טרנספורמציה יעילה בתיווך אגרובקטריה מבוססת רגנרציה של מין דו-חיים א-מיני, Rorippa aquatica

סיכום

אנו מציגים פרוטוקול יעיל ואופטימלי לטרנספורמציה בתיווך אגרובקטריה של מין דו-חיים אל-מיני, Rorippa aquatica, ללא הליכים עתירי משאבים של תרבית רקמות סטריליות. באמצעות סמן טרנספורמציה חזותי וצינור התחדשות של הכדורים נוצרו בהצלחה טרנספורמנטים קרובים לשיבוטים, ובכך קידם את המחקרים העתידיים של הסתגלות הצמח לסביבה התת-ימית.

תקציר

טרנספורמציה גנטית יציבה של צמחים המתווכת על ידי Agrobacterium tumefaciens הייתה כלי עוצמתי למחקר ביולוגי צמחי בסיסי וכן לביוטכנולוגיות צמחים שמשפיעות ישירות על שיפור הגידולים. צינורות טרנספורמציה פשוטים ויעילים, כמו שיטת טבילה פרחונית, ב-Arabidopsis, התקדמו בצורה דרסטית בניתוחים רחבי היקף של תפקוד הגנים. עם זאת, צינור כזה אינו יכול להיות מיושם על מיני צמחים שאינם עוברים רבייה מינית. Rorippa aquatica הוא מין מודל דו-חיים מתפתח של משפחת Brassicaceae, המפגין שינויים הטרופיליים ודרסטיים בצורת העלים והצמחים בסביבות יבשתיות או תת-ימיות. R. aquatica מתרבה אך ורק באופן וגטטיבי. הצינור האופטימלי המוצג כאן מספק טרנספורמציה יעילה ואמינה בתיווך Agrobacterium של R. aquatica, שאינה דורשת תרבית רקמה סטרילית. ייחורי העלים טובלים לזמן קצר באגרובקטריה התלוי בבופר טרנספורמציה המכיל וקטור בינארי שמבטא סמן חזותי, RUBY, מתחת לפרומוטר המרכיב. לאחר מכן, האנקולנטים מגודלים על נייר סינון ספוג מים בתא גידול. לאחר מכן, צמחים מתחדשים עם פיגמנטציה אדומה של RUBY מופרדים ומושתלים באדמה. אותם מתחדשים ראשוניים מסוג T1 (R1-T1) מבטאים מגזרים אדומים. באמצעות חיתוך המגזר האדום וחזרה על שלבי ההתחדשות, נוצרים מספר רב של אחים טרנסגניים בדור הבא של R2-T1, שחלקם כמעט אחידים באדום; מה שמעיד על ביטוי RUBY . צינור הטרנספורמציה הפשוט הזה יכול להיות מאומץ עבור R. aquatica ואולי גם עבור מיני צמחים אחרים המתרבים צמחית, כדי להכניס גנים מעניינים לחקור את תפקידם בהסתגלות לצמחייה לעומת סביבות מימיות.

מבוא

טרנספורמציה גנטית יציבה, כלומר הכנסת והבעה של גנים המעניינים למין צמח מסוים, היא מרכזית במדעי הצמח הבסיסיים ובביוטכנולוגיה של הצמחים. הטרנספורמציה המתווכת על ידי Agrobacterium tumefaciens היא האמצעי הנפוץ ביותר להנדסה גנטית של צמחים בשל יצירה אמינה של טרנספורמנטים יציבים¹. פיתוח מערכת וקטור בינארית, שבה וקטור שיבוט ה-T-DNA ופלסמיד העזר של הוויר מנותק מופרדים לשתי ישויות, חולל מהפכה בטרנספורמציה המתווכת על ידי אגרובקטריה ^1,2. לצמח המודל Arabidopsis thaliana, הליך טרנספורמציה פשוט, חסכוני של טבילה פרחונית, אפשר ייצור מהיר של טרנספורמנטים קלונליים (המיזיגוטיים) לגנטיקה וגנומיקה פונקציונלית ^3,4. עם זאת, גישה כזו אינה ישימה עבור מיני צמחים שמתרבים בעיקר או באופן ווגטטיבי.

צמחים דו-חיים מפגינים יכולת ייחודית לשגשג הן בסביבות יבשתיות והן בסביבות ימיות (תת-ימיות)⁵. Rorippa aquatica היא מין דו-חיים ממשפחת Brassicaceae המפגין הטרופיליות. בסביבה יבשתית, R. aquatica מפתח עלים עגולים עם אפידרמיס המורכב מתאי אספלט וסטומטות. לעומת זאת, עלי המים שלהם מציגים מורפולוגיות המותאמות היטב לסביבה התת-ימית: עלים דמויי מחט מנותחים מאוד עם אפידרמיס נטול תאי מרצף קוטיקולטי או סטומטה ^6,7. פילוגנטית, R. aquatica קשור קשר הדוק ל-Arabidopsis thaliana; שניהם שייכים לאותה משפחה, Brassicaceae⁶. יחד עם זמינות נתוני רצף גנומי מלא ושימור גבוה של גנים מקודדים בין R. aquatica ל-A. thaliana, R. aquatica משמש כצמח מודל אמפיבי מתפתח לחקר הבסיס המולקולרי של הסתגלות ליבשה ולמים⁸. למעשה, מחקרים פיזיולוגיים וביטוי גנים עדכניים מצביעים על כך ששינוי מסלולי האור והאיתות ההורמונלי קריטי להטרופיליה של R. aquatica ^7,8.

