הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הכנת רקמות ניאווסקולריות מרקמות גליומה אנושיות לניתוח פרוטאומיקה כמותי של אנגיוגנזה של גידול

496 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/69547

⸱

20 במרץ 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Shandong Provincial Key Laboratory of Precision Oncology, Shandong Cancer Hospital and Institute, Shandong First Medical University & Shandong Academy of Medical Science, 2Shandong Provincial Key Medical and Health Laboratory of Ovarian Cancer Multiomics, & Jinan Key Laboratory of Cancer Multiomics, Shandong First Medical University & Shandong Academy of Medical Science, 3School of Medicine, Wayne State University, 4Department of Pathology, The Second Xiangya Hospital, Central South University, 5Hunan Clinical Medical Research Center for Cancer Pathogenic Genes Testing and Diagnosis,, 6Department of The 1st General Surgery, The Third Xiangya Hospital, Central South University

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה הצליח להכין מספיק רקמות ניאווסקולריות איכותיות מדגימות גליומה באמצעות מיקרודיסקציה באמצעות לכידת לייזר לניתוח פרוטאומיקה כמותי של אנגיוגנזה גידולית, תוך התגברות על מגבלות מחקרים שמסורתית מתמקדים בעיקר בגורמים אנגיוגניים וסיפק פרופיל פרוטאומיקה רחב היקף של אנגיוגנזה של גליומה.

תקציר

גליומה מייצגת גידולים ממאירים ראשוניים במערכת העצבים המרכזית עם שכיחות ותמותה משמעותית. אנגיוגנזה של הגידול היא סימן ההיכר של הפתופיזיולוגיה של גליומה ומהווה אירוע חשוב בסביבת הגידול. המבנה החריג של ניאווסקולריזציה של הגידול ממלא תפקידים כפולים: מקור אספקת חומרים מזינים ופורטל גרורתי המאפשר פלישת תאי הגידול לזרם הדם. טיפול נגד אנגיוגנזה הוא נושא חם בתחום הסרטן. רוב המחקרים הקודמים מתמקדים בגורמים הפעילים והמעכבים של האנגיוגנזה של הגידול; עם זאת, זה רק מבהיר את האנגיוגנזה של הגידול בטווח מוגבל מאוד. ביטוי חלבוני חריג או שינויים לאחר תרגום תורמים למורפולוגיה החריגה של כלי הדם בגליומה. פרוטוקול זה השתמש במיקרודיסקציה (LCM) לבידוד וטיהור כמות מספקת של רקמות ניאווסקולריות מרקמות גליומה, ששימשה לניתוח פרוטאומיקה כמותית מסומנת באיזוטופים לזיהוי חלבונים המובעים באופן שונה ברקמות ניאווסקולריות של גליומה בהשוואה לביקורת. נתונים אלו מספקים בסיס מדעי חיוני להבהרת המנגנונים הפתולוגיים של אנגיוגנזה של גידול, גילוי מטרות טיפוליות אנטי-אנגיוגניות ובניית סמנים ביולוגיים המבוססים על אנגיוגנזה.

מבוא

גליומות הן גידולים הטרוגניים מאוד במערכת העצבים המרכזית (CNS) שמקורם בתאי גליה המספקים תמיכה מבנית ומטבולית לנוירונים1, ומסווגים היסטולוגית לתת-סוגים: אסטרוציטומות, אוליגונדרוגליומות ואפנדימומות2. לפי מערכת הדירוג של ארגון הבריאות העולמי, דרגות גליומה I ו-II הן גליומות בדרגה נמוכה (LGG), המאופיינות בדרך כלל בקצב גדילה איטי ויציבות פוטנציאלית לטווח ארוך, ולעיתים ניתנות לכריתה כירורגית בהתבסס על מיקום אנטומי. לעומת זאת, דרגות III ו-IV הן גליומות בדרגה גבוהה (HGG), בעיקר לא מובחנת וממאירה עם התנהגות פולשנית מאוד ותחזית גרועה3. הטיפולים הנוכחיים נשארים מוגבלים וברובם לא יעילים; בעוד שכריתה בטוחה מקסימלית בשילוב עם רדיותרפיה/כימותרפיה לאחר ניתוח משפרת במידה מתונה את התחזית, מגבלות ורעילות משמעותיות נמשכות בשל גדילה חדירה מפוזרת של הגידולים וגבולות לא ברורים המונעים כריתה רדיקלית 4,5. גליומות אנושיות, במיוחד בדרגות גבוהות של גליומה, הן גידולים ממאירים מאוד וסקולריים שצמיחתו, התפשטותם ופלישתם תלויים מאוד בניאווסקולריזציה הלא תקינה שלהם, שהיא סימן קריטי לממאירות גליומה 6,7. מחקר אנגיוגנזה של גידול ממוקד בעל יתרונות מדעיים משמעותיים לפריצות דרך טיפוליות.

