הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר מחקר

נוסחת חוקן צמחית מקלה על קוליטיס כיבית על ידי עיכוב הפעלת הגליאל המעי דרך מסלול S100β/RAGE/NF-κB

564 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/69571

⸱

28 בנובמבר 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Beijing University of Chinese Medicine

במאמר זה

סיכום

נוסחת חוקן צמחית המשלבת Sanguisorba officinalis, Bletilla striata ו-Acacia catechu הוערכה באמצעות פרופילינג LC-MS/MS, S100β docking, מודל DSS של קוליטיס וגליה מעיים המופעלת על ידי LPS/IFN-γ. הנוסחה עסקה ב-S100β, דיכאה הפעלה גליאלית והפחיתה את ביטוי p-NF-κB/iNOS, מה שמעיד על שיפור דרך ציר S100β-RAGE-NF-κB.

תקציר

הפעלת תאי גליה אנטריים (EGCs) תורמת לפתוגנזה של קוליטיס כיבית (UC). מחקר זה בדק האם נוזל חוקן דיבאי (DBE) – חוקן צמחי המשלב Sanguisorba officinalis, Bletilla striata ו-Acacia catechu – מווסת דלקת מונעת EGC. פרופילי LC-MS/MS של רכיבי DBE ותרכובות מועדפות הוצברו ל-S100β. היעילות הוערכה בקוליטיס עכברי שנגרם על ידי דקסטרן סולפט נתרן (DSS) באמצעות משקל גוף, אורך המעי הגס, היסטופתולוגיה ורמות ציטוקינים (ELISA). סמני הפעלה גליאלית נמדדו באמצעות אימונוהיסטוכימיה, קולוקליזציה של אימונופלואורסצנציה, PCR כמותי (qPCR) ואימונובלוטינג. מודל במבחנה השתמש בגליה אנטרית CRL-2690 שהופעלה עם ליפופוליסכריד בתוספת אינטרפרון-γ, כאשר סרום העכברים המכיל DBE (15%) היה התערבות. העגינה הציעה על קישור חזק וחזוי של מספר רכיבי DBE ל-S100β. DSS העלה את רמות TNF-α ו-IL-1β, הפריע לצמתים הדוקים, והגביר את S100β/GFAP הן ברמות mRNA והן ברמות חלבון, בהתאם להיפראקטיבציה של הגליאל; DBE הפכה משמעותית את השינויים הללו. במבחנה, DBE הפחית את S100β, RAGE, iNOS (NOS2) ו-NF-κB p65 המזרחן. ביחד, נראה כי DBE מקל על UC על ידי עיכוב הפעלת EGC והורדת ויסות ציר S100β/RAGE/NF-κB/iNOS, ובכך שומר על שלמות הריר.

מבוא

קוליטיס כיבית (UC) היא תת-סוג מרכזי של מחלת מעי דלקתית (IBD) המאופיינת בדלקת רירית כרונית במעי הגס, עם עומס עולמי עולה מאז 1990, ו-UC אחראית לחלק משמעותי מהמקרים של מחלת מעי דלקתית 1,2. תופעות נפוצות כוללות כאבי בטן ושלשול דם, הגורמים למצוקה פיזית ונפשית משמעותית ולעלויות טיפול משמעותיות3. למרות שאפשרויות הטיפול התרחבו, חשיפה ממושכת למודולטורים ואימונומודולטורים ולביולוגיים שמדכאים חיסון מערכתית קשורה לסיכון מוגבר ללימפומה ולזיהומים אופורטוניסטיים, וחלק מהמטופלים נשארים עמידים או לא סובלניים4. UC נחשב באופן נרחב למצב המתווך החיסוני שבו הפרעה בהומאוסטזיס החיסוני הרירי היא מרכזית בפתופיזיולוגיה5. עם זאת, ראיות מצטברות מצביעות על כך שמנגנוני רירית-חיסון לבדם אינם מספיקים כדי להסביר את כל תכונות המחלת המעי הדלקתית; מערכת העצבים המעיים (ENS) תורמת לדלקת מעיים, ומרחיבה את מושג המחלה לדלקת עצבית בתוך IBD6.

תאי גליה אנטריים (EGCs), שעולים על מספר הנוירונים המעיים ביונקים בוגרים, מוכרים כיום כרגולטורים מרכזיים של הומאוסטזיס ודלקת במעי 7,8. EGCs מווסתים את פונקציית מחסום האפיתל על ידי שחרור מתווכים כגון GDNF, TGF-β1, S100β ו-15d-PGJ2, ובכך משפיעים על חדירות ושלמות רירית9. מבין המתווכים הללו, S100β יכול להפעיל מפלים במורד הזרם – כולל מסלול RAGE/NF-κB – שמוביל לפגיעת מחסום ולהגברה דלקתית 10,11. EGCs גם מעצבים את תגובות החיסון על ידי ויסות פנוטיפ המקרופאגים ורגישות ויסרלית באמצעות קונקסין-43 ו-M-CSF, וכן על ידי הפעלת השפעות מדכאות על תאי T במבחנה, תוך הדגשת הפעלת EGC כמטרה טיפולית ניתנת לפתרון ב-UC12,13.