כדי לבדוק את התפקודים המולקולריים של גנים ומסלולים מועמדים, טרנספורמציה גנטית היא חיונית לחלוטין. R. aquatica מתרבה באופן צמחי^{בטבע 8,9}. לכן, בניגוד ל-A. thaliana, לא ניתן ליישם את שינוי הטרנספורמציה הפרחונית של Agrobacterium על R. aquatica. באופן מרשים, R. aquatica מתחדש בקלות צמחים שלמים מעלים מנותקים ללא תוספת חיצונית של פיטוהורמונים¹⁰. לזמן קצר, תוך מספר ימים מניתוק מקטע העלה, התרבות התאים הופכת לפעילה ברקמת כלי הדם בקצה הפרוקסימלי של פני השטח החתוכים. בתוך שבוע, גם השורשים וגם הענפים מתחדשים, ובסופו של דבר מייצרים שתילים צעירים (שתילים רוזטה). צמחים בודדים יכולים להיות מופרדים ולגדל עד לבגרות¹⁰. תהליך ההתחדשות הספונטני של כל הצמחים יכול לשמש בקלות לשינוי גנטי של R. aquatica.

הצינור האופטימלי המדווח כאן מאפשר טרנספורמציה יעילה ואמינה בתיווך אגרובקטריום של R. aquatica על ידי ניצול יכולתו להתחדשות ספונטנית לאחר ניתוק העלים. לבחירה קלה של טרנספורמנטים ללא צורך בתהליכי תרבית סטריליים יקרים, אומץ סמן ברירה חזותי לא פולשני בשם RUBY, וקטור סינתטי עם שלושה גנים שהוביל לביוסינתזה של בטליין¹¹. על ידי אופטימיזציה של תנאי תרביות חיידקים, שלבי החיסון ותהליכי דגירה של ייחורי העלים לרגנרציה, נוצרו צמחי R. aquatica טרנסגניים באופן אמין עד לבגרות. כמעט כל הטרנספורמנטים הראשוניים בדור R1-T1 מציגים מגזרים אדומים, מה שמעיד שמדובר בפסיפסים גנטיים הטרוגניים. על ידי חיתוך מגזרי העלים האדומים RUBY+ וחזרה על תהליכי ההתחדשות, ניתן ליצור צמחי רוזטה אדומים לחלוטין, וכך כמעט שיבוטיים, טרנספורמנטים של R. aquatica בדור R2-T1 הבא. צינור הטרנספורמציה הזה יכול להיות מיושם בקלות להחדה/ביטוי גנים זרים מעניינים ל-R. aquatica, ובכך להאיץ את המחקרים המולקולריים הגנטיים של הסתגלות הטרופילית והצמחים לסביבות קיצוניות.

פרוטוקול

החומרים והציוד בהם משתמשים מופיעים בטבלת החומרים.

1. הכנת חומרים צמחיים

1. חתוך וחתוך, עם אונות מלאה, עלים בריאים לחלקים של 1-2 ס"מ מצמחי אם בוגרים בני חודשיים (איור 1A).
2. רצף מגש רבייה לצמחים (20 על מגשי Perma Nest בגודל 30 ס"מ) בשתי שכבות של מגבות נייר מקופלות באוטוקלב. הרוויו את מגבות הנייר במים סטריליים, כך שיהיה שכבה דקה של מים מעל.
3. הנח את הייחורים בצד כלפי מעלה עם מרווח סביב כל שתיל לשעבר כדי למנוע חפיפה (איור 1A).
4. מרחו בעדינות את החתכים וכיסו היטב את המגש בניילון נצמד.
5. הניחו מגשים בתא הגידול בטמפרטורה של 25°C-28°C עם 16 שעות אור ו-8 שעות חשוך בתנאי לחות ועוצמת אור של 50 מיקרומול/מ^{' 2}/ש'.
6. בדוק ותחזק מגשי התפשטות נקיים ולחות 2-3 פעמים בשבוע.
   1. הוסיפו מים סטריליים כדי לשמור על שכבת מים דקה מעל מגבות נייר רוויות.
   2. החלפת ניילון נצמד שאיבד את ההידבקות ו/או מראה סימני זיהום (למשל, עכירות מים נראית לעין).
7. באמצעות מיקרו-מספריים או אזמל, כריתה בזהירות שתילים של רוזטה בריאה, מחודשת, שנושאים גם ענף וגם שורש בין 14 ל-21 ימים לאחר ההקמה (איור 1B).
   הערה: נדרש כריתה זהירה כדי לקבל שתיל רוזטה יחיד עם הנצר והשורש שלמים. שתילי רוזטה רוריפה מתרבים בצפיפות לאורך הצומת של העלה האקספלט והעצל המרכזי, מה שמקשה על זיהוי שתילי רוזטה בודדים. נצר צמח רוזטה גדל באופן אדקסיאלי, בעוד שהשורשים גדלים מתחת לפני העלה, מה שמקשה על הנראות של כל שתיל הרוזטה (איור 1B).
8. השתלת שתילי רוזטה בודדים לעציצים המכילים חומר קרקע לח (יחס תערובת עציצים 2:1:1: ורמילקוליט: פרלייט) בתוספת דשן שחרור איטי (איור 1B).
9. יש להשקות במי ברז עם 0.25 גרם לליטר של דשן NPK גרגירי ולכסות בכיפת לחות או ניילון נצמד לשמירה על תנאי לחות.
10. הנח מגשים בתא הצמיחה בתנאים קודמים (25°C-28°C עם 16 שעות אור ו-8 שעות חשוך בתנאי לחות ועוצמת אור של 50 מיקרומול/מ^{' 2}/שנייה)
    הערה: חשוב לשמור על תנאי קרקע לחים. שמור על שכבת מים דקה מתחת להשתלות בעציץ.