אנגיוגנזה כוללת בעיקר התרבות תאי אנדותל, נדידה והבחנה תחת גירויים ספציפיים, כאשר המחקר מתמקד ברגולטורים: (i) מעודדים, כולל גורם גדילה אנדותלי וסקולרי (VEGF)8, וסורין (VASN)9, גורם היפוקסיה 1 (HIF1)10, גורם גדילה טרנספורמטיבי β (TGF-β)11, אנדוקן12, גורם גדילה שמקורו בטסיות (PDGF)13, ופקטור גדילה אפידרמלי (EGF)14; ו-(ii) מעכבים, כולל אנגיוסטטין15, אנדוסטטין16, קולטן גורם מפעיל טסיות-1 (TSP-1)17, ומעכבי רקמות של מטלופרוטיינזים (TIMPs)18. בניסויים קליניים של שלב I/II/III על גידולי מוח, רוב התרופות האנטי-אנגיוגניות מכוונות לאיתות VEGF בשל תפקידן המרכזי באנגיוגנזה, כפי שמודגם על ידי בוואסיזומאב, נוגדן מונוקקלונלי המעכב ניאווסקולריזציה דרך חסימת VEGF 19,20,21. עם זאת, ניסויים אחרונים בשלב II/III הראו לא יתרון הישרדות משמעותי הכולל עבור חולי גליובלסטומה מתקדמים שקיבלו בוואסיזומאב פלוס לומוסטין, לעומת לומוסטין בלבד 19,20,21,22. חשוב מכך, טיפול אנטי-VEGF משפר חריגות כלי דם אך מדכא רק את האנגיוגנזה ללא ציטוטוקסיות ישירה של הגידול ועלול לגרום לעמידות לטיפול. כתוצאה מכך, מיקוד ברגולטור אנגיוגני אחד או כמה לא מצליח להשיג ריפוי רדיקלי; אסטרטגיות יעילות דורשות דיכוי מקביל של האנגיוגנזה וחסימת פלישת הגידול והגרורות דרך מסלולי כלי דם. הערך האבחוני והפרוגנוסטי של חלבונים בגליומות מבוסס היטב, אך הטיפול בגליומה ממאירה זכה להתקדמות מוגבלת לאורך העשורים.

פרוטאומיקה יכולה לנתח באופן גלובלי את כל החלבונים בדגימות ביולוגיות, כולל פרופילי ביטוי, שינויים פוסט-תרגומיים (PTMs) ואינטראקציות, באמצעות טכניקות מבוססות ספקטרומטריית מסה (MS), כולל גישות מלמעלה למטה (TDP) ומלמטה למעלה (BUP). טרשת נפוצה בתפוקה גבוהה מאפשרת זיהוי עשרות אלפי חלבונים בכל ריצה, מה שהופך אותה לחיונית לחקר מנגנוני הגידול ולזיהוי מטרות טיפוליות. שפע חלבון ו-PTMs שלו ניתן לזהות ברקמות גליומה ובביופסיות נוזליות כגון דם ונגזרותיו 23,24,25, נוזל מוח-שדרה26, ושתן27. לגבי כלי דם גידוליים, ביטויים חלבונים לא תקינים ו-PTM מניעים שינויים פתולוגיים בכלי הדם. שינויים חלבונים בניאווסקולריזציה של גליומה ניתנים לזיהוי באמצעות פרוטאומיקה, שמניעה את פיתוח הפרוטוקול לפרופיל פרוטאומי אמין של ניאווסקולריזציה של גליומה.

עם זאת, רקמות ניאווסקולריות הן רק אחד מהרכיבים בכל רקמות הגליומה. בידוד וטיהור רקמות ניאווסקולריות מכל רקמות הגליומה הוא הצעד המרכזי לניתוח פרוטאומיקה כמותי מדויק של אנגיוגנזה של גליומה. מיקרודיסקציה בלייזר (LCM)28,29,30,31 היא גישה יעילה לבידוד וטיהור רקמות ניאווסקולריות מרקמות גליומה שלמות. קשה מאוד להשיג כמות מספקת של חלבוני רקמה ניאווסקולרית עבור פרוטאומיקה כמותית. בשנת 2007, צוות מחקר ניסה להשתמש ב-LCM להפרדת רקמות ניאווסקולריות מגליומה מדרגה IV לניתוח פרוטאומיקה, שזיהה רק ארבעה חלבונים עם MS32. בהמשך, בשנת 2012, הם השתמשו ברציפות ב-LCM להעשיר רקמות ניאווסקולריות של גליומות מדרגה IV לניתוח פרוטאומיקה כמותי, שזיהה רק 29 חלבונים עם MS33. שני מחקרי הפרוטאומיה של אנגיוגנזה בגליומה מראים קצב פרוטאומי נמוך מאוד באנגיוגנזה של גליומה, מה שאינו יכול לייצג את הנוף הפרוטאומי המורכב של אנגיוגנזה של גליומה.

פרוטוקול זה פיתח הליך שמאפשר רכישת כמויות מספקות של חלבוני ניאווסקולר לניתוח פרוטאומיקה כמותי של אנגיוגנזה של גליומה, ובכך בונה נוף פרוטאומי רחב היקף של אנגיוגנזה של גידול. יש לכך ערך מדעי משמעותי לגילוי סמנים ביולוגיים יעילים מבוססי אנגיוגנזה ומטרות/תרופות אנטי-אנגיוגנזה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

