלק המרכזי של התפלגות כל פרמטר כדי להבטיח שמירה על הלוקליזציות האמינות ביותר.
    הערה: החלק המרכזי של התפלגות רוחב PSF הוא בדרך כלל בין 0.4 ל-1.2 × גודל פיקסל. יש להוציא התפלגויות משניות שנגרמות לעיתים קרובות על ידי אותות חופפים או נקודות שאינן מפותחות היטב.
  18. שמור את הנתונים המסוננים על ידי בחירת קובץ → שמירה מהתפריט.
  19. חזור על התהליך משלב 6.1 עד 6.18 עבור כל הסרטונים שצולמו עבור כל פתרון המצלמה.
  20. פתח את הקובץ המסונן במודול Picasso Render. העוצמה בתמונה סופר-רזולוציה זו מייצגת את מספר הלוקליזציות. ניתן לשנות את הניגודיות על ידי בחירת הגדרות תצוגה → תצוגה ושינוי ערך הצפיפות המקסימלית.
  21. כדי לשמור את תמונת הרזולוציה העל-של ערוץ יחיד, בחר ב"דיוק לוקליזציה אישית" מתוך סעיף הטשטוש. ניתן גם להוסיף פס סולם מחלק פס הסולם.
  22. לשמירת התמונה ברזולוציה סופר של כל הערוצים, פתח את כל קבצי ה-.hdf5 המעובדים. ניתן לשנות את צבע כל ערוץ על ידי בחירה ב'הצג → קבצים מהתפריט'.
  23. יישר את כל הערוצים בבחירת עיבוד → יישור ערוצים.
  24. בחר קובץ → ייצוא תמונה מלאה כדי לשמור תמונה .png או קובץ → לייצא תצוגה נוכחית לזום מסוים של התמונה.
    הערה: השתמש בשמות קבצים ושיטות תיעוד עקביות לצורך שחזור. תוכנת פיקאסו מוסיפה אוטומטית סיומת לכל קובץ שמור. ניתן לחלץ את מדדי Cramer Rao Lower Limit and nearest neighbor Based analysis (NeNA)22 על ידי בחירת 'הצג → הצג מידע מהתפריט'. ה-NeNA מכמת את ההתפלגות המרחבית של פלואורופורים מקומיים על ידי הערכת המרחק האוקלידי בין לוקליזציות שכנות. בעוד שה-CRLB מספק גבול תחתון תיאורטי לדיוק לוקליזציה המבוסס על סטטיסטיקת פוטונים ורעש רקע, ה-NeNA מציע הערכה ניסיונית של דיוק לוקליזציה שמקורה ישירות במאגר הנתונים עצמו. מסיבה זו, NeNA משמש באופן נרחב ב-SMLM כמדד משלים ל-CRLB, שכן הוא לוכד לא רק גבולות תיאורטיים אלא גם השפעות מעשיות כמו תיקון סטייה, שגיאות התאמה ושונות ניסיונית. מדד NeNA מופק ממודול Picasso Render. ה-CRLB של התאמת המולקולה הבודדת משמש לקביעת ערכי דיוק הלוקליזציה (σSMLM). הערך המדווח הוא הממוצע בין σx ל-σy, עבור כל הלוקליזציות, שהן ערך המצב של התפלגות דיוק הלוקליזציה ב-x ו-y, בהתאמה.

תוצאות

כדי להדגים את יכולות ההדמיה הסופר-רזולוציה של מערכת SDC-OPR (איור 1A), הוערכה רזולוציית המישור שלה באמצעות ביצוע ניסויי דימות DNA-PAINT (איור 1B) על קומפלקסים נקבוביים גרעיניים (NPCs), שהם מבנה ביולוגי ייחוס17. איור 1C מציג תמונה מייצגת של DNA-PAINT SDC-OPR של נוקלאופורין 96 (Nup96), המתויגת בחלבון פלואורסצנטי ירוק מונומרי משופר (mEGFPs) ומסומנת בננו-גופים אנטי-GFP מצומדים ב-DNA, בתאי U2OS. הפאנלים המוגדלים חושפים תת-מבנה של NUP, ואיור 1D מציג זוגות חלבוני Nup96 (מסומנים בחצים) התואמים את הסימטריה הצפויה של 8 פעמים של נקבוביות גרעיניות. באיור 1E, המרחק האוקלידי בין זוגות Nup96 נמדד על ידי יישור החתך ושרטוט ההיסטוגרמה החתך של התמונה המסוכמת (n = 16 זוגות). הניתוח חשף הפרדה בין שיאים של (13 ± 2) ננומטר (איור 1E), בהתאם לתוצאות ממודלים אלקטרומגנטיים וכן מהדמיית HILO ו-TIR23. כל התאמת שיא הציגה סטיית תקן של 4 ננומטר, מה שאישר את דיוק המיקום הגבוה (σSMLM = 3.3 ננומטר, NeNA = 4.4 ננומטר) שהושג באמצעות DNA-PAINT ב-SDC-OPR. ראוי לציין כי דיוק זה נשמר בכל שדה הראייה של 53 × 53 מיקרון רבוע, שהוא יוצא דופן למערכות מבוססות קונפוקלי.

