מאמר שיטה

דם קרציות המזין דרך ממברנה מלאכותית בתא מודפס בתלת-ממד במחקר קרציות איקסודיד

796 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/69606

⸱

20 במרץ 2026

 , 
1Department of Entomology, University of Arizona, 2Department of Entomology, Kansas State University

במאמר זה

סיכום

שיטה זו מתארת את פיתוח מערכת הזנת דם מקרציות במבחנה , המשלבת תא מודפס בתלת-ממד וממברנת סיליקון מעבדתית. המערכת מאפשרת האכלה מלאכותית של קרציות, ומאפשרת דגימה קלה בשלבים שונים של האכלה ושימוש בכמויות דם נמוכות, ומספקת כלי יקר ערך לחקר קרציות איקסודיד.

תקציר

עבודה זו מציגה פרוטוקול מפורט למערכת הזנת קרציות דרך ממברנת סיליקון מלאכותית המשתמשת בתא מודפס בתלת-ממד העשוי משרף פוטופולימר ברזולוציה גבוהה. השיטה כוללת תכנון תא ההזנה, הכנת ממברנת הסיליקון, הרכבת המערכת ותנאים אופטימליים להאכלת קרציות. קרציות הן אחת מהוקטורים המובילים למחלות בארצות הברית ובעולם. מחקר הקרציות חיוני לפיתוח אסטרטגיות יעילות למניעה והפחתת שכיחות מחלות המועברות על ידי קרציות. כטפילים אקטופאוגיים מחויבים, הקרציות חייבות להזין דם כדי לשרוד וכך להעביר מחלות, מה שהופך את ההזנה בדם לתהליך יסודי בחקירת אינטראקציות בין וקטורים-מארחים, העברת פתוגנים, והביולוגיה, הפיזיולוגיה והמבנה האנטומי של הקרציות. מערכות האכלה לקרציות עם ממברנת סיליקון שימשו ושופרו באופן נרחב בעשורים האחרונים. עם זאת, מערכות רבות קיימות מותאמות למין קרציה יחיד, שלב חיים או סט תנאים ספציפי. מערכת ההזנה לקרציות המתוארת בפרוטוקול זה שימשה בהצלחה לאיסוף דגימות מוזנות חלקית ומלאות מלאות מכמה ממיני וקטורי הקרציות החשובים ביותר בארצות הברית, כולל Amblyomma americanum, A. maculatum, Ixodes scapularis ו-Rhipicephalus sanguineus בוגרים. המערכת הראתה הצלחה בהתחלת האכלה של Dermacentor variabilis בוגרים ושל נימפה A. americanum, כאשר שיעורי ההאכלה הגבוהים ביותר (>85%) נצפו בבוגר A. americanum. כתוצאה מכך, תא ההזנה שפותח במחקר זה מתאים לשימוש בנפח נמוך של דם שונים, עד 100 מיקרוליטר, שהוא חיוני בהעברת פתוגנים ובמחקרים טוקסיקולוגיים. המכסה השקוף עם גובה מינימלי של התא אפשר תצפית על קרציות לאורך זמן האכלת קרציות.

מבוא

קרציות הן אקטופרזיטים מחויב להזנת דם, שיכולים לשאת ולהעביר מגוון רחב של פתוגנים, כולל חיידקים, וירוסים וטפילים הגורמים למחלות לבעלי חיים ולבני אדם ברחבי העולם 1,2,3,4. כמוביל המחלה מספר אחת בארצות הברית, שני רק ליתושים בשאר העולם 2,3,5, מספר מיני קרציות יכולים להעביר מחלות הקשורות לפתוגן, בעוד שמינים אחרים ידועים גם כגורמים למחלות לא מדבקות כמו תסמונת אלפא-גל (AGS, הידועה גם כאלרגיה לבשר אדום), שדווחה יותר ויותר ברחביהעולם בשנים האחרונות. 7,8,9,10,11,12,13,14,15,16. מחקר שמטרתו להבין את הביולוגיה, הפיזיולוגיה, הגנטיקה וכישורים של וקטורים הוא חיוני לפיתוח אסטרטגיות להפחתת העומס הכלכלי והבריאותי הציבורי של מחלות מדבקות ולא מדבקות המועברות על ידי קרציות. חקר אינטראקציות בין קרציות למארח דורש לעיתים קרובות קרציות מוזנות חלקית או מלאות לחלוטין כדי לענות על שאלות מחקר ספציפיות. ניתן להשיג זאת באמצעות האכלה של בעלי חיים חיים, מה שמאפשר לקרציות להשלים את מחזור החיים המלאשלהן. בעוד שהשימוש בבעלי חיים חיים להאכלת קרציות יעיל מאוד לפיתוח ותחזוקה של מושבות קרציות18,19, הוא יכול להיות מאתגר ליישם ואינו רלוונטי לכל השערת מחקר בשל מגבלות זמינות המארח ותקנות המתקנים. החשוב מכל, יישום מוצלח של מערכות האכלה לקרציות במבחנה מסייע להפחתת השימוש בבעלי חיים חיים, מטרה משמעותית במחקר במסגרת מסגרת "חלופה לשימוש בבעלי חיים (3Rs)" (החלפה, הפחתה, זיקוק)20.

ישנם יתרונות רבים בשימוש במערכות הזנה מלאכותיות לקרציות מממברנה במחקר, המספקות הזדמנויות רחבות להתמודדות עם מגוון רחב של שאלות מדעיות. ניתן לסכם אותם באופן כללי בשלוש קבוצות; (1) הערכת ההשפעה על שונות בדם המאכסן ואינטראקציות בין וקטורים-מארח, באמצעות מקורות דם שונים, כגון ייצור קרציות אלפא-גאל במהלך ההאכלה21, (2) הערכת רעילות האקריצידים באמצעות מתן תרכובות עם הדם22 והתאוששות תרכובות המופרשות מקרציות במהלך האכלהבדם 23, (3) הערכת כשירות הווקטורים, באמצעות העברת פתוגנים באמצעות רכישה טבעית במהלך האכלה בדם24, 25,26,27, בין היתר. יתרה מזאת, טבעה של מערכת ההזנה באמצעות ממברנה מלאכותית מאפשר בדיקות רחבות היקף של טיפולים וריכוזים שונים מבלי להכניס וריאציות הקשורות לפונדקאי, בקנה מידה ונפח קטנים, מה שמפחית את הצורך בבעלי חיים חיים.

