Method Article

פיתוח ותיקוף מתודולוגיה להקמת מודלים של חולדות שמנות עם לבלב שומני טיפוסי

DOI:

10.3791/69553

⸱

November 11th, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Key Laboratory of Acupuncture and Medicine Research of Ministry of Education, Nanjing University of Chinese Medicine, 2Department of Acupuncture and Moxibustion, Yangzhou TCM Hospital Affiliated to Nanjing University of Chinese Medicine, 3Department of Specialty Medicine, Ohio University, 4Research Department, Swiss University of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה מציע שיטה ניתנת לשחזור וסטנדרטית על מנת לבסס מודלים של חולדות שמנות המציגים השמנת יתר פשוטה, המאופיינת בדרך כלל בלבלב שומני. הוא כולל גם פרוטוקולים מפורטים לדגימת רקמת הלבלב ואימונוהיסטוכימיה.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השמנת יתר התגלתה כמגיפה בריאותית עולמית דומיננטית, כאשר כמעט מחצית מאוכלוסיית העולם מסווגת כעת כסובלת מעודף משקל או השמנת יתר. מאפיין פתולוגי מרכזי אצל אנשים שמנים הוא שקיעת שומנים חוץ רחמית ברקמות שאינן שומניות, כולל הלבלב - מצב הנקרא סטיאטוזיס בלבלב או לבלב שומני. במודלים של מכרסמים הנגרמת על ידי תזונה עתירת שומן (HFD), סטיאטוזיס בלבלב מקדים באופן עקבי את סטיאטוזיס בכבד, מה שמדגיש את הרגישות הספציפית של הלבלב להצטברות שומנים. מעורבות מוקדמת זו ממצבת את הלבלב כאיבר קריטי להבנת חוסר ויסות מטבולי בהשמנת יתר. למרות שחולדות שמנות (DIO) הנגרמות על ידי תזונה מסכמות היבטים מרכזיים של התקדמות מחלות אנושיות, מודלים של בעלי חיים מאופיינים היטב המציגים באופן אמין את הפנוטיפ של הלבלב נותרים נדירים בספרות.

שיקול מתודולוגי משמעותי במידול השמנת יתר אנושית הוא העיתוי של הכנסת HFD. מודלים קיימים רבים יוזמים HFD במהלך תקופת הגמילה, מה שעלול להציג השפעות תכנות מטבוליות התפתחותיות מבלבלות שאינן משקפות באופן מלא את השמנת היתר האנושית, המתפתחת בעיקר לאחר התפתחות. לעומת זאת, המחקר הנוכחי קובע פרוטוקול סטנדרטי שבו HFD מוכנס לאחר הגמילה. גישה זו מחקה בצורה מדויקת יותר את המסלול האנושי הנפוץ של הופעת השמנת יתר בבגרות, נמנעת מהסתגלות מטבולית מוקדמת בחיים ומביאה להתקדמות רלוונטית יותר מבחינה פיזיולוגית לקראת סטיאטוזיס בלבלב.

מחקר זה מספק מסגרת מפורטת וניתנת לשחזור ליצירת מודל חולדה של השמנת יתר המאופיין בפתולוגיה בולטת של לבלב שומני. המתודולוגיה כוללת שלב התאקלמות של שבוע, תקופת זירוז HFD של 14 שבועות החל מהגמילה וקצירת רקמות שיטתית. מתוארים שני מסלולי עיבוד רקמות: הקפאת הצמד לאנליזות מולקולריות (למשל, כתמים מערביים) וקיבוע זלוף פרפורמלדהיד להערכות מורפולוגיות (למשל, IHC, H&E). מודל זה מציע פלטפורמה חזקה לחקירות מכניסטיות של תפקוד מטבולי בלבלב הקשור להשמנה.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השמנת יתר פשוטה מוגדרת כהשמנת יתר הקיימת באופן עצמאי ללא מחלות נלוות אחרות, המיוחסת בעיקר לחוסר איזון אנרגטי הנובע מאורח חיים לא בריא, כגון דפוסי תזונה לא נכונים ופעילות גופנית לא מספקת1. השמנת יתר תורמת באופן משמעותי לעלייה בשכיחות של מחלות לא מידבקות בקרב אוכלוסיות צעירות, המאופיינת בשיעורי שכיחות גבוהים, הופעה מוקדמת וסיבוכים רב-מערכתיים, מה שממצב אותה כאתגר קריטי לבריאות הציבורהעולמי. לבלב שומני הוא מצב המסומן על ידי שקיעת שומנים חוץ רחמית באיבר שאינו שומני זה במהלך חוסר ויסות מטבולי. לבלב שומני משקף יחסי גומלין קריטיים בין רקמת השומן לפתופיזיולוגיה של הלבלב. הצטברות מוגזמת של שומן בלבלב עוקרת רקמות אצינריות ואיים תקינות, וגורמת לליקויים תפקודיים כפולים הן ביכולות האקסוקריניות והן ביכולות האנדוקריניות 3,4. תהליך פתולוגי זה משבש את יחסי α/β תאים, מקדם דה-דיפרנציאציה של תאי β עם אובדן תפקוד הפרשת אינסוליןלאחר מכן 5, ומתווך נזק ליפוטוקסי ישיר לתאי β6. במקביל, התפשטות תאי α ושחרור אינסולין לא מווסת מחמירים את חוסר היציבות הגליקמית, ומאיצים את ההתקדמות לסוכרת מסוג 2 (T2DM) והסיבוכים הנלווים אליה7.

חקירת פתוגנזה של לבלב שומני חושפת מנגנונים חדשים העומדים בבסיס התקדמות המחלה המטבולית8. בעוד שמחקר קודם על השמנת יתר הדגיש סטיאטוזיס בכבד, ראיות חדשות מזהות שקיעת שומנים בלבלב כאירוע מוקדם יותר בחוסר ויסות מטבולי9. שינוי פרדיגמה זה מאפשר בניית מודל פתולוגיה של איברים כפולים להשמנת יתר פשוטה, המשלב סטיאטוזיס לבלבוכבד 10. חקר הדיבור ההדדי שלהם עשוי להבהיר מסלולים קריטיים על פני ספקטרום המחלה המשתרעים על הפרעת חילוף חומרים של שומנים, השמנת יתר, עמידות לאינסולין וסוכרת, ולהציע תובנות חדשות לגבי מנגנוני המחלה11. בתהליך הפתולוגי של הלבלב, הביטוי הראשוני הוא שקיעה משמעותית של שומן הלבלב, המלווה בהתרחבות משמעותית של אדיפוציטים בלבלב. זה נצפה בעיקר בהיבט הגחוני של אזורי הראש, הצוואר והגוף של הלבלב, והוא ממוקם בעיקר באזורי הביניים בין תאי אצינר לאי. במקביל, קיימת דלקת כרונית בדרגה נמוכה של הלבלב, בעוד שהתפקודים האנדוקריניים והאקסוקריניים נשארים שלמים ברובם בשלב זה12,13. חדירת שומן נרחבת פוגעת עוד יותר בתפקוד תאי β הלבלב באמצעות רעילות ליפוטוקסית ומדכאת את פעילות האינסולין. במהלך שלב זה, תאי אצינאר מוחלפים בהדרגה על ידי אדיפוציטים, ובכך תורמים להתפתחות T2DM14,15. למרות שסוכרת אינה גורם סיכון עצמאי לסרטן הלבלב, חולים עם היסטוריה של דלקת לבלב חריפה וסוכרת מציגים סיכון מוגבר משמעותית לפתח סרטן הלבלב16.