כדי להדגים את היכולת להדמיה רב-צבעונית, Nup96, מיטוכונדריה ומיקרוטובולים בתאי U2OS סומנו ב-DNA לרכישה באמצעות Exchange-PAINT18. טכניקה זו עושה שימוש בחוטי צילום DNA אורתוגונליים המחוברים לפלואורופור יחיד, ומאפשרים לעורר את כל המטרות עם אותו מקור לייזר (איור 2A). במקום לקבל אותות בו-זמנית, הוא מפריד אותם בין סבבי הדמיה עוקבים, ומאפשר אינטגרציה פשוטה בכל מערכת SDC-OPR מסחרית. איור 2B מציג את Nup96 בכחול מסומן בננוגוף אנטי-GFP, מיטוכונדריה באדום עם נוגדן אנטי-TOM20 משני, ומיקרוטובולים בירוק עם נוגדן אנטי-α-טובולין ראשוני. ראוי לציין כי דיוק המיקום המולקולי היחיד היוצא דופן שהושג עבור הדמיית Nup96 בצבע יחיד נשמר על פני כל המטרות בניסוי רב-מטרות, והניב ערכי דיוק מיקום של 3.9 ננומטר ל-NPC, 4.0 ננומטר ל-α-טובולין, ו-3.3 ננומטר למיטוכונדריה (איור 2B לוחות 1, 2 ו-3).

להדמיית שדה ראייה גדול, מיקרוטובולים בתאי HeLa צולמו באמצעות הגדלות שונות הזמינות במערכת SDC-OPR, בשילוב עם הגדרות שונות של המצלמה לשמירת גודל פיקסלים בין 78 ל-108 ננומטר (איור 3). איור 3A מציג את שלד הציטובולים של 10 תאי HeLa, כאשר צבעים מייצגים דיוק לוקליזציה. בהגדלה של 1×, דיוק המיקום הממוצע נמוך יותר באופן ניכר לעומת הגדלות גבוהות יותר (איור 3B-D), כאשר נצפתה שונות גבוהה יותר. הסיבה לכך היא ירידה בצפיפות ההספק של הלייזר בשדה הראייה הגדול יותר, שם פרופיל האור הגאוסי מתגלה, מה שמוביל לירידה בדיוק בקצוות שדה הראייה. עם זאת, השגת דיוק מיקום ממוצע של 9.5 ננומטר בשדה ראייה רחב של 211 × 211 מיקרומ² מרשימה למערכות מבוססות קונפוקליות ומאפשרת חקירה ברזולוציה גבוהה של הטרוגניות ביולוגית.

לבסוף, האפשרות להדמות תאים שלמים מודגמת על ידי רכישת תמונות DNA-PAINT של רשת המיקרוטובולים בתאי HeLa קבועים בנפח קונפוקלי של ~500 ננומטר ו-1 מיקרומטר z-step באמצעות ההגדלה הגבוהה ביותר של המערכת (4×, 53 ×-53 מיקרומטר²). איור 4A מציג את תמונות השחזור של מולקולה בודדת עבור כל מישור z, יחד עם דיוק הלוקליזציה וערכי NeNA המתאימים. בנוסף, הדמיה צבעונית תלת-ממדית של רשת המיקרוטובולים בתא HeLa מסופקת באיור 4C. ככל שהעומק עולה, מספר הפוטונים המזוהים פוחת עקב פיזור וסטיות אופטיות, מה שמוביל לירידה בדיוק המיקום הן לדיוקי המיקום הנגזרים מ-Cramér-Rao Lower Front Limit (CRLB) (איור 4A, מימין) וגם לאלו המחושבים באמצעות מדד NeNA. עם זאת, רמת איסוף הפוטונים הגבוהה האפשרית על ידי מערכת SDC-OPR מאפשרת σSMLM ≤ 10 ננומטר לעומק הדמיה של עד 9 מיקרון עם התפלגויות צרות. למעשה, מבני מיקרוטובולים חוטיים דו-דפנתיים היו ברורים בעומקים שונים: ליד ממשק תא כיסוי-תא, במיקומים ציריים ביניים, ובראש התא, עם מרחק שיא לשיא בין 30 ננומטר ל-40 ננומטר (איור 4C), בהתאם לערכים המדווחים24. תוצאות אלו מדגישות את יכולתו של SDC-OPR לספק הדמיה ברזולוציה גבוהה על פני שדה ראייה גדול ובכל גובה התאים.