פרוטוקול זה, שכלל דגימות רקמה אנושית, אושר על ידי ועדת סקירת האתיקה הרפואית של אוניברסיטת שאנדונג הראשונה לרפואה (אישור מס' R202211090133), והתקבלה הסכמה מדעת מהמטופלים ומבני משפחתם. דגימות הגליומה ששימשו במחקר זה נאספו כולן מדגימות נוירוכירורגיות שנלקחו ממחלקת הנוירוכירורגיה בבית החולים שיאנגיה של אוניברסיטת סנטרל סאות', כולל 7 מקרים של רקמות אסטרוציטומה דרגה III. כלי הביקורת התקינים (n = 3) נלקחו ממיקרו-כלי דם בתוך רקמת מוח פגועה שהוסרה עקב טראומה מוחית. כל המטופלים הגיעו לראשונה ללא טיפול קרינתי או כימותרפיה לפני הניתוח, וכולם אובחנו על ידי המחלקה לפתולוגיה בבית החולים שיאנגיה, אוניברסיטת סנטרל סאות'. שלוש רקמות כלי דם בקרה תקינות מתקבלות מכריתה נוירוכירורגית של כלי דם זעירים מאוד ממוח נורמלי שנפגעו מכוח חיצוני (ללא גליומה) בבית החולים שיאנגיה. החומרים והציוד בהם משתמשים מופיעים בטבלת החומרים.

1. שימוש ב-LCM לבידוד רקמות ניאווסקולריות מרקמות גליומה אנושיות

  1. הכנת שקופית LCM: ציפוי ידנית את ממברנת הפוליאתילן נפתלאט (PEN) על מחסניות מתכת רב-פעמיות, ואחסן את המגלשות המצופות בטמפרטורה של -80°C.
    הערה: שקופיות מתכת מצופות מראש ישמשו להדבקה ישירה של חלקי הרקמה הקפואות.
  2. הכינו תמיסת צביעת טולואידין כחולה (0.5%): המיסו 0.25 גרם טולואידין כחול ב-40 מ"ל ddH₂O. הוסיפו טבליית מעכב פרוטאז אחת וערבבו עד שהן נמסות לחלוטין. כוון את הנפח ל-50 מ"ל עם ddH₂O, סנן ואחסן על הקרח.
  3. רקמת התהליך: לשמור על קריוסטט בטמפרטורת פעולה (תא/ראש דגימה של -25 מעלות צלזיוס). שלפו רקמת גליומה מאחסון בטמפרטורה של -80°C, העברו על קרח, הסרו דם עם נייר סינון, ובחרו בלוקים מתאימים להטמעה.
  4. פרוטוקול הטמעת רקמה: דיסק דגימה לפני קירור. מרחו את המדיום המוטמע והטמיעו במהירות את בלוק הרקמה. הקפיאו את כל הבלוק בטמפרטורה של מינוס 25°C למשך 10 דקות להתקשות.
  5. רקמת חתך וכלי מסך מסך: רקמות חתך בעובי 8 מיקרון. התקן חתכי רקמה על שקופיות סטנדרטיות, צבע רקמות בתמיסת צביעת כחול טולואידין, וסקר כלי דם נאווסקולריים תחת מיקרוסקופיה אופטית.
    הערה: אם לא מתגלים כלי דם, יש להשליך 3–5 חתכי רקמה ולחזור על מחזור הצביעה עד שמופיעים אזורים של כלי דם נאווסקולריים.
  6. התקן חתך רקמה חיובי לכלי על שקופית LCM המוכנה: העבר מקטעים חיוביים לכלי על שקופיות LCM מצופות PEN, אטום, מתג ואחסון בטמפרטורה של -80°C.
  7. קיבעו קטעי רקמה מותקנים על גלגיל LCM באתנול מקורר מראש של 70% (4°C, 1–2 דקות); ניקוז וצבוע בכחול טולואידין 0.5% (4 מעלות צלזיוס, 30 שניות); לנקז צבע, לשטוף פעמיים ב-ddH₂O (4 מעלות צלזיוס; שתי אמבטיות שטיפה נפרדות), לנקז, לדגור בתמיסת מעכב פרוטאז (30 שניות), ולאחסן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
  8. הפעל את מכשיר ה-LCM מראש, חמם מראש למשך 30 דקות, השתמש בלייזר אינפרא-אדום במצב מוצק לחמם לעוד 30 דקות, ואז התקן מכשיר איסוף צינורות מיקרוצנטריפוגה של 500 מיקרו-ליטר.
  9. טעינו את פרוסות ה-LCM המותקנות בדגימת הרקמה (המאוחסנות בטמפרטורה של -80°C) על כלי ה-LCM המוכן, והתאימו את המיקוד לכלי הדם הניאווסקולריים ברקמות גליומה בעזרת התוכנה התאימה.
  10. השרטט במדויק את קו סימון הלייזר לאורך הקצה החיצוני של כלי הדם הניאווסקולרי (הימנע מדופן כלי הדם), השתמש בלייזר כדי לשרוף ולהפריד את כלי הדם הניאווסקולריים, ואז לאסוף אותם לתוך מכסה צינור ה-EP.
    הערה: השתמשו בכוויית לייזר שנייה כדי לוודא שכלי הדם הניאווסקולריים ניתקו לחלוטין.
  11. הפוך ואוטם את צינור הדגימה של כלי הדם הנאווסקולרי שנאספ, ואחסן אותו במקפיא בטמפרטורה של -80°C.