2. תרביות אגרובקטריה לטרנספורמציה

1. זן Streak A. tumefaciens GV3101 המכיל את Ti-פלסמיד pMP90 (pTiC58DT-DNA) המכיל את וקטור RUBY על פלטת LB של 30 מ"ל המכילה ריפמפיצין (0.03 מ"ג/מ"ל), גנטמיצין (0.025 מ"ג/מ"ל) וספקטינומיצין (0.05 מ"ג/מ"ל) וגדלים בטמפרטורה של 28° צלזיוס במשך 48-72 שעות עד שמושבות בודדות נראות.
2. בחרו מושבה אחת והחינו 5 מ"ל מרק MG/L עם ביוטין ואנטיביוטיקה סלקטיבית קודמת (טבלה 1) ודגרו בשייקר סיבובי של 28 מעלות צלזיוס ב-200 סל"ד למשך 16 שעות.
3. העבר את החיסון לבקבוק חרוטי עם ציר של 250 מ"ג/ליטר ודגור בשייקר סיבובי של 28 מעלות צלזיוס במהירות 200 סל"ד למשך 16 שעות.
4. ודא שלתרבות הנוזל יש OD מינימלי_{של 600} של 1.2 באמצעות ספקטרופוטומטר. הפלטה את החיידקים בצנטריפוגה ב-3396 x גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר (כ-22 מעלות צלזיוס). לתקן את מרק החיסון עם 200 מיקרומום אצטוסירינגון (AS).
   הערה: אליקווטים של AS סטרילי מסנן מוכנים ב-DMSO בריכוז עבודה של 100 מ"מ ומאוחסנים בטמפרטורה של -20°C. מרק אינוקולום צריך להיות טרי. AS מתווסף ישירות לפני שלב הצנטריפוגציה כדי למזער את התדרדרות. תיאורי המדיה ורכיבי המדיה מפורטים בטבלה 1.
5. כדי להימנע מהפרעה ישירה לכדור החיידקי, יש להשליך את הסופרנטנט ולהחזיר את הכדור למרק האינוקולום.
6. סובב את הבקבוק ביד כך שהתמיסה תקבל OD₆₀₀ של בערך 0.8.
7. דגרו את החיסון על שייקר במהירות 90 סל"ד למשך 2.5 שעות בטמפרטורת הסביבה (כ-22 מעלות צלזיוס).
8. תיעוד התנאים הרלוונטיים (תרבית ואינוקולום OD₆₀₀, ריכוז AS וכמות הסורפקטנטים, תקופת החיסון, ומספר יחידות ניסוי הנדרשות ליעילות הטרנספורמציה).
   הערה: ריכוזי חיידקים ותרביות תלייה אופטימליים הם חיוניים למקסום יעילות הטרנספורמציה תוך מזעור צמיחת חיידקים מופרזים. לפני הצנטריפוגה, יש לוודא שתרבית החיידקים מכילה לפחות OD600 של 1.2; השעתי מחדש ל-OD600 של 0.8. התיקונים למרק ההשראה מותאמים לשיפור הטרנספורמציה מבלי לפגוע בחיוניות ההתחדשות. הריכוזים המומלצים הם 150-225 מיקרומולר עבור AS ו-0.005% עבור סורפקטננט.
   זהירות: השליכו את כל החיידקים והצמחים הטרנסגניים במיכלים ייעודיים לפסולת ביו-מסוכנת.

3. טרנספורמציה של ייחורי עלי R. aquatica

1. בזמן שתרבות ההשעיה מחדש של האינקולום עוברת דגירה, בחרו כמה צמחים בני חודשיים שמציגים עלים בריאים עם שוליים שלמים.
2. הכינו מגש רבייה לצמחים (20 מגשי Perma Nest בגודל 30 ס"מ) עם שתי שכבות של מגבות נייר מאוטוקלבות. קפלו מגבות נייר. הרוויו את מגבות הנייר במים סטריליים, כך שיהיה שכבה דקה של מים מעל.
   הערה: יש להקים מגש בקרה שלילי שבו צמחים לא מחוסנים עוברים תנאים סביבתיים זהים.
3. ודאו שספסל המעבדה מצויד במיכלים סטריליים של 100-500 מ"ל ddH₂O, המתאימים לנפח הצפוי של חיסון מושהה מחדש, מיקרופיפטה וקצוות.
4. לפני סיום שלב הדגירה, כריתה במהירות עשרה עלים בבסיס הפטיול מצמחי המלאי שנבחרו. הניחו צמחים בתבנית פטרי עם מים סטריליים.
   הערה: קריטי להשתמש ברקמה טרייה שנכרתה לצורך חיסון עלים כדי למנוע ייבוש עלים.
5. לאחר 2.5 שעות, פיפטה של 50 מיקרוליטר סורפקטנט לתמיסת השעיה מחדש של 1 ליטר (ריכוז של 0.005% סורפקטננט) ומערבבים בעדינות את הבקבוקון לערבוב (איור 2A). וודא נגישות למגש רבייה להנחת הצמחים לאחר החיסון (איור 2B).
6. מניחים את הצד האחורי של העלה כלפי מעלה וחתכו בניצב לאורך העבה האמצעית לחתיכות באורך 1 ס"מ בעזרת סכין (איור 2C).
7. הניחו מיד עלים חתוכים טריים בצינור בנפח 50 מ"ל, המתאים למערבל הצינורות המסתובב, כדי לשמש כחומרי חיסון.
8. שפוך אינקולום לצינור האקספלנט בנפח כדי לרווי את כל החומר ואז ערבב במיקסר סיבובי למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר לצורך החיסון (איור 2D,E).
9. הסר את כל העלים המחוסנים מהתמיסה עם מלקחיים והניח אותם ישירות במגש ההתרבות המוכן.
10. הפרדו ופזרו את הצמחים הרטובים כך שייטבלו חלקית אך לא לגמרי בשכבת המים הדקה מעל מגבות נייר רוויות (איור 2F).
    זהירות: שמרו על תנאים אספטיים והימנעו מכל מגע עם משטחים או כלים המשמשים במהלך הליכי אגרובקטריה לפני חיטוי.
11. אטום כל מגש בניילון נצמד ודוגר בחושך בטמפרטורת סביבה (22°C) למשך שלושה ימים.
12. בסיום תקופת החושך, ודאו שהמגשים אטומים בניילון נצמד שקוף ותקנו את המגשים עם ddH₂O לשמירת רמת הלחות.
13. העבר את מגשי החיסון לתא צמיחה בתנאי התרבות וגטטיבית.
    אזהרה: לאחד פסולת חיסון במיכל פסולת, לטפל בה בתמיסת אקונומיקה של 10%, ולהשליך אותה בהתאם להנחיות הבטיחות הביולוגית.