איור 1
איור 1: מיקרוסקופ לוקליזציה חד-מולקולית במישור של דגימות תאים שונות והדמיה ברזולוציה על-צבעונית רב-צבעונית. (א) סכמטיקה של מערכת הקונפוקל דיסק המסתובב עם הקצאת פוטונים אופטית (SDC-OPR), הכוללת מערך מיקרועדשות שנועד למקסם את איסוף הפוטונים. (B) סכמטי של DNA-PAINT: גדילי DNA מסומנים פלואורסצנטית, הידועים כגדילי מצלמים, היברידים באופן זמני עם רצפי DNA משלימים (גדילי עגינה) המעוגנים בנוגדן/ננו-גוף המכוון לחלבון המעוניין. אירועי קישור קצרי מועד אלו יוצרים אותות פלואורסצנציה הנראים כהבהוב סטוכסטי. (ג) תמונת DNA-PAINT מייצגת על מערכת SDC-OPR באמצעות הגדלה של 4× של NPC של תאי U2OS. יכולת הרזולוציה הגבוהה מודגמת במערכת הפנימית, שבה NPCים בודדים מפורטים בבירור. (D) DNA-PAINT משופר על ידי SDC-OPR מאפשר המחשה של NPCs בודדים, כאשר חצים לבנים מדגישים זוגות חלבונים אופייניים של Nup96 בתוך ארכיטקטורת הנקבוביות. (ה) התפלגות מדידות המרחק בין דימרים של Nup96 (n=16 זוגות) בתוך יחידות סימטריה NPC בודדות. איור זה שונה מ-Zaza ואחרים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו. 

איור 2
איור 2: Exchange-PAINT להדמיה רב-צבעונית באמצעות מיקרוסקופ SDC-OPR. (א) סכמטי של Exchange-PAINT של שלוש מטרות שצולמו ברצף. שלושה יעדי חלבון סומנו בנוגדנים פונקציונליים ב-DNA, קטעי Fab או ננו-גופים. חוטי המצלמה של Cy3B צולמו ברצף לפי סוג הגדיל עם שלבי שטיפה בין סבבי ההדמיה. (B) הדמיית Exchange-PAINT בשלושה צבעים של תאי U2OS באמצעות מיקרוסקופ SDC-OPR עם הגדלה של 4×, המראה מיקרוטובולים (אדום; מסומנים באנטי-α-טובולין מצומד ב-DNA), מיטוכונדריה (ירוק; TOM20 שמכוון לננו-גופים DNA), ו-NPC (כחול; Nup96 עם תווית mEGFP עם ננו-גופים נגד GFP). מוט סולם: 5 מיקרון. אזור המוגדל מדגיש את הרזולוציה המשופרת שהושגה במערכת SDC-OPR, תוך התמקדות ב-(1) מיטוכונדריה, (2) מיקרוטובולים ו-(3) NUP. פסי קנה מידה = 1 מיקרון. איור זה שונה מ-Zaza ואחרים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 3
איור 3: הדמיית DNA-PAINT בתוך שדה ראייה גדול במיקרוסקופ SDC-OPR. תמונות מיקרוטובול DNA-PAINT (תיוג אנטי-α-טובולין) שנרכשו בהגדלות מרובות: (A) 1× הגדלה ו-1 binning (שדה ראייה של 211 × 211 מיקרומטר²), (B) 2.8× ו-2 binning (שדה ראייה 76 × 76 מיקרומטר²), (C) הגדלה 4× ו-4 binning (שדה ראייה של 53 × 53 מיקרומ²). הצבע מייצג את דיוק הלוקליזציה מ-0 ל-16 ננומטר במקרה של הגדלה פי 1 ובין 0 ל-4 ננומטר באחרים. (D) דיוק מיקום שנמדד במרחקים שונים (במיקרומטר) ממרכז שדה הראייה להגדלות של 1× (אדום), 2.8× (צהוב) ו-4× (ירוק). איור זה שונה מ-Zaza ואחרים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 4
איור 4: הדמיית DNA-PAINT של תא שלם. (א) שמאלה. הדמיית מיקרוטובולים נפחית בתאי HeLa באמצעות DNA-PAINT שנרכשה באמצעות SDC-OPR בהגדלה של 4×, ומציגה חתכים ציריים מ-z = 0 עד 9 מיקרון (שלבים של 1 מיקרומטר). כל מישור מציג מיקום z , דיוק לוקליזציה ומדד NeNA. פסי קשקש: 5 מיקרון (xy). נכון. דיוק לוקליזציה לעומת עומק חדירה לכל המישורים. (B) הדמיה תלת-ממדית של רשת המיקרוטובולים על אותו תא HeLa כמו ב-(A). הצבע מייצג עומק חדירה מ-0 עד 9 מיקרון. (C) תמונות מוגדלות של אזורים קטנים מודגשים מכל עומק חדירה המסומן ב-(A). איור זה שונה מ-Zaza ואחרים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