הרפואה הסינית המסורתית (TCM) נחקרת יותר ויותר ב-UC והראתה יתרונות מבטיחים בסביבות קליניות וניסויים14,15. הזוגיות הקלאסית של Sanguisorba officinalis (דיו) ו-Bletilla striata (בייג'י), יחד עם Acacia catechu (Ercha), מתועדת זמן רב להפרעות דיסנטריות במקורות Materia medica ומופיעה בפרמקופיאה הסינית לסימנים המוסטטיים, משככי כאבים וריפוי פצעים. מחקרים עכשוויים מדווחים על פעילות אנטיבקטריאלית, אנטי-דלקתית, אנטי-חמצונית ואנטי-כיבית עבור צמחים אלו, בעוד ש-A. catechu גם מדגים תכונות נוירופרוטקטיביות עם קטצ'ין כמרכיב בולט16,17. בהשוואה לדיכוי חיסון מערכתית קונבנציונלי, נוסחה שמפעילה מסלולים נוירואימוניים ממוקדי EGC עשויה להציע יעילות משלימה עם מנגנון מובחן ופוטנציאלית פחות סיכונים הקשורים למערכת החיסון18,19.

מחקר זה בוחן האם ההכנה המשולבת של דיו, בייג'י וארצ'ה (DBE) מפחיתה את ה-UC על ידי דיכוי הפעלת EGC. נעשה שימוש בגישה משולבת: פרופילינג לא ממוקד של LC-MS/MS למתן עדיפות לרכיבים, עגינה מולקולרית מול S100β, אימות במודל קוליטיס מונתרן מושרה על ידי דקסטרן סולפט, ובדיקות מכניות ב-EGCs. העבודה מדגישה מנגנון נוירואימוני-S100β/RAGE/NF-κB/iNOS שנחקר בטיפולים קודמים ב-UC, ומפרט השלכות מעשיות לבחירת מינון, אופטימיזציה של נוסחאות ומחקרים תרגומיים לאחר מכן.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל ההליכים בבעלי חיים אושרו על ידי ועדת האתיקה של בעלי החיים של אוניברסיטת הרפואה הסינית בבייג'ינג [BUCM-2023-0912] ובוצעו בהתאם להנחיות מוסדיות ולאומיות לטיפול ושימוש בבעלי חיים במעבדה. לא היו מעורבים נבדקים אנושיים.
החומרים והציוד בהם משתמשים מופיעים בטבלת החומרים.

1. תגובות וחומרים

ממסים בדרגה אנליטית ובמגיבים ברמת ביולוגיה מולקולרית שימשו לאורך כל הדרך. כל המידע המסחרי, כולל יצרנים, מספרי קטלוג ופרטי רישיון תוכנה, מסופק בטבלת החומרים (xlsx). המים לכל ההכנות עברו דה-יוניזציה וסינון. כל המאגרים הוכנו טריים או אוחסנו בתנאים שצוינו להלן.

2. ציוד והגדרת תוכנה

מערכת UPLC-MS/MS מחוברת לספקטרומטר מסה מרובע זמן טיסה; צנטריפוגה מקוררת עם רוטור דלי מתנדנד; חממת CO₂ נשמרת בטמפרטורה של 37°C, 5% CO₂, ולחות יחסית ≥95%; קורא מיקרופלט (450 ננומטר); תרמחזור PCR בזמן אמת; אלקטרופורזה ומערכת הכתמה; וכן נעשה שימוש במיקרוסקופ פלואורסצנציה עם מסנני עירורים/פליטה קבועים. בקרת מכשירים וניתוח נתונים בוצעו ב-MassLynx v4.2 לנתוני כרומטוגרפיה וספקטרומטריות מסה, וב-AutoDock 4.2 עם AutoDockTools 1.5.7 לעגינה. ניתוח תמונה בוצע ב-ImageJ/Fiji v1.53.

3. הכנת נוזל חוקן דיבאי (DBE)

התערובת הצמחית שכללה דיו (50 גרם), בייג'י (50 גרם) וארצ'ה (20 גרם) נמחצה בגסות והושרה במים דה-יוניים של 1,200 מ"ל בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות כדי להבטיח הידרציה מלאה. התערובת השרויה הוטבעה תחת רתיחה חזקה במשך 30 דקות עם ערבוב מדי פעם כדי למנוע היצמדות. הסוכריה החמה סיננה דרך גזה רפואית סטרילית רב-שכבתית אל כלי זכוכית סטריליים להסרת חומר בלתי מסיס. הסינון ריכז בוואקום באמבט מים שלא עלה על 45 מעלות צלזיוס עד שהתקבל ריכוז התואם לריכוז סופי של 1.98 גרם/מ"ל (מלאי במינון גבוה). תמיסות עבודה במינון בינוני ונמוך ב-0.99 גרם למ"ל ו-0.50 גרם למ"ל הוכנו בדילול עם מים טרייליים דה-יוניים עד נפחים סופיים של 100 מ"ל כל אחד. כל תמיסה עברה דרך ממברנה של 0.22 מיקרון בתנאים סטריליים, חולקה למיכלים סטריליים מסומנים, ונשמרה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד שבעה ימים. לפני השימוש, התמיסות היו מעורבבות בעדינות; מראה מקובל היה שקוף עד מעט אופלסנטי ללא חלקיקים נראים לעין.

