הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר מחקר

השראה לפרופטוזיס בגליומה על ידי קלציאולריוזיד A באמצעות מודולציה של מסלול PI3K/Akt/Nrf2

469 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/69643

⸱

30 בדצמבר 2025

 ,  , 
1Department of Pediatric Surgery, Qilu Hospital of Shandong University, 2Department of Pediatric Surgery, Weifang Peoples Hospital, 3Department of Burn, Weifang Peoples Hospital

במאמר זה

הודעת תיקון

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

סיכום

מחקר זה בוחן את הפוטנציאל הטיפולי של קלצאולריוזיד A בגליומה, ומדגים את יכולתו לעכב אותות PI3K/Akt ולקדם פירוק Nrf2, ובכך לגרום לפרופטוזיס ולדכא התקדמות הגידול הן במבחנה והן בחיים.

תקציר

פרוטוקול זה מדגים את תהליך הניסוי שבו השתמשו לחקר השפעות הקלצאולריוזיד A (CaA) על השראה ווידולציה של פרופטוזיס של מסלול הפוספטידילינוזיטול 3-קינאז (PI3K)/קינאז חלבון B (Akt)/גורם גרעיני אריתרואיד 2-קשור לפקטור 2 (Nrf2) במודלים של גליומה. ההליכים כוללים סדרת בדיקות מבוססות תאים בקווי גליומה אנושיים של U251 ו-U87 להערכת חיוניות, התרבות ורגישות לכימוכיה לאחר טיפול ב-CaA. שינויים הקשורים לפרופטוזיס מוערכים על ידי מדידת סוגי חמצן פעילים (ROS), גלוטתיון (GSH), מלונדיאלדהיד (MDA) ורמות ברזל גמישות, יחד עם ביטוי חלבונים הקשורים לפרופטוזיס כגון גלוטתיון פרוקסידאז 4 (GPX4), תת-יחידת אנטיפורטר ציסטאין/גלוטמט (xCT), ופריטין באמצעות ווסטרן בלוט. כדי להעריך את מעורבות המסלול, הפרוטוקול מפרט בדיקות qRT-PCR, ווסטרן בלוט ואימונופרציפיטציה לביטוי Nrf2 ויוביקוויטינציה. ניסויי ביטוי יתר של Nrf2 נכללים כדי לאשר את תפקידו בוויסות הפרופטוזיס. הפרוטוקול מדגים בנוסף את השימוש במודל זנוגרפט של עכבר, שבו תאי U87 מושתלים תת-עורית, ולאחר מכן מתן CaA תוך-פריטוניאלי להערכת גדילה ורעילות גידול בגוף בחיים. ניתוח היסטולוגי של האיברים המרכזיים מתבצע להערכת בטיחות מערכתית. בנוסף, עגינה מולקולרית משמשת לחיזוי קישור ישיר בין CaA לתת-היחידה PI3K p110α (PIK3CA). יחד, פרוצדורות אלו מספקות מסגרת ניתנת לשחזור לבחינת מנגנוני הפרופטוזיס והיעילות הטיפולית של תרכובות טבעיות במחקר גליומה.

מבוא

גליומות, במיוחד גליובלסטומות בדרגה גבוהה, מייצגות אחת הצורות הקטלניות ביותר של גידולי מוח, המאופיינים בהתרבות מהירה, עמידות לטיפול ותחזית לקויה1. בשנים האחרונות נחקרו תרופות אנטי-גליומות שונות, כולל כימותרפיה מסורתית כמו טמוזולומיד ומגוון תרכובות טבעיות כגון כורכומין2, רסברטרול3 ואפיגלוקטכין גאלאט4. סוכנים אלו מפעילים את השפעתם באמצעות מנגנונים רבים, כולל השראת אפופטוזיס, עיכוב אנגיוגנזה וויסות מסלולי לחץ חמצוני. עם זאת, רבות מהתרכובות הללו מתמודדות עם מגבלות כמו זמינות ביולוגית לקויה או אפיון מכני לא שלם. דבר זה מדגיש את הצורך הקריטי במתודולוגיות מקיפות שלא רק מאשרות פעילות אנטי-גידולית אלא גם מנתחות באופן שיטתי את המנגנונים הפרמקולוגיים הבסיסיים. הקמת זרימות עבודה מכניות כאלה חשובה במיוחד להאצת פיתוח תרכובות אנטי-גליומה חדשניות מהגילוי ועד לאימות קדם-קליני.

כדי לתמוך במטרה זו, מספר הולך וגדל של מחקרים משלבים כיום כלים חישוביים וניסויים מתקדמים לשיפור הרזולוציה המכניסטית 5,6. מודלים של עיצוב תרופות מבוססי מבנה ובינה מלאכותית (AI) – כגון AlphaFold3 ועגינה מולקולרית – מאפשרים זיהוי אינטראקציות מבטיחות בין תרופות למטרות במהירות ודיוק חסרי תקדים. כלים אלו משלימים שיטות ניסוי על ידי חיזוי זיקות קישור וזיהוי מטרות מולקולריות פוטנציאליות לפני אימות מעבדתי. במקביל, הופעת בדיקות פונקציונליות מבוססות מסלול, הדמיית תאים חיים וטכניקות פרוטאומיות ברזולוציה גבוהה מאפשרות לחוקרים להעריך את ההשפעה התאית של תרכובות חדשות על פני צירי רגולציה מרובים, כולל תגובות לחץ חמצוני, מפלי העברת אותות ומודאליות מוות תאית כגון פרופטוזיס 9,10,11.