ניתוחים אנטומיים מקרוסקופיים מכמתים את חומרת סטיאטוזיס הלבלב ודפוסי ההסתננות, בעוד שהערכות IHC ברמה המיקרוסקופית מאפיינות מורפולוגיה של תאים אצינאריים, מיקום גרעיני, תדירות ואקואוליזציה ודינמיקה של אוכלוסיית התאים17. גישה רב-מודאלית זו, המשתרעת על פני תצפית אנטומית גסה ועד IHC ברזולוציה תאית, מאפשרת שלב מקיף של פתולוגיה של הלבלב לאורך התקדמות המחלה. המחקר הנוכחי מפרט פרוטוקול סטנדרטי הכולל התאקלמות של שבוע אחד, אינדוקציה של 14 שבועות להשמנת יתר בחולדות בוגרות, ועיבוד אופטימלי של רקמת הלבלב לניתוח מורפולוגי, תוך יצירת מסגרת איתנה לחקירת הפרעות מטבוליות הקשורות לסטיאטוזיס.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הליך הטיפול בבעלי חיים אושר על ידי ועדת האתיקה של בעלי חיים של אוניברסיטת נאנג'ינג לרפואה סינית מסורתית (202006A016) ועמד בהנחיות ARRIVE (מחקר בבעלי חיים: דיווח על ניסויים In Vivo), הנחיות אתיות, הנחיות לגבי הפעלת חוק בעלי חיים (נהלים מדעיים) 1986 והנחיות נלוות, הנחיית האיחוד האירופי 2010/63 להגנה על בעלי חיים המשמשים למטרות מדעיות. כל חיות הניסוי הורדמו בהתאם להליכי הרדמת מכרסמים מאושרים לפני הנתיחה. ההליך אורגן לשלושה מרכיבים נפרדים.

1. הקמת מודל חולדה שמנה

  1. חיות ניסוי וקבוצות
    1. בחר חולדות Sprague-Dawley (SD) זכרים בני 4 שבועות (80-120 גרם) מזן רגיש לתזונה עתירת שומן (HFD).
    2. התאקלמו כל החולדות לדיאטת תחזוקה למשך שבוע אחד, ואז חלקו אותן באופן אקראי לשתי קבוצות: קבוצת הביקורת וקבוצת המודל.
    3. החלף את דיאטת התחזוקה ב-HFD עבור קבוצת המודל לאחר שבוע, תוך שמירה על קבוצת הביקורת על הדיאטה המקורית. שמור על שתי הקבוצות בתזונה שלהן למשך 14 שבועות. הרכב ה-HFD מפורט בטבלה 1, וניסוח הזנת התחזוקה הסטנדרטי נמצא בטבלה 2.
  2. תנאי האכלה ופרמטרים ניסיוניים
    1. פרמטרים סביבתיים: טמפרטורה 22 ± 2 מעלות צלזיוס, לחות 50 ± 10%, מחזור אור/חושך של 12 שעות וגישה חופשית למים ומזון.
  3. אינדיקטורים לניטור
    1. רשום את משקל הגוף וצריכת המזון מדי שבוע בשעה קבועה.
      הערה: ביצוע זה בערב יכול למזער מתח וליישר קו עם דפוסי הפעילות היומית/לילית18.
    2. שרטט עקומת גדילה של משקל גוף באמצעות הנתונים המוקלטים.
    3. הגדירו מודלים מוצלחים של השמנת יתר כאשר משקל הגוף עולה על 20% מקבוצת הביקורת המותאמת לגיל.
מרכיבתוכן (גרם/ק"ג)חומרים מזינים עיקריים מסופקים
הזנה אבקתית רגילה365אספקה תזונתית בסיסית של פחמימות, חלבונים צמחיים, שומנים, קומפלקסי ויטמינים, מינרלים וכו'
שומן חזיר310חומצות שומן רוויות, חומצות שומן בלתי רוויות
קזאין250חומצות אמינו חיוניות
כולסטרול10כולסטרול
תערובת תאית ומינרלים60סיבים, סידן, זרחן, נתרן וכו'
DL-מתיונין מתיונין/חומצות אמינו מתיונין3חומצות אמינו חיוניות
שמרים1ויטמינים מקבוצת B, β-גלוקן וכו'
NaCl1NaCl

טבלה 1: ניסוח HFD מיוחד להקמת DIO במודלים של חולדות. הטבלה מפרטת את ההרכב הספציפי של ה-HFD ששימש במחקר זה עבור קבוצת המודל, אשר ניתן מתום תקופת ההסתגלות ועד לאיסוף הרקמות.

מרכיבתוכןיחידה
לחות12.196%
חלבון גולמי (CP%)18.272%
אנרגיה ניתנת לעיכול (DE)3.186מק"ל/ק"ג
אנרגיה מטבולית (ME)2.939מק"ל/ק"ג
אנרגיה נטו (NE)2.228מק"ל/ק"ג
תמצית אתר (EE%)4.417%
סיבים גולמיים (CF%)3.677%
סידן (Ca%)0.991%
סה"כ זרחן0.681%
(סה"כ P%)
זרחן שאינו פיטאט0.19%
מלח0.407%
ליזין1.118%
ליזין קל לעיכול0.813%
מתיונין0.53%
תראונין0.779%
טריפטופן0.221%
נחושת (Cu)22.06מ"ג/ק"ג
ברזל (Fe)173.69מ"ג/ק"ג
מנגן (Mn)102.1176מ"ג/ק"ג
אבץ (Zn)60.3687מ"ג/ק"ג

טבלה 2: נוסחת הזנת תחזוקה סטנדרטית בחולדות. הטבלה מציגה את הניסוח של הזנת התחזוקה הסטנדרטית, שסופקה לכל החולדות בשלב ההתאקלמות ולקבוצת הביקורת לאורך כל תקופת המחקר.