4. UPLC - ניתוח MS/MS של DBE

האבקה מכל רכיב רפואי נשקלה בדיוק ב-50 מ"ג והופקה עם 1.0 מ"ל של 80% מתנול (v/v) באמצעות ערבוב אולטרסוני למשך 30 דקות בטמפרטורת הסביבה. התמציות הוחזרו לטמפרטורת החדר לאחר הסוניקציה, צונטריפוגות ב-15,000 × גרם למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, והסופרנטנטים סיננו דרך ממברנות של 0.22 מיקרון לבקבוקי דגימה אוטומטית. הפרדה כרומטוגרפית בוצעה על עמודה עם פאזה הפוכה (2.1 × 100 מ"מ, 1.8 מיקרון; סוג C18 עם קצה קוטבי) שנשמרה על 35 מעלות צלזיוס; מותג/דגם עמודה ומספר קטלוג מופיעים בטבלת החומרים. שלב א' נייד: 0.1% חומצה פורמית במים; שלב ב' נייד: אצטוניטריל. קצב זרימה: 0.30 מ"ל לדקה; נפח הזרקה: 10 מיקרוליטר. שיפוע: 5% B למשך 0-2 דקות; 5→95% B בין 2 ל-20 דקות; 95% B ל-20-23 דקות; 95→5% B בין 23.0 ל-23.1 דקות; איזון מחדש ב-5% B עד 26 דקות (טבלת הגרדיאנט המלאה מוצגת בטבלה 1).

ספקטרומטריית מסה השתמשה ביינון אלקטרוספריי עם החלפה חיובית/שלילית ורכישה בלתי תלויה בנתונים עם סריקות באנרגיה נמוכה וגבוהה (MSE). טווח מסה: מטר/z 100-1,500; מתח קפילרי: 2.0 קילו-וולט; קונוס דגימה: 20 וולט; טמפרטורת מקור: 120 מעלות צלזיוס; טמפרטורת המיסה: 360 מעלות צלזיוס; גז חרוט: 50 ליטר לשעה; גז המיסה: 600 ליטר לשעה. פונקציית אנרגיה גבוהה השתמשה באנרגיית התנגשות מדורגת של 20-50 eV. הנתונים עובדו ב-MassLynx v4.2 עם תיקון מסה נעילה ופרמטרי זיהוי שיא סטנדרטיים. רשימה מקיפה של 105 רכיבים שזוהו (נוסחאות מולקולריות, מחזור/ז, זמני שמירה וציוני ביטחון) מוצגת בטבלה משלימה 1.

5. עגינה מולקולרית

העגינה בוצעה באוטודוק 4.2 תחת פרוטוקול התאמה מושרה. המבנה התלת-ממדי של S100β (PDB 3HCM) הוכן על ידי הסרת מולקולות מים קריסטלוגרפיות, הוספת מימנים קוטביים והקצאת מטעני קולמן. מבני ליגנד המייצגים רכיבים אופייניים של DBE נבנו, פרוטונו ב-pH פיזיולוגי, והוזערו באנרגיה. אתר הקישור הוגדר על ידי קואורדינטות הליגנד המקומיות; שאריות חומצה אמינית בטווח של 6 Å מהליגנד הטבעי טופלו כגמישות במהלך העגינה. תיבות הרשת כיסו את כל הכיס עם מרווח רשת של 0.375 Å. פרמטרי האלגוריתם הגנטי של למרק היו: גודל האוכלוסייה 150; הערכות אנרגיה עד 2.5 × 10⁶; 100 ריצות עצמאיות לכל ליגנד. הפוזות הסופיות דורגו לפי אנרגיית קשירה חופשית חזויה ואוצבצו לפי RMSD; דפוסי אינטראקציה (קשרי מימן, מגעים הידרופוביים, אינטראקציות π-π) הוצגו לצורך התאמה עם קומפלקסים ידועים של S100β.

6. מודל בעלי חיים של טיפול בקוליטיס ו-DBE שנגרם על ידי DSS

עכברים זכרים C57BL/6J (8 שבועות, 20-22 גרם) התרגלו לפחות 7 ימים בטמפרטורה של 22 ± 2 מעלות צלזיוס, לחות יחסית של 50%-60%, מחזור בהיר-חושך של 12 שעות, עם אוכל ומים לפי רצון. בעלי החיים חולקו באקראי לשש קבוצות (n = 10 לקבוצה): ביקורת, מודל דסקסטרן סולפט סודיום (DSS), סולפאסלאזין (SASP) בביקורת חיובית, וטיפולי DBE במינון נמוך, בינוני וגבוה. הצוות האחראי על ניקוד היסטולוגי וכימות תמונה היה עיוור להקצאת קבוצות.

קוליטיס ניסיוני נגרם על ידי 2.0% (ללא יחס ל-DSS) במי שתייה למשך 7 ימים, לאחר מכן 1.0% DSS במשך 3 ימים, ואז מים רגילים במשך 4 ימים לפני המתת חסד. DBE ניתנה פעם ביום באמצעות חוקן במינון 10 מ"ל/ק"ג באמצעות קטטר גמיש שהוכנס 2.5 ס"מ לרקטום; בעלי חיים הוחזקו אנכית במשך 30 דקות כדי למזער דליפה. מנות DBE יומיות היו 12.35, 27.4 ו-49.4 גרם לק"ג/יום בקבוצות הנמוכות, הבינוניות והגבוהות, בהתאמה; SASP ניתנה במינון 0.5 גרם/ק"ג/יום כביקורת חיובית. משקל הגוף, עקביות הצואה ודם מצואה נסתר נרשמו מדי יום לחישוב מדד המחלה-פעילות. בנקודת הסיום, העכברים הורדמו בפנטוברביטל נתרן 50 מ"ג/ק"ג i.p.; דם נאסף מהסינוס הרטרו-אורביטלי באמצעות נימים הפאריניים; בעלי חיים הושמתו כתוצאה מפריקת צוואר הרחם. המעי הגס נחתך מהמפגש האילאוצקלי אל הרקטום, הורחב בעדינות, והאורך נמדד במתח מינימלי. מקטעים מייצגים היו קבועים ב-4% פאראפורמלדהיד; הרקמה שנותרה הוקפאה בחנקן נוזלי ונשמרה בטמפרטורה של −80°C.