מבין מסלולי האיתות המעורבים בביולוגיית גליומה, מסלולי פוספטידילינוזיטול 3-קינאז (PI3K)/קינאז חלבון B (Akt) וגורם גרעיני אריתרואיד 2-קשור לפקטור 2 (Nrf2) מעניינים במיוחד בשל תפקידם בצמיחת גידול, הומאוסטזיס רדוקס ועמידות לטיפול12,13. איתות PI3K/Akt מקדם הישרדות, התרבות והסתגלות מטבולית בתאי גליומה, בעוד ש-Nrf2 פועל כרגולטור ראשי של תגובת נוגדי החמצון, ומדכא מוות תאי פרופטוטי14. הפעלה מתמשכת של מסלולים אלו תורמת להתחמקות מטיפול, מה שהופך אותם למטרות אטרקטיביות להתערבות פרמקולוגית15. שיטות קונבנציונליות לחקירת מסלולים כוללות ווסטרן בלוטינג לחלבונים מלאים וחלבונים מפוספורילטים, וכן qRT-PCR לניתוח ביטוי גנים. עם זאת, ניתוח מעמיק של איתות Nrf2 דורש בדיקות נוספות שמעריכות יציבות חלבונים, טרנסלוקציה גרעינית ושינויים פוסט-תרגומיים כגון יוביקוויטינציה. אסטרטגיות הגילוי הרב-ממדיות הללו חיוניות להבנת האופן שבו תרכובות ספציפיות משבשות או מחזקות את ויסות החמצן האדום ואת הבקרה הפרופטוטית.

קלציאולריוזיד A (CaA), נגזרת חומצה הידרוקסיצינמית, מציע מנגנון כפול על ידי עיכוב איתות PI3K/Akt ומקדם פירוק פרוטאזומי של Nrf2, ובכך מגביר את הרגישות הפרופטוטית. אסטרטגיית המטרה הכפולה הזו עשויה לשפר את השכפול והעומק המכני לעומת חומרים קיימים כמו ארסטין או RSL3, הפועלים בהמשך להגנות נוגדי חמצון. פרוטוקול זה מציג גישה ניסיונית משולבת לחקר המנגנון הפרמקולוגי של CaA, הכוללת עגינה מולקולרית לזיהוי אתרי קישור PI3K, אימונובלוטציה ואימונופרציפיטציה לזיהוי ביטוי Nrf2 ואוביקוויטינציה, וסמני פרופטוזיס כגון מיני חמצן תגובתי (ROS), גלוטתיון (GSH) ומלונדיאלדהיד (MDA). יתרה מזאת, מודל עכבר זנוגרפט משמש להערכת היעילות הטיפולית והבטיחות המערכתית של CaA. תהליך עבודה מקיף זה מספק פלטפורמה ניתנת לשחזור ומידע לחקר מנגנון הפעולה של תרופות אנטי-סרטן, עם דגש על שילוב מודולציה של מסלולי האות וויסות מוות תאים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

תרבית תאים וטיפול
תאי עצב HT22 של עכברים וקווי תאי גליומה אנושית U87 ו-U251 גודלו במדיום Modified Eagle של Dulbecco, עם תוספת של 10% סרום בקר עוברי ו-4 מ"מ L-גלוטמין, בתנאים לחים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO₂. כדי לייעל את העקביות הניסויית, כל הטיפולים בתאים תוקנו ותוארו כאן. סעיף זה מפרט את התנאים הספציפיים שבהם נעשה שימוש בכל קבוצת טיפול ואת הבדיקות המתאימות במורד הזרם.

טיפול ב-CaA:
תאי HT22 טופלו בריכוזים הולכים וגדלים של CaA (0, 0.1, 0.5, 1, 1, 10, 50, 100, 250 ו-500 מיקרומון) במשך 72 שעות. תאי גליומה U87 ו-U251 טופלו ב-CaA בריכוזים של 5, 20 או 50 מיקרומולר במשך 24 שעות ברוב הניסויים, או ב-50 מיקרומום ל-0, 6, 12 או 18 שעות למחקרי מסלול זמן. טיפולים אלו שימשו בניתוחים הבאים: ווסטרן בלוטינג עבור תת-יחידת אנטיפורטר ציסטאין/גלוטמט (xCT), גלוטתיון פרוקסידאז 4 (GPX4), פריטין (FTH1), גלוטמינאז, ו-PI3K/Akt/מטרה יונקית של רפמיצין (mTOR)/ גורם התחלה אאוקריוטי 4B (EIF4B) (רמות כוללות ומזורחנות); תגובת שרשרת פולימראז כמותית בזמן אמת (RT-qPCR) עבור Nrf2 וחלבון ECH דמוי קלך 1 (Keap1); מדידת ROS באמצעות דיאצטט 2′,7′-דיכלורודיהידרופלואורסצאין (DCFH-DA); כימות GSH ו-MDA; זיהוי Fe2+ מבוסס FerroOrange; בדיקת התרבות 5-אתיניל-2′-דאוקסיאורידין (EdU); בדיקת היווצרות מושבה; בדיקת עמידות תאי 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT).