2. קצירת רקמות

  1. הכנה לפני הניתוח
    1. טיפול בצום: הגבלת מזון של 12 שעות לפני המתת חסד כדי למזער הפרעה לתוכן המעיים בניתוחים ביוכימיים.
    2. הרדמה: מתן איזופלורן באינהלציה להרדמה עמוקה (ריכוז אינדוקציה 4%, ריכוז תחזוקה 1.5-2%). מכונת ההרדמה הייתה מצוידת במכשיר אידוי לאיזופלורן, וריכוז חומר ההרדמה נשמר על 1.5-2. כהתייחסות להכנה, הצריכה הפיזית של איזופלורן נוזלי הייתה כ-0.5 מ"ל-0.8 מ"ל לחולדה לכל ההליך.
    3. עקוב אחר עומק ההרדמה: עקוב באופן רציף אחר קצב הנשימה ורפלקסים בקרנית. שמור על מצב הרדמה מתמשך לאורך כל ההליך כדי למנוע אוטוליזה של הלבלב לאחר המוות.
    4. נהל הרדמה לא מספקת: אם עומק ההרדמה אינו מספיק או שההכרה חוזרת, יש לתת מיד 20% אורטן תוך צפקי להרדמה משלימה (50 מ"ג/ק"ג) ולבדוק שוב סימנים חיוניים לפני שתמשיך. הכן תמיסת אורטן 20% על ידי המסת אבקת אורטן במי מלח.
      הערה: הרדמה איזופלורן היא השיטה התואמת את הדרישות האתיות של המרכז לבעלי חיים ניסיוניים של אוניברסיטת נאנג'ינג לרפואה סינית. עבור הליך סופי זה, הזרקה תוך-צפקית של 20% אורטן עשויה לשמש כחלופה מקובלת. עם זאת, הראיות הקיימות מצביעות על כך שאיזופלורן עשוי להציע פרופיל בטיחות גבוה יותר מאשר קטמין במכרסמים19.
  2. קצירת רקמות טריות
    1. חיטוי עור: רססו אתנול 75% במהירות על כל הגוף (1-2 שניות) כדי למנוע זיהום שיער של איברי הבטן.
    2. קיבוע מיקום: מקם את החולדה על שולחן הדיסקציה וקבע את כל ארבע הגפיים בצורה מאובטחת בעזרת סיכות ראש גדולות.
    3. אחזו בעור הבטן בעזרת מלקחיים ביד שמאל וחתכו את העור לאורך קו האמצע (מ-xiphoid ועד ערווה) בעזרת מספריים ביד ימין. נתח בצורה בוטה את הפאשיה התת עורית כדי להפריד רקמת חיבור ולחתוך את שריר הבטן והצפק לאורך אותו קו אמצע.
    4. זיהוי לבלב: יש להזיז בעדינות את המעי שמאלה כדי לדמיין את הקיבה, הטחול והתריסריון. הטחול מחובר לזנב הלבלב, והקיבה קרובה ללבלב.
    5. דיסקציה מהירה: הרם בעדינות את הטחול בעזרת מלקחיים ובודד את הלבלב על ידי חיתוך הדרגתי של חיבוריו לטחול, לקיבה ולמזנטריה של התריסריון. בשל המרקם השברירי שלו, הימנע מהידוק ישיר של פרנכימת הלבלב ושמור על צינורות הלבלב/כלי הדם כדי למנוע קריעת רקמות.
    6. שימור רקמות: שטפו את הלבלב המנותח במהירות עם PBS קר כקרח (1× מי מלח עם פוספט, PH 7.4) או מי מלח כדי להסיר שאריות דם. מעבירים מיד את הלבלב לצינור הקפאה של 2 מ"ל, טובלים בחנקן נוזלי תוך 30 שניות ומאחסנים לטווח ארוך ב-80 מעלות צלזיוס.
    7. המתת חסד וסילוק פגרים לאחר איסוף רקמות, המתת חסד של כל חולדות הניסוי על ידי פריקת צוואר הרחם. על פי תקנות המרכז לבעלי חיים ניסיוניים של אוניברסיטת נאנג'ינג לרפואה סינית, פגרי בעלי חיים מסווגים כפסולת ביו-רפואית פתולוגית (קוד פסולת: 831-003-01). יש לאטום את כל פגרי בעלי החיים בשקיות אטומות בהתאם לתקנות, ולאחסן אותם באופן אחיד במקפיאים ייעודיים. סילוק מרכזי וידידותי לסביבה יבוצע על ידי האוניברסיטה. בשום פנים ואופן אין להשליך פגרים באופן שרירותי.
      הערה: הימנע מחשיפה לטמפרטורת החדר כדי למנוע פירוק אנזימטי של ביומולקולות20,21.
  3. קצירת רקמות זלוף (השלבים הנותרים זהים)
    1. חשוף את הלב: הרם את רקמת העור של החולדה ביד שמאל ופתח את חלל בית החזה ביד ימין כדי לחשוף את הלב במלואו.
    2. הכן את החדר השמאלי לזלוף: בצע חתך קטן בחדר השמאלי (גודל התואם את קוטר מחט הזלוף) וחתך את האפרכסת הימנית כדי לאפשר זרימת דם.
    3. החדרת מי מלח: הכנס את מחט הזלוף בעדינות לחדר השמאלי והחדיר לאט 100 מ"ל מי מלח בקצב זרימה של 10 מ"ל לדקה עד שיציאת הפרוזדורים הימנית מתבהרת.
    4. קיבוע Perfuse: עבור ל-200 מ"ל של 4% קיבוע פרפורמלדהיד, קצב זרימה: 5 מ"ל/דקה. יש להחדיר לכל חולדה 100 מ"ל מי מלח, ואחריהם 200 מ"ל של 4% פרפורמלדהיד. מחקר זה השתמש בתמיסת PFA שהוכן מסחרית. בשל חוסר היציבות של PFA בתמיסה, עם פוטנציאל שונות משמעותי בהתאם להכנה וטריות, יש להגן על התמיסה הנוזלית מפני אור ולאחסן אותה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. השתמש ב-aliquot פתוח באופן מיידי כדי להבטיח יעילות. אם מכינים אותו מאבקה, יש להכין את התמיסה טרייה מיד לפני השימוש.
      הערה: ללבוש כפפות, משקפי מגן ומעיל מעבדה; להופיע במכסה אדים מכיוון שפרפורמלדהיד רעיל. על פי התקנות של מרכז חיות הניסוי של אוניברסיטת נאנג'ינג לרפואה סינית, פסולת פרפורמלדהיד מסווגת כפסולת ביו-רפואית כימית (קוד פסולת: 831-004-01). לאחר השימוש, יש לאחסן אותו במיכל פסולת ייעודי המסומן בסמל הסכנה הביולוגית. סילוק מרכזי מתבצע על ידי האוניברסיטה. בשום פנים ואופן אין להשליך אותו בצורה לא ראויה.
    5. אשר את הצלחת הזלוף: בדוק אם יש קשיחות גפיים המעידה על קיבוע יעיל.
    6. מניחים את הלבלב בצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל המכיל 30 מ"ל של תמיסת פרפורמלדהיד 4%. תקן את הרקמה על ידי אחסון הצינור נייח בחושך למשך 2-4 שעות.
    7. מעבירים את הלבלב לצינור צנטריפוגה חדש של 50 מ"ל המכיל 30 מ"ל של תמיסת אתנול 70%. שמור על הצינור נייח ומוגן מפני אור למשך כ-20-24 שעות22.
    8. הטמעת פרפין: הטמע את הרקמות בשעוות פרפין. אחסן את הרקמות המוטבעות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס או -20 מעלות צלזיוס.
      הערה: במחקר זה נעשה שימוש בקטעי פרפין. חלקים קפואים הם חלופה תקפה, אך יש לוודא מראש את ביצועי הנוגדנים עבור סוג החתך הספציפי כדי להבטיח תוצאות מיטביות.