7. הכנת סרום המכיל תרופות

זכרים של חולדות ספרג-דולי חולקו באקראי לקבוצות ביקורת וקבוצות DBE (n = 6 לקבוצה). קבוצת DBE קיבלה 12.34 גרם/ק"ג/יום באמצעות ניתוח אוראלי פעם ביום במשך 7 ימים; הבקרות קיבלו מים מטוהרים בנפח שווה. עשרים וארבע שעות לאחר המנה הסופית, בעלי חיים הורדמו, ונאסף דם מלא מאאורטה הבטנית. הסרום הופרד לאחר קרישה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן בצנטריפוגה ב-1,500 × גרם למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. הסרות הושבתו בחום בטמפרטורה של 56 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות וסוננו דרך ממברנות של 0.22 מיקרון בתנאים סטריליים לפני האחסון. הסרום הועבר לצינורות סטריליים ואוחסן בטמפרטורה של −80°C. דגימות המוליזות, שזוהו על ידי ספיגה מוגברת בסמוך ל-414 ננומטר, הוצאו.

8. בדיקה היסטולוגית (H&E)

רקמת המעי הגס שהתקבעה ב-4% פאראפורמלדהיד במשך 24 שעות יובשה באמצעות אתנולים מדורגים, נוקתה בקסילן והוטמעה בפרפין. החלקים (5 מיקרון) נחתכו, הוסרו מפרפין, הודרו מחדש וצבועו בהמטוקסילין במשך 5 דקות, כחולו במים זורמים במשך 5 דקות, וצבעו ב-eosin למשך 2 דקות. שקופיות הותקנו עם שרף ונבדקו לארכיטקטורת הקריפט, צפיפות תאי הגביע, המשכיות אפיתל וחדירה דלקתית. שינויים מייצגים יוצגו באמצעות חצים/ראשי חץ ויוגדרו באגדות הדמויות; פסי קנה מידה (למשל, 200 מיקרון) וספים ויזואליים מוגדרים מראש יוגדרו במקבלים.

9. אימונוהיסטוכימיה (IHC)

מקטעי הפרפין עברו שליפת אנטיגנים בבופר ציטראט (pH 6.0) במשך 15-20 דקות בטמפרטורה של 95-98 מעלות צלזיוס, הקפאה של פרוקסידאז אנדוגני עם 3% מי חמצן למשך 10 דקות, וחסימה עם 5% סרום תקין למשך שעה בטמפרטורת החדר. הנוגדנים הראשוניים דוגרו במהלך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס בתא לח. לאחר הכביסה, החלקים עובדו באמצעות מערכת זיהוי סטרפטווידין-פרוקסידאז, שפותחה עם DAB למשך 2 דקות (ניטור מיקרוסקופי), צובעה בהמטוקסילין, יובשה והותקנה. ביקורות שליליות ללא נוגדן ראשוני נכללו בכל אצווה.

10. ניתוח אימונופלואורסצנציה (IF)

מקטעים מוטמעים בפרפין עברו דה-פרפין ונחשפו לשאיבת אנטיגנים בבופר EDTA (pH 8.0). לאחר הקירור, הקישור הלא ספציפי נחסם עם 3% אלבומין סרום בקר למשך שעה בטמפרטורת החדר. החתכים נדגרו במהלך הלילה בטמפרטורה של 4°C עם נוגדנים ראשוניים נגד GFAP (1:500) ו-S100β (1:200), ואחריהם נוגדנים משניים מצומדים בפלואורופור (1:500) למשך שעה בטמפרטורת החדר בחושך. הגרעינים צובעו נגד DAPI, והשקופיות הותקנו במדיום נגד דהייה. התמונות צולמו באמצעות מטרות זהות, זמן חשיפה קבוע של 100 מילישניות, ורווח גלאי של 1.0 בין קבוצות. עוצמת הפלואורסצנציה הממוצעת נמדדה ב-ImageJ/Fiji v1.53 לאחר כיול גודל הפיקסלים, חיסור הרקע (רדיוס כדור גלגול 50 פיקסלים), ונרמול לאזור DAPI חיובי. נותחו לפחות חמישה שכפולים ביולוגיים בכל קבוצה ושלושה שדות לא חופפים לכל שכפול.

11. תרבית תאים וטיפולים

תאי גליה מעיים של עכברים (סימון CRL-2690) גודלו ב-DMEM עם תוספת של 10% סרום בקר עוברי ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בדגמה לח עם 5% CO₂. זהות התא אושרה באמצעות פרופילינג חוזר קצר בטנדם, והתרביות היו נקיות ממיקופלסמה. הניסויים בוצעו בקטעים 5-15. התאים הוזרעו ללוחות של 6 בארות באורך 2.0 × 10⁵ תאים לבאר במדיום של 2.0 מ"ל לבאר והותרו להיצמד למשך 24 שעות. קבוצות הניסוי היו: ביקורת לא מטופלת, בקרת רכב, מודל, סרום DBE, ומעכב.