4. התחדשות צמחי רוזטה והקמת דור R1-T1

1. בדקו את מגשי החיסון 2-3 פעמים בשבוע כדי להבטיח תנאים נקיים ולחים.
   1. הוסיפו ddH₂O באמצעות בקבוק סחיטה. אם יש זמין, יש לערפל עם בקבוק ריסוס לפני שאוטמת מחדש את המגשים.
   2. שמור על לחות גבוהה על ידי החלפת ניילון נצמד שאיבד את ההיצמדות או מראה סימני זיהום (למשל, עכירות מים נראית לעין).
2. בדקו ויזואלית שתילי רוזטה משוחזרים לתכונות התאמה להשתלה. מתחדשים אידיאליים יציגו ענף שלם עם מספר עלים ושורשים באורך של לפחות 2-3 מ"מ (איור 2G).
   הערה: צמחי רוזטה טרנסגניים בדרך כלל מתחדשים לאט יותר, בדרך כלל מגיעים להתאמה להשתלה 21-28 ימים לאחר שהונחתם בתא הצמיחה.
3. אקסיז והשתלה של שתילי רוזטה טרנסגניים שלמים בתנאים זהים למתחדשים קלונליים של WT.
4. (אופציונלי) רשמו את מספר הטרנספורמנטים המשוחזרים והתאימו לתנאי הטרנספורמציה שלהם כדי להעריך יעילות.
   הערה: יש להיזהר במיוחד במהלך הבחירה. מתחדשים טרנסגניים לעיתים קרובות קטנים וקל להתעלם מהם. בדקו בקפידה את משטחי העלים האדיקסאליים והאבאקסיליים באמצעות מלקחיים כדי למקסם את התפוקה ולהפחית נזק.
5. להסיר את שתיל הרוזטה, תוך הימנעות ממגע עם עלים טרנסגניים. גזום כל עלווה עודפת שמסביב לעלה הטרנסגני. שתלו צמח אחד לכל עציץ.
6. דשן במהירות, השקה וריסוס כל צמח ומניח מתחת לכיפה מפלסטיק לשמירת לחות (איור 2G,H).
7. תווית והקלטה של כל שתיל טרנסגני.
8. החזירו צמחים שמכילים טרנספורמנטים שחסרים ניצנים, שורשים, או שנראים קטנים מדי להשתל למגש ההתרבות להמשך סינון. השתלת טרנספורמנטים נוספים כאשר הצמיחה מספיקה.
9. השתלות ערפל ומים מדי יום בשבוע הראשון. ודאו שתמיד יש מים במגש.
10. הסר והשליך כל השתלה שהתיישנה או שאינה מציגה עוד ביטוי פיגמנט RUBY.
    אזהרה: יש להיפטר מכל החומרים הטרנסגניים בהתאם לתקנות הבטיחות הביולוגית המוסדית.

5. התחדשות מאוחרת והקמת דור R2-T1 כמעט קלונלי

1. לאחר שצמחי הרוזטה מתפתחים לצמחים גדולים ובריאים (2 חודשים), אקסייז מרחיב עלים מבטאי רובי מנזר אחד (איור 2H).
   הערה: בעוד שעלים המבטאים רובי עשויים להיראות אדומים אחידים, הם לרוב כימריים. שני הפנוטיפים מתאימים להתפשטות. המשך בשיטות רבייה צמחונית סטנדרטיות בשלבים הבאים.
2. מחלקים את חלקי העלה שעברו שינוי צורה והניחו אותם במגש רבייה. יש לסמן בבירור כל מגש התרבות עם מזהה התורם המתאים.
   זהירות: אין לערבב עלים מכמה שתילים באותו מגש. כל שתיל מייצג אירוע טרנסגני ייחודי ויש לעקוב אחריו כדור נפרד.
3. ההשתלה חידשה צמחי R2-T1 (14-28 ימים לאחר ההתרבות). הקצה לכל צמח מזהה חדש המשקף את הסטטוס השני שלו. המשך את הטיפול הסטנדרטי לאחר ההשתלה כפי שתואר קודם (איור 2I,J).

