הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר מחקר

מנגנונים מולקולריים של דוקוקציה של דאצ'נגצ'י בתסמונת מצוקה נשימתית חריפה: פרמקולוגיה רשת וניתוח ביואינפורמטיקה

228 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/69651

⸱

27 במרץ 2026

 , 
1Department of Emergency Medicine, The Fourth Affiliated Hospital of Soochow University

במאמר זה

סיכום

מחקר זה מבהיר את המנגנונים המולקולריים של דקוקציה דצ'נגצ'י (DCQD) מול תסמונת מצוקה נשימתית חריפה (ARDS) באמצעות פרמקולוגיה רשתית, ביואינפורמטיקה ועגינה מולקולרית. זוהו יעדים מרכזיים ונתיבים. עגינה מולקולרית אישרה אינטראקציות חזקות בין ליגנד למטרה ותמכה בפוטנציאל הטיפולי הרב-מטרי של DCQD ל-ARDS.

תקציר

תסמונת מצוקה נשימתית חריפה (ARDS) היא סיבוך מסכן חיים של ספסיס, המאופיין בהיפוקסמיה עמידה ודלקת ריאתית. נכון להיום, ההתערבויות הפרמקולוגיות היעילות נותרות מוגבלות. הרפואה הסינית המסורתית (TCM), המדוגמת על ידי דצ'נגצ'י דקוקציה (DCQD), הוכיחה פוטנציאל טיפולי בוויסות תגובות דלקתיות מורכבות. כדי לחקור את מנגנון DCQD בטיפול ב-ARD, רכיבים פעילים של DCQD והיעדים הנלווים אליהם נאספו תחילה ממאגרי מידע ציבוריים. היעדים הקשורים ל-ARDS זוהו באמצעות ניתוח ביואינפורמטיקה של מאגרי נתונים ציבוריים. על ידי חיתוך מטרות ספציפיות לתרופות עם מטרות הקשורות למחלות, נבנתה רשת אינטראקציה DCQD-ARDS באמצעות ניתוח אינטראקציה בין חלבון לחלבון (PPI) והעשרה פונקציונלית. ניתוח מקיף חשף 32 גנים חופפים הקריטיים ליעילות הטיפולית של DCQD ב-ARDS. ניתוח העשרה הדגיש מסלולים מרכזיים, כולל מסלול איתות הכימוקין, איתות קולטני דמוי NOD, והיווצרות מלכודת נויטרופילים חוץ-תאית (NET), אשר מעורבים באימונומודולציה ודלקת. רשת ה-PPI זיהתה את HSP90AB1, MMP9, HSP90AA1, ARG1 ו-MYC כמטרות ליבה. עגינה מולקולרית אישרה זיקות קשירה חזקות בין מטרות אלו לרכיבי DCQD. הממצאים שלנו מפענחים את הבסיס המכניסטי התומך ב-DCQD כטיפול משלים מבטיח ל-ARDS שנגרם על ידי אלח דם.

מבוא

תסמונת מצוקה נשימתית חריפה (ARDS) היא תסמונת קלינית הטרוגנית מאוד הנגרמת על ידי גורמים ריאתיים או חוץ-ריאתיים שונים, המאופיינת בעיקר בפגיעה ריאתית מפוזרת והיפוקסמיה עמידה1. מאז ההגדרה הראשונה שלה ב-1967, ההבנה של ARDS התפתחה ללא הרף, מה שהוביל לשינויים חוזרים בקריטריונים האבחנתייםשלו 2. יתרה מזאת, יישום אסטרטגיות טיפוליות, כולל הנשמה מגן ריאות, תמיכה ב-ex vivo ומיקום על השכיבה, השפיע עמוקות הן על הניהול הקליני והן על התקדמות המחקר3. למרות זאת, שיעור התמותה מ-ARDS נשאר גבוה באופן מדאיג. סקר עולמי חשף כי חולי ARDS מהווים 10.4% מכלל האשפוזים ביחידות טיפול נמרץ (ICU). למרות התקדמות משמעותית בטיפול נמרץ בעשורים האחרונים, שיעורי התמותה (הן בטיפול נמרץ והן לאחר השחרור) נשארים בין 35% ל-45%.

הפתופיזיולוגיה של ARDS מורכבת, הכוללת פגיעות אפיתל אלוואולרי ואנדותל קפילרי, תגובות דלקתיות ריאתיות וסיסטמיות, ופגיעת ריאה הנגרמת על ידי מכונת הנשמה. ראוי לציין כי ARDS הקשור ל-COVID-19 מציג תכונות פתופיזיולוגיות מובחנות בהשוואה ל-ARDS קלאסי, כאשר COVID-19 עלול לגרום לטרומבוזה מיקרווסקולרית חמורה יותר ולדלקת הטרוגנית אזורית 6,7. בהתחשב בפתופיזיולוגיה המורכבת ובהטרוגניות הגבוהה של המחלה, אין כיום טיפול פרמקותרפי סופי ל-ARDS. מלבד קורטיקוסטרואידים וסוכני חסימה נוירומוסקולריים – שמומלצים מותנית בשל יתרונות לתמותה – טיפולים תרופתיים אחרים (כגון תחמוצת חנקן [NO], פרוסטציקלין, אינטרפרון-β, סורפקטנטים ריאתיים וחלבון C פעיל) לא הראו יעילות קלינית. לעומת זאת, β-אגוניסטים (למשל, אלבוטרול) ופקטור גדילה של קרטינוציטים הוכחו כמזיקים 8,9. כתוצאה מכך, פיתוח טיפולים בטוחים ורב-תכליתיים נותר עדיפות מחקרית קריטית.

