מאמר שיטה

טיהור של טרופובלסטים HLA-G+ אקסטרווילוס מרקמות שליה במונחים אנושיים לצורך פנוטיפינג וניתוח תפקודי

545 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/69545

⸱

13 במרץ 2026

 ,  ,  , 
1Division of Immunobiology, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, 2Department of Obstetrics and Gynecology, Faculty of Medicine, University of Toyama, 3Immunology Graduate Program, University of Cincinnati College of Medicine, 4Department of Pediatrics, University of Cincinnati College of Medicine

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מאפשר טיהור, אפיון ותרבות של טרופובלסטים ראשוניים מסוג HLA-G+ אקסטרווילוס (EVT) מהדצידואה בזליס ומהקרום הכוריוני של שליות המונחים האנושיים. תרביות EVT ראשוניות שומרות על חיוניות למשך 96 שעות, ומאפשרות קו-קלטור עם תאי חיסון אימהיים תואמים לדגימה וניתוח זרימה ציטומטרי ומולקולרי של האינטראקציות ביניהן.

תקציר

הממשק האנושי-אם-עובר מייצג סביבה חיסונית ייחודית שבה תאי החיסון של האם ותאי הטרופובלסטים העובריים (EVT) במגע תאי ישיר כדי לבסס ולשמר את הסבילות החיסונית. EVT מציגים אימונופנוטיפ ייחודי המאופיין בביטוי של מולקולות טולרוגניות, כולל HLA-G, PD-L1 ו-PD-L2, שממלאות תפקידים מרכזיים בוויסות תגובות החיסון של האימהות. בנוסף, EVT אנושי מבטא HLA-C שניתן לזהותו ישירות על ידי תאי NK ו-T של האם ומקדם את פעילותם. חשוב לציין שאין אורתולוגים של HLA-C או HLA-G במודלים של בעלי חיים המשמשים למחקר, וטרופובלסטים בעכברים חסרי ביטוי MHC. לכן, חקירת התכונות הפנוטיפיות והפונקציונליות של EVT אנושי מרקמות שליה, הן בתנאים פיזיולוגיים והן בתנאים פתולוגיים, חיונית להבהרת המנגנונים העומדים בבסיס תחזוקת ההריון והפתופיזיולוגיה של דלקת שליה הקשורה לרעלת הריון, לידה מוקדמת, הגבלת גדילת העובר והשליה האקרטה. פרוטוקול זה מפרט מתודולוגיה מקיפה לבידוד ואפיון של EVT ראשוני בבני אדם מרקמת שליה בריאה לתקופה וגם לאחר לידה מוקדמת ורעלת הריון. הוא כולל: (1) ניתוח של רקמות שליה ורקמות ממברנה כוריוניות; (2) עיכול אנזימטי והכנת תלייה חד-תאית; (3) טיהור EVT באמצעות מיון FACS; (4) אפיון פנוטיפי באמצעות ציטומטריית זרימה מממד גבוה; ו-(5) תרבית חוץ-גופית קצרה טווח וקולטורציה משותפת עם תאי חיסון אימהיים למשך עד 96 שעות. הדגש מושם על השגת EVT טהור ובר קיימא המתאים ליישומים במורד הזרם כגון בדיקות תפקודיות אימונולוגיות, ניתוח ביטוי חלבונים וגנים. יישום פרוטוקול זה מאפשר פלטפורמה איתנה וניתנת לשחזור לקידום הבנת האינטראקציות בין EVT לתאי החיסון האימהיים והשלכותיהם בהריונות בריאים ומורכבים כאחד.

מבוא

השליה האנושית מכילה ארבע קטגוריות עיקריות של סוגי טרופובלסט, תאי גזע של טרופובלסט, סינציטיוטרופובלסטים, ציטוטרופובלסטים של צרע, וטרופובלסטים אקסטרווילוס (EVT), שלכל אחד מהם פונקציות ותכונות פנוטיפיות מובחנות. ביניהם, EVT מציגה תכונות אימונולוגיות ייחודיות, כולל ביטוי גבוה של מולקולות מדכאות חיסון, כגון HLA-G, PD-L1, PD-L2 וחברי משפחת B7, וכן HLA-C פולימורפי 1,2,3,4,5,6. EVT חודרים עמוק לרקמות נשיריות מהאימה, לעורקים הספירליים ולמיומטריום, ומציבים אותם במגע ישיר עם תאי החיסון של האם7. EVT מאופיינת בביטוי בולט של HLA-C פולימורפי, מתווך מרכזי לאינטראקציות עם תאי T ו-NK של האם שיש לשלוט בהם כדי לשמור על סבילות חיסונית במהלך ההריון. כמולקולת ה-MHC הקלאסית היחידה שמובעת על ידי EVT, HLA-C מאפשרת גם הצגת אנטיגן לתאי זיכרון T של האם ותומכת בהגנה חיסונית8. עם זאת, מספר מחקרים הראו כי EVT מגביר ישירות את תאי ה-CD4 T הרגולטוריים ואת מצבי הסבילות של תאי CD8 T ותאי NK כדי להגן על עצמם מפני ציטוטוקסיות ודחייה חיסונית 9,10,11,12,13. בנוסף, מחקרים מסוימים דיווחו על שינויים אימונולוגיים בתאי החיסון של האם וב-EVT של שליה שהושגו לאחר רעלת הריון, לידה מוקדמת או הפלה בהשוואה לביקורת בריאה 14,15,16,17,18,19,20,21. מספר אפשרויות עשויות להיות הבסיס לשינויים החיסוניים הללו, כולל i) חריגות קיימת בתאי T אימהיים; ii) תפקודים מדכאי חיסון פגומים של EVT; או iii) הפרעות בין שני סוגי התאים. כדי להבהיר את המניעים המכניסטיים הבסיסיים, מערכות מודל ניסיוניות אקס ויבו המאפשרות הערכה של תאי חיסון אימהיים ואינטראקציות עם EVT הן חיוניות.