לצורך השראה במודל, תאים נחשפו לליפופוליסכריד (LPS, 1 מיקרוגרם/מ"ל) בנוסף ל-IFN-γ (20 ng/mL) למשך 24 שעות בתווך שלם; ערך U/mL המתאים ל-IFN-γ מדווח בטבלת החומרים בהתאם לעוצמה ספציפית למגרש. לטיפול בסרום DBE, התאים קיבלו סרום חולדה שמכיל DBE מסונן בחום של 0.22% (v/v) (v/v) ומכיל DBE מסנן בטמפרטורה מלאה למשך 24 שעות (טווח מינון 5%-20% משמש לאופטימיזציית כדאיות כפי שמוגדר בסעיף CCK-8). לטיפול במעכבים, הוחל מעכב S100β סלקטיבי SBI-4211 (10-50 מיקרומון; 45 מיקרומטר לקריאות מפתח) למשך 24 שעות. בקרות הרכב התאימו את תכולת הממס (0.1% DMSO (v/v)) עם מדיום זהה אחרת. אלא אם צוין אחרת, הטיפולים הוכנו במדיום מחומם מראש (37 מעלות צלזיוס), והתאים נשטפו 2× עם PBS לפני החלפת הטיפול. לאחר הטיפול, תאים נאספו לצורך הפקת RNA, ניתוח חלבונים ואימונופלואורסצנציה כפי שפורט בחלקים הבאים. השכפול הביולוגי היה ≥ 5 תרביות עצמאיות לכל מצב.

12. מבחן הקיימות של תאי CCK-8

התאים הוזרעו ללוחות של 96 בארות באורך 5 × 10³ תאים לבאר במדיום של 100 מיקרוליטר ונתנו להם להידבק ללילה. המדיום הוחלף במדיום המכיל סרום מטופל ב-DBE ברמות של 5%, 10%, 15%, או 20% (v/v) למשך 24 שעות. נוסף תגובת CCK-8 (10 מיקרוליטר/באר), והצלחות הוגדרו למשך שעה אחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. הספיגה נמדדה ב-450 ננומטר עם חיסור ריק (בינוני + תגובה, ללא תאים). הכדאיות הובאה לידי ביטוי באחוז בקרת הרכב. כל תנאי השתמש ב-n ≥ 5 שכפולים ביולוגיים (תרביות עצמאיות) עם שלושה שכפולים טכניים בכל תרבית.

13. ELISA לציטוקינים של רקמות

רקמת המעי הגס עברה הומוגניזציה על קרח ב-PBS (1:9, w/v) המכיל מעכבי פרוטאז. הומוגנטים הובהרו ב-12,000 × גרם למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס; הסופרנטנטים נבדקו ל-IL-1β ו-TNF-α בהתאם לפרוטוקולי ה-KIT. תקנים ודגימות הועברו בשכפול, והעקומות הותקנו במודל לוגיסטי בעל ארבעה פרמטרים (4PL) עם R² ≥ 0.99; תקנים מחושבים לאחור התקבלו בטווח של 85%-115% מהנומינל. הספיגה נקראה ב-450 ננומטר עם רפרנס 620-650 ננומטר כאשר היה זמין. ריכוזי הציטוקינים נורמל למשקל הרקמה (רקמת pg/mg). כל קבוצה כללה n ≥ 5 שכפולים ביולוגיים.

14. PCR בזמן אמת כמותי (qPCR)

סך ה-RNA מרקמת המעי הגס (או תאים, לפי הצורך) בודד באמצעות ערכת עמוד ספין מסוג ממברנת סיליקה. שלמות ה-RNA אושרה באמצעות A₂₆₀/A₂₈₀ = 1.8-2.1 ובדיקת אגרוז-ג'ל. cDNA של גדיל ראשון סונתז מ-RNA של 1 מיקרוגרם עם הסרת DNA גנומי. qPCR השתמש במיקס מאסטר SYBR Green על תרמחזור מכויל עם התוכנית: 95 °C 30 שניות; 40 מחזורים של 95 °C 5 שניות, 60 °C 30 שניות; עקומת התכה 65-95 מעלות צלזיוס ב-0.5 מעלות צלזיוס ל-5 שניות. GAPDH שימש כבקרה האנדוגנית. הביטוי היחסי חושב על ידי 2⁻ΔΔCt לאחר אימות יעילות הפריימר (90%-110%, ממדרונות עקומות סטנדרטיות). נכללו בקרות ללא RT וללא תבניות. רצפי פריימר מפורטים בטבלה 2. לכל קבוצה היו n ≥ 5 שכפולים ביולוגיים ושתי חזרות טכניות לכל דגימה.

15. ניתוח כתמים מערביים

חלבונים מרקמת המעי הגס (או תאים) הופקו בבופר RIPA עם מעכבי פרוטאז/פוספטאז וכיומו באמצעות בדיקת BCA. חלבון שווה (30 מיקרוגרם לנתיב) עבר דנטרציה, נפתר על SDS-PAGE בגרדיאנט 4-20%, והועבר ל-PVDF (0.45 מיקרון; 0.2 מיקרון למטרות ≤ 20 קילו-דלטון). הממברנות נחסמו בחלב רזה של 5% למשך שעתיים בטמפרטורת החדר ודוגרו במהלך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עם נוגדנים ראשוניים נגד GFAP (1:1,000), S100β (1:1,000), iNOS (1:1,000), NF-κB p65 (1:1,000), פוספו-NF-κB p65 (Ser536, 1:1,000), אוקלודין (1:1,000), קלודין-1 (1:1,000) ו-GAPDH (1:5,000). נוגדנים משניים מצומדים ל-HRP (1:5,000) הוחלו למשך שעה בטמפרטורת החדר. אותות פותחו עם ECL; זמני החשיפה הוגבלו לטווח הדינמי הליניארי (10-90 שניות). ההעברות אומתו על ידי צביעת ממברנה הפיכה לפני החסימה. עוצמות הרצועות נמדדו ב-ImageJ/Fiji v1.53 לאחר חיסור רקע ונרמלו ל-GAPDH. משקלים מולקולריים צפויים: GFAP ~49 kDa, S100β ~10-12 kDa, NF-κB p65 ~65 kDa, iNOS ~130 kDa, Occludin ~65 kDa, Claudin-1 ~22 kDa, GAPDH ~36-37 kDa. כל ניתוח כלל n ≥ 5 שכפולים ביולוגיים.