3. צביעת לבלב אימונוהיסטוכימיה (IHC)

  1. פרוטוקול חיתוך והרכבה
    1. קטעי פרפין: חותכים קטעי רקמה בעובי של 6 מיקרומטר באמצעות מיקרוטום ומרכיבים על שקופיות זכוכית.
    2. שיטת ציפה: יש לצוף את החלקים על אמבט ציפה של רקמות בטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס כדי להחליק קמטים.
    3. איסוף טישו: הרכיבו חלקים על שקופיות מצופות דבק (2-3 לכל שקופית) וייבשו על מחמם שקופיות של 80 מעלות צלזיוס.
    4. ייבוש שקופיות: מעבירים שקופיות עם חלקים מותקנים לתנור 60 מעלות צלזיוס למשך הלילה לאחר החיתוך.
  2. פרוטוקול דה-פארפיניזציה והחזרת נוזלים
    1. מניחים שקופיות במתלה שקופיות וטובלים ברצף באופן הבא: קסילן I, 7 דקות; קסילן II, 7 דקות; אתנול נטול מים, 5 דקות; 90% אתנול, 5 דקות; 85% אתנול, 5 דקות; 75% אתנול, 5 דקות; מים מזוקקים, 5 דקות; PBS, 5 דקות (שלוש פעמים).
      הערה: בצע שלבי קסילן במכסה אדים עם כפפות ומשקפי מגן. השלך פסולת קסילן בהתאם לפרוטוקול הזהה שצוין עבור פרפורמלדהיד כשלב 2.3.4.
  3. פרוטוקול אחזור אנטיגן
    1. הכנת תמיסת נתרן ציטראט: הכן מאגר נתרן ציטראט (pH 6.0). השתמשנו בתמיסת חיץ נתרן ציטראט בהכנה עצמית על ידי המסת חבילה אחת של האבקה ב-1 ליטר מים.
    2. מיקרוגל ברצף: מניחים את השקופיות בצנצנת מכתים מזכוכית מלאה בתמיסת חיץ נתרן ציטראט כדי לכסות את השקופיות, ולאחר מכן מניחים את הצנצנת במיקרוגל. הדגימות עברו טיפול במיקרוגל ברצף הבא: חום בינוני (600 וואט) למשך 8 דקות, ואחריו עמידה ללא חימום למשך 8 דקות, ולבסוף חום נמוך (300 וואט) למשך 7 דקות.
    3. מצננים באופן טבעי לטמפרטורת החדר: מניחים למיכל להתקרר באופן טבעי לטמפרטורת החדר.
    4. PBS: שטפו את השקופיות ב-PBS למשך 5 דקות פעמיים.
  4. דגירה בתנור
    1. H2O2: יש למרוח 3% H2O2 על חלקי הרקמה למשך 10 דקות כדי לחסום פעילות פרוקסידאז אנדוגנית. מרחו כ-50 - 80 מיקרוליטר של H2O2 על כל שקופית.
    2. PBS: שטפו את השקופיות ב-PBS למשך 5 דקות שלוש פעמים.
    3. קומפלקס Strept-Avidin-Biotin-Peroxidase (SABC): יש למרוח SABC בטיפה על הרקמה ולצבוע למשך 30 דקות באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס. מרחו כ- 50 - 80 מיקרוליטר של SABC על כל שקופית.
    4. PBS: שטפו את השקופיות ב-PBS למשך 5 דקות שלוש פעמים.
  5. עיבוד צבע
    1. 3,3'-diaminobenzidine (DAB): מרחו תמיסה כרומוגנית DAB על חלקי הרקמה ועקבו עד שמתפתח צבע חום-צהוב. מכתים את החלקים למשך כ 1-5 דקות. התאם את משך הצביעה על סמך ספציפיות הרקמה וטמפרטורת הסביבה. עבור רקמת הלבלב, מומלץ זמן צביעה של 2 דקות ב-22 מעלות צלזיוס.
    2. שטיפה: יש לשטוף מיד מתחת לזרם עדין של מים מזוקקים כדי לעצור את התגובה.
    3. טבילה: טבלו את המגלשות במים מזוקקים למשך 5 דקות כדי להסיר ריאגנטים שנותרו.
  6. מכתים המטוקסילין
    1. המטוקסילין: טבלו שקופיות בהמטוקסילין למשך דקה אחת. תמיסת המטוקסילין מוכנה באמצעות מים טהורים ביחס של 56 מ"ג/מ"ל.
    2. שטיפה: יש לשטוף את ההחלקות פעמיים במים מזוקקים (5 שניות לשטיפה).
    3. בידול חומצה הידרוכלורית-אלכוהול: הבדיל את השקופיות בתמיסת ההתמיינות של חומצה הידרוכלורית-אלכוהול למשך שנייה אחת.
    4. טבילה: טבלו את המגלשות במי ברז למשך 10 דקות כדי לפתח צביעה גרעינית כחולה יציבה.
  7. התייבשות: ייבשו את המגלשות ברצף באמצעות התמיסות הבאות: 70% אתנול, 80% אתנול, 90% אתנול, אתנול נטול מים, קסילן I וקסילן II, למשך 3 דקות בכל תמיסה, בהתאמה.
    הערה: בצע שלבי קסילן במכסה אדים עם כפפות ומשקפי מגן.
  8. איטום
    1. הרכיבו את החלקים עם בלסם ניטרלי: מרחו בלסם ניטרלי על המגלשה באמצעות טפטפת נורת גומי. מכסים בכיסוי. הימנע מדחיסת הנורה בכוח כדי למנוע היווצרות בועות. מרחו כ-50 מיקרוליטר של בלסם ניטרלי על כל שקופית.
    2. ייבוש באוויר: הנח את השקופיות במכסה אדים למשך הלילה כדי לאפשר לשרף הנייטרלי להתייבש לחלוטין.

4. ניתוח Western Blotting (WB)