הרפואה הסינית המסורתית (TCM), עם היסטוריה של למעלה מ-3,000 שנה, שימשה למניעה ולטיפול במחלות נשימה שונות. במהלך אלפי שנים של יישום קליני ומודרניזציה של מחקר הרפואה הסינית הסינית, הוא הוכיח פוטנציאל בניהול ARDS10,11. הרפואה הסינית הסינית מפעילה את השפעותיה הטיפוליות באמצעות מנגנונים רב-רכיבים, רב-מסלולים ורב-מטרות, במיוחד על ידי הפחתת תגובות דלקתיות, ויסות תפקוד מערכת החיסון והגנה על רקמות הריאות12. לדוגמה, הזרקת שואביג'ינג (XBJ), תכשיר שמקורו ב-TCM המורכב משורשי Paeonia lactiflora, שורשי Ligusticum chuanxiong, שורשי Salvia miltiorrhiza, פרחי Carthamus tinctorius ושורשי Angelica sinensis, מכילה מספר רכיבים פעילים. הוא מקל על ARDS על ידי ויסות תפקוד מערכת החיסון, לחץ חמצוני ודלקת דרך מסלולי האיתות IL-17, HIF-1 ו-TNF13. מחקרים קליניים הראו גם כי מטופלים שנחשפו לטיפול ב-XBJ הציגו שיעורי תמותה ירודים, שהייה קצרה יותר בטיפול נמרץ ורמות נמוכות יותר של ציטוקיניםדלקתיים. במהלך מגפת הקורונה, הפעלה חיסונית מופרזת שנגרמה מתגובות דלקתיות חמורות הפכה לגורם קריטי במקרים חמורים15,16. בנוסף, רכיבים מסוימים של הרפואה הסינית הסינית מחזיקים בתכונות נוגדי חמצון, המאפשרות להם לאסוף רדיקלים חופשיים ולהפחית פגיעות ריאות הנגרמות מלחץ חמצוני. ARDS מלווה לעיתים קרובות בתפקוד מיקרוקולטורי ריאתי, הפוגע בהחלפת גזים. חלק מהנוסחאות של הרפואה הסינית הסינית מציגות השפעות מפעילות דם ופותרות קיפאון, ומשפרות את המיקרוזרימה כדי להפחית בצקת ריאתית ולהגברת החמצון. יתרה מזאת, הרפואה הסינית הסינית יכולה להקל על פגיעות ריאה על ידי ויסות מסלולי מוות תאים 12,17,18. ביחד, ממצאים אלו מדגישים את הפוטנציאל הקליני הרב של רפואה סינית סינית בטיפול ב-ARDS.

דצ'נגצ'י דקוקציה (DCQD), נוסחה חיונית ברפואה הסינית למצבים חריפים, מורכבת מארבעה רכיבים צמחיים: ריבס, מירביליט, קליפת מגנוליה ותפוז מר לא בשל19. כנוסחה מורכבת, DCQD מציג אינטראקציות רב-רכיביות ורב-מטריות, ומעכב ביעילות את ייצור מתווכי דלקת שונים ומיני חמצן תגובתיים, כולל פקטור נמק גידול-אלפא (TNF-α) ואינטרלוקין-6 (IL-6)20,21. תיבת קבוצת ניידות גבוהה 1 (HMGB1), מתווך דלקתי עמוק, ממלאת תפקיד מרכזי בפתוגנזה ובהתקדמות של ספסיס. קולטן דמוי טול 4 (TLR4), קולטן המובע על תאי חיסון, מפעיל מסלולי איתות דלקתיים במורד הזרם, כגון גורם גרעיני-קאפה B (NF-κB) וקינאז חלבון מופעל על ידי מיטוגן (MAPK), בעת קישור HMGB1, מה שמוביל לשחרור מוגבר של ציטוקינים דלקתיים. DCQD מפעיל השפעות טיפוליות על ידי ויסות ציר האיתות HMGB1-TLR4, ובכך מדכא את הפעלת NF-κB ו-p38 MAPK, מפחית ייצור ציטוקינים דלקתיים ומפחית דלקת מערכתית22,23. יתרה מזאת, רכיבי DCQD מפעילים השפעות טיפוליות על ידי ויסות מסלולי איתות פרו-דלקתיים, לחץ חמצוני, אפופטוזיס ופירופטוזיס 24,25,26,27. DCQD ממלא גם תפקיד קריטי בטיפול ב-ARDS על ידי החלשת תגובות היפר-דלקתיות הנגרמות על ידי LPS ונזק אפיתל ריאתי. מבחינה מכנית, הוא מדכא את הרכבה של קינאז חלבון 1 (ZBP1) האינטראקטיבי עם קולטנים של חלבון 1 (ZBP1)-PANoptoזום (מתייחס לתהליך יצירת קומפלקס רב-חלבוני שיכול לגרום למוות דלקתי של תאים), ובכך מפחית את ה-PANoptosis28 הנגרמת על ידי LPS. מתן טיפולי דרך הפה של DCQD מעלה את ביטוי חלבוני אקוופורין-1 (AQP-1) ואקוופורין-5 (AQP-5) ברקמת הריאה, תוך עיכוב מסלול האיתות TLR4/NF-κB וייצור הציטוקינים הדלקתיים, ובסופו של דבר מקל על דלקת הקשורה ל-ARDS.

ההרכב המורכב של TCM, המאופיין בהשפעות סינרגטיות של תרכובות מרובות, מציב יתרונות ואתגרים בהבהרת המנגנונים הפרמקולוגיים שלו. רכיבים שונים של הרפואה הסינית עשויים להפעיל השפעות טיפוליות דרך מטרות מולקולריות ומסלולים שונים, בעוד שאינטראקציות אפשריות בין רכיבים אלו מסבכות עוד יותר את ההבנה המקיפה של המנגנונים המשולבים ביניהם29,30. בפרט, הפיטוכימיקלים המעורבים בטיפול ב-ARDS והמסלולים המכניסטיים שלהם נותרו בלתי מושגים. כדי להתמודד עם פערי ידע אלו, ביואינפורמטיקה, תחום בין-תחומי מתפתח המשלב אנליטיקה של ביג דאטה ובינה מלאכותית, מבטיח זיהוי רכיבים פעילים תרופתיים ופענוח מנגנוני תרופות בסיסיים 31,32,33. בהתאם לכך, מחקר זה עושה שימוש בגישות ביואינפורמטיות, כולל פרמקולוגיה רשתית ועגינה מולקולרית, כדי לזהות באופן שיטתי את הפיטוכימיקלים החיוניים, המטרות המולקולריות והמסלולים העומדים בבסיס ההשפעות הטיפוליות של DCQD בטיפול ב-ARD.