מערכות האכלת קרציות באמצעות ממברנות מלאכותיות שימשו רבות במחקר ולתמיכה בגידול מושבת קרציות 19,28,29, ובמקרים מסוימים אפשרו השלמת מחזור החיים הארוך של הקרצייה 30,31. דווחו פרוטוקולים רבים לאופטימיזציה של מערכות האכלת קרציות וחומריהן עבור מיני קרציות שונים 32,33,34. עם זאת, ידוע כי האכלת קרציות במבחנה יכולה להיות משתנה מאוד בהתאם לתנאי המערכת, לחומרים בהם משתמשים, וחשוב מכל, למיני הקרציות ולשלבים34. יתרה מזאת, מערכות רבות מסתמכות על כמויות גדולות של דם, כמו מערכות זרימה רציפה27, שהן יעילות מאוד אך עלולות להיות יקרות בשל נפחי הדם המשמעותיים הנדרשים. פרוטוקול זה מפרט מערכת הזנה מלאכותית ממברנה לקרציות שהוכחה כמוצלחת בשלבים הבוגרים של חמישה מינים שונים של וקטורי קרציות בארצות הברית. אלה כוללים את Amblyomma americanum, A. maculatum, Ixodes scapularis, Rhipicephalus sanguineus ו-Dermacentor variabilis.

פרוטוקול

ניסויי האכלת קרציות בוצעו באמצעות דם בקר דפיברין מסחרי זמין (Hemostat Laboratories, קליפורניה, ארה"ב) ודם אדם דפיברין (Bioivt, קליפורניה, ארה"ב), שאוסף ומעבד דם בהתאם לפרוטוקולים והנחיות שאושרו על ידי ועדת טיפול ושימוש בבעלי חיים מוסדית (IACUC) ומועצת הביקורת המוסדית (IRB). במחקר זה לא נעשה שימוש בבעלי חיים חיים של חולייתנים להזנת קרציות. כל הקרציות ששימשו בפרוטוקול זה נרכשו ממתקן גידול הקרציות של אוניברסיטת מדינת אוקלהומה. החומרים והציוד בהם משתמשים מופיעים בטבלת החומרים.

1. תאי האכלה של קרציות

  1. תכננו את התאים באמצעות תוכנת עיצוב תלת-ממדי חופשית שתתאים על צלחת פטרי בגודל 35 מ"מ על 10 מ"מ. גדלי החלקים המודפסים (איור 1A) הם: גוף התא (חלק i) 25 מ"מ (קוטר פנימי) x 20 מ"מ (גבוה), עם עובי קיר 3 מ"מ בבסיס ו-6 מ"מ עובי דפנות בטבעת המכסה העליונה (חלק II), 30 מ"מ (קוטר פנימי) x 5 מ"מ (גבוה) ו-3.5 מ"מ עובי דפנה, וטבעת חיצונית (חלק iii) 31 מ"מ (קוטר פנימי) x 5 מ"מ (גבוה) ו-3 מ"מ עובי דפנה.
    הערה: טבעת המכסה כוללת ארבעה פתחים עגולים בקוטר 3 מ"מ על 2 מ"מ (גובה) למעלה להצבת מגנטים. לחלק העליון של התא יש גם פתחים בגודל זהה לחיבור המגנטים (איור 1B). עיצוב המודל התלת-ממדי צריך להישמר כקובץ .stl , פורמט ההדפסה התלת-ממדי הנפוץ ביותר. קבצים המכילים את העיצוב התלת-ממדי בפרוטוקול זה יסופקו לפי בקשה.
  2. תאי הדפסה באמצעות מדפסת תלת-ממד LCD בגודל 10" 14K עם שרפי פוטופולימר אפורים או לבנים (איור 1A) או מדפסת/שירות תלת-ממדי ברזולוציה גבוהה שמדפיס מודלים תלת-ממדיים מקובץ .stl.
    הערה: פרוטוקול זה השתמש בשירותי ההדפסה והשרפים של אוניברסיטת אריזונה. שימוש בשרפים ברזולוציה גבוהה מבטיח יצירת תאים מפורטים ועמידים.
  3. באמצעות כפפות, ודאו שאין שאריות שרף על החלקים לפני ההרכבה, על ידי שטיפה ואם צריך, שיוף עדין בנייר שיוף דק (180 עד 200 גריט). ודא שהתחתית השטוחה של חלק i (איור 1A) חלקה. זה מבטיח הידבקות תקינה של ממברנת הסיליקון, ומפחית את הסיכון לדליפה.
  4. חשפו את כל החלקים היבשים לאור UV למשך 10 דקות כדי להבטיח פולימריזציה מלאה של השרף.
    הערה: רוב שירותי ההדפסה התלת-ממדיים המשתמשים בשרפים רעילים להדפסה משתמשים באור UV לקישוט השרף (הקשחת הדגמים והסרת רעילות השרף); עם זאת, לעיתים הוא נשאר "לא נרפא לחלוטין". דגם שאינו מתקשה לחלוטין יישאר מעט דביק למגע ועלולים לשאת שרף לא מקוטב, שיכול להיות רעיל או לגרום לגירוי בעת הטיפול. חשיפה נוספת לאור UV תבטיח התקשות מלאה של השרף.
  5. הדביקו את המגנטים העגולים בגודל 3 מ"מ על 2 מ"מ לחריצים בחלק העליון של התאים וטבעות המכסה באמצעות דבק אפוקסי שקוף. אפשר להתייבש ללילה בטמפרטורת החדר (20–25 מעלות צלזיוס/מינימום של 16 שעות). ודא שהקטבים של המגנטים פונים לכיוון אחד כדי להתאים למשיכת הקטבים על המגנטים בחלק העליון של טבעת המכסה (איור 1A, חלק ב').
  6. הרכיבו את כל החלקים עבור המודל כדי להבטיח התאמה תקינה של כל הרכיבים, כפי שמוצג באיור 1A–C.