טיפול משותף בליפרוקסטטין-1 (Lip1):
התאים עברו טיפול מוקדם ב-50 ננומטר Lip1 במשך 2 שעות לפני הוספת 50 מיקרומום CaA. תנאים אלו שימשו בבדיקת MTT (0, 24, 48, 72 שעות); בדיקת היווצרות מושבה; בדיקת EdU; בדיקת אפופטוזיס Annexin V/PI (עם/בלי ציספלטין של 20 ננומטר).

טיפול משותף ב-MG132:
התאים טופלו ב-10 מיקרומום MG132 בלבד או שולבו עם 50 מיקרומום CaA למשך 24 שעות. זה יושם על ווסטרן בלוטינג לייצוב חלבון Nrf2 (כולל וגרעיני); בדיקות אימונופרסיפיטציה (IP) עבור Nrf2 ו-Keap1 מאוביקוויטינים.

טיפול משותף בציספלטין:
התאים טופלו בציספלטין של 20 ננומטר בלבד או בשילוב עם 20 מיקרומום CaA למשך 24 שעות. טיפולים אלו שימשו בבדיקת אפופטוזיס של Annexin V/Propidium yodide (PI).

הבעה מופרזת של Nrf2:
התאים עברו טרנספקציה עם פלסמיד של 2.5 מיקרוגרם Nrf2 או וקטור ריק באמצעות חומר טרנספקציה למשך 18 שעות, ולאחר מכן טופלו ב-50 מיקרומום CaA למשך 24 שעות. תנאי זה שימש בבלוט מערבי עבור xCT, GPX4, FTH1 וגלוטמינאז; בדיקות ROS, MDA, GSH; צביעת FerroOrange לברזל תוך-תאי.

דיאגרמת זרימת עבודה (איור משלים S1) מסכמת את תנאי הניסוי לעיל ואת הניתוחים המתאימים. איור זה מקשר חזותית כל פרוטוקול טיפול למבחנים הספציפיים שלו במורד הזרם לשיפור הבהירות והשחזור.

הערכת כחיות התאים
חיוניות התאים הוערכה באמצעות שיטת הקולורימטריה הקונבנציונלית של MTT כפי שתוארה קודם16. תאי HT22, U251 ו-U87 הועברו לפלטות תרבית של 96 בארות ודגרו במהלך הלילה כדי לאפשר היצמדות. לאחר סיום תקופת הטיפול, הוזנו 15 מיקרוליטר של תמיסת MTT לכל באר והלוחות דגרו במשך 4 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. המדיום נזרק, והוספו 150 מיקרוליטר דימתיל סולפוקסיד (DMSO) כדי להמיס את גבישי הפורמזן שנוצרו. הספיגה נרשמה לאחר מכן ב-490 ננומטר באמצעות קורא מיקרופלט. ערכי ספיגה גבוהים יותר מצביעים על חיוניות תא גבוהה יותר, בעוד שהפחתה בספיגה מרמזת על השפעות ציטוטוקסיות.

בדיקת התאגדות ב-EdU
להערכת סינתזת DNA והתרבות תאים, בוצעו בדיקות שילוב EdU באמצעות ערכת הדמיה של EdU כפי שתוארה קודם17. בקצרה, תאי הגליומה U251 ו-U87 הוזרעו בלוחות של 24 בארות. לאחר הטיפול, התאים דוגרו עם EdU (ריכוז סופי של 10 מיקרומטר) וגודלו במשך 24 שעות נוספות. לאחר שלב הדגירה, התאים תוקנו באמצעות 4% פאראפורמלדהיד ולאחר מכן חדרו ב-0.5% טריטון X-100., וצבועו לפי הוראות הערכה. אחוז התאים החיוביים ל-EdU (תאים מתרבים) נמדד במיקרוסקופ פלואורסצנטי וננורמל לסך הגרעינים המוצבעים 4′,6 דיאמידינו-2-פנילינדול (DAPI).

בדיקת היווצרות מושבות
לבדיקת יצירת המושבות, תאי הגליומה U251 ו-U87 צויפו בצלחות בגודל 3.5 ס"מ בצפיפות נמוכה (500 תאים לצלחת). לאחר הטיפול, מדיום התרבית הוחלף במדיום טרי וללא תרופות, והתאים נשמרו עוד 14 ימים כדי לאפשר יצירת מושבה, עם החלפת מדיום כל שלושה ימים. המושבות שנוצרו תוקנו לאחר מכן באמצעות 4% פאראפורמלדהיד, צובעו ב-0.1% קריסטל סגול, ונספרו ידנית תחת מיקרוסקופ. אשכולות בקוטר מעל 75 מיקרון סווגו כקולוניות. כל ניסוי בוצע בשלושה עותקים וחזר על עצמו שלוש פעמים. בדיקה זו התבצעה לפי פרוטוקולים מקובלים להערכת קיבולת רבייה ארוכת טווח18. המושבות צריכות להיראות כאשכולות צפופים ועגולים; פחות ויותר מושבות קטנות מצביעות על קיבולת הפצה מופחתת.