השיטות והגישות כפי שמוצגות כאן מעניקות יתרונות רבים על פני שיטות קיימות המשתמשות בקווי טורפובלסט קלאסיים, מודלים של תאי גזע של טרופובלסט או אורגנואידים. החשוב מכל, קווי תאים טרופובלסטיים קלאסיים ומודלים של תאי גזע טרופובלסטים אינם משחזרים תכונות חיוניות של EVT ראשוני, כולל פרופילי ביטוי MHC 3,5,22,23. שנית, דרישות המדיה המורכבת של תאי גזע טרופובלסטיים אנושיים (hTSC) ותרביות אורגנואידים הכוללות מספר מעכבים מולקולריים משפיעות ישירות על תפקוד תאי החיסון ופנוטיפ, ומונעות הערכה מספקת של EVT ואינטראקציות תאי חיסון 22,24,25,26,27. לבסוף, המגוון התאים של תרביות hTSC לאחר התמיינות והאופי הפנימי של מבני האורגנים השלייתיים, מאפשרים אינטראקציות חיסוניות עם סוגי טרופובלסט שחסרים רלוונטיותפנימית, מה שמפחית את בהירות המחקרים22,27.

כאן אנו מתארים שיטות לטיהור HLA-G+ EVT ראשוני מרקמות שליה במונחים אנושיים, המאפשרים תרבית למשך עד 96 שעות בנוכחות או בהיעדר אוכלוסיות תאי חיסון. המדיום חסר מעכבים מולקולריים המשפיעים על EVT ותפקודי תאי החיסון תוך שמירה על חיוניותם. גישה זו מספקת פלטפורמה חשובה למחקרים ישירים מחוץ לחיים של EVT ותאי חיסון בהריונות בריאים ומורכבים. מצופה שהיא תתרום לגילוי גורמים מרכזיים לסבילות החיסונית בין אם-עובר ולזהות מטרות טיפוליות לטיפול בדלקת שליה.

פרוטוקול

ועדת הביקורת המוסדית בבית החולים לילדים של סינסינטי אישרה את פרוטוקול המחקר הזה (אישור #2021-0336), העומד בדרישות של שיקולים ביואתיים, טיפול במידע אישי, פתוגנים זיהומיים ונהלי הסכמה מדעת בהתאם לחוק האמריקאי. כל מעבדה צריכה לקבל אישור התואם את הנחיות המחקר הלאומיות לפני תחילת הניסוי.

פרוטוקול זה מתמקד בגידול HLA-G+ EVT ראשוני השומר על כדאיות עד 96 שעות לבדיקה פונקציונלית משנית, על ידי שיפור הפרוטוקולהקודם שלנו 2,28. ראו את Hamilton ואח' 2 לקביעת קו תאים דמוי EVT ב-HLA-G+ ו-Ikumi et al.28 לשילוב לימפוציטים נשיריים אימהיים תואמים.

1. להקים את המעבדה (יום 0).

הערה: השתמש בארון בטיחות ביולוגית מסוג II (BSL2) לטיפול בדגימות.

  1. הקימו שני אמבטיות מים בטמפרטורה של 39 מעלות צלזיוס ו-37 מעלות צלזיוס. הקימו אינקובטורCO2 עם לחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
  2. הכינו 1x PBS, שטוף בינוני A, שטוף בינוני B, תרבית EVT מדיום A, B ו-C (טבלה 1 וטבלה 2).
  3. הפשרה של 15 מ"ל של תמיסת DNase I של 10 מ"ג/מ"ל (טבלה 1) ו-500 מ"ל של 0.25% טריפסין/EDTA באמבט מים בטמפרטורה של 37°C.
  4. הניחו מיכל מלא בתמיסה ביוצידלית/וירוסידלית (למשל, 10% אקונומיקה) בארון BSL2 לאיסוף פסולת נוזלית. התקן מיכל פסולת עם שקית ביולוגית בארון BSL2 לפסולת מוצקה.
  5. הכינו רפידות סופגות, כלי חיתוך סטריליים (פינצטה עם קצה מעוקל ומספריים בקוטר 6 1/2 אינץ'), מסנני מתכת סטריליים, מדפי צינורות, וצינורות קוניים סטריליים בקוטר 50 מ"ל בארון BSL2.
  6. הכינו שלושה צינורות קוניים בקוטר 50 מ"ל (שניים עם 1x PBS כל אחד ואחד עם Wash Medium A לאיסוף חלקי רקמת השליה במהלך הניתוח).

2. איסוף דגימות (יום 0)

הערה: השתמשו בשליה אנושית עם ממברנות שהושגו בניתוח קיסרי בין שבועות 24 ל-42 להריון. שליה שנולדה בנרתיק עשויה להניב פחות EVT.

  1. התחילו בעיבוד השליה מיד בארון BSL2, רצוי תוך שעה-שעתיים מהלידה, כדי למקסם את התפוקה של התאים הבריאים. שמרו על השליה בטמפרטורת החדר בכל עת.
  2. בדקו את השליה ואם יש צורך, לתעד את גודלה, משקלה ומראה המורפולוגי הגס שלה.