2. הכנת ממברנה

  1. מניחים חתיכת ניילון נצמד בגודל 30 ס"מ על 30 ס"מ על משטח נקי וודא שהיא נקייה מקמטים על ידי מתיחה על משטח שטוח וחיבור הקצוות עם סרט דבק (איור 2Ai).
  2. הניחו 4–5 דפי נייר ניקוי עדשה בודדים מעל חתיכת פלסטיק/ניילון נצמד מוארכת במרחק של 5 ס"מ (איור 2Aii).
  3. הכינו את ממברנת הסיליקון באמצעות הרכיבים והכמויות המפורטות להלן.
    הערה: הכמויות מספיקות להכנת 4–5 ממברנות (7 ס"מ × 12 ס"מ), כל אחת מכילה עד 5–6 תאי הזנה, לסך הכל 20–30 חדרים.
  4. הכינו את תערובת הסיליקון על ידי שילוב של 15 גרם איטום סיליקון שקוף (קושי 20–25 Shore A) והוספת 4.5 גרם שמן סיליקון (30% מסך הסיליקון), ו-2.9 גרם הקסן (19.3% מסך הסיליקון). הניחו את המרכיבים בסירת שקילה מפלסטיק וערבבו בעדינות בעזרת מרית (איור 2Aiii).
    הערה: וודא יצירת בועות מינימליות על ידי ערבוב עדין של המרכיבים.
  5. מניחים 2–3 גרם תערובת סיליקון לאורך הקצה הקטן של נייר העדשה כדי להצמיד אותה לעטיפת הנצמד. אפשר 5–10 שניות עד שהסיליקון יחלחל דרך נייר העדשה (איור 2Aiv).
  6. פזרו באופן שווה את תערובת הסיליקון לאורך דף הנייר באמצעות כלי ישר כמו מכסה, סרגל או מרית. ודא שהאובייקט מכסה את כל שטח נייר העדשה (איור 2Av). זה מבטיח כיסוי סיליקון במכה אחת, ומונע פרפורים וגלים של הממברנה בקצה האובייקט.
  7. ודאו שכל תערובת הסיליקון משולבת בממברנה על ידי החזרת כלי ההתפשטות למצב ההתחלתי לפיזור. מכיוון שחלק מתערובת הסיליקון תישאר על כלי ההתפשטות, החזרת הכלי לאיסוף תבטיח שכל הסיליקון ישמש כדי למנוע פערים (איור 2Avi).
    הערה: הממברנה צריכה להיראות שקופה באופן אחיד ללא גלים (איור 2B).
  8. הכינו ממברנות בעוביים שונים בתחילה על ידי הוספת תערובת סיליקון גדולה או פחותה, שכן העובי לא ניתן למדוד עד שהממברנות יבשות.
  9. תנו לממברנות להתייבש באוויר לילה בטמפרטורת החדר (20–25 מעלות צלזיוס/מינימום של 16 שעות).
  10. מדדו את עובי הממברנה באמצעות כלי מדידה דיגיטלי חיצוני למיקרומטר. עובי ממברנה שונים משמשים למיני קרציות בוגרים שונים, החל מחלקי פה קצרים (עובי ממברנה של 70 מיקרון) ועד חלקי פה ארוכים יותר (עובי ממברנה של 200 מיקרון).
  11. הסר את כל החלקים מהתאים שהורכבו מראש ומרח דבק סיליקון על השפה התחתונה של התאים. למיקום מדויק של דבק, השתמש במזרק של 1 מ"ל ומלא אותו בדבק סיליקון (איור 2Ci).
  12. מניחים קצה פיפטה בנפח 200 מיקרוליטר על קצה המזרק (במקום המחט) לצורך הדבקה (איור 2Cii) והבריגו אותו לקצה המזרק, כמו עם קצה מחט (איור 2Ciii). זה יאפשר מריחת דבק דק על השפה התחתונה של כל תא (איור 2Civ).
  13. הנח את התא מעל הממברנה (איור 1, חלק א') עם גוף משוקלל כדי להבטיח שקיעה. יש לאפשר להם לשבת ללילה בטמפרטורת החדר (20–25 מעלות צלזיוס/מינימום של 16 שעות) (איור 2D,E).
    הערה: השתמש בכל אובייקט עם משקל שטוח. פרוטוקול זה השתמש בחתיכת אקריליק במשקל 2.5 ק"ג (איור 2E).
  14. חתוך את עודף הממברנה מהתאים באמצעות מספריים מעוקלים (איור 3A).
  15. לפני השימוש בתא להאכלת קרציות, יש להסיר את ניילון הנצמד שנותר (במקום בו מוכנה הממברנה (שלב 2.1) (איור 3B).
  16. הרכיבו מחדש את חלקי התא, כוללים צלחת פטרי בגודל 35 מ"מ על 10 מ"מ בתחתית, והשתמשו במכסים של הכלים כמכסים של התאים על ידי הפיכתם והנחתם בין המגנטים (איור 3C,D).
    הערה: השתמש במכסים הפוכים, שכן טבעת מחזיק המכסה מתאימה בדיוק למכסה אם היא הפוכה (ראו תיאורי חלקים באיור 3C,D).
  17. השרו את ממברנת התא במים מזוקקים באמצעות החלק התחתון של צלחות פטרי בגודל 35 מ"מ על 10 מ"מ. תן לממברנה להישאר במים ללילה בטמפרטורת החדר (20–25 מעלות צלזיוס/מינימום של 16 שעות). מכיוון שהממברנה בתחילה הידרופובית, השריה במים לפני הוספת דם תסייע להפחית את היווצרות הבועות הכלואים.
    הערה: היעדר בועות מאשר שההידרופוביות הוסרה.

3. האכלת קרציות והכנת דם

  1. יש ליצור 2–3 חורי נשימה קטנים במכסים של כל תא (מהצלחות פטרי בגודל 35 מ"מ x 10 מ"מ) (חלק ד' באיור 1A) המוזכר בשלב 2.16 (איור 3E). השתמש בסקלפל מתכת מחומם או במרית מתכת דקה כדי לדקור את חורי הנשימה במכסה.
    הערה: חורי הנשימה מאפשרים ללחות להיספג בתוך מארז התא.
  2. הוסיפו לדם גנטמצין סולפט בריכוז סופי של 50 מיקרוגרם/מ"ל. הוסף אנטיביוטיקה רק לדם המיועד לשימוש בתוך שבוע ואחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. שמור על דם בקר (או כל דם בעל חיים אחר) בטמפרטורה של 4°C לפני ואחרי הוספת אנטיביוטיקה.
  3. מניחים 2–3 מ"ל דם בצלחת פטרי נקייה בגודל 35 מ"מ על 10 מ"מ, ואז מניחים את התא עליה. כוונן את גובה התא כדי להגדיל או להפחית את כמות הדם בכל תא על ידי סיבוב טבעת ההתאמה (חלק iii מאיור 1A). כוונו את גובה התא, והשאירו מרווח של 1–2 מ"מ מתחתית צלחת פטרי אל הממברנה. ראו חיצי מג'נטה באיור 4A לעיון.
    הערה: עיצוב טבעת ההתאמה של התאים מאפשר שליטה בנפח הדם שבו משתמשים. כלומר, מרווח גדול יותר בין תחתית צלחת פטרי לממברנה ידרוש נפח גדול יותר כדי למלא את החלל.
  4. הניחו קרציות לא מוזנות בתוך תאים במספר שווה של זכרים ונקבות. ודאו ששני המינים תמיד כלולים בתא, שכן זה עלול להשפיע על קצב האכילה (איור 4B מראה 4 זכרים ו-4 נקבות של A. americanum בוגר בתוך התא). מקסימום 10–15 קרציות בכל תא (לשלב הבוגר) משמש לטיפול קל יותר.
    הערה: בעבודה עם שלבים לא בוגרים, מספר הקרציות גבוה יותר (20–50 נימפות בכל תא, לא מוצגות בפרוטוקול זה).
  5. הניחו תאים באמבטיות יבשות מכוסות בטמפרטורה של 37°C ±-1°C עם מקור לחות (כלומר, כוסות מים) השומר על לחות יחסית של 63% ±-2% (איור 4C) תחת פוטו-אפור של 12:12 שעות.
    הערה: דרישות אלו עשויות להשתנות בהתאם למין הקרציות ולתנאי המעבדה; נסה הגדרות לחות אחרות במידת הצורך והעריך את ההגדרה הטובה ביותר למעבדה.