בהתבסס על ההיגיון לעיל, אנו משערים כי DCQD מפעיל השפעות טיפוליות על ARDS על ידי ויסות סינרגטי של תהליכים פתולוגיים מרכזיים, כולל דיסרגולציה דלקתית והפעלת תאי חיסון, דרך הרשת הרב-רכיבית שלו. כדי לבדוק השערה זו ולהתקדם מעבר למגבלות החיזוי המסורתי של יעדים, השתמשנו בגישה ביואינפורמטית משולבת. החידוש המרכזי באסטרטגיה זו טמון בחיתוך היעדים הפוטנציאליים של DCQD עם גנים הקשורים ל-ARDS שמקורם לא רק במאגרי מידע ציבוריים אלא, חשוב יותר, ממאגר הנתונים הקליני (GSE32707) של מטופלים עם ARDS שנגרם על ידי אלח דם. סקר בשלושה שלבים זה נועד לשפר את הרלוונטיות הקלינית של הממצאים שלנו ולזהות את הגנים והמסלולים המרכזיים שבאמצעותם DCQD עשוי לשפר את ARDS, ובכך לספק מסגרת תיאורטית מדויקת ואמינה יותר למנגנון הפעולה שלו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל החומרים, כולל מאגרי מידע, תוכנה ומגבים ניסיוניים, ששימשו במחקר זה מופיעים בטבלת החומרים. כל ההליכים הניסיוניים אושרו על ידי ועדת האתיקה לבעלי חיים של בית החולים אגם דושו בסוז'ואו (מספר היתר: 2410008).

סינון רכיבים פעילים ורכישת יעדים של DCQD
הרכיבים הפעילים של צמחי המרפא המרכיבים ריבס, מירביליט, קליפת מגנוליה ותפוז מר לא בוגר במרקם Da-Cheng-Qi (DCQD) נבדקו ממאגר הפרמקולוגיה של מערכות הרפואה הסינית המסורתית (TCMSP) תוך שימוש בקריטריונים הבאים: זמינות ביולוגית דרך הפה (OB) ≥30%) ודמיון תרופה (DL) ≥0.18). המטרות המקבילות של הרכיבים הפעילים שזוהו נאספו לאחר מכן. ספים אלו מאומצים באופן נרחב במחקרי פרמקולוגיה רשתית כדי לסנן תרכובות בעלות תכונות פרמקוקינטיות חיוביות ופוטנציאל גבוה יותר להיות מולקולות דמויות תרופה34,35. כדי לשפר את אמינות בחירת התרכובות ולהפחית הטיה מסינון במאגר יחיד, בוצעה אימות הדדי באמצעות מסד הנתונים BATMAN-TCM. BATMAN-TCM הוא מאגר נתונים אינטגרטיבי המאחסן אינטראקציות ידועות וחזויות בין רכיבי הרפואה הסינית הסינית לחלבוני המטרה, המסייע בחקר מנגנוני הפרמקולוגיה של הרפואה הסינית ובגילוי תרופות. הגרסה המעודכנת 2.0 מציעה מאגר נתונים מורחב משמעותית של TTI ותכונות משופרות, מה שהופך אותה למשאב חשוב להבנת המנגנונים המולקולריים של ה-TCM ולפיתוח טיפולים חדשים למחלות מורכבות. תרכובות ללא מטרות צפויות או עם ציוני מטרות BATMAN-TCM נמוכים מ-20 הוצאו. בנוסף, תרכובות עם ערכי OB נמוכים יחסית אך עם מטרות חזויות ב-BATMAN-TCM ופעילויות פרמקולוגיות מתועדות היטב (כגון אנתראקינונים ופלבונואידים) נשמרו באמצעות אוצרות ספרות. כדי להפחית עוד יותר רכיבים חיוביים שגויים, הורמונים אנדוגניים וחומרים דמויי נוירוטרנסמיטר (כגון פרוגסטרון וסרוטונין) הוצאו ידנית. קבוצת התרכובות הסופית שימשה לחיזוי מטרות ובניית רשת לאחר מכן. תהליך העבודה המפורט מוצג באיור משלים 1. הרשימה הסופית של הרכיבים הפעילים מוצגת בטבלה משלימה 1.

מזהי SMILES (שיטת סימון ליניארית המשתמשת במחרוזות ASCII לתיאור המבנה הכימי של מולקולות. באמצעות שימוש בסמלים וכללים ספציפיים, הוא מקודד אטומים, קשרים כימיים וטופולוגיה מולקולרית לשרשרת רציפה של תווים ללא רווחים, מה שמאפשר אחסון והעברת מידע מולקולרי תמציתי, חד-משמעי וקריא על ידי מחשב) של כל רכיב פעיל נלקח ממאגר PubChem ומטרות פוטנציאליות נחזו באמצעות חיזוי מטרות שווייצריות, כאשר פרמטר האורגניזם הוגדר ל'הומו ספיינס' וחתוך ציון הסתברות של >0. מערכי היעד שהושגו משני מסדי הנתונים אוחדו, ורשומות כפולות הוסרו כדי ליצור את קבוצת היעד המועמדת הסופית ל-DCQD.

חשוב לציין כי Mirabilitum (Mangxiao, Na₂SO₄·10H₂O), תרופה מינרלית ב-DCQD, אינה כלולה ב-TCMSP או במאגרי נתונים דומים למטרות תרכובות. כתוצאה מכך, בשל מגבלת מסד הנתונים הזו, רשת הרכיב-יעד שנבנתה במחקר זה אינה כוללת את התרומה הפוטנציאלית של Mirabilitum. לכן, הרשת מבוססת על המרכיבים הפיטוכימיים של שלושת הרכיבים הצמחיים האחרים: ריאום פאלמטום, מגנוליה אופיצינליס והדר אורנטיום.