דיון

מיקרוסקופ פלואורסצנציה ברזולוציה על-גבוהה שברה את מחסום העקיפה, ושיפרה באופן דרמטי את הרזולוציה המרחבית. עם זאת, האימוץ הנרחב שלו במחקר ביולוגי מתמודד עם אתגרים מתמשכים. ראוי לציין שפשרות בין שדה ראייה, רזולוציה ועומק חדירה מקשות על אופטימיזציה של שלושת הגורמים בו-זמנית. אתגרים אלו טופלו באמצעות שימוש ביכולות משולבות של SMLM ומיקרוסקופיה קונפוקלית דיסקית מסתובבת, שהוגברה על ידי הקצאת פוטונים אופטית (SDC-OPR). על ידי שילוב מערכי מיקרו-עדשות בתצורת SDC סטנדרטית, כפי שאפשר על ידי מערכת SDC-OPR המסחרית, איסוף הפוטונים גדל בעוד גודל החור הסיכה האפקטיבי הופחת, מה שהוביל לשיפור משמעותי ברזולוציה. בהשוואה ל-SDC הסטנדרטי, מערכת SDC-OPR הראתה שיפור משמעותי בעוצמת הפתרון, והבדילה בהצלחה תכונות המופרדות ב-10 ננומטרו-14 במישור המוקד, בעוד ש-SDC סטנדרטי הצליח לפתור רק מרחקים הגדולים מ-20 ננומטר11. יכולת הפתרון המוגברת הזו מדגישה את היתרון של הקצאת פוטונים מחדש להשגת הפרדות בקנה מידה מולקולרי. במיוחד, דיוק מיקום צידי מתחת ל-2 ננומטר הושג במישור המוקד (z = 0 מיקרון), כאשר דיוק רוחבי נשאר מתחת ל-10 ננומטר בעומקים של עד 9 מיקרון, בשילוב עם שדה ראייה גמיש מאוד של 53 × 53 מיקרומטר² או 76 × 76 מיקרומטר². אפילו בשדה ראייה גדול של 211 × 211 מיקרומטר רבוע, המערכת סיפקה דיוק מרשים של 9.5 ננומטר ממוצע מיקום במישור. תוצאות אלו מדגישות את יכולת המערכת להדמיה ברזולוציה גבוהה בכל תאים שלמים.

לגבי תגובות הקישור לנוגדנים השונים בהם משתמשים, יש לעקוב בקפידה אחרי הפרוטוקול כדי להבטיח יחס מיטבי בין נוגדנים ל-DNA. חריגה מיחס זה עלולה להפחית את דיוק הלוקליזציה ולהשפיע לרעה על מדידות כמותיות, כמו אלו שבוצעו ב-qPAINT25. לכן, חשוב לאמת את היחס באמצעות ספקטרופוטומטר מיקרו-ווליום UV-Vis, כדי להבטיח יחס סופי של 1:1 בין DNA לנוגדן.