תוצאות

פרמטרי הטרנספורמציה של A. tumefaciens הותאמו לייצור הצמחים הטרנסגניים המבטאים את רובי, R. aquatica , תוך עקיפת מגבלות העקריות תוך ניצול קצב ההתחדשות הא-מיני המהיר שלו (איור 1 ואיור 2). לאחר שחתיכות העלים חוסנו ונחשפו לטיפול כהה של 72 שעות, צמחים מתחדשים החלו לגדול תוך שבועיים בתנאים שתוארו. שתילים שהתחדשו עם מגזרים כימריים של RUBY שהיו גדולים מספיק להשתלה נמצאו בין 3 ל-5 שבועות לאחר ההעברה (איור 3) והיו קטנים במקצת מאלו שהתבטאו את הרוזטה. לא נמצאו צמחים מחודשים של RUBY על מגשי הביקורת, מסוג פראי, מה שמאשר שתופעה זו שונה מהפיזיולוגיה של R. aquatica . סוג מרק תרבית חיידקים, סוג מרק חיסון מחדש, שיטת החדירה ותקופת החיסון לא היו שונים משמעותית ביכולתם או בקצב ייצור טרנספורמנטים (טבלה 2 וטבלה 3). גורמי טיפול שהשפיעו לטובה על יעילות הטרנספורמציה כללו ריכוז מוגבר ל-AS וטיפול בחשיפת אוקסין לפני חיסון העלים ללא שתיל. ריכוז מוגבר של סורפקטנט השפיע לרעה על התפוקה ונמצא כבלתי מתאים.

גרסה R 4.4.2 12,13,14,15 שימשה לביצוע ניתוח Poisson General Linear Mixed Model (Poisson GLMM) של נתוני ספירת צמחי רוזטה. עם זאת, בניסוי D (טבלה 2D), שבו נבדקו מתחדשים מבוטאים ב-RUBY לחיסון של 15 דקות עם 150 מיקרומום AS או 225 מיקרומום AS, המודל הפר את ההנחות הנובעות מחוסר פיזור, ובמקום זאת הוחל GLMM בינומיאלי שלילי.

ההשפעות של תנאים שונים של מרק חיידקים ותרבות על יעילות הטרנספורמציה נבדקו בקפידה. מבין חמשת השכפולים הניסיוניים, השימוש במרק LB של מילר או במרק MG/L ספציפי לטרנספורמציה, הוביל לכך שטרנספורמנטים הביעו RUBY בפרמטרים כמעט זהים ולא היו שונים משמעותית בהשפעותיהם (טבלה 2A). האמצעים של RUBY ביטאו שתילים מחודשים מחלקי עלה בודדים, שכללו 15-60 צמחים בכל טיפול, נעו בין 1.61 ± 0.71 שתילים מתחדשים שנוצרו מניסויים שהשתמשו במרק תעתיק תרבית LB ולא-MS (ציר השראה בקרה, טבלה 1) ו-3.23 ± 1.13 מתחדשים מניסויים שכללו MG/L ומרק אינדוקציה אופטימלי. למרות היעדר הבדל משמעותי, בשל תצפיות סובייקטיביות, נבחרו תרבית MG/L ומרק אינדוקציה אופטימלי (טבלה 1) לניסויי אופטימיזציה עתידיים.

לאחר מכן, בדקנו גורמים המשפיעים על עומס חיידקים ועל היכולת לגשת לרקמת צמחים מריסטמטית. מבין שמונה שכפולים (טבלה 2B), צמחים משוחררים עם ריכוז מוגבר של 0.01% הראו לחץ קיצוני חודש לאחר מכן, מה שהוביל למתחדשים קטנים וברובם לא ברי קיימא. לא נראה שהיו טרנספורמטנטים מחודשים בין השכפולים הללו, אם כי הפנוטיפ המתחדש המודגש של האקספלאנטים היה פיגמנטציה בורדו, חום וצהוב, כך שייתכן שהיו טרנספורמנטים פוטנציאליים. בכל מקרה, אי-הקיימות של המתחדשים אישרה שמירה על ריכוז של 0.005% סורפקטנטים.

שתי טכניקות מכניות, ערבוב או חדירת ואקום, הושוו בהשפעתן כדי להכניס את ה-DNA הרצוי לצמח המארח. שיטת החדירה הבקרתית, שבה הוצגו ב-50 מ"ל של אינוקולום מושהה מחדש וסובבו במערבל צינורות, הצליחה לייצר רגנרנטים המובעים על ידי RUBY לאורך כל הטיפולים הרשומים. חדירת ואקום מיושמת ייצרה גם רגנרנטים המובעים על ידי RUBY, אך לא הייתה שונה ביעילות הטרנספורמציה שלה לעומת שיטת הבקרה (p = 0.478, טבלה 2D). נצפו כ-2-5 רגנרנטים המובעים על ידי RUBY בכל מגש התפשטות, בין אם מחוסנים באמצעות חדירת ואקום או ערבוב פיזי.

ריכוז החיסון החיידקי המתוקן של אצטוסירינגון (AS) היה שונה בבירור בהשפעתה על יעילות הטרנספורמציה. הגדלת ריכוז AS מ-150 מיקרומום ל-225 מיקרומולר שיפרה משמעותית את ייצור ה-RUBY המבטא באקסטלנטים טרנסגניים (p = 0.000309, 0.000458; טבלה 3C,D). מבין ארבעת הניסויים, כל טיפול כלל מגש עם 40 צמחים מחוסנים שטופלו באותו אופן. אלו שחוסנו בריכוז הגבוה הצביעו בממוצע כמעט 5 מחדשי RUBY לעומת טרנספורמטנט אחד לכל מגש AS בקרה (טבלה 3C). יתרה מזאת, אפקט ה-AS נראה נפרד מתקופות משך החיסון.