ניתוח העשרה של מטרות DCQD
מטרות DCQD יובאו למסד הנתונים המטאסקייפ לניתוח העשרה, כאשר המין מוגבל ל"הומו ספיינס". בוצעו ניתוחי העשרת אונטולוגיית גנים (GO) ואנציקלופדיית קיוטו של גנים וגנומים (KEGG), כאשר הראשון כלל תהליכים ביולוגיים (BP), רכיבים תאיים (CC) ותפקודים מולקולריים (MF). נבחרו ששת התוצאות המובילות בתוצאות העשרה של GO ו-20 הראשונות של תוצאות העשרת KEGG. גרפים של הבר KEGG ו-GO נוצרו באמצעות הכלי המקוון של ביואינפורמטיקה. הנתונים יובאו דרך חבילת DOSE ב-R כדי לבנות את גרף הבר של אונטולוגיית המחלה (DO).

בניית רשת "רכיב-מרפאים-יעד"
הרכיבים הרלוונטיים של DCQD והיעדים המתאימים להם יובאו ל-Cytoscape 3.10.3 כדי לבנות דיאגרמת רשת הממחישה את הקשרים בין "רפואה צמחית-רכיב-מטרה". תוסף CytoNCA שימש לחישוב ערכי דרגות, וחמשת הרכיבים הפעילים המובילים נבדקו לפי דירוג.

שליפת מטרות ARDS ממאגרי מידע ציבוריים
באמצעות "תסמונת מצוקה נשימתית חריפה" כמילת מפתח, מטרות הקשורות ל-ARDS נאספו ממאגרי OMIM ו-GeneCards. בקלפי גנים נבחרו מטרות עם ציון רלוונטיות >5. לאחר מיזוג והסרת כפילויות משני מסדי הנתונים, התקבלה קבוצת יעד מועמדת ל-ARDS.

ניתוח ביואינפורמטיקה
מאגר הנתונים הקשור לספסיס-ARDS GSE32707 (פלטפורמת GPL570, n = 45), הכולל נתוני RNA-seq מתאי דם מונוגרליים היקפיים של 30 חולי ARDS שנגרמו על ידי אלח דם ו-15 ביקורת בריאה, הורד ממאגר ה-GEO של NCBI. הנתונים יובאו באמצעות חבילת GEOquery ב-R, והנרמול בוצע באמצעות חבילת לימה כדי למזער שונות בין דגימות. גנים מבוטאים באופן שונה (DEGs) זוהו באמצעות הספים |log2FC| > 1 ו-p < 0.05. ההדמיה בוצעה באמצעות גרפים של הרי געש ומפות חום. בוצעו ניתוחי העשרת GO ו-KEGG לניתוח המסלול, כאשר התוצאות הוצגו כגרפים בועות וגרפים בר.

חיזוי מטרות פוטנציאליות ל-DCQD בטיפול ב-ARDS
דיאגרמת ון נוצרה באמצעות כלי הביואינפורמטיקה המקוון להשוואת DEGs, מטרות הקשורות ל-ARDS ממאגרי מידע ציבוריים ומטרות תרופות DCQD, ובכך זיהתה מטרות טיפוליות פוטנציאליות ל-DCQD עבור ARDS.

בניית רשת האינטראקציה בין חלבון לחלבון (PPI) וסינון מטרות הליבה
היעדים החופפים יובאו למסד הנתונים של STRING כאשר המין מוגדר ל"הומו ספיינס" וסף ציון אינטראקציה של 0.4. נתוני רשת ה-PPI יוצאו בפורמט TSV והוצגו באמצעות Cytoscape 3.10.3. תוסף CytoHubba יושם לסינון עשרת היעדים המובילים בהתבסס על ציוני MCC, MNC, דרגה, EPC, ביניים, קרבה, רדיאליות ומתח. המפגש בין מטרות אלו הניב 5 מטרות ליבה.

בניית רשת "רפואה צמחית-רכיב-מחלה-מטרה"
בהתבסס על היעדים החופפים, זוהו רכיבי DCQD מתאימים. הרכיבים הרלוונטיים, יחד עם היעדים הקשורים והקשרים המחלות, יובאו ל-Cytoscape 3.10.3 כדי לבנות דיאגרמת רשת הממחישה את הקשרים בין "רפואה צמחית-רכיב-מטרה-מחלה".

ניתוח העשרה של מטרות הליבה ובניית רשת "הרפואה הצמחית-רכיב-מטרה-מחלה-מסלול"
כדי לחקור את הפונקציות הביולוגיות הפוטנציאליות ואת מסלולי האיתות המרכזיים של DCQD בטיפול ב-ARD, היעדים המרכזיים עברו ניתוחי העשרת GO ו-KEGG ב-Metascape (מין: "Homo sapiens"). נבחרו עשרת הראשונים של GO ו-13 הראשונים בתוצאות העשרה של KEGG. ההמחשה בוצעה באמצעות כלי ביואינפורמטיקה ליצירת גרפים בועות KEGG, גרפי GO וגרפי בועה של סאנקי. בנוסף, בהתבסס על תוצאות ההעשרה הפונקציונלית, נבנתה דיאגרמת רשת ב-Cytoscape 3.10.3 כדי להמחיש את הקשרים בין "רפואה צמחית-רכיב-מטרה-מחלה-מסלול".