4. החלפת דם וחדרים

  1. הכינו שני בקבוקי התזת מים עם התמיסות לשימוש בשטיפת הממברנה בין החלפות הדם. בבקבוק אחד יש להוסיף תמיסת ניסטטין של 0.005% במים מזוקקים; בבקבוק השני מוסיפים מים מזוקקים.
  2. לאחר 12–16 שעות, הכינו צלחות פטרי חדשות עם דם טרי ומניחים אותן באמבט יבש בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס לפני הכנסת התא.
  3. בזמן שהדם הטרי מתחמם, הסר את התא מהדם המשומש ושוטף את תחתית הממברנה במים מזוקקים למשך 3–5 שניות, ואז עם תמיסת ניסטטין של 0.005% למשך 3–5 שניות כדי למנוע זיהום פטרייתי. שטוף שוב את הממברנה במים מזוקקים כדי להסיר שאריות ניסטטין שנותרו.
    הערה: תהליך זה אורך פחות מ-5 דקות ואינו משפיע על האכלת הקרציות המחוברות לממברנה על פני השטח העליונים.
  4. השליכו את כל הדם והמים בשימוש במיכל המכיל תמיסת נתרן היפוכלוריט של 0.5% (10% אקונומיקה). פסולת דם נזרקת בהתאם לפרוטוקול הבטיחות המוסדית.
  5. לאחר השטיפה, מניחים את התא בצלחת פטרי החדשה עם דם.
    הערה: השתמש בתאים למשך עד 2–3 חודשים לפני הכביסה, בתנאי שאין זיהום ואין נזילות. תאים וממברנות מתלכלכים ונמצאים בסיכון לזיהום מעבר ל-3 חודשים של שימוש ללא כביסה. זה מוביל לירידה בקצב ההאכלה של הקרציות. יש להשתמש מחדש בתאים עד שנה וחצי (~10 מחזורי כביסה).
  6. משתמשים מחדש בתאים על ידי הנחתם בתמיסת נתרן היפוכלוריט 0.5% (10% אקונומיקה) למשך עד 30 דקות, ואז שטיפה עם סבון כלים. אין לחשוף את התאים להלבין לפרקי זמן ממושכים (>30 דקות), שכן הריח מפחית את קצב ההיצמדות ועלול להחליש את שלמות השרף עם הזמן.
    הערה: חשיפה ממושכת לאקונומיקה הופכת את התא לגמיש כשהוא רטוב ולשביר כשהוא מתייבש, מה שמוביל לשבירה. דבר זה גורם לתא להחזיק מעמד יותר מ-4–5 מחזורי שטיפה בהתבסס על תצפיות חזרות. שימוש רציף באותו תא ללא שטיפה (עד 3 חודשים) מוביל לחיבור מהיר יותר של קרציות (1–3 ימים לאחר ההצבה בתא) בהשוואה לתא שנשטף לאחרונה (לעיתים >7 ימים להצמדה). סביר להניח שזה נובע מריח של פסולת ופרומוני הצטברות אחרים מקרציות הניזונות בתא, מה שיכול לעורר הזנה של קרציות35,36.

תוצאות

עובי הממברנה לכל מין קרציה.
קצבי האכילה הגבוהים ביותר של קרציות נצפו במפרטי עובי הממברנה הבאים עבור כל מין קרציה בוגר: Amblyomma americanum 100–200 מיקרון; A. maculatum 100–250 מיקרון; Rhipicephalus sanguineus 70–100 מיקרון; Ixodes scapularis <150 מיקרון, Dermacentor variabilis <150 מיקרון. כל מיני הקרציות נשמרו באותם תנאים של לחות וטמפרטורה במהלך האכלה (63% לחות יחסית ו-37 מעלות צלזיוס) (טבלה 1).

קרציות ומקורות דם המשמשים בפרוטוקול זה
כל הקרציות נאספו ממתקן גידול הקרציות של אוניברסיטת מדינת אוקלהומה ונשמרו על לחות יחסית של >90% בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס, תחת תקופת אור של 12:12 שעות של אור-חושך. כל הקרציות הוזנו מדם בקר או דם אדם דפיברין כחלק מפרויקט מחקר שחקר רמות אלפא-גל (αGal) במיני קרציות שונות. מחקר זה השווה את השפעות ההזנה על מקורות דם שונים במסגרת פרויקט רחב יותר של תסמונת אלפא-גל (AGS) שנערך על ידי קבוצת המחקר. רוב דגימות הקרציות המתוארות כאן ננתחו לפני התנפחות מלאה לביצוע ניתוחי כימות αGal בקרציות שקיבלו מזון חלקי (2–5 ימים של האכלה). רק תת-קבוצה של קרציות Amblyomma americanum (אלו שלא נדרשו לכימות αGal) הורשו להיזון עד השלמה. למרות שלא מוצגות כאן השוואות מפורטות בין קצב האכלה של קרציות שמוזנות מבקר לבין קצב האכלה בבני אדם, ראוי לציין כי התרחבות מלאה (כלומר, הצלחת האכלה) הושגה יותר בקרציות שניזונו מדם בקר. מבין הקרציות שהורשו להישאר במאכילים לפרקי זמן ממושכים (n = 35), 15 הגיעו להתמלאות מלאה, מה שמייצג שיעור הצלחה של 42.8%. מתוכם, 9 מהם הוזנו מדם בקר ו-6 מהם על דם אדם (60% הואכלו מבקר לעומת 40% מהם).

שיעורי האכלת קרציות לעומת שיעורי הצלחה באכילה של קרציות
קצבי האכלת הקרציות במחקר זה נקבעו על בסיס רכישת קרציות שקיבלו אוכל חלקי (2–5 ימים של האכלה), בעוד שהצלחת האכלה הוגדרה כהתמכרות מלאה, בדרך כלל בשינוי בצבע האלוסקוטום של הנקבה (הנתונים זמינים רק עבור Amblyomma americanum). קצב ההאכלה של זכרים הוגדר כהזנה רציפה של יותר מ-2 ימים (2–5 ימים). קצב ההזנה הכולל חושב על ידי שילוב נתונים מקרציות שהוזנו מדם בקר ואדם, וחישוב אחוזים של קרציות שהשיגו 2–5 ימי האכלה או התמלאות מלאה מקרציות שהונחו בתאים. קרציות שלא נצמדו או מתו לאחר <2 ימים של ההיצמדות נלקחו בחשבון חישובי קצב האכלה. למרות שנתונים כמותיים על השפעת מקור הדם על קצב האכלת הקרציות אינם מוצגים, ראיות תצפיתיות אלו מצביעות על כך שברוב מיני הקרציות, קצבי ההיצמדות והאכילה אינם שונים באופן מהותי בין דם בקר לדם אנושי במהלך תקופת ההאכלה של 2–5 ימים. נצפה יוצא מן הכלל עבור Rhipicephalus sanguineus, שהציג שיעורי האכלה נמוכים יותר בדם אנושי בין הימים 3 ל-5 בהשוואה לדם בקר. קצבי ההאכלה של כל מיני הקרציות שהשיגו האכלה חלקית והתנפחות מלאה באמצעות מערכת ההזנה הזו במבחנה מסוכמים בטבלה 1.