הערכת אפופטוזיס תאים
מוות תאי אפופטוטי הוערך באמצעות ערכת זיהוי אפופטוזיס FITC-Annexin V כפי שתוארה קודם16. תאי גליומה U87 ו-U251 טופלו בציספלטין של 20 ננומטר בנוכחות או בהיעדר 20 מיקרומום CaA במשך 24 שעות לפני הצביעה. לניסויים שכללו עיכוב פרופטוזיס, התאים טופלו מראש ב-50 ננומטר Lip1 למשך 2 שעות, ולאחר מכן טיפול משותף ב-20 מיקרומום CaA ו-20 ננומטר ציספלטין למשך 24 שעות נוספות. לאחר הטיפולים הנדרשים, התאים נקטפו (300 × גרם, 5 דקות) וצבועו ב-Annexin V-FITC ו-PI בהתאם להוראות היצרן. לאחר הסימון, נבדקו דגימות על ציטומטר זרימה. רכישת הנתונים בוצעה באמצעות ערוצי FL1 (FITC) ו-FL2 (PI), עם הגדרות פיצוי שהוחלו כדי למזער חפיפה ספקטרלית. היחס של תאי אנקסין V-חיוביים חושב לאחר מכן כדי לקבוע את דרגת האפופטוזיס.

ניתוח כתמים מערביים
ה-western blating בוצע לפי נהלים מוכרים19,20. בקצרה, לאחר הטיפולים המיומנים, התאים עברו ליזציה בבופר RIPA המכיל מעכבי פרוטאז ופוספטאז, ורמות החלבון נקבעו באמצעות מבחן ברדפורד. לניסויים שהעריכו את התפלגות התת-תאית של Nrf2, הופקו חלבונים גרעיניים וציטופלזמיים באמצעות ערכת חילוץ גרעינית מסחרית לפי הוראות היצרן.

סך הכל 40 מיקרוגרם חלבון מכל דגימה נפתרו על ג'ל SDS-PAGE של 10% והועברו לאחר מכן לממברנות PVDF. הממברנות נחסמו עם חלב דל שומן 5% שהוכן ב-PBST (PBS עם 0.1% Tween-20) למשך שעה בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן דגירה לילית עם נוגדנים ראשוניים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. לאחר השטיפה, הוחלו נוגדנים משניים מצומדים ל-HRP (1:5,000) למשך שעה אחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, והאותות זוהו באמצעות מערכת כימילומינציה מוגברת (ECL).

רמות הביטוי של xCT, גלוטמינאז, GPX4 ו-FTH1 נמדדו, תוך שימוש בגליצראלדהיד-3-פוספט דה-הידרוגנאז (GAPDH) כבקרת עומס. חלבונים מזרחנים (p-PI3K, p-Akt, p-mTOR ו-p-EIF4B) הוערכו ביחס לרמות החלבון הכוללות שלהם, בעוד שהחלבונים הכוללים נורמליזציה מול GAPDH. ה-Nrf2 הגרעיני נורמל ל-Lamin B. התוצאות הצפויות כוללות ירידה תלויה במינון ובזמן ב-Nrf2 וב-p-PI3K/Akt/mTOR/EIF4B, וירידה ברגולציה של סמנים הקשורים לפרופטוזיס בתאים שטופלו ב-CaA.

לבדיקות יוביקוויטינציה, התאים טופלו ב-MG132 (10 מיקרומון) עם או בלי CaA (50 מיקרומון) למשך 24 שעות. לאחר הליזה, קומפלקסי חלבונים עברו אימונופרסיציפט באמצעות נוגדנים אנטי-Nrf2 או אנטי-Keap1; IgG ארנב רגיל שימש כבקרה שלילית. האימונופרציפיטטים נבדקו לאחר מכן בנוגדנים אנטי-יוביקוויטין לזיהוי צורות יוביקוויטיניות, בעוד שנבדקו גם ליזטים כוללים לרמות Nrf2 ורמות של חלבון ECH 1 (Keap1) שקשור ל-Kelch-like Kelch כדי לאשר קלט.

חילוץ RNA ו-PCR כמותי בזמן אמת (qRT-PCR)
חילוץ RNA ו-qRT-PCR בוצעו בהתאם לפרוטוקולים סטנדרטיים21. בקצרה, תאי גליומה U87 ו-U251 טופלו עם או בלי 50 מיקרומום CaA למשך תקופות שונות (6 ו-18 שעות). סך ה-RNA בודד והומר ל-cDNA באמצעות שעתוק הפוך. PCR כמותי בזמן אמת (qRT-PCR) בוצע באמצעות SYBR Green qPCR Master Mix על פלטפורמת PCR בזמן אמת. ביטוי הגנים היחסי נקבע באמצעות חישוב 2-ΔΔCt. רצפי הפריימרים ששימשו ל-Nrf2, Keap1 וגן הניקיון GAPDH היו כדלקמן:

Nrf2 קדימה, 5′-CACATCCAGTCAGAAACCAGTGG-3′;
Nrf2 הפוך, 5′-GGAATGTCTGCGCCAAAAGCTG-3′

Keap1 קדימה, 5′-CAACTTCGCTGAGCAGATGGC-3′;
Keap1 הפוך, 5′-TGATGAGGTCACCAGGTTGGCA-3′