עגינה מולקולרית והדמיה
המבנים המולקולריים המשניים של התרכובות נאספו ממאגר PubChem, בעוד שהמבנים התלת-ממדיים של מטרות הליבה התקבלו ממסד הנתונים PDB (http://www.rcsb.org/). מולקולות מים ושאריות חומצות אמינו הוסרו באמצעות PyMOL. חלבונים ותרכובות מטרה יובאו ל-AutoDock לצורך עגינה מולקולרית לחישוב אנרגיות קישור. ההמחשה בוצעה באמצעות PyMOL. מפת חום אנרגיית קישור נוצרה באמצעות חבילת pheatmap ב-R, עם מטרות ליבה בציר ה-x, תרכובות בציר ה-y, וגרדיאנט צבע המייצג אנרגיות קישור. דיאגרמות אינטראקציה דו-ממדיות של תוצאות עגינה נוצרו באמצעות Discovery Studio Visualizer 4.5. עגינה מולקולרית בוצעה כדי להעריך את היתכנות הקשר בין תרכובות למטרות, ולא לחזות יעילות מעכבת בפועל.

בניית מודל העכבר ARDS
מחקר זה אושר על ידי ועדת האתיקה הרפואית של בית החולים אגם סוז'ואו דושו (2410008). הושגו עכברים זכרים בריאים C57BL/6J (n = 30; 20 ± 5 גרם). העכברים חולקו לקבוצת ביקורת (n = 10), קבוצת LPS (n = 10, LPS 10 mg/kg), וקבוצת DCQD (n = 10, קבלת DCQD 0.9 גרם לק"ג בשילוב עם LPS 10 mg/kg). עכברים בקבוצת ה-LPS קיבלו הזרקה תוך-פריטונאלית של LPS. עכברים בקבוצת DCQD קיבלו DCQD 0.9 גרם לק"ג באמצעות הערכה אורלית מיד לאחר ההזרקה התוך-פריטוניאלית של LPS. המדידות נלקחו מיד לפני ואחרי הוצאת הריאות מכל העכברים. בהמשך, רקמות הריאה נשמרו בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.

ניתוח כתם מערבי (WB)
חלבונים בודדו מליזאטים של רקמת הריאות של העכברים, וריכוזיהם נמדדו באמצעות ערכת כימות חלבון BCA. לאחר מכן, החלבונים עברו דנטור על ידי רתיחה ב-95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. החלבונים המפוזרים הופרדו על ג'ל SDS-PAGE של 10% שהוכן עם ערכת הכנת ג'ל, ואז הועברו לממברנת PVDF. כדי למנוע קישור לא ספציפי, ממברנות ה-PVDF נחסמו בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות באמצעות בופר חסימה מהיר ללא חלבון. לאחר שטיפה עם PBST, הממברנות נדגרו במהלך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עם נוגדנים ראשוניים נגד MMP9, HSP90, MYC ו-ARG1. לאחר שטיפה נוספת עם PBST, הממברנות דגרו במשך שעתיים בטמפרטורת החדר עם IgG(H+L) אנטי-ארנב מנוגד לעזים בצורת HRP. לבסוף, הוחל סובסטרט ערכת זיהוי כימילומינסנציה רגישה במיוחד, וזוהו רצועות חלבון כימימיומינסנציות באמצעות מערכת הדמיה כימילומינסנציונית BIO-RAD. ניתוח גווני אפור בוצע באמצעות ImageJ. הנוגדנים ששימשו בניסוי זה מופיעים בטבלה משלימה 2.

ניתוח מבחן אימונוסורבנט מקושר לאנזימים (ELISA)
ראשית, נאסף נוזל שטיפה ברונכואלוואולרי (BALF) על ידי ביצוע שטיפה שלוש פעמים עם 2 מ"ל מלח. נוזלי השטיפה שהתקבלו נאספו וצונטריפוגה ב-10,000 גרם במשך 10 דקות להסרת תאים. הסופרנטנט נשאף ואוחסן בהקפאה בחנקן נוזלי. לאחר מכן, נקבעו ריכוזי הציטוקינים המטרה בהתאם להוראות היצרן באמצעות ערכת Mouse IL-6 ELISA, ערכת ELISA של עכבר IL-18 וערכת ELISA TNF-alpha של עכבר. לאחר מכן, לוח התגובה הונח בקורא מיקרופלט, וערך הצפיפות האופטית (OD) של כל באר נמדד באורך גל של 450 ננומטר, כאשר באר הבקרה הריקה שימשה לכיוון אפס. לבסוף, נרשמה עקומה סטנדרטית בהתבסס על הריכוזים וערכי ה-OD המתאימים של התקנים. ריכוז גורם היעד בכל מדגם חושב לפי משוואת העקומה הסטנדרטית.

ניתוח סטטיסטי
הנתונים נותחו באמצעות GraphPad Prism 10.1.2. המשמעות של ההבדלים בין הקבוצות הוערכה סטטיסטית באמצעות ניתוח חד-כיווני של שונות או מבחן t של סטודנט. אם ערך P קטן מ-0.05, ההפרש נחשב משמעותי; אם ערך ה-P קטן מ-0.01, הוא נחשב למשמעותי מאוד.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

ניתוח ביואקטיביות של DCQD
כדי לפענח את המנגנונים המולקולריים שמאחורי הביואקטיביות של DCQD, זוהו תחילה מטרות פוטנציאליות על ידי סינון מסדי הנתונים של חיזוי מטרות שוויצרי ו-TCMSP. סך הכל הותאמו 16 רכיבים מרובס, 17 מתפוז מר לא בוגר, ו-2 מקליפת מגנוליה, והניבו 614 מטרות פוטנציאליות (איור 1A). בהמשך, נבנתה דיאגרמת רשת כדי להמחיש את הקשרים בין שלוש התרופות הצמחיות, 35 המרכיבים הפעילים שלהן, ו-614 היעדים. כפי שמודגם באיור 1B, ריבועים ירוקים מייצגים ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

ARDS התפתח להפרעת ריאות מסכנת חיים, שמטילה נטל משמעותי על מערכת הבריאות העולמית, עם שכיחות שנתית של 1.5-79 מקרים ל-100,000 איש ושיעורי תמותה הנעים בין 34.9% ל-46.1% ברמות חומרה משתנות37. למרות התקדמות באסטרטגיות הנשמה מכנית, כולל אוורור מגן ריאות ומיקום על השכיבה, התוצאות הקליניות נותרות לא אופטימליות בשל הטרוגניות בתהליכים פתופיזיולוגיים ואפשרויות טיפוליות מוגבלות38. טיפולים עכשוויים, כגון קורטיקוסטרואידים ומעכבי נויטרופילים אלסטאז, מציגים...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים כי המחקר נערך בהיעדר קשרים מסחריים או פיננסיים שיכולים להיחשב כניגוד עניינים פוטנציאלי. בינה מלאכותית גנרטיבית וטכנולוגיות בסיוע בינה מלאכותית לא שימשו בהכנת עבודה זו.