משקל ושלב האכלה של Amblyomma americanum נקבה
נקבות A. americanum שהואכלו חלקית סווגו לפי ימי האכלה כך: (1) לא הוזנה, (2) 2–3 ימים עם האכלה חלקית, (3) 4–5 ימים עם האכלה חלקית, ו-(4) נפוחה (איור 5). שלב ההאכלה הנפוח כלל קרציות בתחילת שלב הנפיחה המהירה (עם משקלים שנעו בין 48.9 מ"ג ל-109 מ"ג) וקרציות נפוחות לחלוטין (עם משקלים שנעו בין 272.7 מ"ג ל-348.7 מ"ג).

figure-results-1
איור 1: תא הזנת קרציות - דגם תלת-ממדי והרכבה מודפסת עם ממברנה. דגם תלת-ממד מתפוצץ ותא מורכב סופי המציג רכיבים בודדים: (i) גוף תא (בית קרציות), (ii) טבעת מחזיק מכסה, (iii) טבעת כוונון גובה, (iv) מכסה צלחת פטרי בגודל 40 מ"מ x 10 מ"מ, ו-(v) תחתית צלחת פטרי בגודל 40 מ"מ x 10 מ"מ עם דם (A). הרכבת דגם מודפס בתלת-ממד וגדלי חלקים בודדים המוצגים במ"מ (B). תא מורכב מודפס בשרף אפור ברזולוציה 8K (C). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-2
איור 2: הכנת ממברנת הסיליקון והרכבת התא. (i) ניילון נצמד בגודל 30 ס"מ × 30 ס"מ מחובר בסרט דבק, כדי למנוע קמטים נראים לעין, (ii) דפי נייר ניקוי עדשה בודדים המונחים על העטיפה במרחק של כ-5 ס"מ, (iii) ערבוב עדין של רכיבי הסיליקון עם מרית בתנועות מעגליות, (iv) כל דף נייר עדשה מאובטח על ידי מריחת 1–2 גרם תערובת הסיליקון לאורך הקצוות, (ה) תערובת הסיליקון מתפזרת באופן שווה על פני נייר העדשה באמצעות כלי ישר שגדול מהנייר (התמונה מראה את קצה מכסה הזכוכית), (vi) שימו לב לכמות התערובת המופחתת של תערובת הסיליקון במהלך הפיזור, הסיליקון השמור בכלי מוחזר ומופזר מחדש כדי להבטיח כיסוי אחיד (A). ממברנות שהתפזרו כראוי לא הראה בועות אוויר או פערים (B). הכנת המזרק ליישום דבק: (i) מזרק בנפח 1 מ"ל מלא בדבק סיליקון, (ii) קצה פיפטה בנפח 200 מיקרוליטר המותקן בקצה המזרק, (iii) קצה הפיפטה מוברג במקום כדי להבטיח אטימה אטומה לדליפות, ו-(iv) הנחת הדבק על השפה התחתונה של חלק I (C). התא המונח על הממברנה היובשת (D), וחפץ משוקלל (בלוק אקרילי עבה במשקל 2.5 ק"ג; חץ מג'נטה) מונח למעלה כדי להבטיח הידבקות יציבה (E). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-3
איור 3: השלבים הסופיים בהכנת התא והממברנה לפני השימוש. חיתוך קצוות הממברנה המקיפה את התא באמצעות מספריים קטנים מעוקלים (A), הסרת ניילון נצמד לפני השימוש בתא (B), הרכבת דגם סופית (C), מיקום התא בצלחת פטרי בגודל 40 מ"מ x 10 ס"מ המכילה מים, ושימוש בצלחת פטרי llid כמכסה תא (D) (המספרים i-v מציינים חלקים כפי שמפורט באיור 1A), ומכסי תאים המציגים חורי נשימה (מסומנים על ידי ראשי חץ מג'נטה) (E). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-4
איור 4: סידור הזנת דם ומיקום הקרציות. החדר מונח בצלחת מלאה בדם, עם טבעת התאמת הגובה מודגשת (חצים מג'נטה) (A). מבט פנימי על בית התא המכיל מספר שווה של קרציות זכר ונקבה (B). תאי קרציות ממוקמים באמבטיות יבשות עם מקור לחות, ושומרים על לחות יחסית של 63% ± 2% וטמפרטורה של 37°C ±-1°C. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-5
איור 5: שונות בגודל ובמשקל Amblyomma americanum במהלך האכלה. גודל הקרציות שלא הוזנו ומשקל ממוצע של קרציות שקיבלו אוכל חלקי מוצגים. התמונות מייצגות דוגמאות טיפוסיות המתאימות למשקל הממוצע שנרשם בכל פרק זמן של האכלה. הטבלה המצורפת מציגה משקלים ממוצעים, סטיות תקן, מספר הקרציות שנותחו, חציון, ורבעון 1 ו-3 לכל נקודת זמן האכלה. קרציות שהוזנו במשך 2–3 ימים הראו טווח משקל בין 7.4 מ"ג (מינימום) ל-19.2 מ"ג (מקסימום). הקרציות שהוזנו במשך 4–5 ימים נעו בין 20.6 מ"ג ל-44.8 מ"ג. הקרציות בתחילת שלב הנפיחה המהיר והקרציות הנפוחות לחלוטין שקלו בין 48.9 מ"ג ל-348.7 מ"ג. תמונה של נקבות A. americanum מצורפות נקבה מוזנת 4-5 ימים (ראש חץ צהוב), ונקבה נפוחה לחלוטין (ראש חץ מג'נטה). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

מיני קרציות ומיןמספר הקרציות שהוזנו / סך הקרציות שהונחו בתאים (מספר הקרציות המתות)קצב האכלה (קרציות מחוברות 2-5 ימים)משקל ממוצע (מ"ג) (SD)עובי הממברנה בשימוש (מיקרומטר)
נקבות A. americanum85/97 (12)87.60%37.3 (54.40)*100 - 200
זכרים מסוג A. americanum19/22 (2)86.30%לא הוקלט100 - 200
נקבות A. maculatum45/66 (21)68.20%122.4 (141.65)100 - 250
זכרים של A. maculatum36/47 (11)76.60%לא הוקלטלא הוקלט
נקבות R. sanguineus34/60 (26)56.60%לא הוקלט70 - 100
נקבות I. scapularis15/23 (8)65.20%לא הוקלט<150
*שיעור הצלחת ההאכלה שהוערך בתת-קבוצה של קרציות בוגרות שאכלו על ידי בקר הוא (n=35) היה 42.8%

טבלה 1: קצב האכלה של קרציות ומשקל ממוצע.

איור משלים 1: הזנה בנפח נמוך (100 מיקרוליטר) של הקרציות הבודדות שכבר מחוברות לאתר של תא התלת-ממד. צינור PCR קטן שמחובר לתחתית הממברנה המלאכותית בדבק סיליקון מלא ב-100 מיקרוליטר דם. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

דיון

מערכות האכלה ממברנה מלאכותית לקרציות הן כלים יעילים מאוד למחקר קרציות ומשמשות בהרחבה במעבדות מחקר רבות כחלופות יעילות להאכלת בעלי חייםחיים 28,29. הערך העיקרי של מערכות אלו טמון ביכולתן לספק או לשחזר חומרים שונים דרך ארוחה בדם, כולל פתוגנים, אקריצידים, תרכובות שמקורן בקרציות ומולקולות מודולטוריות נוספות 22,23,25,27. אופטימיזציה של מערכות האכלה ממברנה מלאכותית יכולה להקל על פיתוח גידול קולוני קרציות בת-קיימא, ובכך להפחית את התלות בבעלי חיים חיים.