מבין שלושת הניסויים עם משך חיסון של 15 דקות, שכללו אקספלנטים מתוקנים עם 225 מיקרומום AS, נמצא ממוצע של 7.28 ± 4.13 מתחדשים בביטוי RUBY, שהיה ברור שהוא גבוה יותר מהטיפולים של 150 מיקרומון, כאשר 2.03 ± קצב התחדשות של 1.32 (טבלה 3D). לא נראה השפעה ברורה על מרווח הזמן בין טיפולי AS של 150 מיקרומום (p = 0.676), כאשר קצב החיסון הממוצע של 10 דקות היה 1.48 ± 0.954 לעומת 1.84 ±-1.230 חיסונים של 15 דקות (טבלה 3B). באופן דומה, 10 דקות ו-225 מיקרומום שיקמו בערך 5 שתילים של רוזטה שבוטאו ב-RUBY בכל טיפול, מה שלא היה שונה בבירור מטיפולי חיסון של 15 דקות, שבהם הוצגו 6-7 מתחדשים למגש הטיפול (טבלה 3A).

בנוסף, נבדק הורמון הצמח אוקסין, המסייע להתחדשות הצמחים בכלל. חשיפת חתיכות עלים שזה עתה נכרתו לטיפול בפולס אוקסין לפני החיסון השפיעה באופן חיובי ברור על עלייה בהתחדשות RUBY בהשוואה לאלו ב-ddH₂O (p = 0.00969, טבלה 2C). כאשר הוצבו ב-ddH_2.0עם 285 מיקרומום אינדול-3-אצטית חומצה (IAA), האקספלנטים הציגו קצב טרנספורמנט ממוצע של 6.67 ± 1.490 לכל טיפול לעומת טיפול ללא אוקסין, שממוצע קצב התחדשות של 2.00 ± 0.816.

הקו הטרנסגני שהתחדש מיד סומן כדור R1-T1 (איור 2), עם רגנרנטים בודדים כקווים. כל צמחי הרוזטה הראשוניים של R1-T1 הציגו ביטוי RUBY בצורת עלים כימריים, עם מגוון דפוסים כימריים. בדרך כלל 1-3 עלי שתיל ביטאו כימרות מובחנות, כאשר הרקמה המובעת על ידי RUBY והרקמה הלא מבוטאת התפצלו במרצע. רוב שתילי R1-T1 בני חודש שמרו על ביטוי כימרי (איור 3A), אך נמצאו מספר קטן של שתילים שהביעו רק רובי.

סקטורים כימריים עם פיגמנט רובי שהתרבו אל-מינית מחלקי עלי שתיל R1-T1 (איור 3B) התחדשו מחדש או שתילים מלאים של RUBY או כימרי R1-T1 בתוך 2-4 שבועות לאחר הכריתה (איור 3C). לאחר חודש, רוב שתילי R2-T1 הציגו בעיקר עלי RUBY, כאשר חלקם הראו אזורים כימריים קטנים שלא מבוטאים (איור 3D,E).

איור 1: פרוטוקול ולוח הזמנים של ההתרבות הוגטטיבית. תמונות מייצגות ממחישות את צינור הייצור המשמש לשיקום צמחי רוזטה א-מיניים. (א) כריתת עלים בוגרים, בריאים ומלאים עם אונות מצמחים אם מבוססים, וחתיכתם ל-2-3 חלקים. (ב) הנחת צמחים בתבנית רבייה ותחזוקה שלהם בתנאים מוגדרים. לאחר 3 שבועות, שתילי הרוזטה נכרתו מהצמחים האקסטים והועברו לתווך הקרקע. להלן תמונה אמיתית של הרוזטות המתחדשות שעדיין מחוברות (חצים ורודים) לגזם עלה האם. צמחים אלו נמצאים בשלב האופטימלי להשתלה. פס קנה מידה: 10 מ"מ. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של הדמות הזו.

איור 2: טרנספורמציה של ייחורי עלי R. aquatica והתחדשות של טרנספורמנטים המבטאים תעתיקי RUBY . סקירה גרפית של תהליך הטרנספורמציה וייצור מתחדשים שעברו טרנספורמה. (א) השגת חיסון חיידקי. (ב) הכנת מגש רבייה עם נייר סינון סטרילי ומים. (ג) כריתת עלים לחתיכות שפרט. (ד) טבילה של צמחים חיצוניים בחינוקולום. (ה) ערבוב במיקסר סיבובי למשך 20r/1 דקה למשך 10 דקות. (F) פיזור צמחים רוויים במגש, מכסה בכיפה מפלסטיק, ודגירה בתנאי חשוך למשך 72 שעות. (G,H) לאחר חודש, הסרת צמחים מתחדשים שהפכו שלמים מצמחים חשופים לאגרובקטריה והשתלה להקמת צמחים בוגרים. (I,J) חזרה על שלב ההפצה (G,H) ליצירת דור כמעט קלוני של R2-T1. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 3: דורות שהתרבו אסקסואלית של קו טרנסגני RUBY . (A) שתיל בוגר R1-T1 המציג עלים כימריים הנושאים ביטוי RUBY . פס קשקש: 1 ס"מ. (B) שניים מתוך עשרים שתילים שהונחו טריים במגש ריבוי מהשתיל בן 3 החודשים המוצג ב-(A). הצמחים החיצוניים מציגים דפוס כימרי של RUBY המופרד במרכז העצל. פס קשת: 1 ס"מ. (C) שתילי רוזטה R2-T1 שהתחדשו עם דרגות שונות של ביטוי כימרי של RUBY , חודש לאחר הכריתה לפני ההשתלה. שורשים חיוביים של RUBY מחודש (חץ מרון חץ). פס קשקש: 2 ס"מ (D) שתיל R2-T1 שהוצג חודש לאחר ההעברה, מציג ביטוי RUBY . פס קשקש: 2 ס"מ. (E) שתיל R2-T1 בוגר 3 חודשים לאחר ההשתלה מציג מגזרים קטנים (חצים ירוקים). פס קנה מידה: 2 ס"מ. אנא לחצו כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של הדמות הזו.