16. ניתוח סטטיסטי

הנתונים נותחו ב-GraphPad Prism 8.0 והוצגו כממוצע ± SEM. להשוואות בין קבוצות מרובות, נעשה שימוש ב-ANOVA חד-כיווני ואחריו מבחן פוסט-הוק של טוקי; להשוואות זוגיות, מבחני t לסטודנט דו-זנביים לא מזווגים יושמו כאשר היה מתאים. לעיצובים עם מסלול זמן או דו-שלבי (למשל, טיפול × מינון או טיפול × זמן), נעשה שימוש ב-ANOVA דו-כיווני (מדידות חוזרות כאשר רלוונטי) עם תיקון של טוקי או דאנט כפי שמצוין בכתובות האיורים. מבחני שפירו-וילק ולביין שימשו לבחינת נורמליות והומוסקדסטיות לפני בדיקות פרמטריות; כאשר ההנחות הופרו, הנתונים עברו טרנספורמציה לוגיתמית או נותחו באמצעות מבחנים לא פרמטריים מתאימים (קרוסקל-ווליס עם הפוסט-הוק של דאן; Mann-Whitney U לזוגות). ערכי p מדויקים ומדדי גודל אפקט (η² עבור ANOVA, d של כהן למבחני t) מדווחים באגדות איורים כאשר רלוונטי. p דו-צדדי < 0.05 נחשב מובהק סטטיסטית. מיתוגי הדמויות משתמשים בסימון הבא למשמעות: *p<0.05, **p<0.01, *** p<0.001 מול Control; # p<0.05, ## p<0.01, ### p<0.001 מול DSS; NS, לא משמעותי.

17. תוצאות צפויות ובקרת איכות

מצופה ש-DSS יקצר את אורך המעי הגס, יעלה את מדד פעילות המחלה, ויגרום לנזק היסטולוגי (עיוות ארכיטקטורה של הקריפטה, דלדול תאי הגביע, שחיקה אפיתלית). טיפול ב-DBE אמור לשפר את המדדים הללו בהתאם למינון ולהפחית את סמני ההפעלה המעיים-גליאליים. כתמים מערביים צריכים להראות פסים במשקלים המולקולריים שצוינו לעיל, עם אותות מוגברים ב-DSS והחלשה באמצעות DBE או SBI-4211; החשיפות צריכות להישאר בטווח הדינמי הליניארי. אימונופלואורסצנציה עבור GFAP ו-S100β צפויה להראות עוצמות ממוצעות גבוהות ב-DSS וירידה לאחר טיפול ב-DBE. כרומטוגרמות LC-MS/MS אמורות להציג זמני שמירה יציבים (סטייה ≤ 0.2 דקות) ודיוקי מסה בטווח של ± 5 ppm ליוני ייחוס, עם יוני פרגמנט אופייניים לרכיבים מרכזיים. ביקורות שליליות (למשל, השמטת נוגדנים ראשוניים) לא אמורות להניב אות ספציפי. פרמטרי רכישת הדמיה (אובייקטיבי, חשיפה, רווח, גמא) חייבים להישאר קבועים בין קבוצות כדי לאפשר השוואות כמותיות תקפות.

18. הערות לפתרון תקלות

עכרות או חלקיקים בתמיסות DBE מעידים על סינון או משקעים לא מספקים; חזור על סינון של 0.22 מיקרון ואשר pH של 6.5-7.5. תמותה מופרזת או ירידה חמורה במשקל במהלך חשיפה ל-DSS מעידים על השראת יתר; הפחתת ריכוז DSS, בדיקת משקל מולקולרי באצוות, והחלפת תמיסות DSS מדי יום. כימות אימונופלואורסצנציה לא עקבי משקף בדרך כלל חשיפה משתנה; קבע את זמן החשיפה והרווח, וכלול שקופית ייחוס לכיול אצווה. רצועות ווסטרן-בלוט חלשות עשויות לשקף עומס נמוך או חוסר יעילות העברה; בדוק את כמות החלבון, בחר אחוז ג'ל או גרדיאנט מתאים, ואשר העברה באמצעות צביעת ממברנה הפיכה. התאמת ELISA לקויה (R² < 0.99 או חישוב אחורי סטנדרטי מחוץ ל-85-115%) מצדיקה חזרה על העקומה הסטנדרטית ובדיקת דגימות מדוללות. עבור qPCR עם יעילות פריימר מעבר ל-90-110%, יש לייעל מחדש את טמפרטורת החישוש או את ריכוז הפריימר לפני הניתוח.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