תודות

מחקר זה נתמך על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מספר מענק: 82570078).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
נוגדן פוליקלונלי ארגינאז-1Protein Tech Group Inc., ארה"ב16001-1-AP
אוטודוקמכון המחקר סקריפסNAhttp://autodock.scripps.edu/
מאגר הנתונים של BATMAN-TCM  אוניברסיטת בייג'ינג לרפואה סיניתNAhttp://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/
ערכת כימות חלבון BCAסרוויסביוG2026
ביואינפורמטיקהביואינפורמטיקהNAhttps://www.bioinformatics.com.cn/
מערכת הדמיה כימילומינסנציונית BIO-RADתרמו פישר סיינטיפיקhttps://www.bio-rad.com/en-in/category/chemidoc-imaging-systems?ID=NINJ0Z15
עכברים C57BL/6Jמעבדת זיואן האנגג'ואו, חברת טכנולוגיית בעלי חיים בע"מ
נוגדן פוליקלונלי c-MYCProtein Tech Group Inc., ארה"ב10828-1-AP
ציטוסקייףציטוסקייףגרסה 3.10.3https://cytoscape.org/
DCQDמחלקת הרפואה הסינית המסורתית של בית החולים אגם דושו בסוז'ואו
Discovery Studio Visualizer גילויגרסה 4.5
GraphPad Prism דוטמטיקסversion10.1.2https://www.graphpad.com/
נוגדן פוליקלונלי GAPDHProtein Tech Group Inc., ארה"ב10494-1-AP
ערכת הכנת ג'לסרוויסביוG2003
GeneCards  מאגר נתוניםמרכז הגנום האנושי של הכתרNAhttps://previous.genecards.org/
מסד נתונים GEOהמרכז הלאומי למידע ביוטכנולוגי (NCBI)GSE32707 (פלטפורמת GPL570, n=45)
Affinipure Goat נגד ארנב IgG(H+L) מצורף HRPProtein Tech Group Inc., ארה"בSA00001-2
נוגדן פוליקלונלי HSP90Protein Tech Group Inc., ארה"ב13171-1-AP
ליפופוליסכרידים (LPS)סולרביולוגיהL8880
מסד הנתונים MetascapeNIHNAhttps://metascape.org/gp/index
קורא מיקרופלטBioTeKhttps://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/microplate-readers?srs
ltid=AfmBOoqJhJhNJW6vNU
fnskFb9jjcTgXww1A1km-JVP
P1SScq1Mx78HBi
נוגדן פוליקלונלי MMP-9 (קצה N)Protein Tech Group Inc., ארה"ב10375-2-AP
ערכת ELISA עכבר IL-18סרוויסביוGEH0010
ערכת ELISA Mouse IL-6סרוויסביוGEM0001
ערכת ELISA עכבר TNF-אלפאסרוויסביוGEH0004
מסד הנתונים OMIMאוניברסיטת ג'ונס הופקינסNAhttps://www.omim.org/
Omni-ECL&Trade; ערכת זיהוי כימילומינסנציה רגישה במיוחדאפיזים ביוטכנולוגיהSQ201
מסד נתונים PDBRCSBNAhttp://www.rcsb.org/
בופר חסימה מהיר ללא חלבוןאפיזים ביוטכנולוגיהG2052
מסד נתונים PubChemהמרכז הלאומי למידע ביוטכנולוגי (NCBI)https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/
ממברנת PVDFמרקNA
PyMOLשרדינגרגרסה 3.10.3
מאגר מחרוזותקואליציית הביודאטה הגלובלית ו-ElixirNAhttps://cn.string-db.org/
מאגר חיזוי מטרות שווייץהמכון השווייצרי לביואינפורמטיקהNAhttp://www.swisstargetprediction.cn/
מסד נתונים של פרמקולוגיה של מערכות רפואה סינית מסורתית (TCMSP)אוניברסיטת נורת'ווסטרן פוליטכניתגרסה 2.3https://www.tcmsp-e.com/