איור 4: תרשים זרימה של הצינור האופטימלי. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

טבלה 1: ניסוחי מדיה אנא לחצו כאן להורדת הטבלה הזו.

טבלה 2: השפעת ארבעה פרמטרים לאופטימיזציה על יעילות הטרנספורמציה של R. aquatica. אנא לחצו כאן להורדת הטבלה הזו.

טבלה 3: השפעת ריכוז האצטוסירינגון באינוקולום על יעילות הטרנספורמציה שלR. aquatica. אנא לחצו כאן להורדת הטבלה הזו.

דיון

במחקר זה, קבענו טרנספורמציה יציבה פשוטה, מבוססת רגנרציה ישירה, המתווכת על ידי אגרובקטריום, של R. aquatica, צמח דו-חי מסוג Brassicaceae שמתרבה רק באופן אל-מיני^10,16. צינור טרנספורמציה מקיף של צמחים דו-חיים שמתרבים צמחית טרם הוכח, וגם לא נוצל היכולת הטרנספורמציה המעשית של R. aquatica עם סמן חזותי. ראוי לציין כי צינור זה אינו דורש תהליך תרבית רקמות צמחים עקשן וסטרילי או דוגמות גידול צמחים ייעודיות. לכן, פרוטוקול זה יכול להיות מאומץ באופן נרחב במגוון מסגרות ניסוי, ממעבדות מחקר מדעיות ועד לכיתה.

מבין תנאי החיסון והדגירה השונים שנבדקו, מספר גורמים שיפרו משמעותית את יעילות הטרנספורמציה. ראוי לציין כי ריכוז אצטוסירינגון (AS) מעט גבוה יותר וכן ריכוז חומצה אינדול-3-אצטית (IAA) השפיעו לטובה על יעילות הטרנספורמציה (טבלה 1 וטבלה 2). AS הוא תרכובת פנולית שמושכת אגרובקטריום, והוכח כי היא משפרת את יעילות הטרנספורמציה של צמחים ב-Arabidopsis¹⁷. הפיטוהורמון אוקסין הוא מרכזי לתכנות מחדש של תאי הצמח. נרשמה עלייה מהירה בביטוי גנים הקשור לאוקסין במהלך ההתחדשות^המושרה על ידי הפצע. מסיבה זו, ניתן להניח כי אוקסין חיצוני (IAA) שמופעל במהלך חיסון מחוץ לצמחייה מעלה את יעילות ההתחדשות. עם זאת, לא נצפו הבדלים במספר הצמחים המתחדשים שנצפו משלושה ניסויים (57 7.55 לעומת 59.67 5.51 בקרב קבוצת ביקורת לעומת טיפול). לכן, טיפול באוקסין עשוי לסייע בתהליך הטרנספורמציה ולא בהתחדשות עצמה.

סורפקטנט לא-יוני, טריסילאן אלקוקסילאט (המכונה סילווט L-77), משפר משמעותית את יעילות הטרנספורמציה של ערבידופסיס באמצעות שיטת הטבילה הפרחונית³, ולכן הוא בשימוש נרחב בקרב קהילת ביולוגיית הצמחים. נצפה עומס צמחי מינימלי בקרב צמחים משודרגים עם Silwet L-77 ב-0.005% (הריכוז המומלץ לטבילה פרחונית). כאשר מינון זה הוכפל (0.01%), ייחורי העלים של R. aquatica ניזוקו קשות, מה שהוביל להחלמה כמעט ללא טרנספורמנטים (טבלה 2B). במהלך טבילה פרחונית של ארבידופסיס, השימוש בסורפקטנטים מפחית את מתח הפנים של האינקולנטים ומגביר את הגישה לניצני פרח. לעומת זאת, כמין צמח דו-חיים, R. aquatica מפתח עלים חלקים ללא טריכומות או קוטיקולות עבות⁵. עלייה בסורפקטנט גרמה לנזק לרקמת העלה, מה שמעיד כי יש להעדיף גורמים נוספים מלבד סורפקטנט ליעילות השינוי ברקמות עלים שאינן מתפתחות. סרפקקטנט רלוונטי יותר לפנוטיפ של גיל ההתבגרות, שם הוא מקל על חדירת רקמות. לאחר אינטגרציה של כל הפרמטרים שנבדקו, מסופק צינור עם התנאים האופטימליים ביותר כתרשים זרימה (איור 4).