שלב קריטי בהשגת תמונות ברזולוציה על-איכותית של מיקרוטובולים הוא קיבוע נכון. שיטות קיבוע קונבנציונליות המבוססות אך ורק על ריכוזים גבוהים של PFA לעיתים קרובות משבשות את מבני המיקרוטובולים. במקום זאת, שימוש בגלוטראלדהיד (GA) בלבד או בשילוב עם PFA משפר משמעותית את שימור המבנה26,27.

להדמיה אופטימלית, מטרה עם פתח מספרי גבוה (NA) חיונית למקסום איסוף הפוטונים לכל אירוע במולקולה בודדת. במערכת המסחרית SDC-OPR, עוצמת הלייזר נמוכה במכוון מאשר במיקרוסקופים TIRF רגילים המשמשים ל-SMLM כדי למזער הלבנת דגימות. בעוד ש-DNA-PAINT מבטל חששות מפוטוליצ'ינג ויכול תיאורטית להשתמש בעוצמת לייזר גבוהה יותר, מערכות מסחריות קיימות מטילות מגבלות, מה שמחייב זמני חשיפה ארוכים יותר לעומת תאורת TIRF. יתרה מזאת, מכיוון שהאור ב-SDC-OPR הוא קונפוקלי, המולקולות אינן מתעוררות ברציפות במהלך החשיפה. כתוצאה מכך, יש צורך בזמני חשיפה ארוכים יותר יחסית לתאורת TIRF רציפה; במחקר זה נעשה שימוש בזמן חשיפה של 300 מילישניות. עם זאת, בהתאם לדרישות הרזולוציה של ניסוי מסוים, ניתן להשתמש בזמני אינטגרציה קצרים יותר (למשל, 150-200 מילישניות) עם אובדן מינימלי של רזולוציה28.

אופטימיזציה של ריכוז גדיל המצלמה היא שלב קריטי להבטיח שאותות חד-מולקוליים יישארו מופרדים היטב תוך יצירת מספיק לוקליזציות לשחזור מדויק. התאמה זו דומה לרכישות SMLM סטנדרטיות, שבהן האיזון בין צפיפות האירועים לחפיפת האות נשלט בקפידה. יש להתאים את ריכוז המכשיר האופטימלי לכל מטרה שונה. לדוגמה, עבור מיקרוטובולים, מומלץ ריכוז ראשוני של חוט מצלם של פחות מ-1 ננומטר, עם התאמות לפי הצורך.

שמירה על מיקוד יציב במהלך רכישות ממושכות היא קריטית, שכן הסטה צירית (z) אינה ניתנת לתיקון לאחר העיבוד. ניתן לפצות על סטייה רוחבית (xy) באמצעות סימני RCC או פידוציאליים. במערכת זו, מערכת המיקוד המושלמת (PFS) של המיקרוסקופ מבטיחה יציבות פוקוס לאורך שעות של דימות.

לסיכום, האינטגרציה של SMLM עם SDC-OPR מספקת פלטפורמה עוצמתית להדמיה ברזולוציה גבוהה עמוק בתוך תאים שלמים, תוך התגברות על פשרות מסורתיות בין רזולוציה, עומק ושדה ראייה. עם זאת, כדי לממש את יכולות המערכת במלואן, חשוב לשים לב קפדני לתנאי הניסוי, החל מהצמדת וקיבוע נוגדנים ועד להגדרות רכישה ועיבוד נתונים. כל שלב, מהכנת הדגימה ועד תיקון הסטייה, ממלא תפקיד קריטי בהשגת נתונים אמינים ומדויקים מאוד. עם אופטימיזציה קפדנית של הפרוטוקול, גישה זו מציעה פתרון חזק ורב-שימושי להדמיה כמותית בקנה מידה ננומטרי בדגימות ביולוגיות מורכבות. פרוטוקול זה צפוי לסייע לקהילה לאמץ מיקרוסקופ מיקום של מולקולה אחת ולקבל תמונות סופר-רזולוציה ממישורי דגימות שמאתגרות לגשת אליהן באמצעות תאורת TIRF או HILO קונבנציונלית. שתי המטרות מתבצעות באמצעות מיקרוסקופים מסחריים שנמצאים בדרך כלל במתקני מיקרוסקופיה ברחבי העולם.