מקורות

  1. ARDS Definition task force. Acute respiratory distress syndrome: the Berlin definition. JAMA. 307 (23), 2526-2533 (2012).
  2. Ashbaugh, D. G., Bigelow, D. B., Petty, T. L., Levine, B. E. Acute respiratory distress in adults. Lancet. 2 (7511), 319-323 (1967).
  3. Matthay, M. A., et al. A new global definition of acute respiratory distress syndrome. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 209 (1), 37-47 (2024).
  4. Jia, F., et al. A prediction model for 30-day mortality in patients with ARDS admitted to the intensive care unit. Eur J Med Res. 30 (1), 559(2025).
  5. Bos, L. D. J., Ware, L. B. Acute respiratory distress syndrome: causes, pathophysiology, and phenotypes. Lancet. 400 (10358), 1145-1156 (2022).
  6. Lippi, G., Mattiuzzi, C., Favaloro, E. J. Prone position and the risk of venous thrombosis in COVID-19 patients with respiratory failure. Semin Thromb Hemost. 50 (7), 1019-1021 (2024).
  7. Ball, L., et al. Understanding the pathophysiology of typical acute respiratory distress syndrome and severe COVID-19. Expert Rev Respir Med. 16 (4), 437-446 (2022).
  8. Battaglini, D., Iavarone, I. G., Rocco, P. R. M. An update on the pharmacological management of acute respiratory distress syndrome. Expert Opin Pharmacother. 25 (9), 1229-1247 (2024).
  9. Matera, M. G., Rogliani, P., Bianco, A., Cazzola, M. Pharmacological management of adult patients with acute respiratory distress syndrome. Expert Opin Pharmacother. 21 (17), 2169-2183 (2020).
  10. Rahman, M. M., et al. Natural therapeutics and nutraceuticals for lung diseases: Traditional significance, phytochemistry, and pharmacology. Biomed Pharmacother. 150, 113041(2022).
  11. Chen, Z., Ye, S. Y. Research progress on antiviral constituents in traditional Chinese medicines and their mechanisms of action. Pharm Biol. 60 (1), 1063-1076 (2022).
  12. Liu, Y., et al. Pharmacological mechanisms of traditional Chinese medicine against acute lung injury: From active ingredients to herbal formulae. Phytomedicine. 135, 155562(2024).
  13. Li, J., Shen, M., Yin, Z. Exploring the mechanism of action of xuebijing injection in treating acute respiratory distress syndrome based on network pharmacology and animal experiments. J Inflamm Res. 18, 6037-6047 (2025).
  14. Zhang, Y., Wang, J., Liu, Y. M., Yang, H., Wu, G. J., He, X. H. Analysis of the efficacy and mechanism of action of xuebijing injection on ARDS using meta-analysis and network pharmacology. BioMed Res Int. 2021, 8824059(2021).
  15. Mehta, P., et al. COVID-19: consider cytokine storm syndromes and immunosuppression. Lancet. 395 (10229), 1033-1034 (2020).
  16. Cavalcante-Silva, L. H. A., et al. Neutrophils and COVID-19: The road so far. Int Immunopharmacol. 90, 107233(2021).
  17. Zhang, Y., et al. Electroacupuncture alleviates LPS-induced ARDS through α7 nicotinic acetylcholine receptor-mediated inhibition of ferroptosis. Front Immunol. 13, 832432(2022).
  18. Zhang, H., et al. Pharmacodynamic advantages and characteristics of traditional Chinese medicine in prevention and treatment of ischemic stroke. Chin Herb Med. 15 (4), 496-508 (2023).
  19. Liu, Z., et al. Dachengqi Decoction alleviates intestinal inflammation in ovalbumin-induced asthma by reducing group 2 innate lymphoid cells in a microbiota-dependent manner. J Tradit Complement Med. 13 (2), 183-192 (2023).
  20. Shuhan, W., et al. Dachengqi decoction ameliorated liver injury in liver fibrosis mice by maintaining gut vascular barrier integrity. Phytomedicine. 136, 156272(2025).
  21. Yin, F. T., et al. Prediction of the mechanism of Dachengqi Decoction treating colorectal cancer based on the analysis method of " into serum components -action target-key pathway.". J Ethnopharmacol. 293, 115286(2022).
  22. Chen, Z., et al. Dachengqi Decoction attenuates inflammatory response via inhibiting HMGB1 mediated NF-κB and P38 MAPK signaling pathways in severe acute pancreatitis. Cell Physiol Biochem. 37 (4), 1379-1389 (2015).
  23. Zhu, Q., et al. Large Chengqi Decoction improves sepsis-related intestinal damage by inhibiting inflammatory response through the HMGB1-TLR4 signaling pathway. J Inflamm Res. 18, 5415-5425 (2025).
  24. Vajdi, M., Karimi, A., Karimi, M., Abbasalizad Farhangi, M., Askari, G. Effects of luteolin on sepsis: A comprehensive systematic review. Phytomedicine. 113, 154734(2023).
  25. Gao, L. L., Wang, Z. H., Mu, Y. H., Liu, Z. L., Pang, L. Emodin promotes autophagy and prevents apoptosis in sepsis-associated encephalopathy through activating BDNF/TrkB signaling. Pathobiology. 89 (3), 135-145 (2022).
  26. Fu, W., et al. Emodin inhibits NLRP3 inflammasome activation and protects against sepsis via promoting FUNDC1-mediated mitophagy. Int J Biol Sci. 21 (8), 3631-3648 (2025).
  27. Chunlian, W., Heyong, W., Jia, X., Jie, H., Xi, C., Gentao, L. Magnolol inhibits tumor necrosis factor-α-induced ICAM-1 expression via suppressing NF-κB and MAPK signaling pathways in human lung epithelial cells. Inflammation. 37 (6), 1957-1967 (2014).
  28. Zhang, M., et al. Dachengqi decoction dispensing granule ameliorates LPS-induced acute lung injury by inhibiting PANoptosis in vivo and in vitro. J Ethnopharmacol. 336, 118699(2025).
  29. Li, J., et al. Macrophagedriven pathogenesis in acute lung injury/acute respiratory disease syndrome: Harnessing natural products for therapeutic interventions (Review). Mol Med Rep. 31 (1), 16(2025).
  30. He, Y. Q., et al. Natural product derived phytochemicals in managing acute lung injury by multiple mechanisms. Pharmacol Res. 163, 105224(2021).
  31. He, T., et al. Integrating network pharmacology and non-targeted metabolomics to explore the common mechanism of Coptis Categorized Formula improving T2DM zebrafish. J Ethnopharmacol. 284, 114784(2022).