3. ניתוח רקמות (יום 0)

  1. ניתוח ממברנה
    1. הניחו את השליה פונה לצד העוברי כלפי מעלה (חלק הכנסת חבל הטבור נראה לעין). הסרת האמניון, שהוא שכבת הממברנה הקרובה ביותר לצד העוברי, על ידי קילוף ידני מהממברנה הצדדית לכיוון אתר החדרת חבל הטבור; לחתוך ולזרוק את האמניון.
    2. חתוך את הממברנה הכורידיצידיאלית לרצועות בגודל 2 אינץ' החל מבסיס השליה כלפי מעלה, תוך השארת רצועת הממברנה מחוברת לשליה.
    3. מניחים את רצועת הממברנה הכורידית על שתי האצבעות הפונות כלפי מעלה וגרד בעדינות את הדקסידואה פריאטליס האימהי מהכוריון באמצעות מלקחיים קמורים סטריליים.
      הערה: עבוד ביעילות ואל תתן לממברנה הכירונית להתייבש.
    4. אסוף את הממברנה הכוריונית לתוך צינור קוני של 50 מ"ל עם 20 מ"ל של Wash Medium A.
    5. אוספים דצידואה פריאטליס לבידוד לימפוציטים נשיריים בחצוצצת הקונית של 50 מ"ל עם 20 מ"ל PBS ועקובים אחרי הפרוטוקול שתואר על ידי איקומי ואחרים לבידוד לימפוציטים28.
    6. חתוך את הממברנה הכירונית עם מספריים בצינור של 50 מ"ל עד שהיא הופכת לחתיכות קטנות של <2 מ"מ 2.
      הערה: הכמות הכוללת של הממברנה שהתיישבת היא אידיאלית 30 מ"ל לאחר החיתוך.
    7. השליכו את ה-Wash Medium A ושטפו עם PBS מספר פעמים עד שהסופרנטנט מתבהר.
  2. כריתת שליה
    1. הנח את השליה כלפי מעלה כלפי מעלה והסירו קרישי דם. חתכו את חלקי לוח הבסיס של השליה (אורך 2 ס"מ, רוחב 2 ס"מ, עומק 0.5 ס"מ) באמצעות מספריים סטריליים, תוך הימנעות מהחלקים הנמקיים, המסוידים או האיסכמיים.
    2. מניחים את חתיכת הדצידואה בזליס על האצבעות הפונות לווילי (צד העובר) כלפי מעלה. הסר בזהירות את הסדילים מהדצידואה בזליס עם מספריים כדי לקבל 2-3 מ"מ של ממברנה, כאשר רק שכבה דקה של סילי נשארה על הדצידואה בזליס.
    3. אסוף רקמת דצידואה בזליס לתוך צינור קוני בקוטר 50 מ"ל עם 20 מ"ל PBS. קצוץ את הדסידואה בזליס עד שהם הופכים לחתיכות קטנות של <2 מ"מ 2.
      הערה: הכמות הכוללת של הרקמה המתיישבת היא אידיאלית 15 מ"ל לאחר החיתוך.
    4. להשליך את ה-PBS ולשטוף את הבזליס הנשיר עם PBS מספר פעמים עד שהסופרנטנט מתבהר ללא דם נראה לעין.
    5. חלק 15 מ"ל של תליית רקמה לשני צינורות קונים של 50 מ"ל (7.5 מ"ל בכל צינור).
      הערה: פרוטוקול בידוד הלימפוציטים מדצידואה בזליס שונה מהפרוטוקול הזה. עיין בפרוטוקול שמופיע בהמילטון ואח' 2.

4. עיכול רקמות (יום 0)

  1. לאחר השטיפה הסופית של ממברנה כורית ודצידואה בזליס במקטע 3, מלאו את כל הצינורות ב-1x PBS, צנטריפוגות ב-200 × גרם למשך דקה, ושפכו את הסופרנאנט.
  2. הכינו את קוקטייל האנזים לעיכול רקמות (טבלה 1). הוסיפו 150 מ"ל של קוקטייל אנזימי עיכול חם לבקבוק זכוכית בנפח 300 מ"ל, ואז הוסיפו 30 מ"ל ממברנה כורית לבקבוק.
  3. הוסיפו 20 מ"ל DMEM/F20 חמים ו-80 מ"ל קוקטייל אנזימי עיכול חם לשני בקבוקי זכוכית של 300 מ"ל ואז הוסיפו 7.5 מ"ל דצידואה בזאליס לכל בקבוק.
  4. דגרו את הבקבוק עם ממברנה כורית באמבט מים בטמפרטורה של 39 מעלות צלזיוס ואת שני הבקבוקים עם דצידואה בזליס באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. במהלך 15 דקות הדגירה, נער את כל הבקבוקים כל 3-4 דקות (עיכול ראשון).
  5. לאחר העיכול, סננו את הרקמה המעובדת דרך מסננות מתכת (גודל רשת 40). הוסיפו Wash Medium B לרקמות לשטיפה ולהמיס חומר ג'לטיני.
  6. סננו את מתלי התא מעל פילטר של 100 מיקרון לצינורות של 50 מ"ל המסומנים בסוג הרקמה ומספר העיכול.
  7. המשיכו בעיכול השני על ידי העברת הרקמה הלא מעוכלת חזרה לבקבוקי המדיום של 300 מ"ל, הוסיפו את קוקטייל האנזים לעיכול רקמה כפי שמתואר בשלב 4.2, וחזרו על השלבים 4.2-4.6.
    הערה: כל רקמות דצידואה בזליס מועברות לבקבוק אחד בנפח 300 מ"ל. שמור על הפרדה בין התאים שהתקבלו לאחר העיכול הראשון והעיכול השני.
  8. סובב את מתלה התא ב-650 × גרם למשך 8 דקות וזרוק את הסופרנטנט.
  9. משלב את הכדורים (אך שמור על העיכול הראשון והעיכול השני נפרדים) מאותו סוג רקמה ומספר עיכול לצינור אחד. מלא ב-Wash Medium B עד 25 מ"ל.