GAPDH קדימה, 5′-CGGAGTCAACGGATGTGTCG-3′;
GAPDH הפוך, 5′-AGCCTTCTACATGGTGGTGAAGAC-3′

טרנסדוקציה של Nrf2
תאי גליומה U251 ו-U87 עברו טרנסיפקט זמני עם פלסמיד הבעה מופרזת של Nrf2 או וקטור בקרה ריק תואם באמצעות תגובת טרנספקציה מבוססת שומן; ההליך התבסס על שיטות טרנספקציה חולפות קונבנציונליות22. בקצרה, תאים נזרעו בלוחות של 6 בארות בצפיפות של 3 × 10⁵ תאים לבאר ונתרבו במהלך הלילה כדי להגיע לכ-70-80% מפגש בזמן הטרנספקציה. לכל באר, 2.5 מיקרוגרם DNA פלסמיד דוללו ב-125 מיקרוליטר של תווך סרום מופחת וערבבו עם 5 מיקרו-ליטר של תגובת הטרנספקציה. בנפרד, 3.75 מיקרוליטר ממגיב הטרנספקציה דולל ב-125 מיקרוליטר נוספים של מדיום הסרום המופחת. תערובות ה-DNA והתגובה המדוללת שולבו, ערבבו בעדינות ודגרו במשך 10-15 דקות בטמפרטורת החדר כדי לאפשר היווצרות מורכבות. קומפלקסי הטרנספקציה שהתקבלו (נפח כולל 250 מיקרוליטר) נוספו בטיפה לכל באר המכיל תאים במדיום מלא וטרי.

לאחר 18 שעות של דגירה בטמפרטורה של 37°C באינקובטור CO₂, מדיום הטרנספקציה הוחלף במדיום תרבית טרי. התאים עברו בדיקות נוספות, כולל Western Blotting, ניתוח ROS, כימות MDA/GSH ומחקרי הצטברות ברזל. פרוטוקול זה פועל לפי נהלי ביטוי גנים זמניים מקובלים ומאפשר ביטוי עמיד של Nrf2 בתוך 24-48 שעות לאחר הטרנספקציה.

מדידת ברזל תוך-תאי
רמות Fe2+ תוך-תאיות נמדדו באמצעות האינדיקטור הפלואורסצנטי FerroOrange. בקיצור, תאי הגליומה U251 ו-U87 נזרעו בלוחות של 24 בארות וטופלו בריכוזים משתנים של CaA (5, 20 ו-50 מיקרומון). כדי להעריך את השפעת ביטוי יתר של Nrf2 על פרופטוזיס, תאי U87 ו-U251 עברו טרנספקציה עם פלסמיד ביטוי Nrf2 או וקטור ריק. לאחר 18 שעות, המדיום הוחלף, והתאים טופלו ב-50 מיקרומום CaA למשך 24 שעות. לאחר מכן, התאים נחשפו ל-1 מיקרומום פרואורנג' בתווך ללא סרום ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לפני הניתוח. לאחר הדגירה, התאים נשטפו ונצפו תחת מיקרוסקופ פלואורסצנציה, באמצעות מסנן TRITC (עירור ~543 ננומטר, פליטה 560-600 ננומטר), כאשר עוצמת פלואורסצנציה כתומה מוגברת מצביעה על רמות גבוהות יותר של Fe2+ גמיש, בדרך כלל ממוקדות בציטופלזמה. שיטה זו הותאמה מבדיקות ברזל מבוססות גלאי פלואורסצנטי מבוססות23.

מדידת GSH ו-MDA
רמות GSH ו-MDA תוך-תאיות נקבעו בהתאם לפרוטוקולי הערכה סטנדרטיים להערכת סטרס חמצוני24. בקיצור, תאי הגליומה U251 ו-U87 נזרעו בלוחות של 24 בארות וטופלו בריכוזים משתנים של CaA (5, 20 ו-50 מיקרומון). כדי להעריך את השפעת ביטוי יתר של Nrf2 על פרופטוזיס, תאי U87 ו-U251 עברו טרנספקציה עם פלסמיד ביטוי Nrf2 או וקטור ריק. לאחר 18 שעות, התווך הוחלף והתאים טופלו ב-50 מיקרומום CaA למשך 24 שעות. בהמשך, תאים נבדקו בבופר RIPA, וריכוזי החלבון הכוללים נמדדו באמצעות ערכת כימות חלבון BCA. תכולת GSH ו-MDA נותחה לאחר מכן באמצעות ערכות גילוי מסחריות בהתאם לפרוטוקולי היצרנים.

מבחן ROS
יצירת ROS תוך-תאית הוערכה באמצעות הגלאי הפלואורסצנטי DCFH-DA בהתאם לפרוטוקולים25 שנקבעו. בקיצור, תאי הגליומה U251 ו-U87 נזרעו בלוחות של 24 בארות וטופלו בריכוזים משתנים של CaA (5, 20 ו-50 מיקרומון). כדי להעריך את השפעת ביטוי יתר של Nrf2 על פרופטוזיס, תאי U87 ו-U251 עברו טרנספקציה עם פלסמיד ביטוי Nrf2 או וקטור ריק. לאחר 18 שעות, התווך הוחלף והתאים טופלו ב-50 מיקרומום CaA למשך 24 שעות. לאחר מכן, תאים טופלו ב-5 מיקרומום DCFH-DA בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה, ולאחר מכן שטיפות PBS להסרת צבע עודף. אותות פלואורסצנציה הוצגו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנציה הפוך, מצויד במסנן FITC (עירור 488 ננומטר, פליטה 525 ננומטר), ותמונות צולמו לניתוח. עוצמת הפלואורסצנציה הירוקה מוגברת לרמות ROS תוך-תאיות גבוהות.