מבחינת יישומים אחרים ועתידיים, השיטה ישמה לדגימות תא שלמות וכן לדגימות רקמה מורכבות יותר בעומקי הדמיה גבוהים יותר, כפי שהודגם במחקרים קודמים14. בניגוד לגישות שדורשות חתך פיזי, טכניקה זו מאפשרת הדמיה וולומטרית של רקמות שלמות, תוך שמירה על הארכיטקטורה הטבעית ומזעור חפצים שנוצרים על ידי חתך פיזי. השימוש בגשושי זיקה קטנים יותר, כגון ננוגופים, משפר עוד יותר את חדירת הרקמות בהשוואה לנוגדנים באורך מלא, ומאפשר תיוג אחיד יותר בדגימות עבות. גישה זו פותחת את הדלת לחקר ארגון תאים והתפלגויות מולקולריות במקום באיכות גבוהה יותר. מעבר ליישומים אלו, האסטרטגיה מאפשרת גם סינון מהיר של ננו-מבנים ומכלולים ביומולקולריים, ומאפשרת חקירות שיטתיות של הטרוגניות ותפקוד מבנית. בנוסף, פיתוחים אחרונים ב-DNA-PAINT הניבו גשושי צילום עם כיבוי עצמי, המבוססים על אינטראקציות צבע-כיבוי או צבע-צבע 29,30,31, שמפחיתים אותות רקע, מגבירים את עוצמת הפלואורסצנציה ומשפרים את הרזולוציה המרחבית, מה שמאפשר קצב רכישה מהיר יותר. שילוב הגשושים הפלואורוגניים הללו במסגרת SDC-OPR עשוי לשפר עוד יותר את מהירות ההדמיה והרזולוציה. שילוב ההתקדמות הזו עם חוזקות מערכת SDC-OPR יכול להרחיב את היישום שלה לדגימות ביולוגיות מורכבות יותר, ולבסס את הפלטפורמה ככלי גמיש למיפוי מפורט של מבנים תאיים ומולקולריים במגוון רחב של רקמות.

גילויים

למחברים אין מה להצהיר.