5. גרדיאנט צפיפות פיקול (יום 0)

  1. הכינו ארבעה צינורות חרוטיים בקוטר 50 מ"ל מסומנים בסוג הרקמה ומספר העיכול. שפוך 12 מ"ל פיקול לתוך הצינורות.
  2. טען בזהירות את מתלי התאים על ה-Ficoll. צנטריפוגה את הצינורות ב-800 × גרם למשך 20 דקות (טמפרטורת החדר) בלי בלם.
  3. העבר בזהירות את שכבת התא בממשק Ficoll-medium לצינורות קוניים נקיים בגודל 50 מ"ל, המסומנים לפי סוג הרקמה ומספר העיכול לאחר הצנטריפוגה.
    הערה: אספו בזהירות את השכבה מבלי להפריע לממשק באמצעות פיפטת העברה סטרילית.
  4. מלא את הצינורות ב-Wash Medium B, וצנטריפוגה ב-650 × גרם למשך 8 דקות.
  5. זרוק את הסופרנטנט ותלווה מחדש את כדורי התאים עם החומר הנותר (כ-0.5 מ"ל). אם יש צורך, שמרו כ-10% מהמתלה של התא נפרדים לפנוטיפינג והשתמשו ב-90% למיון תאים. ספרו את התאים כדי לקבוע את מספר התאים ואת החיוניות.

6. מיון EVT (יום 0)

  1. הניחו את כדורי התאים שהוחזרו לתוך צינורות FACS סטריליים המסומנים בסוג הרקמה ומספר העיכול. הוסף אנטי-CD45-BV785 (1:100), אנטי-HLA-G-APC (1:125), ואנטי-EGFR1-BV711 (1:160) (טבלה 3). דגרו את הצינורות למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.
  2. הוסיפו 1 מ״ל Wash Medium B וצנטריפוגות ב-650 × גרם למשך 8 דקות.
  3. השליך את הסופרנטנט ותלווה מחדש את כדורי התא עם Wash Medium B כדי ליצור בערך 1 ×10 6 תאים / מ"ל.
  4. סנן את התאים דרך מסננת תאים של 40 מיקרומטר, ישירות לפני מיון התאים, ומיין את CD45-HLA-G+EGFR+ EVT לצינורות עם 1 מ"ל של מדיום תרבית EVT A בהתאם לאסטרטגיית השער המתוארת באיור 1A.
    הערה: לצורך יעילות מיטבית של טרופובלסט, יש להשתמש במיון תאי סילון באוויר (למשל, ביגפוט או מופלו) עם פיה של 100 מיקרון. ממיינים מבוססי נוזלים (למשל, DB S6 או Sony Nano) עשויים להפחית את חיוניות הטרופובלסט, בעוד שאסטרטגיות מיון תאים מגנטיים (כגון Easysep או MACS) עשויות לשמור על חיוניות אך בעלות טוהר נמוך, מה שמוביל לצמיחת יתר של תאי סטום בתרבויות.
  5. צנטריפוגה את צינורות ה-FACS עם תאים ממויננים, זרקו את הסופרנטנט, ומשלים מחדש את כדורי התאים עם EVT Culture Medium B.
    הערה: המשך בחלק הבא להכנת לוחות תרבית בזמן מיון התאים.

7. תרבית ראשונית של HLA-G+ EVT לבדיקה משנית (ימים 0 - 1)

  1. ציפוי את הבארות של לוחות תרבית תאים שטוחים עם 96 בארות ב-50 מיקרוליטר של 20 מיקרוגרם/מ"ל פיברונקטין (טבלה 2) בטמפרטורת החדר למשך 45 דקות.
  2. הסר את הפיברונקטין והוסף את תליית התא עם EVT Culture Medium B לבארות. כוון ל-0.5 ×-10תאי EVT בבזליס/200 מיקרוליטר של מדיום/באר ו-1.0 ×10 5 תאי EVT כוריוניים/200 מיקרוליטר של מדיום/באר. דגרו את לוחות תרבית התאים למשך 12-18 שעות באינקובטורCO2 הלח בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס (דגירה ביום 0).
  3. ביום הראשון, הסר את מדיום B, שטוף בעדינות את התאים עם 1x PBS, והוסיף EVT Culture Medium C עם או בלי תאי T להמשך (קו)תרבית (ראו סעיף 8).

8. קו-קולטורציה של HLA-G+ EVT ראשוני עם תאי T מופעלים (ימים 0 - 4)

  1. גירוי תאי CD8+T מתורםצד שלישי (ימים 0-1)
    1. במהלך מיון HLA-G+ EVT (יום 0), בודדו אוכלוסיות תאי חיסון הדם היקפי מדם אם או מתורמי דם לא קרובים, באמצעות קוקטייל העשרת תאי T האנושי CD8+ (ראו טבלת החומרים) ואחריו צנטריפוגציה של גרדיאנט צפיפות Ficoll או מיון FACS.
    2. תאי T או NK עם חרוזי אנטי-CD3/28 או ציטוקינים (למשל, IL2, IL15, IL12 או IL18) במדיום תרבית תאי לימפוציטים לפי הצורך.
  2. EVT קו-קולטורציה עם תאי T מופעלים (ימים 1-4)
    1. סופר את מספר הלימפוציטים ויצר תלסיסים תאיים עם מדיום תרבית תאי לימפוציטים בריכוז של 0.5 × 106 / מ"ל. הוסף 1 ×10 5 לימפוציטים לבארות ה-EVT הראשיות (נפח מדיום תרבית EVT C: מדיום תרבית תאי לימפוציטים = 1:1). דגרו את הלוחות למשך 24-72 שעות באינקובטורCO2 לח בטמפרטורה של 37°C.
    2. אספו לימפוציטים לניתוח ציטומטריית זרימה ואספו סופרנטנטים לניתוח ציטוקינים.
    3. קציר EVT באמצעות טריפסיניזציה ואיסוף EVT לצינורות FACS לניתוח ציטומטריית זרימה ביום 4 (ראו סעיף 9).