ניסויים בבעלי חיים
כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להמלצות במדריך לטיפול ושימוש בבעלי חיים במעבדה של המכונים הלאומיים לבריאות. הפרוטוקול אושר על ידי ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים מוסדית של בית החולים וייפאנג לפי מספר אישור [2025SDL579]. כדי ליצור את מודל הגזע של גליומה, 2 ×-106 תאי U87 הושמו מחדש ב-0.2 מ"ל של PBS והוחזקו תת-עורית לצד שמאל של עכברי BALB/c עירומים זכרים בני 4 שבועות. לאחר שאפשרו לגידולים להתפתח במשך 7 ימים, העכברים חולקו באקראי לשלוש קבוצות (n = 8 לקבוצה): קבוצת ביקורת לא מטופלת, מטופלת ב-CaA (2.5 מ"ג/ק"ג), ו-CaA (2.5 מ"ג/ק"ג) בשילוב עם Lip1 (10 מ"ג/ק"ג). הטיפולים ניתנו באמצעות הזרקה תוך-פריטוניאלית יומית במשך 14 ימים רצופים. ממדי הגידול נמדדו כל 3 ימים באמצעות קליפרים, והנפחים חושבו לפי הנוסחה: נפח = (אורך × רוחב²) / 2. ביום ה-21, כל העכברים הושמתו, והגידולים נכרתו וצולמו לניתוח נוסף.

ריצוף RNA וניתוח מסלולי KEGG
בוצע ריצוף RNA כדי לפרופיל שינויים בתעתוק לאחר חשיפה ל-CaA. שלמות ה-RNA אושרה באמצעות ספקטרופוטומטר מיקרו-ווליום UV-VIS ומערכת אלקטרופורזה מבוססת נימים לפני הריצוף בפלטפורמת Illumina. קריאות נקיות מופו לגנום הייחוס האנושי (GRCh38) באמצעות HISAT2, והביטוי הגנטי נמדד כ-FPKM. גנים המובעים באופן שונה זוהו באמצעות DESeq2 (FDR < 0.05, |log₂FC| ≥ 1), וההעשרה התפקודית הוערכה באמצעות ניתוח מסלול KEGG (התאמה של P < 0.05).

ניתוח עגינה מולקולרית
עגינה מולקולרית שימשה לחיזוי האינטראקציה בין CaA לנתיב PI3K/Akt. מבנה הגביש של תת-היחידה הקטליטית האנושית PI3K p110α (PIK3CA) התקבל מבנק נתוני חלבונים (PDB ID: 8BFU). המבנה של CaA נלקח מ-PubChem ומזעורר אנרגיה באמצעות תוכנת מידול מולקולרי. באמצעות תוכנת הכנת עגינה מולקולרית, כל מולקולות המים והליגנדים הלא-חיוניים הוסרו ממבנה PIK3CA, והוספו אטומי מימן. רשת עגינה הוגדרה סביב האתר הפעיל של PIK3CA (בהתבסס על קואורדינטות אתר קישור ידועות), ואלגוריתם עגינה שימש לביצוע העגינה. תנוחות הקישור עם הציון הגבוה ביותר של CaA נבחרו לפי זיקת הקישור (kcal/mol) ונבדקו לאינטראקציות מפתח. אינטראקציות חלבון-ליגנד, כגון קשרי מימן ומגעים הידרופוביים, הוצגו באמצעות תוכנת הדמיה מולקולרית וכלי מיפוי אינטראקציה דו-ממדית.

בטיחות וסילוק פסולת
כל הניסויים שכללו תגובות כימיות כגון DMSO, צבעים פלואורסצנטיים (DCFH-DA, FerroOrange) ומקבעים בוצעו במכסה אדים עם ציוד מגן אישי (PPE) מתאים, כולל כפפות ומשקפי בטיחות. DMSO וגשושי פלואורסצנטיים טופלו בזהירות בשל יכולתם לחדור לעור ופוטנציאל לציטוטוקסיות. חומרים מזוהמים, כולל קצות פיפטה, לוחות תרבית וכפפות, הושלכו במיכלי פסולת מסוכנים ייעודיים. רקמות וגופות בעלי חיים טופלו כפסולת ביולוגית מסוכנת ונשרפו או הושמדו על ידי תקנות בטיחות ביולוגית מוסדיות והנחיות סביבתיות מקומיות.

ניתוח סטטיסטי
כל התוצאות מוצגות כסטיית תקן ממוצעת ± (SD). ההבדלים בין שתי קבוצות הוערכו באמצעות מבחן t דו-זנבי לסטודנטים. בניתוחים שכללו מספר קבוצות, הוחל ANOVA חד-כיווני ואחריו השוואות לאחר מכן מתאימות (כמו מבחן טוקי). ערך p מתחת ל-0.05 נחשב כאינדיקטור למשמעות סטטיסטית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

דיכוי רבייה והגברת הרגישות הכימוכיאלית של תאי U251 ו-U87 במבחנה על ידי CaA
איור 1A ממחיש את מבנה CaA. תחילה הערכנו את ההשפעות הציטוטוקסיות של CaA באמצעות בדיקת MTT על תאי עצב HT22 רגילים בעכברים ותאי גליומה אנושיים U251 ו-U87. בהשוואה לתאים לא מטופלים (0 מיקרומום CaA), ל-CaA הייתה השפעה מינימלית על חיוניות תאי HT22 בריכוזים מתחת ל-100 מיקרומולר לאורך 72 שעות (איור 1B). עם זאת, טיפול ב-250 מיקרומום ו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