2. חילוץ חלבונים מרקמות גליומה ניאווסקולריות מבודדות ב-LCM וכימות תכולת החלבון

  1. הכינו בופר חילוץ חלבון המכיל 4% נתרן דודציל סולפט (SDS), 1 מ"מ דיתיותרייטול (DTT) ו-150 מ"מ טריס-HCl (pH 8.0).
    הערה: SDS הוא אבק מסוכן שמגרה מאוד את העיניים, העור ומערכת הנשימה, ויש לשקול אותו במכסה אדים; ו-DTT הוא מגרה, שצריך לשקול אותו במכסה אדים.
  2. החזירו את רקמות כלי הדם הנאו-וסקולריים שנאספו על ידי LCM בבופר חילוץ. סוניקט על אמבט מים קרים למשך דקה אחת לליסיס מלא.
  3. צנטריפוגה ב-16,000 x g למשך 10 דקות, והעברת סופרנטנט לצינורות מיקרוצנטריפוגות חדשים.
  4. Aliquot סופרנטנט מינימלי לכימות חלבון. הוסיפו DTT לסופרנטנט שנותר (ריכוז סופי: 1 mM DTT), ערבבו בעדינות באמצעות פיפטינג כדי למנוע בועות. אליקווט ואחסן בטמפרטורה של -80°C.
  5. בצע בדיקת חלבון של חומצה ביצינכונינית (BCA) לפי השלבים הבאים:
    1. הכן תמיסה עובדת (מגיב A:B = 50:1).
    2. הכינו אלבומין סרום בקר (BSA) בתקן (0.5 מ"ג/מ"ל).
    3. הוסף את הפתרונות המתאימים לפי טבלה 1.
    4. מערבבים דגימות/תקנים עם התמיסה הפועלת, והעבירו ללוח עם 96 בארות.
    5. דגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
    6. מדוד את הספיגה ב-562 ננומטר.
    7. חשב ריכוזים מול העקומה הסטנדרטית.