9. פנוטיפינג של HLA-G+ EVT ראשוני

הערה: יש להתחיל בצביעת ציטומטריה זרימה מיד ולשמור על EVT וכל התמיסות הנדרשות בטמפרטורת החדר בכל עת.

  1. צנטריפוגה את צינורות ה-FACS עם EVT ראשוני ב-650 × גרם למשך 7 דקות וזרוק את הסופרנטנט.
  2. הוסף את תמיסת הצביעה 3/7 (טבלה 3) לכדורי התאים וערבב בעדינות.
  3. צבעו את התאים בנוגדנים (טבלה 3), ערבבו בעדינות ודגרו עוד 20 דקות (סה"כ 30 דקות דגירות).
  4. הוסף 1 מ"ל של EVT Culture Medium C, צנטריפוגה את הצינורות ב-650 × גרם למשך 7 דקות, וזרוק את הסופרנטנט.
  5. החזירו את כדור התא לתלות עם 0.4 מ"ל של מדיום תרבית EVT של תא C. הוסיפו תמיסת צביעה 7-AAD (5 מיקרוליטר/תלייה תא) לצינורות ונתחו מיד על ציטומטר זרימה.

תוצאות

תפוקות תאים צפויות

מ-15 מ"ל של דצידואה בזליס, ה-EVT הצפוי של HLA-G+ מניב 0.1-0.3 ×-106 תאים מהעיכול הראשון ו-0.1-0.6 ×-106 תאים מהעיכול השני (סה"כ 0.2-0.8 × 106 תאים). מ-30 מ"ל ממברנה כוריונית, התפוקה הצפויה של HLA-G+ EVT היא 0.4-1.0 × 106 תאים מהעיכול הראשון ו-0.4-1.5 ×-106 תאים מהעיכול השני (סה"כ 0.8-2.5 × 106 תאים). החלק של קספס 3/7-7-7-EVT חי במבודדים צפוי להיות 90-95%.

תרבית ראשונית של HLA-G+ EVT

ניתוח ציטומטריית הזרימה של סמני שושלת (HLA-G, HLA-C, EGFR) וסמני מוות תאים הראה כי פרוטוקול זה מספק תרבית EVT ראשונית יעילה עד היום הרביעי (96 שעות לאחר ציפוי ה-EVT הממוין) (איור 1B-D). תמונות מיקרוסקופ אור מייצגות של HLA-G+ EVT כוריוני ראשוני ו-d.basalis מוצגות לאחר 24, 48 ו-72 שעות של תרבית (איור 2A-F).

קו-קולטורה של HLA-G+ EVT ראשוני עם תאי T

פרוטוקול זה שיפר את הקיימות של EVT ראשוני ב-96 שעות לאחר בידוד מהשליה, שיפור בהשוואה לדוח הקודםשלנו 1,2,10. לכן, הוא מאפשר ניתוח תגובות EVT לאחר קו-קולטורציה עם לימפוציטים מגרים מראש, המדמה דלקת חריפה בממשק אם-עובר. EVT מבטאת HLA-C פולימורפית וכן מולקולות מעבדות מדכאות חיסון, כגון PD-L1, PD-L2, PVR (המוכר גם כ-CD155), B7H3 ו-HLA-E, כפי שנקבע על ידי צביעת ציטומטריית זרימה חוץ-תאית (איור 3A,B). EVT הגדילה את הביטוי של HLA-C, כמו גם PD-L1, PD-L2 ו-HLA-E, אך לא העלתה את הביטוי של PVR ו-B7H3 בעת גידול משותף עם לימפוציטים מופעלים במשך 72 שעות לפי סעיף 8 בפרוטוקול (איור 4A,B). בנוסף, לא נצפתה עלייה בתמותה מ-EVT כפי שהודגם בצביעת 7AAD וקספאז 3/7 (איור 4C,D).