  1. פירוק רקמות
    1. קח 200 מ"ג רקמת לבלב של חולדה, הנח אותה בצינור שחיקה של 2 מ"ל המכיל 1 מ"ל של מאגר ליזה ו-3 כדורי פלדה קטנים. מאגר הליזיס מורכב מקוקטייל מעכב פרוטאז שלם ומאגר ליזה RIPA. יחס הערבוב הוא טבליה אחת של מעכב פרוטאז: 50 מ"ל מאגר ליזה RIPA.
    2. הטחינה בוצעה באמצעות טחנת כדור עם הפרמטרים הבאים: תדירות: 30/s; זמן: 30 שניות; 10-15 פעמים. עד שלא נראים חלקיקים לבנים לעין בלתי.
    3. העבירו את החלבון העליון לצינור מיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל, אל תיקחו קצף. צנטריפוגה עם 16900 x גרם 30 דקות, 4 מעלות צלזיוס.
      הערה: הומוגנטים לניתוח כתמים מערביים הוכנו מכל הלבלב.
  2. כימות חלבון: כימות ריכוז החלבון באמצעות ערכת בדיקת החלבון Pierce BCA בהתאם להוראות היצרן. יחס הערבוב עבור פתרון עבודה BCA הוא פתרון A: פתרון B = 50:1.
  3. אלקטרופורזה של חלבון:
    1. הוסף את דגימות חלבון הלבלב המוכנות (נפח של 6 מיקרוליטר הועמס לכל נתיב) לג'ל נתרן דודציל סולפט-פוליאקרילאמיד-יאנג PAGE, Bis-Tirs, 10 × 8, לאלקטרופורזה.
    2. הפעל ב-70 וולט למשך 0.5 שעות, ולאחר מכן הפעל ב-110 וולט למשך שעה אחת באמצעות מערכת טטרה Mini-PROTEAN. יש לדלל את נוזל האלקטרופורזה של MOPS Running Buffer 20×במים טהורים לריכוז של 1×.
  4. העברת ממברנה
    1. לדלל את תרכיז ההעברה eBlot L2 5× עד 1× ריכוז עבודה באמצעות מים טהורים. ניתן לעשות שימוש חוזר במאגר העברה זה של 1× עד 3 פעמים. יש לדלל את תרכיז האיזון eBlot L2 בריכוז עבודה של 5× עד 1× באמצעות מים טהורים.
    2. חותכים קרום PVDF (ממברנת העברת אימובילון-P) לגודל המתאים (למשל, 7.5 ס"מ × 5.5 ס"מ). גודל הנקבוביות הוא 0.45 אום.
    3. יוצקים כ -30 מ"ל מתנול לקופסת דגירה עם 90 × 60 × 32 מ"מ. טבלו את קרום ה-PVDF במתנול למשך 5 שניות כדי להפעיל אותו.
    4. יוצקים כ -30 מ"ל מתמיסת האיזון המוכנה 1x לקופסת דגירה נקייה אחרת. הסר בזהירות את הג'ל מלוחות האלקטרופורזה והנח אותו בתמיסת האיזון.
    5. העבירו את קרום ה-PVDF המופעל מהמתנול והניחו אותו גם לקופסת הדגירה המכילה את תמיסת האיזון. ודא שהממברנה ממוקמת מתחת לג'ל למגע תקין. אפשר לשניהם להתאזן.
    6. בהתאם להוראות יצרן מכשיר הספיגה, הניחו את "כריך" ההעברה בסדר זה מלמעלה למטה: ספוג, ג'ל, קרום PVDF, ספוג. ודא שאין בועות אוויר כלואות בין השכבות. הנח נכון את ערימת ההעברה המורכבת לתוך תא מכשיר הספיגה. חבר את ספק הכוח והפעל את ההעברה במצב רגיל למשך 15 דקות.
  5. חסימה
    1. הכינו שתי קופסאות דגירה, האחת מכילה כ-15 מ"ל TBST (Tris-buffered salline-Tween20), והשנייה עם כ-15 מ"ל של תמיסת חסימת BSA 5%.
    2. הכנת תמיסת TBST: יש להמיס שקיק אחד של אבקת מי מלח Tris Buffered ב-2 ליטר מים טהורים, ולאחר מכן להוסיף 2 מ"ל של Tween 20.
    3. הנח את קרום ה-PVDF בתמיסת ה-TBST, וודא שהצד שהיה במגע עם הג'ל פונה כלפי מעלה.
    4. שוטפים את קרום ה- PVDF על שייקר ב 40 סל"ד בטמפרטורת החדר למשך 3-5 דקות.
    5. העבר את קרום ה-PVDF למאגר החוסם. חסום אותו על שייקר ב -20 סל"ד, בטמפרטורת החדר למשך שעה.
  6. דגירה ראשונית של נוגדנים
    1. שוטפים את קרום ה-PVDF בקופסת דגירה המכילה TBST, שוטפים את הממברנה שלוש פעמים למשך 5 דקות כל אחת על שייקר ב-40 סל"ד בטמפרטורת החדר.
    2. דגירה עם נוגדן ראשוני למשך הלילה (14-18 שעות) ב-4 מעלות צלזיוס (1:40000, נוגדן רב-שבטי וינקולין) בקופסת דגירה אחרת של נוגדנים על שייקר ב-20 סל"ד.
    3. ודא שהנוגדן מדולל בתמיסת חסימת BSA של 5%, שהוכנה על פי היחס המצוין בסעיף.
  7. דגירה משנית של נוגדנים
    1. הנח את קרום ה-PVDF בקופסת דגירה המכילה 15 מ"ל של תמיסת TBST. שוטפים את הממברנה שלוש פעמים למשך 5 דקות כל אחת על שייקר בטמפרטורת החדר, מתסיסים ב -40 סל"ד.
    2. הכן את הנוגדן המשני על ידי דילול נוגדן IgG נגד ארנב, נוגדן מקושר HRP ב-1:2000 במאגר חוסם BSA של 5%.
    3. דגירה למשך שעה בטמפרטורת החדר על שייקר ב-20 סל"ד23.
    4. שוטפים את קרום ה- PVDF שלוש פעמים בתמיסת TBST למשך 5 דקות כל אחת, לפי השיטה שתוארה לעיל.
  8. זיהוי
    1. הכן את תמיסת מצע העבודה על ידי ערבוב AccuWest ECL Plus, Raegent A ו-AccuWest ECL Plus, Raegent B ביחס נפח של 1:1 ישירות בקופסת דגירה. בצע את כל השלבים הבאים מוגנים מפני אור.
    2. דגרו את קרום ה-PVDF בתמיסה למשך 5-10 שניות, ולאחר מכן זהו מיד רצועות אימונוריאקטיביות באמצעות ריאגנטים כימילומינסנציה משופרת (ECL) - Vilber Fusion FX6 MINI. זמן החשיפה האופייני נע בין 5 ל -10 שניות.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מתארים פרוטוקול שניתן לשחזר לביסוס מודל השמנת יתר פשוט שמציג באופן אמין לבלב שומני (איור 1). התהליך כולו, מהאכלת בעלי החיים ואיסוף הרקמות ועד לאימות המולקולרי שלאחר מכן, מסוכם באופן סכמטי באיור 1. השינויים השבועיים במשקל של קבוצת המודל (n = 5) וקבוצת הביקורת (n = 5) נרשמו, ולא היה הבדל משמעותי במשקל של שתי הקבוצות לפני האכלה ב-HFD. בעוד שמשקל קבוצת המודל היה גבוה משמעותית מזה של קבוצת הביקורת באותה תקופה לאחר האכלה ב-HFD, הע...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כמניע העיקרי לתסמונת מטבולית, השמנת יתר לא מסובכת מייצגת את הביטוי הראשוני של חוסר ויסות בחילוף החומרים של השומנים המערכתיים. ללא התערבות, הוא עלול להתקדם לסוכרת מסוג 2 ולסיבוכי סוכרת חמורים, מה שמדגיש את הצורך בתיקון מטבולי מוקדם30. סטיאטוזיס לבלב (לבלב שומני), סמן מוקדם של שקיעת שומנים חוץ רחמית בהשמנת יתר, מגדיר מחדש את הלבלב כאיבר שומן לא קלאסי, ומאתגר את פרדיגמת ציר השומן הקונבנציונלית. שינוי זה מספק תובנות קריטיות לגבי הצלבה מטבולית בין איברים, מרכזית להבהרת...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי פרויקט היורשים והמדריכים לירושת החוויה האקדמית של הקבוצה השביעית של מומחים לאומיים בעלי שם ברפואה סינית מסורתית; הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין, פרויקט קרן המדענים הצעירים [מענק מספר 82305376]; פרויקט תמיכה בכישרונות צעירים במדע וטכנולוגיה במחוז ג'יאנגסו בשנת 2024 [מספר מענק JSTJ-2024-380].