  32. Liu, D., Zhang, Y., Bai, B., Xiong, X., Zhou, Q., Shi, R. Integration of single-cell RNA sequencing and network pharmacology to elucidate the effect of Yantiao Formula on alleviating ALI by regulating the polarization of alveolar macrophages. J Ethnopharmacol. 343, 119436(2025).
  33. Mao, X., et al. Toosendanin alleviates acute lung injury by reducing pulmonary vascular barrier dysfunction mediated by endoplasmic reticulum stress through mTOR. Phytomedicine. 136, 156277(2025).
  34. Li, X., Liu, Z., Liao, J., Chen, Q., Lu, X., Fan, X. Network pharmacology approaches for research of Traditional Chinese Medicines. Chin J Nat Med. 21 (5), 323-332 (2023).
  35. Zhao, L., et al. Network pharmacology, a promising approach to reveal the pharmacology mechanism of Chinese medicine formula. J Ethnopharmacol. 309, 116306(2023).
  36. Hsin, K. Y., Ghosh, S., Kitano, H. Combining machine learning systems and multiple docking simulation packages to improve docking prediction reliability for network pharmacology. PloS One. 8 (12), e83922(2013).
  37. Mannes, P. Z., et al. Molecular imaging of chemokine-like receptor 1 (CMKLR1) in experimental acute lung injury. Proc Nat Acad Sci U. 120 (3), e2216458120(2023).
  38. Lu, Y., Li, W., Qi, S., Cheng, K., Wu, H. Mapping knowledge structure and emerging trends of extracorporeal membrane oxygenation for acute respiratory distress syndrome: a bibliometric and visualized study. Front Med. 11, 1365864(2024).
  39. Sherman, E., Han, M. H. Acute and chronic management of neuromyelitis optica spectrum disorder. Curr Treat Options Neurol. 17 (11), 48(2015).
  40. Piccinini, A. M., Midwood, K. S. DAMPening inflammation by modulating TLR signalling. Mediators Inflamm. 2010, 672395(2010).
  41. Al-Husinat, L., et al. A narrative review on the future of ARDS: evolving definitions, pathophysiology, and tailored management. Crit Care. 29 (1), 88(2025).
  42. Ma, W., et al. Advances in acute respiratory distress syndrome: focusing on heterogeneity, pathophysiology, and therapeutic strategies. Signal Transduct Target Ther. 10 (1), 75(2025).
  43. Cao, Z., et al. Targeting of the pulmonary capillary vascular niche promotes lung alveolar repair and ameliorates fibrosis. Nat Med. 22 (2), 154-162 (2016).
  44. Fang, C., Wang, Y., Pan, Z. Formation of self-assembly aggregates in traditional Chinese medicine decoctions and their application in cancer treatments. RSC advances. 15 (7), 5476-5506 (2025).
  45. Shuhan, W., et al. Dachengqi decoction ameliorated liver injury in liver fibrosis mice by maintaining gut vascular barrier integrity. Phytomedicine. 136, 156272(2025).
  46. Pan, G., Wu, Y., Liu, Y., Zhou, F., Li, S., Yang, S. Dachengqi decoction ameliorates sepsis-induced liver injury by inhibiting the TGF-β1/Smad3 pathways. Journal of Traditional and Complementary Medicine. 14 (3), 256-265 (2024).
  47. Guo, W., et al. Dachengqi decoction for the treatment of acute pancreatitis: a comprehensive analysis based on metabolites, pharmacokinetics, and metabolites efficacy mechanisms. Front Pharmacol. 16, 1549909(2025).
  48. Yin, F. T., et al. Prediction of the mechanism of Dachengqi Decoction treating colorectal cancer based on the analysis method of " into serum components -action target-key pathway.". J Ethnopharmacol. 293, 115286(2022).
  49. Hu, X., Liu, S., Zhu, J., Ni, H. Dachengqi decoction alleviates acute lung injury and inhibits inflammatory cytokines production through TLR4/NF-κB signaling pathway in vivo and in vitro. J Cell Biochem. 120 (6), 8956-8964 (2019).
  50. Yang, J. Y., et al. Material basis and molecular mechanism of Dachengqi Decoction in treatment of acute pancreatitis based on network pharmacology. Chin J Chin Materia Medica. 45 (6), 1423-1432 (2020).
  51. Lu, X., et al. Integrating network pharmacology, transcriptome and artificial intelligence for investigating into the effect and mechanism of ning fei ping xue decoction against the acute respiratory distress syndrome. Front Pharmacol. 12, 731377(2021).
  52. Liang, X., et al. Study on intervention mechanism of yiqi huayu jiedu decoction on ARDS based on network pharmacology. Evid-Based Complement Alternat Med. 2020, 4782470(2020).
  53. Yang, B., Liu, X., Liang, Y., Li, Y. Chemical inhibition of HSP90 inhibits TNF-α mediated proliferation and induces apoptosis in human rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes. J Cell Biochem. 120 (2), 2547-2553 (2019).
  54. Zhang, X., et al. Ponicidin-induced conformational changes of HSP90 regulates the MAPK pathway to relieve ulcerative colitis. J Ethnopharmacol. 321, 117483(2024).
  55. Albakova, Z. HSP90 multi-functionality in cancer. Front Immunol. 15, 1436973(2024).
  56. Chien, L. H., Deng, J. S., Jiang, W. P., Chou, Y. N., Lin, J. G., Huang, G. J. Evaluation of lung protection of Sanghuangporus sanghuang through TLR4/NF-κB/MAPK, keap1/Nrf2/HO-1, CaMKK/AMPK/Sirt1, and TGF-β/SMAD3 signaling pathways mediating apoptosis. Biomed Pharmacother. 165, 115080(2023).
  57. Warburton, D., Shi, W., Xu, B. TGF-β-Smad3 signaling in emphysema and pulmonary fibrosis: an epigenetic aberration of normal development. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 304 (2), L83-L85 (2013).
  58. Yadav, P., et al. Macrophage-fibroblast crosstalk drives Arg1-dependent lung fibrosis via ornithine loading. bioRxiv: The Preprint Server for Biology. , (2024).
  59. Lamoke, F., et al. Amyloid β peptide-induced inhibition of endothelial nitric oxide production involves oxidative stress-mediated constitutive eNOS/HSP90 interaction and disruption of agonist-mediated Akt activation. J Neuroinflamm. 12, 84(2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

רשת אינטראקציות בין חלבוניםסיגנלינג של כמכיניםקולטן דמוי NODמלכודת חוץ-תאית של נויטרופיליםעגינה מולקולריתתגובה דלקתית
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.