מערכת ההזנה לקרציות במבחנה המתוארת בפרוטוקול זה הייתה מוצלחת במיוחד עם Amblyomma americanum ו-Ixodes scapularis הבוגרים. שיעורי הצלחת האכלת קרציות מוגדרים כאחוז (או אחוז) הקרציות שמסיימות בהצלחה את האכילה עד למלאות נפיחות. עם זאת, קרציות שמוזנות חלקית (בדרך כלל 3–4 ימים לאחר תחילת האכלה) מספיקות לעיתים כדי לענות על השערות ניסיוניות ספציפיות עבור רוב מעבדות המחקר על קרציות החוקרים את הביולוגיה או הפיזיולוגיה של הקרציות. בפרוטוקול מערכת האכלה ממברנלית מלאכותית זה, וכדי לענות על מטרות מחקר ספציפיות בפרויקט אלפא-גל (αGal), שימשו המונחים "קצב האכלת קרציות" להתייחס לרכישת קרציות שקיבלו אוכל חלקי (2–5 ימים של האכלה) ו"הצלחת האכלת קרציות" כדי להתייחס לנפיחה מלאה ב-A. americanum. שיעורי ההאכלה הגבוהים ביותר היו בנקבות A. americanum (87.6%), אחריהן זכרים של A. americanum (86.3%), נקבות A. maculatum (68.2%), זכרים של A. maculatum (76.6%), נקבות I. scapularis (65.2%) ונקבות R. sanguineus (56.6%), בעוד ששיעור הצלחת האכילה של A. americanum היה 42.8% (טבלה 1). נקבות A. americanum שהואכלו חלקית סווגו על פי ימי האכלה ב-4 קטגוריות (שלבי האכלה), עם שינויים מפרסומים קודמים כך: (1) ללא אוכל, (2) 2–3 ימים עם האכלה חלקית, (3) 4–5 ימים עם האכלה חלקית, ו-(4) נפוחה (איור 5). שלב ההזנה המתנפחת כלל קרציות בתחילת שלב הנפיחה המהירה (עם משקלים שנעו בין 48.9 מ"ג ל-109 מ"ג) וקרציות מלאות (עם משקלים שנעו בין 272.7 מ"ג ל-348.7 מ"ג) (איור 5). מערכת ההזנה המלאכותית של קרציות באמצעות ממברנה אפשרה מספר מחקרים בתוך אותה קבוצת מחקר ושותפים, בכך שאפשרה יצירת קרציות שקיבלו מזון חלקי על דם בקר, אשר שימשו לאחר מכן להדביק עכברים ולבדיקת השערת ההעברה של תסמונת אלפא-גל (AGS), אלרגיה לבשר אדום הנגרמת מנשיכות קרציות, ולמחקר N-גליקומיקס11,21, 37. הנוחות של ההגדרה האישית אפשרה שימוש במקורות דם שונים, והמכסה השקוף והגובה המינימלי של התא אפשרו ויזואליזציה של הקרציות במהלך תקופת ההזנה תחת מיקרוסקופ סטריאופי עם מרחק עבודה מספק.

שינויים אחרונים בלחות (מאמבט מים, 90% RH, לאמבט יבש, 63% ± 2% RH), בטמפרטורה (מ-37 °C ל-35 °C וחזרה ל-37 °C), ובעובי הממברנה (טבלה 1) אפשרו האכלה מוצלחת של מיני קרציות מרובים. בעוד שטמפרטורה ולחות יחסית (RH) הם משתנים חשובים לשליטה בהאכלה מקרציות במבחנה, עובי ועוצמת הממברנה הם גורמים קריטיים שמבטיחים הזנה מוצלחת בין מיני קרציות שונים33,38. חשוב לזכור שקרציות עם חלקי פה קצרים, כמו Rhipicephalus sanguineus ו-Dermacentor variabilis, יזדקקו לממברנות דקות יותר מאשר קרציות עם חלקי פה ארוכים39, כמו Amblyomma spp ו-Ixodes spp. שיעורי האכילה הגבוהים ביותר של הקרציות היו ב-Amblyomma americanum ו-A. maculatum בעובי ממברנה של 100–200 מיקרון; Rhipicephalus sanguineus בעובי שבין 70–100 מיקרון; Ixodes scapularis בעובי <150 מיקרון, ו-Dermacentor variabilis <150 מיקרון (טבלה 1). גורם מרכזי שיש לציין בהאכלת קרציות מממברנה מלאכותית הוא שעדיין מתרחשות תנודות בקצב ההאכלה. במערכת זו, שינוי קל בטמפרטורה, כלומר מ-37 מעלות צלזיוס ל-35 מעלות צלזיוס וחזרה ל-37 מעלות לאחר מספר ימים, לעיתים קרובות מעלה או משחזר את קצב ההאכלה של הקרציות. יתרה מזאת, מעבר מאמבט יבש לאמבט מים מניב תוצאות דומות עבור Amblyomma spp. ו-Ixodes scapularis, אך אפקט זה לא נצפה עבור Rhipicephalus sanguineus, שמזין ביעילות רבה יותר ב-63% ± 2% RH באמבטיות יבשות.