איור 1
איור 1. אסטרטגיית השער למיון תאי EVT וגרפים של ציטומטריית זרימה לאחר תרבית EVT ממוין. (א) אסטרטגיית השער הייצוגי למיון דצידואה בסאליס EVT ו-EVT כוריוני. R1 הוא שער התא החי בגרף פיזור הצד הקדמי. R2 הוא השער להדרה של לויקוציטים CD45+. R3 הוא שער HLA-G+EGFR+EVT. R4 הוא ה-7-AAD-caspase3/7- EVT חי. למרות ששער R4 אינו בהכרח נחוץ למיון, הוא מוצג כאן כדי להדגים את היתכנות EVT הראשי. (B) גרפים של ציטומטריית זרימה מייצגת של HLA-G+EGFR+EVT ממוין, לאחר 96 שעות של תרבית במבחנה. (C,D) תדרים של קספאז 3/7 - 7-AAD - EVT חי במהלך המיון (יום 0) ו-96 שעות של הגידול (יום 4). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 2
איור 2. המורפולוגיה של EVT במהלך תרבית חוץ-גופית . תמונות מיקרוסקופ אור מייצגות של EVT כוריוני לאחר (A) 24 שעות, (B) 48 שעות, ו-(C) 72 שעות של תרבית ודצידואה בסאליס EVT לאחר (D) 24 שעות, (E) 48 שעות, ו-(F) 72 שעות של תרבית. פס קנה מידה = 50 מיקרון. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3
איור 3. פנוטיפים אימונולוגיים של EVT ראשוני. (א) גרפי הזרימה המייצגים של HLAs ומולקולות מעכבות משותפות על EVT ראשוני כפי שנקבעו על ידי צביעת ציטומטריית זרימה חוץ-תאית (יום 0). (B) גרפים מזווגים מציגים MFI גולמי של בקרת IgG וצבע מלא של כל סמן מ-d. basalis EVT (כחול) ו-EVT כוריוני (ירוק) ביום 0. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 4
איור 4. פנוטיפים אימונולוגיים של EVT ראשוני עם או בלי לימפוציטים מופעלים (יום 4). (א) גרפים מייצגים של EVT לאחר תרבית 72 שעות (יום 4) עם או בלי לימפוציטים צד שלישי מופעלים. (B) גרפים של קווים מזווגים מראים MFI של EVT עם או בלי לימפוציטים צד שלישי מופעלים. גרפים כחולים מייצגים דצידואה בזאליס EVT, וגרפים ירוקים מייצגים EVT כוריוני. (ג) גרפים של ציטומטריית זרימה מייצגת עבור קספאז 3/7- 7-AAD - EVT חי עם או בלי לימפוציטים צד שלישי מופעלים ביום 4. (D) גרפים זוגיים מראים תדירויות של קספאז 3/7-7-AAD - EVT חי עם או בלי לימפוציטים צד שלישי מופעלים. גרפים כחולים מייצגים דצידואה בזאליס EVT, וגרפים ירוקים מייצגים EVT כוריוני. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

טבלה 1. מגיבים מרכזיים לפירוק הרקמה ולעיכול. ראו גם 1,2,24. אנא לחצו כאן להורדת הטבלה הזו.

טבלה 2. מגבים מרכזיים לתרבות EVT ולקולטורציה משותפת עם תאי T. ראו גם 1,2,24. אנא לחצו כאן להורדת הטבלה הזו.

טבלה 3. נוגדנים ותגובות מרכזיים למיון וניתוח ציטומטריית זרימה. אנא לחצו כאן להורדת הטבלה הזו.

דיון

שלבים קריטיים בפרוטוקול

כדי להשיג EVT תקין, חשוב להתחיל בבידוד התאים מהשליה מיד לאחר הלידה, ולבצע את כל ההליכים מהבידוד ועד המיון בטמפרטורת החדר. מכיוון ש-EVT גדולים ודביקים יותר לעומת לימפוציטים, יש לנקוט אמצעי זהירות למיון כדי למנוע סתימה: i) להעביר את תליית התא דרך מסננת תאים של 40 מיקרון לפני המיון, ii) להשתמש במדיום המכיל DNase לתליית תאים, iii) להימנע מריכוז יתרה של תליות התא (רצוי ~1 × 10⁶ תאים/מ"ל), ו-iv) להשתמש בגודל פיה של לפחות 100 מיקרון. מיון Jet-in-Air (למשל, Bigfoot, MoFlo) משיג תפוקת EVT יעילה יותר בהשוואה לממייני תאים מבוססי נוזלים (למשל, ממייני BD, Sony Nano).

שינויים ופתרון תקלות בשיטה

עיכול יתר או לא מספיק לאחר העיכול הראשון של Decidua basalis EVT

יעילות העיכול של רקמת דצידואה בזליס משתנה בין שליות. רקמות מעוכלות מדי יוצרות אגרגטים גדולים ודביקים שקשה להעביר דרך המסננת המתכתית. בדרך כלל, הוספת 10-30 מ"ל של Wash Medium B מסייעת לפיזור האגרגטים במהלך הסינון. אם זה לא פותר את הבעיה, הוסף 1-2 מ"ל DNase ישירות לרקמות. אם העיכול הראשון גורם לעיכול יתר, הפחיתו את ריכוז קוקטייל האנזים Tissue Dishtion מ-80% ל-70% בעיכול השני. לאחר הסינון של העיכול הראשון, יש להפחית את נפח הרקמה שנותר לפחות מחצי. אם נפח הרקמה השארי נשאר ללא שינוי, יש להעלות את ריכוז קוקטייל האנזימים לעיכול רקמתי מ-80% ל-90-100% לעיכול השני. רקמות הממברנה הכוריוניות מתעכלות באופן עקבי לאורך השליה. לכן, התאמת ריכוז קוקטייל אנזימי העיכול של הרקמות בדרך כלל מיותרת.

לעיכול של נפחי רקמה גדולים יותר מאלה שתוארו בפרוטוקול לעיל

לעיכול של יותר מ-30 מ"ל ממברנה כורית או יותר מ-15 מ"ל של רקמת דצידואה בזליס, יש להשתמש בבקבוקים נוספים עם קוקטייל האנזים לעיכול רקמות. הגדלת נפח הרקמה בבקבוק אחד נוטה לגרום לעיכול לקוי.

מגבלות השיטה

מצפים לתפוקות EVT נמוכות יותר משליה שנולדה בנרתיק. ה-EVT לא ניתן לשמורת קריופריזציה לפני או אחרי המיון, שכן היא רגישה ללחץ הקפאה והפשרה, מה שמגביל משמעותית את החיוניות והתפקוד שלהן. לכן, פרוטוקול זה אינו כולל נקודת עצירה כלשהי.