תרשימי הזרימה הופקו באמצעות FigDraw, Biorender.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
<חזק>חומרי
צינור מיקרו-צנטריפוגה 1.5 מ"לביושארפ ביוהנדסה בע"מBS-15-MWB
צינור הקפאה של 2 מ"לLABSELECTCV-002-200-EXWB
צינור השחזה של 2 מ"לחברת ווהאן סרוויסביו טקנטג'י, בע"מHT-200-MWB
3% H2O2בוסטר אלקטרוניקס טכנולוגיה בע"מ20A23CIHC
4% פאראפורמלדהידביושארפ ביוהנדסה בע"מBL539Aניתוח ניתוח פרפוזיה של הלבלב
פתרון BSA של 5%Biofroxx4240GR100IHC
צינור צנטריפוגה 50 מ"ל  ביושארפ ביוהנדסה בע"מBS-500-Mשימור רקמות
AccuWest ECL Plus, רייג'נט Aנאנג'ינג ג'ין איזי ביוטכנולוגיה בע"מQ201220WB
AccuWest ECL Plus, רייג'נט Bנאנג'ינג ג'ין איזי ביוטכנולוגיה בע"מQ201220WB
אתנול חסר מיםShanghai SCR-Biotech Co., Ltd.10009257IHC
IgG אנטי-ארנב, נוגדן הקשור ל-HRPCell Signaling Technology.Inc,7074WB
קוקטייל מעכב פרוטאז קומפלטהופמן-לה רוש בע"מ  82256300WB
קוברסליפCITOTEST LABWARE MANUFACTURING Co., LTD10212450CIHC
תמיסת DAB כרומוגניתבוסטר אלקטרוניקס טכנולוגיה בע"מAR2017-1IHC
מלקחייםחברת שנזן RWD Life Science בע"מSP0007-Mניתוח של חולדת SD
שקופיות זכוכית  CITOTEST LABWARE MANUFACTURING Co., LTD188105IHC
צנצנת צבע מזכוכיתשנגחאי ביוטיים ביוטכנולוגיה בע"מFG010IHC
המטוקסיליןשנגחאי ביוטיים ביוטכנולוגיה בע"מST2067-20gIHC
דיאטה עתירת שומןמעבדת סוז'ואו שואנגשי טכנולוגיית מזון לבעלי חיים בע"מ.טבלה 1ניזונה מבעלי חיים ניסיוניים
אלכוהול חומצה כלוריתשנגחאי ביוטיים ביוטכנולוגיה בע"מC0163MIHC
איזופלוראןחברת שנזן RWD Life Science בע"מR510-22-10עכברים מונדים
מתנול Biofroxx67-56-1WB
נוזל בופר פועל MOPS 20 פעמים;Nanjing Genscript Biotechnology Co., Ltd. C36842504WB
בלסם ניטרלימדעי הסולארביולוגיה של בייג'ינג חברת טכנולוגיה בע"מ.G8590IHC
שרף נייטרליShanghai SCR-Biotech Co., Ltd.G8590IHC
פתרון PBSג'יאנגסו קייגן ביוטכנולוגיה בע"מKGL2206-500שימור רקמות
ערכת בדיקת חלבון Pierce BCA  תרמו פישר סיינטיפיק בע"מ, וולטהם, ארה"ב.ZB382867
ערכת בדיקת חלבון Pierce BCA  הרמו פישר סיינטיפיק בע"מ, וולת'ם, ארה"בZB382867WB
קוקטייל מעכב פרוטאזהופמן-לה רוש בע"מ  82256300
ממברנת PVDF (ממברנת העברת Immobilon-P, מיליפור, 0000380346) מרק מיליפור0000380346WB
מאגר ניתוק RIPAביושארפ ביוהנדסה בע"מBL504A, 70096436WB
SABCבוסטר אלקטרוניקס טכנולוגיה בע"מ20C03AIHC
סלייןSHANXI SHENGAO ANIMAL PHARMACEUTICAL CO.,LTD. 270071460שימור רקמות
חולדות זכר SDJiangsu GemPharmatech Co., Ltd. D000017עכברים
נתרן ציטראטמרק לייף סיינסS1804IHC
הזנה סטנדרטית לתחזוקהמעבדת סוז'ואו שואנגשי טכנולוגיית מזון לבעלי חיים בע"מ.טבלה 2ניזונה מבעלי חיים ניסיוניים
האיזון מרוכז ב-eBlot L2 5&f;Nanjing Genscript Biotechnology Co., Ltd. C97212410 WB
ריכוז ההעברה eBlot L2 5&;Nanjing Genscript Biotechnology Co., Ltd. C97211504WB
תמיסת מלח עם בופר, אבקה  ביושארפ ביוהנדסה בע"מBL602AWB
גיל 20BiofroxxEZ681A3EA8WB
יורתןסיגמא-אלדריץ' בע"מ.U2500-100Gעכברים מונדים
נוגדן וינקולין פוליקלונליקבוצת פרויטטק, בע"מ,26520-1-APWB
קסילןתאגיד נאנג'ינג ריג'נטC0430530223IHC
Young PAGE, ביס-טירס, 10× 8Nanjing Genscript Biotechnology Co., Ltd. C33152505WB
<חזק>ציוד
מכונת הרדמהחברת שנזן RWD Life Science בע"מדגם R5805עכברים מונדים
בול מיל Retsch Technology GmbH - MicrotracMM400WB
צנטריפוגותאפנדורף SE5418RWB
מייבש רקמות ביולוגי ממוחשבחברת הכלים ג'ג'ג'יאנג ג'ינחואה קדיSC2013-G-KITIHC
תגובות כימילומינסנציה משופרת (ECL)  הדמיה ביולוגית של וילבר00170961WB
מיקרוטום תרמו פישר סיינטיפיק בע"מ, וולטהם, ארה"ב.HM325IHC
מיקרוגלשנגחאי בוקסון אינדסטרי בע"מ;97000IHC
מערכת טטרה מיני-פרוטיאןBio-Rad Laboratories, Inc.1658004WB
תנורחברת שנגחאי ג'ינגהונג המדעית בע"מ.DNP-9082IHC
מים טהוריםסצ'ואן UPT אולטרה-פיור טכנולוגיה בע"מ.אולופ-טזIHC