מערכות האכלה מלאכותיות נוספות לקרציות, כמו אלו שהותאמו ממערכת הזרימה הרציף בת חמישה חלקים שפותחה על ידי Ueti, M. ואחרים (USDA-ARS) ושונדמו מאוחר יותר למינים נוספים על ידי Yamasaki, Y. ואחרים, הוכיחו יעילות גבוהה, והניבו שיעורי הצלחה גבוהים בעקביות של האכלת קרציות27.40. עם זאת, מחקרים שדורשים גישה תכופה למערכת לניתוח קרציות שמוזנות חלקית הופכים את ההגדרות הללו לפחות מתאימות, שכן פתיחה וסגירה חוזרת של תא בית הקרציות עלולות להיות מסורבלות. תא המודפס בתלת-ממד המתואר בפרוטוקול זה כולל מכסה מגנטי עם נעילה בטוחה וצלחות פטרי נפרדות, המאפשרים טיפול קל ובדיקה ויזואלית של הזנת הקרציות מבלי להפריע להגדרה. המכסה השקוף מאפשר ניטור חזותי ללא הפרעה ומחובר היטב לתא באמצעות מגנטים מוטמעים, בניגוד למערכות ההזנה הנפוצות ביותר של קרציות, כמו אלו שאופטימיזציה בעיצוב המקורי של קרוברוגרין 22,29, שבהן לא ניתן לראות את התמונה האישית ללא הסרת תא ההזנה מהדם, שכן כל יחידות ההזנה משולבות בלוח אחד ושם השיטות למניעת בריחה מקרציות אל תאפשר ויזואליזציה. יתרה מזאת, מערכת ההזנה של קרציות במבחנה זו יכולה להיות משוכללת עוד יותר כדי לספק כמויות דם קטנות יותר ומותאמות למקום. לדוגמה, לאחר שנקבות הקרציות מחוברות לאתרי האכלה מוגדרים, ניתן להחליף את צלחת הפטרי התחתונה במאגרים זעירים, כמו החלק העליון של צינור PCR בנפח 100 מיקרוליטר, המכיל פחות מ-100 מיקרוליטר דם הממוקם ישירות מתחת לאזור החיבור (איור משלים 1). גישה זו להזנה בנפח נמוך תאפשר מחקרים מפורטים על רכישת פתוגנים והעברתו, וכן חקירות על השפעות רעילי קרציות ונוגדנים שמקורם במארח. פרוטוקול זה הוכח כמוצלח בהשגת קרציות שקיבלו מזון חלקי ממינים בוגרים שונים. לצורך מחקר זה, שיעורי הטלת ביצים ושיעורי התפיסות מלאה לא הוערכו בפרוטוקול זה; עם זאת, מתבצעת אופטימיזציה נוספת במטרה להשיג צאצאי קרציות, שניתן להשיג באמצעות Amblyomma americanum ו-Ixodes scapularis בהתבסס על תצפיות ראשוניות. אולי התכונה החדשנית ביותר של מערכת זו היא הגמישות שלה למניפולציות ניסיוניות בקנה מידה קטן, המאפשרת שונות מבוקרת של טיפולים ותנאי סביבה, תוך תמיכה ביישומי גידול מושבות.

האכלת קרציות במבחנה היא כלי חשוב לחוקרים החוקרים ביולוגיה, פיזיולוגיה וכישורי וקטורים. עם זאת, האכלת קרציות ממברנה מלאכותית היא משימה דורשת זמן ודורשת מאמץ. פרוטוקול זה, הכולל תא מודפס בתלת-ממד עם מערכת נעילה בטוחה וממברנה פשוטה שנוצרה במעבדה, מציע התקנה פשוטה לאחר הדפסת התאים והכנת הממברנות, מה שמאפשר שימוש ממושך. בנוסף, על ידי התאמת עובי הממברנה, ניתן להתאים את המערכת ביעילות למיני קרציות שונים. אופטימיזציה נוספת, כולל גודל התא ועובי הממברנה, יכולה לאפשר את יישומו בשלבים שונים של חיי הקרציות.

גילויים

המחברים מצהירים שאין אינטרסים פיננסיים מהותיים הקשורים למחקר המתואר במאמר זה.

תודות

המחברים מבקשים להודות לעבודה החרוצה של הסטודנטים לתואר ראשון והעובדים, קארה גולדן, סידני אינגהם ועומימה ג'דו נג'מה, שסייעו בהאכלת קרציות ובהקמת תא הקרציות והממברנה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מזרק לואר-לוק 1 מ"לBD309628טיפ לואר-לוק
סיליקון שקוף מתקדם ג'נרל אלקטריק2810435איטום סיליקון שקוף. איטום זה יוצר מחסום חסין למים לאחר התייבשות.
דבק אפוקסי שקוףJB וולד-קליר‎ B009EU5ZM0מספר מוצר של אמזון
עטיפת אוכל שקופה (אטם נצמד)שמחCLO00020
דם בקר דפיבריןמעבדות המוסטאטDBB100
דם אנושי דפיבריןBioIVT
מרית חד-פעמיתלבגו, בע"מ.17211מספר מוצר של אמזון
חממות אמבטיות יבשותONiLAB ScientificHB120-Sמספר מוצר של אמזון. בלוק החימום הופך כדי לקבל משטח שטוח.
מלח סולפט גנטמיציןמיליפור סיגמאG3632-5G
נייר ניקוי עדשותטיפןEK1546027T
קצות מיקרופיפטות, 200 & mu; L ביוטיקס uTIP63300057בשביל מזרק. מכשיר איטום סיליקון
כפפות ניטרילהשראהCOBALT-OGמספר מוצר של אמזון
ניסטטיןפישר ביוריאגנטיםBP2949-5
צלחת פטרי 35 מ"מ x 10 מ"מפלקון351008
מדפסת שרף Phrozen Sonic MEGA 8K V2פרזןB0F9NBXVVTנפח בנייה של 320 על 175 על 300 מ"מ. ניתן לרכוש דרך אמזון אם מעדיפים הדפסה פנימית
Pro 8K פוטופולימר & nbsp; שרף אקווה גרייפרזןדרך אוניברסיטת אריזונההתכווצות נמוכה. איכות גבוהה ואיכותית דגמים תלת-ממדיים מורכבים במיוחד ברזולוציית 8K.
מגנטים עגולים בגודל 3 מ"מ x 2 מ"ממילוסB08NZTN426מספר מוצר של אמזון
RPG פוטופולימר שרף עשן לבןפרזןדרך אוניברסיטת אריזונהאיכות גבוהה ואיכותית מודלים תלת-ממדיים מורכבים במיוחד. גמישות נהדרת עם כיפוף מרשים.
שמן סיליקוןמיליפור סיגמא378321-250ml
עיצוב תוכנת תלת-ממד חינמית של Tinkercadטינקרקאדלא זמיןhttps://www.tinkercad.com
סירות שקילה (קיבולת 100 מ"ל)פורה פונטהMDO-AZOC-1030