זיהוי רכיבי DBE וסרום המכיל תרופות

LC-MS/MS זיהה 105 רכיבים כימיים ייחודיים ב-DBE, עם שגיאת מסה < 10 ppm. הזיהוי אושר באמצעות נוסחה מולקולרית, דפוס איזוטופים והתאמת קטעים. הקבוצות העיקריות כללו טריטרפנים, פלבנואידים, ביפננתרנים וחומצות אורגניות. סרום המכיל תרופות חשף 59 רכיבים שמקורם ב-DBE לאחר חיסור ריק. TICs מייצגים מוצגים באיור 1A,B, והערות מלאות (שם, נוסחה, m...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

קוליטיס כיבית (UC) היא מחלת מעי דלקתית כרונית עם פתוגנזה רב-גורמית. בנוסף לתגובות חיסוניות לא מאוסנות, דיספונקציה של מחסום אפיתל במעי ודיסביוזה של מיקרוביוטה במעי הם גורמים מוכרים, בעוד שחריגות במערכת העצבים המעיים (ENS) מזוהות יותר ויותר כגורם מרכזי בהתקדמות UC23. באופן ספציפי, גם חוסר ויסות מבני וגם תפקודי של ה-ENS עלול להחמיר דלקת רירית וחומרת מחלה24. בנוסף, מחקרים פרה-קליניים הראו כי דיכוי הפעלת תאי גליה מעיים (EGC) מפחית דלקת במעי והתנ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

מחקר זה נתמך על ידי פרויקט הבנייה של תחומי רפואה מרכזיים ברמה גבוהה של המינהל הלאומי לרפואה סינית מסורתית (ZYYSZX-2023256).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אוטודוק 4.2תוכנת עגינה מולקולרית-מכון המחקר סקריפס
דסקסטרן סולפט נתרן (DSS)כימיקלים לגרימת קוליטיס בעכברים9011-18-1סיגמא-אלדריץ'
נוזל חוקן דיבאי (DBE)תערובת צמחים לטיפול בקוליטיס כיבית-אוניברסיטת בייג'ינג לרפואה סינית
DMEM (הנשר הבינוני המותאם של דולבקו)מדיום תרבית תאים11965-092תרמו פישר
סרום בקר עוברי (FBS)תוסף לתרבות תאים16000-044תרמו פישר
מיקרוסקופ פלואורסצנציהמכשיר להדמיית אימונופלואורסצנציה-אולימפוס
מערכת LC-MS/MSספקטרומטר מסה לניתוח LC-MS-תאגיד ווטרס
ליפופוליסכריד (LPS)גורם לדלקת בתרבות תאיםL2630סיגמא-אלדריץ'
מחזור תרמי PCRציוד ל-qPCRT100ביו-ראד
נוגדן ראשוני (S100)נוגדן לזיהוי חלבון S100ABC1234אבקאם
ערכת בדיקת חלבון (BCA)ערכת כימות חלבון23225תרמו פישר
אינטרפרון רקומביננטי - (IFN)ציטוקין להפעלת EGC בתרבית תאים-סיגמא-אלדריץ'
נוגדן משני (מצ'ומד HRP)נוגדן משני לאימונוהיסטוכימיהXYZ5678תרמו פישר
סולפאזלזין (SASP)שליטה חיובית בקוליטיס כיבית-סיגמא-אלדריץ'
ציוד כתם מערבימערכת אלקטרופורזה לניתוח חלבונים-ביו-ראד