CaA מציג אפקט אנטי-גידולי מרשים בגליובלסטומה על ידי ויסות ייחודי של שני צירי הישרדות קריטיים: מסלול PI3K/Akt/mTOR ומנגנון ההגנה של Nrf2-פרופטוזיס. מסלול PI3K/Akt לעיתים קרובות מופראקטיבי בגליובלסטומה מולטיפורמה (GBM, משתנה עד ~88-90% מהמקרים) עקב אובדן PTEN או הפעלה של RTK, מה שמניע התרבות והתנגדות לטיפול26. עם זאת, מיקוד במסלול זה בלבד הניב אפופטוזיס מוגבל ב-GBM, שכן גידולים לעיתים בורחים מעיכוב PI3K באמצעות מנגנונים ציטוסטטיים או פיצויים26

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Agilent 2100 Bioanalyzerמערכת אלקטרופורזה מבוססת נימי
Annexin V-FITC Apoptosis KitRoche Diagnostics11858777001N/A
AutoDock Tools 1.5.7 (AutoDock Vina)תוכנת הכנה לעגינה מולקולרית (אלגוריתם עגינה)
Calceolarioside A (CaA)Sigma-AldrichSMB00246N/A
Chem3Dתוכנת מודלים מולקולריים
cDNA Synthesis KitVazyme BiotechR223N/A
DCFH-DASigma-AldrichD6883N/A
DMEMThermo Fisher Scientific11965092N/A
DMSOMerckD8418N/A
FerroOrange probeDojindoF374N/A
Fetal Bovine Serum (FBS)Sigma-AldrichF2442N/A
Flow cytometerBD BiosciencesFACSAriaIII Flow Cytometryמכשיר לניתוח תאים צבועים באנקסין V
Fluorescence microscopeOlympusIX73מכשיר לתצפית על פלואורסצנציה של FerroOrange ו-DCFH-DA
FTH1 antibodyAbcamab75973AB_1310150
GAPDH antibodyAbcamab8245AB_2107448
GLS antibodyAbcamab93434AB_10563527
GPX4 antibodyAbcamab125066AB_10972289
HT22 murine neuronal cell lineAddexBioC0011008CVCL_0321
jetPRIME transfection reagentPolyplus-transfection114-07חומר עגינה מבוסס פולימר
Keap1 antibodyAbcamab139729AB_2732852
L-Glutamine (200 mM)Thermo Fisher Scientific25030081N/A
LigPlot+כלי מפת תקשורת דו-ממדית
Lipofectamine 3000Thermo Fisher Scientificחומר עגינה מבוסס ליפידים
Liproxstatin-1SelleckS7699N/A
MG132SelleckS2619N/A
Microplate readerThermo Fisher ScientificH1Mמכשיר למדידת ספיגה במבחן MTT (ב-490 ננומטר)
MTTSigma-AldrichM5655N/A
NanoDropספקטרופוטומטר UV-Vis מיקרו-נפח
Nrf2 antibodyAbcamab62352AB_945626
Nude BALB/c miceVital River, ChinaN/AIMSR_CRL:028
OptiMeM reduced serum medium
PyMOLתוכנת הדמיה מולקולרית
QuantStudio 5 Real-Time PCR System
SYBR Green Master MixVazyme BiotechQ711N/A
TRIzol ReagentThermo Fisher15596026N/A
U251 human glioma cell lineCLS Cell Lines Service300385CVCL_0021
U87 human glioma cell lineATCCHTB-14CVCL_0022
Ubiquitin antibodyAbcamab7780AB_306981
xCT/SLC7A11 antibodyAbcamab175186AB_2715513