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wang, G., et al. Comparative effectiveness of massage combined with lifestyle intervention and lifestyle intervention alone for simple obesity: a systematic review and meta-analysis. Medicine. 104 (2), e41074(2025).
  2. World Obesity Federation. World Obesity Atlas 2024. , World Obesity Federation. London. (2024).
  3. Kromrey, M. L., et al. Pancreatic steatosis is associated with impaired exocrine pancreatic function. Invest Radiol. 54 (7), 403(2019).
  4. Miyake, H., et al. Association of fatty pancreas with pancreatic endocrine and exocrine function. PLoS One. 13 (12), e0209448(2018).
  5. López-Bermudo, L., et al. Contribution of liver and pancreatic islet crosstalk to β-cell function/dysfunction in the presence of fatty liver. Front Endocrinol (Lausanne). 13, 892672(2022).
  6. Vilas-Boas, E. A., Almeida, D. C., Roma, L. P., Ortis, F., Carpinelli, A. R. Lipotoxicity and β-cell failure in type 2 diabetes: oxidative stress linked to NADPH oxidase and ER stress. Cells. 10 (12), 3328(2021).
  7. Martínez, M. S., et al. The role of the α cell in the pathogenesis of diabetes: a world beyond the mirror. Int J Mol Sci. 22 (17), 9504(2021).
  8. Catanzaro, R., Cuffari, B., Italia, A., Marotta, F. Exploring the metabolic syndrome: nonalcoholic fatty pancreas disease. World J Gastroenterol. 22 (34), 7660-7675 (2016).
  9. Pinnick, K. E., et al. Pancreatic ectopic fat is characterized by adipocyte infiltration and altered lipid composition. Obesity. 16 (3), 522-530 (2008).
  10. Wang, Y. D., et al. New insight of obesity-associated NAFLD: dysregulated "crosstalk" between multi-organ and the liver. Genes Dis. 10 (3), 799-812 (2023).
  11. Savage, D. B., Petersen, K. F., Shulman, G. I. Disordered lipid metabolism and the pathogenesis of insulin resistance. Physiol Rev. 87 (2), 507-520 (2007).
  12. Shah, N., Rocha, J. P., Bhutiani, N., Omer, E. Nonalcoholic fatty pancreas disease. Nutr Clin Pract. 34 (S1), S49-S56 (2019).
  13. Chang, M. L. Fatty pancreas-centered metabolic basis of pancreatic adenocarcinoma: from obesity, diabetes and pancreatitis to oncogenesis. Biomedicines. 10 (3), 692(2022).
  14. Ou, H. Y., Wang, C. Y., Yang, Y. C., Chen, M. F., Chang, C. J. The association between nonalcoholic fatty pancreas disease and diabetes. PLoS One. 8 (5), e62561(2013).
  15. Yu, T. Y., Wang, C. Y. Impact of non-alcoholic fatty pancreas disease on glucose metabolism. J Diabetes Investig. 8 (6), 735-747 (2017).
  16. Petrov, M. S. Post-pancreatitis diabetes mellitus and excess intra-pancreatic fat deposition as harbingers of pancreatic cancer. World J Gastroenterol. 27 (17), 1936-1942 (2021).
  17. Mihoc, T., et al. Pancreatic morphology, immunology, and the pathogenesis of acute pancreatitis. Biomedicines. 12 (11), 2627(2024).
  18. Robinson-Junker, A. L., O'Hara, B. F., Gaskill, B. N. Out like a light? the effects of a diurnal husbandry schedule on mouse sleep and behavior. J Am Assoc Lab Anim Sci. 57 (2), 124-133 (2018).
  19. Virgilio, T., et al. Impact of prolonged isoflurane or ketamine-xylazine anesthesia with or without buprenorphine and oxygen on mouse vitals and immune responses. Lab Anim. 54, 1-8 (2025).
  20. Oh, S., Ahn, B., Lee, B. J., Nam, S. Y. Effect of humidity on postmortem changes in rats. J Vet Sci. 25 (3), e24(2024).
  21. Wu, C. T., et al. SARS-CoV-2 infects human pancreatic β cells and elicits β cell impairment. Cell Metab. 33 (8), 1565-1576.e5 (2021).
  22. Tremblay, C., Moullé, V., Zarrouki, B., Ghislain, J., Poitout, V. Immunofluorescent staining of pancreatic sections. protocols.io. , (2022).
  23. Liu, Y., et al. Electroacupuncture at ST25 mediated glial cells pruning of pancreatic TRPV1 neural synapse responds to neuropathy-associated beta cell dysfunction. Chin Med. 20 (1), 65(2025).
  24. Lu, M., et al. Electroacupuncture stimulation regulates adipose lipolysis via catecholamine signaling mediated by NLRP3 suppression in obese rats. Front Endocrinol. 12, 773127(2022).
  25. Lu, M., et al. Remodelling the inguinal adipose sensory system to switch on the furnace: electroacupuncture stimulation induces brown adipose thermogenesis. Diabetes Obes Metab. 26 (4), 1430-1442 (2024).
  26. Otsuka, N., Shimizu, K., Taniai, M., Tokushige, K. Risk factors for fatty pancreas and effects of fatty infiltration on pancreatic cancer. Front Physiol. 14, 1243983(2023).
  27. Zhang, X., Cui, Y., Fang, L., Li, F. Chronic high-fat diets induce oxide injuries and fibrogenesis of pancreatic cells in rats. Pancreas. 37 (3), e31(2008).
  28. Liu, Y., et al. Electroacupuncture at ST25 mediated glial cells pruning of pancreatic TRPV1 neural synapse responds to neuropathy-associated beta cell dysfunction. Chin Med. 20 (1), 65(2025).
  29. Liu, Y., et al. Neurophysiological mechanisms of electroacupuncture in regulating pancreatic function and adipose tissue expansion. World J Diabetes. 16 (5), 101354(2025).
  30. Jirawat, N., Srisuk, A. Obesity, metabolic syndrome, and cardiovascular disease: pathophysiological connections. Sci Acad J. 7 (1), 1-12 (2024).
  31. Fan, Y. H., et al. Inter-organ metabolic interaction networks in non-alcoholic fatty liver disease. Front Endocrinol. 15, 1494560(2025).
  32. Wang, Y. D., et al. New insight of obesity-associated NAFLD: dysregulated "crosstalk" between multi-organ and the liver. Genes Dis. 10 (3), 799-812 (2023).
  33. Zhang, X., Ji, X., Wang, Q., Li, J. Z. New insight into inter-organ crosstalk contributing to the pathogenesis of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD). Protein Cell. 9 (2), 164-177 (2018).
  34. Zhang, C. L., Wang, J. J., Li, J. N., Yang, Y. Nonalcoholic fatty pancreas disease: an emerging clinical challenge. World J Clin Cases. 9 (23), 6624-6638 (2021).
  35. Corte, C. D., et al. Nonalcoholic fatty pancreas disease and nonalcoholic fatty liver disease: more than ectopic fat. Clin Endocrinol. 83 (5), 656-662 (2015).
  36. Saloman, J. L., et al. Animal models: challenges and opportunities to determine optimal experimental models of pancreatitis and pancreatic cancer. Pancreas. 48 (6), 759(2019).
  37. Hariri, N., Thibault, L. High-fat diet-induced obesity in animal models. Nutr Res Rev. 23 (2), 270-299 (2010).