3. שימוש בפרוטאומיקה כמותית לניתוח חלבוני ניאווסקולר מוכנים

  1. הכינו דגימות פפטיד טריפטי מחלבוני הנאווסקולר שהופקו.
    1. הוסיפו אצטון קר לכל דגימת חלבון שהופקה (גידול; ביקורת) (דגימה: אצטון = 1:5, v/v), ערבבו היטב, ודגרו בטמפרטורה של מינוס 20°C למשך שעה. צנטריפוגה בעוצמה של 12,000 x גרם (4 מעלות צלזיוס) למשך 15 דקות. השליך סופרנטנט להסרת תגובות חילוץ חלבון (SDS, DTT ו-Tris-HCL), והשעה מחדש את הכדור בבופר המסה של 20 מיקרוליטר עם 1 מיקרוליטר 1% SDS.
      הערה: השתמשו באצטון עם אוורור מתאים בעת רכישת משקפי בטיחות, התרחקו ממקורות הצתה, והשליכו פסולת במיכל ייעודי עמיד לניצוצות.
    2. הוסיפו 2 מיקרוליטר חומר החזרה (DTT) לכל דגימה, ערבבו היטב ודגרו בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס למשך שעה. הוסיפו 1 מיקרוליטר חומר חוסם ציסטאין (יודואצטמיד), ואז דגרו בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
    3. הוסף טריפסין (חלבון: טריפסין = 20:1, v/v) לכל דגימה. מערבבים מערבבים ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס במהלך הלילה.
  2. השתמש ב-Isobaric targ לתרגול כימות יחסי ומוחלט (iTRAQ) כדי לתייג את הפפטידים הטריפטיים המוכנים.
    הערה: בפרוטוקול זה, משתמשים בתגובות iTRAQ שש-פלקס (תגיות plex 113, 114, 115, 116, 117 ו-118) לסימון דגימות פפטיד טריפטי (גידול; ביקורת), וכל סוג דגימה מסומן שלוש פעמים (טבלה 2).
    1. שחזר כל צינור תגובת iTRAQ עם 50 מיקרוליטר איזופרופנול.
    2. הוסף דגימות פפטיד טריפטי לצינורות המגיב המתאימים, דגר בטמפרטורת החדר למשך שעה.
    3. סיימו תגובות על ידי הוספת מים אולטרה-טהורים בנפח של 3×, ואז דגרו במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
    4. באותה מידה איחד את ששת הדגימות המסומנות, ערבב היטב ועשה ליופיליזציה.
  3. השתמש בהחלפת קטיון חזקה (SCX) כדי לפרק את דגימת הפפטיד הטריפטי המסומנת ב-iTRAQ.
    1. לשחזר פפטידים ליופילים בתמיסה של 2 מ"ל A (10 מ"מ KH₂PO₄, 25% ACN, pH 2.7). טענו על עמודת חילוף קטיון פונקציונלית סולפואתיל (4.6 × 100 מ"מ, 5 מיקרון, 200 אנגומטר).
    2. אלוט עם קצב זרימה קבוע של 1 מ"ל לדקה באמצעות תמיסה B (500 מ"מ KCl, 10 מ"מ KH₂PO₄, 25% ACN, pH 2.7): 0%→10% (2 דקות) → 10%→20% (25 דקות) → 20%→45% (5 דקות) → 50%→100% (5 דקות). יש לעקוב ב-214 ננומטר לאורך כל התהליך, לאסוף כל דקה לכל צינור, לסך הכל 30 חלקים.
    3. מרוכזים כל חלק בצנטריפוגציה בוואקום, ואז משחזרים עם 40 מיקרוליטר של חומצה טריפלואורואצטית (TFA) של 0.1% (v/v). כל 30 החלקים מאוחסנים במקפיא בטמפרטורה של -80°C.
      הערה: TFA הוא קורוזיבי מאוד ורעיל, גורם לנזק חמור לעור ולעיניים, ומגרה את מערכת הנשימה; יש לטפל בו באמצעות מכסה אדים עם ציוד מגן מתאים הכולל כפפות עמידות לחומצה, משקפי מגן ומעיל מעבדה, ויש לאסוף פסולת כפסולת חומצית.
  4. השתמש ב-LC-MS/MS לניתוח כל דגימת פפטיד מפורקת.
    1. השתמש במחסנית פאזה מוצקה הפוכית של C18 (צפיפות סטנדרטית, זיהוי מיטה 7 מ"מ, נפח 3 מ"ל) להסרת מלח.
    2. השתמש בעמודת כרומטוגרפיה נוזלית בפאזה הפוכה (LC) של C18 (אורך 10 ס"מ, 75 מיקרון מזהה, שרף 3 מיקרון) כדי לשחרר 10 מיקרוליטר מכל חלק עם תמיסה C (0.1% חומצה פורמית) וגרדיאנט של תמיסה D (80% אצטוניטריל ו-0.1% חומצה פורמית) בקצב של 250 ננוליטר לדקה למשך 140 דקות.
    3. הזנה מקוונת של פפטידים מופרדים מ-LC לספקטרומטר מסה ברזולוציה גבוהה לניתוח MS/MS.
    4. המרו קבצי ספקטרום גולמיים (.raw) שנוצרו על ידי Q Exactive לפורמט .mgf עם Proteome Discoverer 1.4, ואז שלחו את קבצי ה-.mgf הללו לשרת MASCOT 2.2, המודול המובנה של התוכנה לחיפוש מסדי נתונים.
      הערה: מאגר הנתונים האנושי של Uniprot (146,704 רצפים בסך הכל; הורד ב-20 ביולי 2025 מ-http://www.uniprot.org) משמש עם פרמטרי חיפוש מפורטים (טבלה 3).
    5. שלפו את קבצי החיפוש (.dat) שהתקבלו משרת MASCOT חזרה ל-Proteome Discoverer 1.4. נתונים לסינון בסף גילוי שגוי (FDR) של <0.01 לקבלת זיהויים בביטחון גבוה.
    6. זיהוי רצף חומצות האמינו של החלבון באמצעות נתוני MS/MS, כמת את שפע החלבון בעוצמות יוני מדווח iTRAQ.
    7. חישבו את השחזוריות הניסויית כדי לקבוע את ערך החיתוך של חלבונים מבוטאים באופן דיפרנציאלי (DEPs) בתוספת מובהקות p<0,05.
      הערה: במחקר זה, ערך החיתוך נקבע כשינוי קיפול (FC) > 1.4, שיכול להסיר ביעילות את השגיאות השיטתיות.
  5. נתחו את המאפיינים התפקודיים של DEPs ניאווסקולריים בגליומה.
    1. גש לדף הבית של DAVID (מסד נתונים להערות, ויזואליזציה וגילוי משולב, גרסה 6.7; https://david.ncifcrf.gov/) ובחר ב-Start Analysis בשורת התפריטים כדי להתחיל ניתוח.
    2. בחר את הלוח השמאלי המשמש כממשק ההעלאה; הזן מזהי חלבונים או גנים בתיבת הקלט של שלב 1 לפי הבקשות (באמצעות פונקציונליות העתקה-הדבקה).
    3. לשלב 2, בחר את סוג המזהה התואם לחלבונים שהועלו; מחקר זה השתמש ב-UniProt Accession.
    4. לשלב 3, בחרו רשימת גנים או הגדרות רקע: ניתוח העשרת גנים דורש בחירת מערך גנים רקע. המערכת פועלת כברירת מחדל לכל הגנום של המין, או שהמשתמשים יכולים להעלות רשימת חלבונים/גנים מותאמת כרקע.
    5. לחץ על 'שלח רשימה ' כדי להגיש את ההגשות ולהתחיל בניתוח.
      הערה: תוצאות הניתוח מוצגות בצד ימין של לוח "תוצאות סיכום הערות". משתמשים יכולים לבחור פלטים לפי צרכים אנליטיים; מחקר זה השתמש במיוחד ברשימת GOTERM_BP_FAT לניתוח תהליכים ביולוגיים הכוללים DEPs.
    6. השגת תהליכים ביולוגיים (BPs), רכיבים תאיים (CCs), פונקציות מולקולריות (MFs) ומסלולי KEGG עבור DEPs ניאווסקולריים בגליומה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

כמות מספקת של דגימות חלבון מבודדות ב-LCM נאספה עבור פרוטאומיקה כמותית

כדי לקבל פרופילים פרוטאומיים אמינים של חלבונים מבוטאים באופן שונה ברקמות ניאווסקולריות של גליומה, מחקר זה בחר את תת-הסוג הנפוץ ביותר של גליומה, אסטרוציטומה דרגה III, ורקמות ניאווסקולריות מבודדות באמצעות LCM בשל זמינות כלי דם ניאווסקולריים מועשרים. יתרה מזאת, פרוטאומיקה כמותית דורשת ≥400 מיקרוגרם חלבון לדגימה. מחקר זה השתמש בטכנולוגיית LCM להפרדה מדויקת של רקמת ניאווסקולר מ-7...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