מקורות

  1. Lin, D., et al. Global, regional, and national burden of inflammatory bowel disease, 1990-2021: Insights from the global burden of disease 2021. Int J Colorectal Dis. 39 (1), 139(2024).
  2. Le Berre, C., Honap, S., Peyrin-Biroulet, L. Ulcerative colitis. Lancet. 402 (10401), 571-584 (2023).
  3. Cui, Y., et al. Integrated network pharmacology, molecular docking and animal experiment to explore the efficacy and potential mechanism of Baiyu decoction against ulcerative colitis by enema. Drug Des Devel Ther. 17, 3453-3472 (2023).
  4. Rosh, J. R., Gross, T., Mamula, P., Griffiths, A., Hyams, J. Hepatosplenic T-cell lymphoma in adolescents and young adults with Crohn's disease: A cautionary tale. Inflamm Bowel Dis. 13 (8), 1024-1030 (2007).
  5. Pastorelli, L., De Salvo, C., Mercado, J. R., Vecchi, M., Pizarro, T. T. Central role of the gut epithelial barrier in the pathogenesis of chronic intestinal inflammation: Lessons learned from animal models and human genetics. Front Immunol. 4, 280(2013).
  6. Capoccia, E., et al. Enteric glia: A new player in inflammatory bowel diseases. Int J Immunopathol Pharmacol. 28 (4), 443-451 (2015).
  7. Sharkey, K. A., Mawe, G. M. The enteric nervous system. Physiol Rev. 103 (2), 1487-1564 (2023).
  8. Fung, C., Boesmans, W., Cirillo, C., Foong, J. P. P., Bornstein, J. C., Vanden Berghe, P. VPAC receptor subtypes tune purinergic neuron-to-glia communication in the murine submucosal plexus. Front Cell Neurosci. 11, 118(2017).
  9. Bubeck, M., Becker, C., Patankar, J. V. Guardians of the gut: Influence of the enteric nervous system on the intestinal epithelial barrier. Front Med. 10, 1228938(2023).
  10. Da Silva Sousa, J. J., et al. Colonic mast cells trigger enteric neuronal death through the S100β/RAGE/NFκB pathway on inflammatory bowel diseases. Med Hypotheses. 170, 111004(2023).
  11. Xie, H., et al. Enteric glial cells aggravate the intestinal epithelial barrier damage by secreting S100β under high-altitude conditions. Mol Biomed. 4 (1), 31(2023).
  12. Grubišić, V., et al. Enteric glia modulate macrophage phenotype and visceral sensitivity following inflammation. Cell Rep. 32 (10), 108100(2020).
  13. Kermarrec, L., Durand, T., Neunlist, M., Naveilhan, P., Neveu, I. Enteric glial cells have specific immunosuppressive properties. J Neuroimmunol. 295 - 296, 79-83 (2016).
  14. Liu, D., et al. Flos lonicerae flavonoids attenuate experimental ulcerative colitis in rats via suppression of NF-κB signaling pathway. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 393 (12), 2481-2494 (2020).
  15. Zhao, Y., et al. Gegen Qinlian decoction maintains colonic mucosal homeostasis in acute/chronic ulcerative colitis via bidirectionally modulating dysregulated Notch signaling. Phytomedicine. 68, 153182(2020).
  16. Zhu, L., Gu, P., Shen, H. Protective effects of berberine hydrochloride on DSS-induced ulcerative colitis in rats. Int Immunopharmacol. 68, 242-251 (2019).
  17. Zhang, S., et al. International clinical practice guideline on the use of traditional Chinese medicine for ulcerative colitis by Board of Specialty Committee of Digestive System Disease of World Federation of Chinese Medicine Societies (2023). Phytother Res. 38 (2), 970-999 (2024).
  18. He, X., et al. Bletilla striata: Medicinal uses, phytochemistry and pharmacological activities. J Ethnopharmacol. 195, 20-38 (2017).
  19. Kumari, M., et al. Acacia catechu (L.f.) Willd.: A review on bioactive compounds and their health promoting functionalities. Plants. 11 (22), 3091(2022).
  20. Yasueda, A., et al. Sanguisorba officinalis L. derived from herbal medicine prevents intestinal inflammation by inducing autophagy in macrophages. Sci Rep. 10 (1), 9972(2020).
  21. Garg Jyoti, V. Acacia catechu Willd. and Acacia arabica Willd. decrease the extent of anxiety behavior by reducing oxidative stress and moderating neurochemicals. J Ethnopharmacol. 312, 116496(2023).
  22. Ban, J. Y., et al. 3,4-Dihydroxybenzoic acid from Smilacis chinae rhizome protects amyloid β protein (25-35)-induced neurotoxicity in cultured rat cortical neurons. Neurosci Lett. 420 (2), 184-188 (2007).
  23. Olech, M., Ziemichód, W., Nowacka-Jechalke, N. The occurrence and biological activity of tormentic acid: A review. Molecules. 26 (13), 3797(2021).
  24. Wang, Q., et al. Hyperoside: A review on its sources, biological activities, and molecular mechanisms. Phytother Res. 36 (7), 2779-2802 (2022).
  25. Xun, L., et al. Physcion and physcion 8-O-β-glucopyranoside: A review of their pharmacology, toxicities and pharmacokinetics. Chem Biol Interact. 310, 108722(2019).
  26. Cirillo, C., et al. Increased mucosal nitric oxide production in ulcerative colitis is mediated in part by the enteroglial-derived S100B protein. Neurogastroenterol Motil. 21 (11), 1209-e112 (2009).
  27. Li, Y., et al. Inhibiting the activation of enteric glial cells alleviates intestinal inflammation and comorbid anxiety- and depressive-like behaviors in the ulcerative colitis mice. Neurochem Int. 178, 105789(2024).
  28. Cirillo, C., et al. S100B protein in the gut: The evidence for enteroglial-sustained intestinal inflammation. World J Gastroenterol. 17 (10), 1261-1266 (2011).
  29. Esposito, G., et al. Enteric glial-derived S100B protein stimulates nitric oxide production in celiac disease. Gastroenterology. 133 (3), 918-925 (2007).
  30. Yang, Y. H., Qian, W., Hou, X. H., Dai, C. B. Bifidobacterium bifidum and Bacteroides fragilis induced differential immune regulation of enteric glial cells subjected to exogenous inflammatory stimulation. Inflammation. 45 (6), 2388-2405 (2022).
  31. Le Berre, C., Naveilhan, P., Rolli-Derkinderen, M. Enteric glia at center stage of inflammatory bowel disease. Neurosci Lett. 809, 137315(2023).
  32. Schroeter, M. L., et al. Mood disorders are glial disorders: Evidence from in vivo studies. Cardiovasc Psychiatry Neurol. 2010, 780645(2010).
  33. Kaplan, G. G. The global burden of IBD: From 2015 to 2025. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 12 (12), 720-727 (2015).
  34. Fan, M., et al. Electroacupuncture at ST36 relieves visceral hypersensitivity based on the vagus-adrenal axis in the remission stage of ulcerative colitis. Neuromodulation. 28 (5), 812-824 (2025).
  35. Lechner, M., Lirk, P., Rieder, J. Inducible nitric oxide synthase (iNOS) in tumor biology: The two sides of the same coin. Semin Cancer Biol. 15 (4), 277-289 (2005).
  36. Nomura, Y. NF-kappaB activation and IkappaB alpha dynamism involved in iNOS and chemokine induction in astroglial cells. Life Sci. 68 (15), 1695-1701 (2001).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

S100RAGENF BDSS

מאמר זה פורסם

הסרטון יגיע בקרוב

צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.