תודות

מחקר זה מומן על ידי ארגון תוכנית המדע של הגבול האנושי (HFSP) באמצעות מלגת פוסט-דוקטורט בין-תחומית ל-CZ (LT0025/2023-C) ולמועצת המחקר להנדסה ומדעי הפיזיקה לתמיכה ב-M.T. (EP/R513143/1 ו-EP/W524335/1) ו-O.P.L.D (EP/R513143/1 ו-EP/T517793/1). S.S גם מכירה בחברה המלכותית דרך מלגת דורותי הודג'קין (DHF\R1\191019 ו-DHF\R\251006). עבודה זו נתמכה גם על ידי יוזמת צ'אן צוקרברג (2023-321188) וממענקי BBSCR (BB/Y513064/1) ל-S.S.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
(±)-6-הידרוקסי-2,5,7,8-טטרמתילכרומן-2-חומצה קרבוקסיליתמרק 238813-5Gטרולוקס
3,4-דיהידרוקסיבנזואיק חומצה  מרק 37580-25G-FPCA
60& עדשת אובייקטיבית Apo NA 1.49ניקון
עמודת הסרת מלח ספין 7.0 KDA המכילה שרף עם הוצאת גודל  פישר סיינטיפיק בע"מ89882עמודי דה-מלח Zeba Spin לשלב 2.4
אקוטאז - מדיום ניתוק תאי אנזיםתא קידוםC-41310
אלפקה sdAb (1H1) אנטי-GFP בשילוב עם DNA מותאם אישית (sdAB-5'-TCCTCCTCCTCCT-3')פוטוניקה מסיביתמוצר מותאם אישיתננו-גוף אנטי-GFP עבור דרוזופילה
אלפקה sdAb (1H1) אנטי-GFP בשילוב עם DNAפוטוניקה מסיביתMASSIVE-TAG-Q-FAST אנטי-GFP - F3גוף ננו-אנטי-GFP עבור NUP
טובולין אנטי-אלפא (YL1/2)תרמו פישר סיינטיפיקMA1-80017
אנטי-ארנב IgGפוטוניקה מסיביתMassive-sdAB-FAST 2-Plex, sdAB משני F2
אנטי-TCRζ (6B10.2)ביולג'נד644102
אלבומין סרום בקרמרק A4503-10GBSA
צינור צנטריפוגלי קוני 15 מ"לפישר סיינטיפיק בע"מ17705004
צינור צנטריפוגלי חרוטי 50 מ"לVWR אינטרנשיונל734-0448
CSU-W1 SoRaניקוןמיקרוסקופ SDC-OPR
הסרת מלח עמודות ספין עם Sephadex G-25 (שרף הוצאת גודל לטיהור DNA) פישר סיינטיפיק בע"מ11743309מותג: Cytiva. עמודות G-25 לשלב 2.5
D-גלוקוזמרק G8270-1KG
מדיה DMEMתרמו פישר סיינטיפיק11965092
DMSO, אנהידרוסתרמו פישר סיינטיפיקD12345
DTT  (דיתיותרייטול)תרמו פישר סיינטיפיק15976082
EDTAתרמו פישר סיינטיפיק15575020
EGTAמרק324626
סרום בקר עובריתרמו פישר סיינטיפיקA5256701
גלוטראלדהידסרבה2311402
גליצרולמרק G5516-500ML 
גליציןביומדיקל MP219482580
מאלימיד-PEG2-סוקסינימידיל מרק 746223-50MG
מדיה 5A של מקויפישר סיינטיפיק בע"מ16600082
MES (2-(N-מורפולינו)אתאנסולפוניק חומצה)מרקM3671-50G
מתנולפישר סיינטיפיק בע"מ32213-25L
MgCl2פישר סיינטיפיק בע"מ10418464
צינורות מיקרוצנטריפוגות 0.5 מ"לפישר סיינטיפיק בע"מ11508232
צינורות מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"לאפנדורף10509691 
ספקטרופוטומטר מיקרוווליום UV-Visתרמו פישר סיינטיפיקND-ONE-Wננודרופ
NaCl2סיגמא-אלדריץ'S6546-1L 
ננו-חלקיקים 90 ננומטר - זהבציטודיאגנוסטיקהG-90-100
מצלמת CMOS של Orca Fusion-BTהמאמאצו
פניצילין-סטרפטומיציןתרמו פישר סיינטיפיק15070063P/S
תמיסה עם בופר פוספט (תמיסה 1x)פישר סיינטיפיק בע"מ11530546PBS
פירס 16% פורמלדהיד (ללא מתנול), ללא מתנולפישר סיינטיפיק בע"מ11586711PFA
כלוריד אשלגן  מרק   P9541-500G
פרוטוקטצ'ואט 3,4-דיאוקסיגנאז  מרק P8279-25UN PCD
Sodium  הידרוקסידפישר סיינטיפיק בע"מ12963614
נוגדן TOM20אבקאםAb186735
בופר טריסVWR אינטרנשיונלA4577.1000
טריטון  X-100   VWR אינטרנשיונל1086031000
טווין-20מרק P9416-50ML
יחידת סינון צנטריפוגלית אולטרסילטרציה, MWCO 100 קילו-דלטוןמרק UFC510024יצרן: אמיקון אולטרה
μ-Slide 8 באר גבוהה עם תחתית זכוכית גבוההאיבידיIB-80807
μ-Slide VI 0.5 תחתית זכוכיתאיבידיIB-80607