LCM בשילוב עם פרוטאומיקה כמותית לתיוג איזוטופים זיהו את הפרופיל הפרוטאומי הראשון בקנה מידה גדול של אנגיוגנזה של גליומה

אנגיוגנזה של הגידול היא סימן פתולוגי קריטי של גליומות, הקשורה קשר הדוק לפולשניות הגבוהה ולעמידותן הטיפולית 6,7. טיפולים אנטי-אנגיוגניים מסורתיים (כגון מעכבי VEGF) מראים יעילות קלינית מוגבלת בשל מונוטוניות מטרה ועמידות מפצה 19,20,21,22.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים מתחרים.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי קרנות הטבע הלאומיות של סין (81272798 ל-X.Z., ו-82203592 ל-N.L.), קרן המדע הטבעי של מחוז שאנדונג (ZR2022QH112 ל-N.L.), קרנות מיוחדות לפרויקט ההנדסה המלומדים של מחוז שאנדונג (NO.tstp2021143 עד X.Z.), תוכנית הכישרונות הלאומית הגבוהה של סין (H20240743; מומחה זר: X.Z.), ופרויקט המחקר המדעי של אוניברסיטת שנדונג הראשונה לרפואה בשדות אסטרטגיים מתפתחים (202403).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
לוח 96-בארתרמו פישר סיינטיפיק (ארה"ב)468667מוצרי צריכה
אצטוןNanJing Reagent (סין)C0720114023ריאגנט
אצטוניטרילמרק (סין)CN34892ריאגנט
ערכת בדיקת חלבון BCAאבקאם (בריטניה)ab102536ריאגנט
תקן אלבומין סרום בקר (BSA)סולארביו (סין)PC0001-1ריאגנט
צינור צנטריפוגה (50ML)קירגן (סין)KG2811מוצרי צריכה
קריוסטט מיקרוטוםלייקה (גרמניה)סביבות 1900ציוד
ציסטאיןאלאדין (סין)C108238ריאגנט
DL-דיתיותרייטול (DTT)אמרסקו (ארה"ב)D8220ריאגנט
עמוד HPLC בשלב הפוך של EASY-Spray C18תרמו-סיינטיפיק (ארה"ב)ES800Aמוצרי צריכה
איזון אלקטרוניסארטוריוס (ארה"ב)BSA224Sציוד
מדיום הטמעהלייקה (גרמניה)39475237מוצרי צריכה
מחסניות Empore SPE C18סיגמא-אולדריץ' (ארה"ב)66872-Uמוצרי צריכה
צינור אפנדורףקירגן (סין)KG2211מוצרי צריכה
נייר פילטרסיטיבה (ארה"ב)כיתה 42מוצרי צריכה
חומצה פורמיתאלאדין (סין)F112032ריאגנט
זכוכית ביקרשובו (סין)1015479מוצרי צריכה
גליל זכוכית מדורגשובו (סין)1601מוצרי צריכה
‌ כרומטוגרפיה נוזלית-ספקטרומטריית מסה ברזולוציה גבוההתרמו-סיינטיפיק (ארה"ב)Q-אקסקטיביציוד
מיכל מבודדפפון (סין)LCZYX-12מוצרי צריכה
מיקרוסקופ הפוך לייקה (גרמניה)XDS-1ציוד
יודואצטמידסולארביו (סין)I8010ריאגנט
איזופרופנולאלאדין (סין)I112018ריאגנט
ריאגנטים של iTRAQסיגמא-אולדריץ' (ארה"ב)4381663ריאגנט
KClביוטיים (סין)ST1596ריאגנט
KH2PO4שאנגהאי יואן יה (סין)S24278ריאגנט
מיקרודיסקציה בלכידת לייזרלייקה (גרמניה)LMD 6000ציוד
שקופית מיקרו-דיסקציה בלכידת לייזרלייקה (גרמניה)3800040מוצרי צריכה
להבים חד-פעמיים בולטים של לייקהלייקה (גרמניה)14035838926מוצרי צריכה
מיכל חנקן נוזליקייקריו (סין)YDS-3ציוד
מערבל פלטת חימום מגנטיתShanghaiSILE (סין)LAB-0002-0068-SHSLציוד
קורא מיקרופלטTECAN (שווייץ)אינפנייט F200ציוד
עט  ממברנהלייקה (גרמניה)11505189מוצרי צריכה
מד PHסארטוריוס (ארה"ב)PB-10ציוד
פיפטהאפנדורף (גרמניה)3123000268ציוד
פיפטהאפנדורף (גרמניה)3123000241ציוד
פיפטהאפנדורף (גרמניה)3123000225ציוד
פוליסולפוטיל APolyLC Inc (ארה"ב)104SE0303מוצרי צריכה
מעכב פרוטאזרוש (שווייץ)05892791001ריאגנט
צנטריפוגה מקוררתבקמן (ארה"ב)AllegraTM X-22Rציוד
מקררמיילינג (סין)BCD-180KCTציוד
נתרן דודציל סולפט (SDS)אמרסקו (ארה"ב)1027P033ריאגנט
צנצנת צביעהביוטיים (סין)FG005מוצרי צריכה
כף נירוסטהמוזיסינג (סין)XYS-101מוצרי צריכה
טיפיםקירגן (סין)KG1313מוצרי צריכה
תמיסת צביעת טולואידין כחולהסיגמא-אולדריץ' (ארה"ב)198161-5G/198161-25Gריאגנט
חומצה טריפלואורואצטיתאלאדין (סין)T103293ריאגנט
טריס-HClאמרסקו (ארה"ב)T8230ריאגנט
פתרון Trypsin-EDTAסולארביו (סין)T1300ריאגנט
מקפיא בטמפרטורה נמוכה במיוחדסאניו (יפן)MDF-382Eציוד
מטהר מים טהור במיוחדELGA (בריטניה)PureLAB flexציוד
מפריע תאים אולטרסונייםQSONICA (ארה"ב)Q500ציוד
מייבש בהקפאה בוואקוםתרמו (ארה"ב)SNL 315SVציוד
מערבל מערבולתקריסטל טכנולוגיה & תעשיות (ארה"ב)HYQ-3110ציוד
חממת אמבטיית מיםמכשיר הטכנולוגיה של שנגחאי ייהנג (סין)HWS-26ציוד
נייר שקילהקול-פרמר (ארה"ב)133802מוצרי צריכה