חשיבות השיטה ביחס לשיטות קיימות

דיווחנו בעבר על הפרוטוקול להקמת קווי תאים דמויי EVT מסוג HLA-G+ משליות מונחים באמצעות Tissue Culture Medium B וצלחות מצופות קולגן. עם זאת, מספר מעכבים במדיום ובקולגן עשויים להשפיע על תפקוד תאי T במערכת הקו-קולטורציה2. דוחות קודמים נוספים שלא השתמשו ב-Tissue Butter Medium B אפשרו הערכה של תאי T בתרבות משותפת, אך לא של EVT בשל שונות התאים 1,10. היתרון של הפרוטוקול הנוכחי הוא שהוא ממזער את השפעת מדיום התרבית תוך שהוא מאפשר תרבות של EVT ראשוני בר קיימא. פרוטוקול זה מספק פלטפורמה ניסיונית לחקירת התפקוד האימונולוגי של EVT והשינויים התפקודיים שלהם בתגובה לתאי החיסון הסובבים – תחום שנחקר באופן מועט.

גילויים

אין ניגוד עניינים הקשור למחקר זה.

תודות

אנו רוצים להודות לשרי תורנטון ולליבת Research Flow Cytometry במחלקת ראומטולוגיה במרכז הרפואי לילדים של סינסינטי על כל עזרתם בזרימה-ציטומטריה ומיון תאים; כל האחיות והרופאים של בתי החולים המשתתפים על מאמציהם באיסוף חומרי שליה; כל חברי מעבדת טילבורג וסגל האימונולוגיה של CCHMC על דיונים מועילים; עבודה זו נתמכה על ידי NIH R01HD116852 (T.T.); קרן המחקר לילדים של סינסינטי (T.T.); פרס ההריון לדור הבא של קרן בורוז וולקום #NGP10115 (T.T.); והמענק השיתופי של March of Dimes Ohio (T.T.). S.T. נתמכת על ידי JSPS KAKENHI מספרי מענקים 22KK0287 ו-25K12697.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.25% Trypsin/EDTAGibco25200-072
15 mL Centrifuge tubesThermo Fisher14-955-238
-20 °C freezerany supplier
37 °C 5% CO2 Incubatorany supplier
4 °C fridgeany supplier
50 mL Conical Centrifuge tubesThermo Fisher14-955-240
55 mM β-MercaptoethanolGibco21985-023
6 ½” scissorsany supplier
7-AAD Viability Staining SolutionBiolegend420403
-80 °C freezer any supplier
A83-01REPROCELL04-0014
AF700, mouse, IgG1 k Isotype ControlBiolegend400144
APC/Cy7 Rat IgG2a, κ Isotype ControlBiolegend400524
B7H3 PE/Dazzle594Biolegend351012
BD FACSymphony A5 SE Cell AnalyzerBD Biosciences
Bigfoot Spectral Cell SorterThermo Fisher
Bovine Serum Albumin (BSA)Sigma-AldrichA3294
BSL2 biosafety cabinetany supplier
BV605 Mouse IgG1, κ Isotype ControlBD Biosciences562652
BV750 Mouse IgG1, κ isotype Control Biolegend400105
BV785 Mouse IgG1, κ Isotype CotrolBiolegend400170
CD45 BV785Biolegend304048
Cell dissociation sieveMillipore Sigma CD1-1KT (mesh size 60)
Cell strainers 40µm, 70µm, 100µmThermo Fisher22363547; 22363548; 22363549
CellEvent caspase-3/7 Green Detection ReagentinvitrogenC10423
Centrifugeany supplier
CHIR99021, 3mMSigma-AldrichSML 1046-5MG
Curved tip tweezersany supplier
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)VWR Life Science97063-136
DMEM/F12ThermoFisher11320-033
DNAse ISigma-AldrichDN25
Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 for T Cell Expansion and ActivationThermo Fisher Scientific11131D
EGF, Human, Recombinant, Animal FreePeproTechAF-100-15-1MG
EGFR1 BV711Biolegend352920
FACS DIVA softwareBD Bioscienceshttps://www.bdbiosciences.com/ja-jp/products/software/instrument-software/bd-facsdiva-software
Ficoll Paque PlusCytivia17144003
FlowJo SoftwareFlowJohttps://www.flowjo.com/
HLA-C PEBD Biosciences566372
HLA-E PE/Cy7Biolegend342608
HLA-G APCabcamAB40915
Human AB serumCorning35060CI
Human chorionic gonadotropin (hCG) (2500IU/mL)Sigma-AldrichC1063
Human fibronectin (1mg/mL)Corning354008
Human recombinant IL-2PeproTech200-02
Insulin-Transferrin-Selenium, 100x (ITS-G)Thermo Fisher Scientific41400-045
ITGA6 APC/cy7Biolegend313627
L-Ascorbic AcidSigma-AldrichA0278
magnet separatorpromegaZ5342
Newborn Calf Serum (NCS)gibco16010-159
PD-L1 AF700invitrogen56-5983-42
PD-L2  BV750Biolegend345528
PE/Cy7 mouse, IgG1 k, Isotype ControlBiolegend400126
PE/Dazzle594 Mouse IgG1, κ Isotype CotrolBiolegend400176
Penicillin and Streptomycin Gibco15140-122
Phosphate Buffered Saline 10X SolutionThermoFisherBP399-4
PVR BV605BD Biosciences748276
Research grade FBSThermo Fisher ScientificFB12999102
RosetteSep Human CD8+ T Cell Enrichment CocktailStem Cell15023
SB431542. 10 mMApex-BioA8249
Shaking water bath 37 °Cany supplier
Tryple Express 1x No Phenol RedThermo Fisher Scientific12604013
VPASigma-AldrichP4543
X-VIVO 10 Serum-free Hematopoietic Cell MediumLonza04-380Q
Y27632Sigma-Aldrich688000-1MG