מקורות

  1. Lelek, M., et al. Single-molecule localization microscopy. Nat Rev Methods Primers. 1 (1), 39(2021).
  2. Axelrod, D. Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence. J Cell Biol. 89 (1), 141-145 (1981).
  3. Tokunaga, M., Imamoto, N., Sakata-Sogawa, K. Highly inclined thin illumination enables clear single-molecule imaging in cells. Nat Methods. 5 (2), 159-161 (2008).
  4. Vignolini, T., Capitanio, M., Caldini, C., Gardini, L., Pavone, F. S., et al. Highly inclined light sheet allows volumetric super-resolution imaging of efflux pumps distribution in bacterial biofilms. Sci Rep. 14 (1), 12902(2024).
  5. Kim, J., et al. Oblique-plane single-molecule localization microscopy for tissues and small intact animals. Nat Methods. 16 (9), 853-857 (2019).
  6. Ghosh, A., et al. Decoding the molecular interplay of CD20 and therapeutic antibodies with fast volumetric nanoscopy. Science. 387 (6730), eadq4510(2025).
  7. Wäldchen, F., et al. Whole-Cell imaging of plasma membrane receptors by 3D lattice light-sheet d STORM. Nat Commun. 11 (1), 887(2020).
  8. Zagato, E., et al. Microfabricated devices for single objective single plane illumination microscopy (SoSPIM). Opt express. 25 (3), 1732-1745 (2017).
  9. Galland, R., et al. 3D high-and super-resolution imaging using single-objective SPIM. Nat Methods. 12 (7), 641-644 (2015).
  10. Pawley, J. Handbook of biological confocal microscopy. 236, Springer Science & Business Media. (2006).
  11. Schueder, F., et al. Multiplexed 3D super-resolution imaging of whole cells using spinning disk confocal microscopy and DNA-PAINT. Nat Commun. 8 (1), 2090(2017).
  12. Azuma, T., Kei, T. Super-resolution spinning-disk confocal microscopy using optical photon reassignment. Opt Express. 23 (11), 15003-15011 (2015).
  13. York, A. G., et al. Instant super-resolution imaging in live cells and embryos via analog image processing. Nat Methods. 10 (11), 1122-1126 (2013).
  14. Zaza, C., et al. Super-resolution imaging in whole cells and tissues via DNA-PAINT on a spinning disk confocal with optical photon reassignment. Nat Commun. 16 (1), 4991(2025).
  15. Jungmann, R., et al. Single-molecule kinetics and super-resolution microscopy by fluorescence imaging of transient binding on DNA origami. Nano Lett. 10 (11), 4756-4761 (2010).
  16. Schnitzbauer, J., Strauss, M. T., Schlichthaerle, T., Schueder, F., Jungmann, R. Super-resolution microscopy with DNA-PAINT. Nat Protoc. 12 (6), 1198-1228 (2017).
  17. Thevathasan, J. V., et al. Nuclear pores as versatile reference standards for quantitative super-resolution microscopy. Nat Methods. 16 (10), 1045-1053 (2019).
  18. Jungmann, R., et al. Multiplexed 3D cellular super-resolution imaging with DNA-PAINT and Exchange-PAINT. Nat Methods. 11 (3), 313-318 (2014).
  19. Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes. Biophys J. 82 (5), 2775-2783 (2002).
  20. Ober, R. J., Ram, S., Ward, E. S. Localization accuracy in single-molecule microscopy. Biophys J. 86 (2), 1185-1200 (2004).
  21. Tetley, R., Vaughan, A., Zaza, C. NIS-Elements JOB for DNA-Paint Acquisition at Serial Z-Planes. , (2025).
  22. Endesfelder, U., Malkusch, S., Fricke, F., Heilemann, M. A simple method to estimate the average localization precision of a single-molecule localization microscopy experiment. Histochem Cell Biol. 141, 629-638 (2014).
  23. Schlichthaerle, T., et al. Direct visualization of single nuclear pore complex proteins using genetically-encoded probes for DNA-PAINT. Angew Chem. 131 (37), 13138-13142 (2019).
  24. Stehr, F., Stein, J., Schueder, F., Schwille, P., Jungmann, R. Flat-top TIRF illumination boosts DNA-PAINT imaging and quantification. Nat Commun. 10 (1), 1268(2019).
  25. Jungmann, R., et al. Quantitative super-resolution imaging with qPAINT. Nat Methods. 13 (5), 439-442 (2016).
  26. Whelan, D. R., Bell, T. D. M. Image artifacts in single molecule localization microscopy: why optimization of sample preparation protocols matters. Sci Rep. 5 (1), 7924(2015).
  27. Xie, Z., et al. Quantitative characterization of microtubule ultrastructure based on single-molecule localization microscopy. Cytoskeleton. , (2025).
  28. Steen, P. R., et al. The DNA-PAINT palette: A comprehensive performance analysis of fluorescent dyes. Nat Methods. 21 (9), 1755-1762 (2024).
  29. Kessler, L. F., et al. Self-quenched fluorophore-DNA labels for super-resolution fluorescence microscopy. J Phys Chem B. 128 (28), 6751-6759 (2024).
  30. Kessler, L. F., et al. Self-quenched fluorophore dimers for DNA-PAINT and STED Microscopy. Angew Chem Int Ed. 62 (39), e202307538(2023).
  31. Chung, K. K. H., et al. Fluorogenic DNA-PAINT for faster, low-background super-resolution imaging. Nat Methods. 19 (5), 554-559 (2022).

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

DNA PAINT
דימות סופר-רזולוציה של תא שלם באמצעות DNA-PAINT על דיסק מסתובב עם הקצאת פוטונים אופטית
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.