מקורות

  1. Lapointe, S., Perry, A., Butowski, N. A. Primary brain tumours in adults. Lancet. 392 (10145), 432-446 (2018).
  2. Pienkowski, T., et al. Proteomic profiling reveals dynamic regulation of vesicle trafficking across glioma grades. J Neurooncol. 175 (2), 585-598 (2025).
  3. Louis, D. N., et al. The 2021 WHO classification of tumors of the central nervous system: A summary. Neuro Oncol. 23 (8), 1231-1251 (2021).
  4. Kan, L. K., et al. Potential biomarkers and challenges in glioma diagnosis, therapy and prognosis. BMJ Neurol Open. 2 (2), e000069(2020).
  5. Bertolini, G., et al. Prognostic impact of second surgical resection in IDH wildtype recurrent glioblastoma following chemo-radiation therapy: a propensity score analysis cohort study. J Neurooncol. 174 (3), 789-798 (2025).
  6. Ma, X., et al. Long non-coding RNA HOTAIR enhances angiogenesis by induction of VEGFA expression in glioma cells and transmission to endothelial cells via glioma cell derived-extracellular vesicles. Am J Transl Res. 9 (11), 5012-5021 (2017).
  7. Wang, R., et al. MCPIP1 promotes cell proliferation, migration and angiogenesis of glioma via VEGFA-mediated ERK pathway. Exp Cell Res. 418 (1), 113267(2022).
  8. Seyedmirzaei, H., Shobeiri, P., Turgut, M., Hanaei, S., Rezaei, N. VEGF levels in patients with glioma: a systematic review and meta-analysis. Rev Neurosci. 32 (2), 191-202 (2021).
  9. Zhong, Y., et al. Vasorin exocytosed from glioma cells facilitates angiogenesis via VEGFR2/AKT signaling pathway. Mol Cancer Res. 22 (7), 668-681 (2024).
  10. Domènech, M., Hernández, A., Plaja, A., Martínez-Balibrea, E., Balañà, C. Hypoxia: The cornerstone of glioblastoma. Int J Mol Sci. 22 (22), 12608(2021).
  11. Chen, Z., et al. Prrx1 promotes stemness and angiogenesis via activating TGF-β/smad pathway and upregulating proangiogenic factors in glioma. Cell Death Dis. 12 (6), 615(2021).
  12. Bastola, S., et al. Endothelial-secreted Endocan activates PDGFRA and regulates vascularity and spatial phenotype in glioblastoma. Nat Commun. 16 (1), 471(2025).
  13. Krenzlin, H., et al. Cytomegalovirus promotes murine glioblastoma growth via pericyte recruitment and angiogenesis. J Clin Invest. 129 (4), 1671-1683 (2019).
  14. Hong, G., et al. EGFL7: Master regulator of cancer pathogenesis, angiogenesis and an emerging mediator of bone homeostasis. J Cell Physiol. 233 (11), 8526-8537 (2018).
  15. Feldo, M., et al. Effect of diosmin administration in patients with chronic venous disorders on selected factors affecting angiogenesis. Molecules. 24 (18), 3316(2019).
  16. Anakha, J., Dobariya, P., Sharma, S. S., Pande, A. H. Recombinant human endostatin as a potential anti-angiogenic agent: therapeutic perspective and current status. Med Oncol. 41 (1), 24(2023).
  17. Kaur, S., et al. Functions of thrombospondin-1 in the tumor microenvironment. Int J Mol Sci. 22 (9), 4570(2021).
  18. Qi, J. H., Anand-Apte, B. Deglycosylation increases the aggregation and angiogenic properties of mutant tissue inhibitor of metalloproteinase 3 protein: Implications for sorsby fundus dystrophy. Int J Mol Sci. 23 (22), 14231(2022).
  19. Sandmann, T., et al. Patients with proneural glioblastoma may derive overall survival benefit from the addition of bevacizumab to first-line radiotherapy and temozolomide: Retrospective analysis of the AVAglio trial. J Clin Oncol. 33 (25), 2735-2744 (2015).
  20. Funakoshi, Y., et al. Update on chemotherapeutic approaches and management of bevacizumab usage for glioblastoma. Pharmaceuticals (Basel). 13 (12), 470(2020).
  21. Sferruzza, G., Malcangi, M., Bosco, L., Finocchiaro, G. Reassessing the efficacy of bevacizumab in newly diagnosed glioblastoma: A systematic review and external pseudodata-based analysis. Neurooncol Adv. 6 (1), vdad174.31(2024).
  22. Ahir, B. K., Engelhard, H. H., Lakka, S. S. Tumor development and angiogenesis in adult brain tumor: glioblastoma. Mol Neurobiol. 57 (5), 2461-2478 (2020).
  23. Hallal, S., et al. A comprehensive proteomic SWATH-MS workflow for profiling blood extracellular vesicles: A new avenue for glioma tumour surveillance. Int J Mol Sci. 21 (13), 4754(2020).