מקורות

  1. Bajwa, M. H., Anis, S. B., Yousaf, I., Shah, M. A. A 10-year survival-trend analysis of low-grade glioma and treatment patterns from an LMIC. Asian J Neurosurg. 18 (3), 533-538 (2023).
  2. Su, X., Chen, S., Lu, H., Li, H., Qin, C. Study on the inhibitory effect of curcumin on GBM and its potential mechanism. Drug Des Devel Ther. 15 (1), 2769-2781 (2021).
  3. Karkon-Shayan, S., et al. Resveratrol as an antitumor agent for glioblastoma multiforme: targeting resistance and promoting apoptotic cell deaths. Acta Histochem. 125 (6), 152058(2023).
  4. Kuduvalli, S. S., et al. A combination of metformin and epigallocatechin gallate potentiates glioma chemotherapy in vivo. Front Pharmacol. 14 (1), 1096614(2023).
  5. Abdul Raheem, A. K., Dhannoon, B. N. Automating drug discovery using machine learning. Curr Drug Discov Technol. 20 (6), 79-86 (2023).
  6. Yang, J., et al. Automating biomedical literature review for rapid drug discovery: leveraging GPT-4 to expedite pandemic response. Int J Med Inform. 189 (1), 105500(2024).
  7. Jumper, J., et al. Highly accurate protein structure prediction with AlphaFold. Nature. 596 (7873), 583-589 (2021).
  8. Desai, D., et al. Review of AlphaFold 3: transformative advances in drug design and therapeutics. Cureus. 16 (7), e63646(2024).
  9. Reinis, J., Reicher, A. Monitoring subcellular protein localization at scale in live cells. Nat Rev Mol Cell Biol. 25 (9), 673(2024).
  10. Kwon, Y. W., et al. Application of proteomics in cancer: recent trends and approaches for biomarkers discovery. Front Med (Lausanne). 8 (1), 747333(2021).
  11. Wang, X., Liu, Z., Ma, L., Yu, H. Ferroptosis and its emerging role in tumor. Biophys Rep. 7 (4), 280-294 (2021).
  12. Glaviano, A., et al. PI3K/AKT/mTOR signaling transduction pathway and targeted therapies in cancer. Mol Cancer. 22 (1), 138(2023).
  13. Hoxhaj, G., Manning, B. D. The PI3K-AKT network at the interface of oncogenic signalling and cancer metabolism. Nat Rev Cancer. 20 (2), 74-88 (2020).
  14. Liu, Y., et al. Protein kinase B (PKB/AKT) protects IDH-mutated glioma from ferroptosis via Nrf2. Clin Cancer Res. 29 (7), 1305-1316 (2023).
  15. Su, H., Peng, C., Liu, Y. Regulation of ferroptosis by PI3K/Akt signaling pathway: a promising therapeutic axis in cancer. Front Cell Dev Biol. 12 (1), 1372330(2024).
  16. Song, L., Li, D., Gu, Y., Li, X., Peng, L. Let-7a modulates particulate matter (≤2.5 µm)-induced oxidative stress and injury in human airway epithelial cells by targeting arginase 2. J Appl Toxicol. 36 (10), 1302-1310 (2016).
  17. Liu, H., et al. Activation of PI3K/Akt pathway by G protein-coupled receptor 37 promotes resistance to cisplatin-induced apoptosis in non-small cell lung cancer. Cancer Med. 12 (19), 19777-19793 (2023).
  18. Song, L., et al. miR-144-5p enhances the radiosensitivity of non-small-cell lung cancer cells via targeting ATF2. Biomed Res Int. 2018 (1), 5109497(2018).
  19. Song, L., et al. The Legionella effector SdjA is a bifunctional enzyme that distinctly regulates phosphoribosyl ubiquitination. mBio. 12 (5), e0231621(2021).
  20. Luo, J., et al. Acinetobacter baumannii kills fungi via a type VI DNase effector. mBio. 14 (1), e0342022(2023).
  21. Liu, K., et al. Trim27 aggravates airway inflammation and oxidative stress in asthmatic mice via potentiating the NLRP3 inflammasome. Int Immunopharmacol. 134 (1), 112199(2024).
  22. Song, L., et al. Legionella pneumophila regulates host cell motility by targeting Phldb2 with a 14-3-3ζ-dependent protease effector. Elife. 11 (1), e73220(2022).
  23. Gao, Z., Jiang, J., Hou, L., Ji, F. Lysionotin induces ferroptosis to suppress development of colorectal cancer via promoting Nrf2 degradation. Oxid Med Cell Longev. 2022 (1), 1366957(2022).
  24. Bai, X., et al. Maackiain protects against sepsis via activating AMPK/Nrf2/HO-1 pathway. Int Immunopharmacol. 108 (1), 108710(2022).
  25. Zhu, Y., et al. The protective role of zingerone in a murine asthma model via activation of the AMPK/Nrf2/HO-1 pathway. Food Funct. 12 (7), 3120-3131 (2021).
  26. Brennan, C. W., et al. The somatic genomic landscape of glioblastoma. Cell. 155 (2), 462-477 (2013).
  27. Dodson, M., Castro-Portuguez, R., Zhang, D. D. NRF2 plays a critical role in mitigating lipid peroxidation and ferroptosis. Redox Biol. 23 (1), 101107(2019).
  28. Cahuzac, K. M., et al. AKT activation because of PTEN loss upregulates xCT via GSK3β/NRF2, leading to inhibition of ferroptosis in PTEN-mutant tumor cells. Cell Rep. 42 (5), 112536(2023).
  29. Cai, J., et al. Fatostatin induces ferroptosis through inhibition of the AKT/mTORC1/GPX4 signaling pathway in glioblastoma. Cell Death Dis. 14 (3), 211(2023).
  30. Li, F. J., et al. System X(c)-/GSH/GPX4 axis: an important antioxidant system for the ferroptosis in drug-resistant solid tumor therapy. Front Pharmacol. 13 (1), 910292(2022).
  31. Guo, F., et al. Juglone induces ferroptosis in glioblastoma cells by inhibiting the Nrf2-GPX4 axis through the phosphorylation of p38MAPK. Chin Med. 19 (1), 52(2024).
  32. Tuncer, C., Hacioglu, C. Borax induces ferroptosis of glioblastoma by targeting HSPA5/NRF2/GPx4/GSH pathways. J Cell Mol Med. 28 (7), e18206(2024).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תיקון


Formal Correction: Ferroptosis Induction in Glioma by Calceolarioside A via Modulation of the PI3K/Akt/Nrf2 Pathway
Posted by JoVE Editors on 8/06/2026. Citeable Link.

This corrects the article 10.3791/69643

תגיות

PI3K AktNrf24Western Blot
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.