מקורות

  1. Papuchova, H., et al. Three types of HLA-G+ extravillous trophoblasts that have distinct immune regulatory properties. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (27), 15772-15777 (2020).
  2. Hamilton, I., Ikumi, N. M., Kshirsagar, S., Goodman, W. A., Tilburgs, T. Utilizing primary HLA-G+ extravillous trophoblasts and HLA-G+ EVT-like cell lines to study maternal-fetal interactions. STAR Protoc. 4 (2), 102276(2023).
  3. Tilburgs, T., et al. Human HLA-G+ extravillous trophoblasts: Immune-activating cells that interact with decidual leukocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (23), 7219-7224 (2015).
  4. Yu, J., et al. Progestogen-driven B7-H4 contributes to onco-fetal immune tolerance. Cell. 187 (17), 4713-4732.e19 (2024).
  5. Apps, R., et al. Genome-wide expression profile of first trimester villous and extravillous human trophoblast cells. Placenta. 32 (1), 33-43 (2011).
  6. Apps, R., Gardner, L., Hiby, S. E., Sharkey, A. M., Moffett, A. Conformation of human leucocyte antigen-C molecules at the surface of human trophoblast cells. Immunology. 124 (3), 322-328 (2008).
  7. Moffett, A., Loke, C. Immunology of placentation in eutherian mammals. Nat Rev Immunol. 6 (8), 584-594 (2006).
  8. Papúchová, H., Meissner, T. B., Li, Q., Strominger, J. L., Tilburgs, T. The dual role of HLA-C in tolerance and immunity at the maternal-fetal interface. Front Immunol. 10, 2730(2019).
  9. Vander Zwan, A., et al. Mixed signature of activation and dysfunction allows human decidual CD8+ T cells to provide both tolerance and immunity. Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (2), 385-390 (2018).
  10. Salvany-Celades, M., et al. Three types of functional regulatory T cells control T cell responses at the human maternal-fetal interface. Cell Rep. 27 (9), 2537-2547.e5 (2019).
  11. Mahajan, S., et al. Antigen-specific decidual CD8+ T cells include distinct effector memory and tissue-resident memory cells. JCI Insight. 8 (17), e171806(2023).
  12. Crespo, ÂC., Strominger, J. L., Tilburgs, T. Expression of KIR2DS1 by decidual natural killer cells increases their ability to control placental HCMV infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (52), 15072-15077 (2016).
  13. Burton, G. J., Redman, C. W., Roberts, J. M., Moffett, A. Pre-eclampsia: Pathophysiology and clinical implications. BMJ. 366, 12381(2019).
  14. Inada, K., Shima, T., Nakashima, A., Aoki, K., Ito, M., Saito, S. Characterization of regulatory T cells in decidua of miscarriage cases with abnormal or normal fetal chromosomal content. J Reprod Immunol. 97 (1), 104-111 (2013).
  15. Tsuda, S., et al. Clonally expanded decidual effector regulatory T cells increase in late gestation of normal pregnancy but not in preeclampsia. Front Immunol. 9, 1934(2018).
  16. Tsuda, S., et al. CD4+ T cell heterogeneity in gestational age and preeclampsia using single-cell RNA sequencing. Front Immunol. 15, 1401738(2024).
  17. Pique-Regi, R., et al. Single-cell transcriptional signatures of the human placenta in term and preterm parturition. eLife. 8, e52004(2019).
  18. Yang, J., et al. Single-cell RNA-seq reveals developmental deficiencies in placentation and decidualization in late-onset preeclampsia. Front Immunol. 14, 1142273(2023).
  19. Morita, K., et al. Analysis of TCR repertoire and PD-1 expression in decidual and peripheral CD8+ T cells reveals distinct immune mechanisms in miscarriage and preeclampsia. Front Immunol. 11, 1082(2020).
  20. Sasaki, Y., et al. Proportion of peripheral blood and decidual CD4+ CD25bright regulatory T cells in pre-eclampsia. Clin Exp Immunol. 149 (1), 139-145 (2007).
  21. Sasaki, Y. Decidual and peripheral blood CD4+CD25+ regulatory T cells in early pregnancy and spontaneous abortion. Mol Hum Reprod. 10 (5), 347-353 (2004).
  22. Shannon, M. J., et al. Single-cell assessment of primary and stem cell-derived human trophoblast organoids as placenta-modeling platforms. Dev Cell. S1534-5807, 00043-00051 (2024).
  23. Apps, R., Murphy, S. P., Fernando, R., Gardner, L., Ahad, T., Moffett, A. HLA expression of primary trophoblast cells and placental cell lines. Immunology. 127 (1), 26-39 (2009).
  24. Okae, H., et al. Derivation of human trophoblast stem cells. Cell Stem Cell. 22 (1), 50-63.e6 (2018).
  25. Shimizu, T., et al. CRISPR screening in human trophoblast stem cells reveals shared and distinct aspects of placental development. Proc Natl Acad Sci U S A. 120 (51), e2311372120(2023).
  26. Hori, T., et al. Trophoblast stem cell-based organoid models of the human placental barrier. Nat Commun. 15 (1), 962(2024).
  27. Wang, M., et al. Single-nucleus multi-omic profiling of human placental syncytiotrophoblasts. Nat Genet. 56 (2), 294-305 (2024).
  28. Ikumi, N. M., Koenig, Z., Mahajan, S., Gray, C. M., Tilburgs, T. Purification of primary human placental leukocytes. STAR Protoc. 4 (2), 102277(2023).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

HLA GFACS

מאמרים קשורים