  24. Westphal, M., Lamszus, K. Circulating biomarkers for gliomas. Nat Rev Neurol. 11 (10), 556-566 (2015).
  25. Santangelo, A., Tamanini, A., Cabrini, G., Dechecchi, M. C. Circulating microRNAs as emerging non-invasive biomarkers for gliomas. Ann Transl Med. 5 (13), 277(2017).
  26. Gahoi, N., et al. Multi-pronged proteomic analysis to study the glioma pathobiology using cerebrospinal fluid samples. Proteomics Clin Appl. 12 (2), 201870013(2018).
  27. Hao, X., et al. Urinary protein biomarkers for pediatric medulloblastoma. J Proteomics. 225, 103832(2020).
  28. Mustafa, D., Kros, J. M., Luider, T. Combining laser capture microdissection and proteomics techniques. Methods Mol Biol. 428, 159-178 (2008).
  29. Zheng, P. P., et al. Differential expression of splicing variants of the human caldesmon gene (CALD1) in glioma neovascularization versus normal brain microvasculature. Am J Pathol. 164 (6), 2217-2228 (2004).
  30. Miyai, M., Iwama, T., Hara, A., Tomita, H. Exploring the vital link between glioma, neuron, and neural activity in the context of invasion. Am J Pathol. 193 (6), 669-679 (2023).
  31. Komiyama, K., et al. Glioma facilitates the epileptic and tumor-suppressive gene expressions in the surrounding region. Sci Rep. 12 (1), 6805(2022).
  32. Mustafa, D. A. N., et al. Identification of glioma neovascularization-related proteins by using MALDI-FTMS and nano-LC fractionation to microdissected tumor vessels. Mol Cell Proteomics. 6, 1147-1157 (2007).
  33. Mustafa, D. A. N., et al. A proteome comparison between physiological angiogenesis and angiogenesis in glioblastoma. Mol Cell Proteomics. 11 (6), M111.008466(2012).
  34. Li, C., et al. Accurate qualitative and quantitative proteomic analysis of clinical hepatocellular carcinoma using laser capture microdissection coupled with isotope-coded affinity tag and two-dimensional liquid chromatography mass spectrometry. Mol Cell Proteomics. 3 (4), 399-409 (2004).
  35. Woo, J., Schoenfeld, M., Sun, X., Iraguha, T., Zhou, Z., Zhang, Q. Mouse paneth cell-enriched proteome enabled by laser capture microdissection. Proteome Res. 21 (10), 2435-2442 (2022).
  36. Zhang, Y., et al. Quantitative phosphoproteomics reveals molecular pathway network alterations in human early-stage primary hepatic carcinomas: potential for 3P medical approach. EPMA J. 14 (3), 477-502 (2023).
  37. Yang, H., et al. Ubiquitinomics revealed disease- and stage-specific patterns relevant for the 3PM approach in human sigmoid colon cancers. EPMA J. 14 (3), 503-525 (2023).
  38. Wen, S., et al. Quantitative acetylomics revealed acetylation-mediated molecular pathway network changes in human nonfunctional pituitary neuroendocrine tumors. Front Endocrinol (Lausanne). 12, 753606(2021).
  39. Su, J., Yang, L., Sun, Z., Zhan, X. Personalized drug therapy: Innovative concept guided with proteoformics. Mol Cell Proteomics. 23 (3), 100737(2024).
  40. Yang, L., et al. What does one-dimensional gel electrophoresis-based western blotting data really mean in the reality of proteoforms. Talanta. 295, 128266(2025).
  41. Fang, Z., et al. Proteoformics: Current status and future perspectives. J Proteomics. 321, 105524(2025).
  42. Lu, M., Zhan, X. The crucial role of multiomic approach in cancer research and clinically relevant outcomes. EPMA J. 9 (1), 77-102 (2018).
  43. Jia, W., Gong, X., Ye, Z., Li, N., Zhan, X. Nitroproteomics is instrumental for stratification and targeted treatments of astrocytoma patients: Expert recommendations for advanced 3PM approach with improved individual outcomes. EPMA J. 14 (4), 673-696 (2023).
  44. Gong, X., et al. Glioma angiogenesis phosphoproteome landscape and biomarker sets identified with phenome-centered multiomics toward 3P medical approaches. EPMA J. 16 (4), 831-856 (2025).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

אנגיוגנזה של גליומהמיקרודיסקציה בשבי captured לייזרכלי דם של גידולביטוי חלבוני דיפרנציאליאנליזה באמצעות LC-MS/MSרשת אינטראקציות בין חלבוניםסממנים ביולוגיים של גידוליםטיפול אנטי-אנגיוגני
הכנת רקמות ניאווסקולריות מרקמות גליומה אנושיות לניתוח פרוטאומיקה כמותי של אנגיוגנזה של גידול
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.