  38. Lee, H. -Y., Min, K. -J. Dietary restriction and lipid metabolism: unveiling pathways to extended healthspan. Nutrients. 16 (24), 4424(2024).
  39. Rosini, T. C., Ramos da Silva, A. S., de Moraes, C. Diet-induced obesity: rodent model for the study of obesity-related disorders. Rev Assoc Med Bras (Engl Ed). 58 (3), 383-387 (2012).
  40. Uc, A., et al. Chronic pancreatitis in the 21st century - research challenges and opportunities: summary of a national institute of diabetes and digestive and kidney diseases workshop. Pancreas. 45 (10), 1365(2016).
  41. Fisher, W. E., et al. Standard operating procedures for biospecimen collection, processing, and storage: from the consortium for the study of chronic pancreatitis, diabetes, and pancreatic cancer. Pancreas. 47 (10), 1213(2018).
  42. Alexander, J., Chang, G. Q., Dourmashkin, J. T., Leibowitz, S. F. Distinct phenotypes of obesity-prone AKR/J, DBA2J and C57BL/6J mice compared to control strains. Int J Obes (Lond). 30 (1), 50-59 (2006).
  43. Nishikawa, S., Yasoshima, A., Doi, K., Nakayama, H., Uetsuka, K. Involvement of sex, strain and age factors in high-fat diet-induced obesity in C57BL/6J and BALB/cA mice. Exp Anim. 56 (4), 263-272 (2007).
  44. Levin, B. E., Dunn-Meynell, A. A., Balkan, B., Keesey, R. E. Selective breeding for diet-induced obesity and resistance in Sprague-Dawley rats. Am J Physiol. 273 (2 Pt 2), R725-R730 (1997).
  45. Kautzky-Willer, A., Harreiter, J., Pacini, G. Sex and gender differences in risk, pathophysiology and complications of type 2 diabetes mellitus. Endocr Rev. 37 (3), 278-316 (2016).
  46. Lee, M. J., Wu, Y., Fried, S. K. Adipose tissue heterogeneity: implication of depot differences in adipose tissue for obesity complications. Mol Aspects Med. 34 (1), 1-11 (2013).
  47. Geer, E. B., Shen, W. Gender differences in insulin resistance, body composition, and energy balance. Gender Med. 6 Suppl 1 (Suppl 1), 60-75 (2009).
  48. Nadal-Casellas, A., Proenza, A. M., Lladó, I., Gianotti, M. Sex-dependent differences in rat hepatic lipid accumulation and insulin sensitivity in response to diet-induced obesity. Biochem Cell Biol. 90 (2), 164-172 (2012).
  49. Stubbins, R. E., Holcomb, V. B., Hong, J., Núñez, N. P. Estrogen modulates abdominal adiposity and protects female mice from obesity and impaired glucose tolerance. Eur J Nutr. 51 (7), 861-870 (2012).
  50. Liu, Y., et al. Neuromechanical dimorphism of hypoglycemic effect of electroacupuncture. Neuroendocrinology. 113 (7), 679-691 (2023).
  51. Xu, T. C., Liu, Y., Yu, Z., Xu, B. Gut-targeted therapies for type 2 diabetes mellitus: a review. World J Clin Cases. 12 (1), 1-8 (2024).
  52. Xu, T., et al. Hypoglycemic effect of electroacupuncture at ST25 through neural regulation of the pancreatic intrinsic nervous system. Mol Neurobiol. 59 (1), 703-716 (2022).
  53. Feng, X., et al. Ferroptosis enhanced diabetic renal tubular injury via HIF-1α/HO-1 pathway in db/db mice. Front Endocrinol (Lausanne). 12, 626390(2021).
  54. Fang, X., et al. Beinaglutide shows significantly beneficial effects in diabetes/obesity-induced nonalcoholic steatohepatitis in ob/ob mouse model. Life Sci. 270, 118966(2021).
  55. Mao, T., et al. Semaglutide alters gut microbiota and improves NAFLD in db/db mice. Biochem Biophys Res Commun. 710, 149882(2024).
  56. Zeng, Z., et al. Bacillus amyloliquefaciens SC06 alleviates the obesity of ob/ob mice and improves their intestinal microbiota and bile acid metabolism. Food Funct. 13 (9), 5381-5395 (2022).
  57. Suriano, F., et al. Novel insights into the genetically obese (ob/ob) and diabetic (db/db) mice: two sides of the same coin. Microbiome. 9 (1), 147(2021).
  58. Owada, Y., et al. Novel non-alcoholic steatohepatitis model with histopathological and insulin-resistant features. Pathol Int. 68 (1), 12-22 (2018).
  59. Flessa, C. M., et al. Genetic and diet-induced animal models for non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) research. Int J Mol Sci. 23 (24), 15791(2022).
  60. Liu, Y., et al. Electroacupuncture at ST25 mediated glial cells pruning of pancreatic TRPV1 neural synapse responds to neuropathy-associated beta cell dysfunction. Chin Med. 20 (1), 65(2025).
  61. Xu, T., et al. Hypoglycemic effect of electroacupuncture at ST25 through neural regulation of the pancreatic intrinsic nervous system. Mol Neurobiol. 59 (1), 703-716 (2022).
  62. Vimaleswaran, K. S., et al. Causal relationship between obesity and vitamin D status: bi-directional Mendelian randomization analysis of multiple cohorts. PLoS Med. 10 (2), e1001383(2013).
  63. Alvheim, A. R., et al. Dietary linoleic acid elevates endogenous 2-AG and anandamide and induces obesity. Obesity (Silver Spring). 20 (10), 1984-1994 (2012).
  64. Hintze, K. J., Benninghoff, A. D., Cho, C. E., Ward, R. E. Modeling the Western diet for preclinical investigations. Adv Nutr. 9 (3), 263-271 (2018).
  65. D, L. Obesity due to a high-fat diet in the rat and mouse. Nutr Dieta Eur Rev Nutr Diet. 9 (1), 27-42 (1967).
  66. Lemonnier, D., Tremolieres, J. Experimental obesity induced by high-fat diets. Probl Actuels Endocrinol Nutr. 7, 77-85 (1963).
  67. Samuel, V. T., et al. Mechanism of hepatic insulin resistance in non-alcoholic fatty liver disease. J Biol Chem. 279 (31), 32345-32353 (2004).
  68. Hu, S., et al. Dietary fat, but not protein or carbohydrate, regulates energy intake and causes adiposity in mice. Cell Metab. 28 (3), 415-431.e4 (2018).
  69. Goh, S. K., et al. Perfusion-decellularized pancreas as a natural 3D scaffold for pancreatic tissue and whole organ engineering. Biomaterials. 34 (28), 6760-6772 (2013).
  70. Levin, B. E. Factors promoting and ameliorating the development of obesity. Physiol Behav. 86 (5), 633-639 (2005).
  71. Yuan, C. X., et al. Electroacupuncture alleviates diabetic peripheral neuropathy through modulating mitochondrial biogenesis and suppressing oxidative stress. World J Diabetes. 16 (2), 93130(2025).
  72. Liu, Y., et al. Neuromechanical dimorphism of hypoglycemic effect of electroacupuncture. Neuroendocrinology. 113 (7), 679-691 (2023).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Obese Rat ModelsFatty PancreasPancreatic SteatosisHigh Fat DietDiet Induced ObesityLipid DepositionTissue HarvestingWestern BlottingParaformaldehyde FixationMetabolic Dysfunction

Related Articles