מקורות

  1. De La Fuente, J., Estrada-Pena, A., Venzal, J. M., Kocan, K. M., Sonenshine, D. E. Overview: Ticks as vectors of pathogens that cause disease in humans and animals. Front Biosci. 13, 6938-6946 (2008).
  2. Gubler, D. J. In vector biology, ecology and control. Atkinson, P. W. , Springer. Netherlands, Dordrecht. 39-62 (2010).
  3. Sonenshine, D. E., Roe, R. M. In biology of ticks. 1, Oxford University Press. Cary. 3-17 (2013).
  4. A global brief on vector-borne diseases. , World Health Organization. 1-54 (2014).
  5. Mullen, G. R., Durden, L. A. In medical and veterinary entomology. , Academic Press. Amsterdam. 517-558 (2002).
  6. Choudhary, S. K., et al. Tick salivary gland extract induces alpha-gal syndrome in alpha-gal deficient mice. Immun Inflamm Dis. 9 (3), 984-990 (2021).
  7. Van Nunen, S. A., O'Connor, L. R., Clarke, L. R., Boyle, R. X., Fernando, S. L. An association between tick bite reactions and red meat allergy in humans. Med J Aust. 190 (9), 510-511 (2009).
  8. Fischer, J., et al. Spatial distribution of alpha-gal in Ixodes ricinus – A histological study. Ticks Tick Borne Dis. 11 (5), 101506(2020).
  9. Hamsten, C., et al. Identification of galactose-α-1,3-galactose in the gastrointestinal tract of the tick Ixodes ricinus; possible relationship with red meat allergy. Allergy. 68 (4), 549-552 (2013).
  10. Chinuki, Y., Ishiwata, K., Yamaji, K., Takahashi, H., Morita, E. Haemaphysalis longicornis tick bites are a possible cause of red meat allergy in Japan. Allergy. 71 (3), 421-425 (2016).
  11. Maldonado-Ruiz, L. P., Boorgula, G. D., Kim, D., Fleming, S. D., Park, Y. Tick intrastadial feeding and its role on IgE production in the murine model of alpha-gal syndrome: The tick “transmission” hypothesis. Front Immunol. 13, 1-11 (2022).
  12. Commins, S. P., et al. Delayed anaphylaxis, angioedema, or urticaria after consumption of red meat in patients with IgE antibodies specific for galactose-α-1,3-galactose. J Allergy Clin Immunol. 123 (2), 426-433 (2009).
  13. Commins, S. P., Jerath, M. R., Cox, K., Erickson, L. D., Platts-Mills, T. Delayed anaphylaxis to alpha-gal, an oligosaccharide in mammalian meat. Allergol Int. 65 (1), 16-20 (2016).
  14. Crispell, G., et al. Discovery of alpha-gal-containing antigens in North American tick species believed to induce red meat allergy. Front Immunol. 10, 1056(2019).
  15. Park, Y., et al. Alpha-gal and cross-reactive carbohydrate determinants in the N-glycans of salivary glands in the lone star tick, Amblyomma americanum. Vaccines. 8 (1), 95(2020).
  16. Sharma, S. R., Karim, S. Tick saliva and the alpha-gal syndrome: Finding a needle in a haystack. Front Cell Infect Microbiol. 11, 680264(2021).
  17. Sonenshine, D. E. In biology of ticks. Sonenshine, D. E., Roe, R. M. Vol 1, New York. 51-66 (1991).
  18. Narasimhan, S., et al. Laboratory management of mammalian hosts for Ixodes scapularis host–pathogen interaction studies. Comp Med. 74 (4), 235-245 (2024).
  19. Allan, S. A. Tick rearing and in vitro. feeding. Biology of ticks. Sonenshine, D. E., Roe, R. M. , Oxford University Press. New York. 445-473 (2013).
  20. Costa-Da-Silva, A. L., Carvalho, D. O., Kojin, B. B., Capurro, M. L. Implementation of artificial feeders in hematophagous arthropod research cooperates with the vertebrate animal use replacement, reduction and refinement (3Rs) principle. J Clin Res Bioeth. 5 (2), 1-3 (2014).
  21. Maldonado-Ruiz, L. P., et al. High levels of alpha-gal with large variation in the salivary glands of lone star ticks fed on human blood. Sci Rep. 13 (1), 21409(2023).
  22. Kröber, T., Guerin, P. M. An in vitro. feeding assay to test acaricides for control of hard ticks. Pest Manag Sci. 63 (1), 17-22 (2007).
  23. Stone, B. F., Commins, M. A., Kemp, D. H. Artificial feeding of the Australian paralysis tick, Ixodes holocyclus, and collection of paralysing toxin. Int J Parasitol. 13 (5), 447-454 (1983).
  24. Bonnet, S., Liu, X. Laboratory artificial infection of hard ticks: a tool for the analysis of tick-borne pathogen transmission. Acarologia. 52 (4), 453-464 (2012).
  25. Oliver, J. D., et al. Infection of immature Ixodes scapularis (Acari: Ixodidae.) by membrane feeding. J Med Entomol. 53 (2), 409-415 (2015).
  26. Vimonish, R., et al. Isolation of infectious Theileria parva sporozoites secreted by infected Rhipicephalus appendiculatus ticks into an in vitro. tick feeding system. Parasit Vectors. 14 (1), 616(2021).
  27. Vimonish, R., et al. Quantitative analysis of Anaplasma marginale acquisition and transmission by Dermacentor andersoni fed in vitro. Sci Rep. 10 (1), 470(2020).
  28. Kröber, T., Guerin, P. The tick blood meal: From a living animal or from a silicone membrane. Altex. 24, 39-41 (2007).
  29. Kröber, T., Guerin, P. M. In vitro feeding assays for hard ticks. Trends Parasitol. 23 (9), 445-449 (2007).
  30. Waladde, S. M., Ochieng, S. A., Gichuhi, P. M. Artificial-membrane feeding of the ixodid tick, Rhipicephalus appendiculatus, to repletion. Exp Appl Acarol. 11 (4), 297-306 (1991).
  31. Khoo, B., Cull, B., Oliver, J. D. Tick artificial membrane feeding for Ixodes scapularis. J Vis Exp. (189), e64553(2022).
  32. Krull, C., Böhme, B., Clausen, P. H., Nijhof, A. M. Optimization of an artificial tick feeding assay for Dermacentor reticulatus. Parasit Vectors. 10 (1), 60(2017).
  33. Garcia Guizzo, M., et al. Optimizing tick artificial membrane feeding for Ixodes scapularis. Sci Rep. 13 (1), 16170(2023).
  34. Rochlin, I., et al. Optimization of artificial membrane feeding system for lone star ticks, Amblyomma americanum (Acari: Ixodidae), and experimental infection with Rickettsia amblyommatis (Rickettsiales: Rickettsiaceae). J Med Entomol. 61 (2), 442-453 (2023).
  35. Barré, N., Garris, G., Lorvelec, O. Field sampling of the tick Amblyomma variegatum (Acari: Ixodidae.) on pastures in Guadeloupe: Attraction of CO and/or tick pheromones and conditions of use. Exp Appl Acarol. 21 (2), 95-108 (1997).
  36. Norval, R., Peter, T., Sonenshine, D., Burridge, M. Responses of the ticks Amblyomma hebraeum and A. variegatum. to known or potential components of the aggregation-attachment pheromone. III Aggregation. Exp Appl Acarol. 16 (3), 237-245 (1992).
  37. Park, Y., et al. Alpha-gal and cross-reactive carbohydrate determinants in the N-glycans of salivary glands in the lone star tick, Amblyomma americanum. Vaccines. 8 (1), 1-18 (2020).
  38. Trentelman, J. J., Kleuskens, J. A., Van De Crommert, J., Schetters, T. P. A new method for in vitro feeding of Rhipicephalus australis (formerly Rhipicephalus microplus.) larvae: A valuable tool for tick vaccine development. Parasit Vectors. 10 (1), 153(2017).
  39. Kemp, D. H., Stone, B. F., Binnington, K. C. In physiology of ticks. Obenchain, F. D., Galun, R. , Pergamon. 119-168 (1982).
  40. Yamasaki, Y., Singh, P., Vimonish, R., Ueti, M., Bankhead, T. Development and application of an in vitro. tick feeding system to identify Ixodes tick environment-induced genes of the Lyme disease agent, Borrelia burgdorferi. Pathogens. 13 (6), 1-13 (2024).

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

Ixodid
דם קרציות המזין דרך ממברנה מלאכותית בתא מודפס בתלת-ממד במחקר קרציות איקסודיד
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.