שימוש בסמן ויזואלי, RUBY, הוא חיוני לצינור הטרנספורמציה הזה. RUBY הוא מדווח סינתטי המקודד שלושה גנים מקודדים (CYP76AD1, DODA וגלוקוזיל טרנספראז) שמסנתזים פיגמנט אדום בוהק, בטאלין¹¹. כאשר נצפה ביטוי RUBY במתחדשים של R1-T1, הוא הראה ביטוי כמגזרים אדומים, מה שמעיד שהם ככל הנראה כימריים (איור 2 ואיור 3). מחקר קודם חשף כי התחדשות R. aquatica נובעת מקמביום וסקולרי של עלה חתוך¹⁰. באופן מרשים, מתחדשים של R1-T1 מציגים לעיתים גבול כימרי לאורך הווריד, כאשר חצי מהלהב אדום והחצי השני ירוק (איור 3A,B). התחדשות ממגזרי RUBY הניבה לעיתים שתילים אדומים לחלוטין עם שורשים אדומים (איור 3C, חץ בורדו), שגודלו לאחר מכן לצמחים אדומים אחידים בצבע R2-T1 (איור 3D). לא נצפו השפעות לוואי של ביטוי יתר של RUBY על גדילה והתפתחות של R. aquatica (איור 3). לתמיכה, לא נצפו הבדלים ניכרים בגודל ובצורת עלי רוזטה R1-T1 עם מגזרי RUBY (למשל, איור 3B). ייתכן שכל טרנסגן חזק ומונע על ידי פרומוטרים עלול להפריע לצמיחה תקינה של הצמח ולתגובה הפיזיולוגית.

במקרים מסוימים, צמחי ה-RUBY 'כמעט הקלונליים' הללו פיתחו מגזרים ירוקים (איור 3E, חצים ירוקים), שמרמזים על חזרה או השתקת גן טרנסגני. דבר זה מצביע על כך שסמן גלוי כמו RUBY הוא חיוני לביטוי חוץ-רחמי או להשתקה (למשל, RNAi) של גן רלוונטי למחקרים מולקולריים ומכניים עתידיים. ניתן להכניס גן טרנסג'יני מעניין לקלטת RUBY ולצפות בפנוטיפים במגזרים האדומים ו-RUBY . לסיכום, תוך ניצול התכנות הישיר המושרה על ידי כריתת העלים וסמן גלוי לא פולשני, מותאם צינור טרנספורמציה פשוט ויעיל עבור R. aquatica, משפחת Brassicaceae המתפשטת וגטטיבית. למרות שזה מחוץ להיקף הפרוטוקול הזה, הבנה עתידית של המקור המדויק של ההתחדשות של R. aquatica שטרנספורמציה עשויה לספק תובנות לגבי תכנות מחדש תאי בצמחים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
1000 ומיקרו; קצה פיפט LTS מסונן עם אחיזה נמוכה	ריינין	30389213
אצטוסירינגון	סיגמא-אלדריץ'	D134406-1G
תמצית שמרי בקטו, טכני	פישר סיינטיפיק	DF0886-17-0
BD בקטו אגר	פישר סיינטיפיק	214030
BD Difco LB ברות', מילר	מידלנד סיינטיפיק	DIFCO 244610
BD Bacto טריפטון מיובש	פישר סיינטיפיק	DF0123-17-3
אבקת ביוטין ליופילית	סיגמא-אלדריץ'	B4501-100MG
כיפות נקיות למגשי PermaNest	פתרון המגדל	GD221
ניילון נצמד שקוף	תומאס סיינטיפיק	22-305654
ורמיקוליט גס	בקטין
די-אשלגן מימן פוספט אנהידרוס	סיגמא-אלדריץ'	105109
צלחות פטרי חד-פעמיות בגודל 100 על 15 מ"מ	VWR אינטרנשיונל	25384-342
D-מניטול	סיגמא-אלדריץ'	M9546-250G
אתנול, 200 proof	פישר סיינטיפיק	04-355-720
צינורות צנטריפוגה חרוטיים של פלקון 50 מ"ל	פישר סיינטיפיק	14-432-22
מגבות נייר מקופלות בגודל 9.3" x 10.5"	קימברלי-קלארק	2920
ספקטרופוטומטר GENESYS 30	תרמו-סיינטיפיק	840-277000
תמיסת גנטמיצין	סיגמא-אלדריץ'	G1272-100ML
מלח מונונסודיום L-גלוטמית הידראט	סיגמא-אלדריץ'	G1626-100G
כלוריד מגנזיום	סיגמא-אלדריץ'	M8266-100G
מגנזיום סולפט, הפטהידרט	סיגמא-אלדריץ'	M9546-250G
מנער החממה MaxQ 6000	תרמו-סיינטיפיק	SHKE6000
MES הידרטי	סיגמא-אלדריץ'	M8250-100G
תערובת מלח בסיס Murashige ו-Skoog (MS), אבקה	סיגמא-אלדריץ'	M5524-50L
MX-RL-pro: סיבוב צינור רוטיסרי	סקילוגקס	824222019999
מיו-אינוסיטול	סיגמא-אלדריץ'	I7508-100G
חדר הצמיחה פרסיבל	פרסיבל	AR36L3
תוסף קרקע לזריעה בפרלייט	PVP Industries	PVP105408
מגשי צמחים Perma-Nest בגודל 8''x12''	VWR אינטרנשיונל	470150-476
מד pH שבע קומפקט 5220	מטלר טולדו	30019028
סקלפל מוגן	פישר סיינטיפיק	02-688-79
ריפמפיצין	סיגמא-אלדריץ'	R3501-5G
שחרור חכם לדשן מזון צמחי	אוסמוקוט	B0071CZTBA
כלוריד נתרן	פישר סיינטיפיק	S271-3
ספקטינומיצין דיהידרוכלוריד פנטהידרט	סיגמא-אלדריץ'	S4014-5G
בקבוקי ריסוס עם אידוי משאבת	תומאס סיינטיפיק	1141V43
פוטים ריבועים בגודל 3.5 אינץ'	Growers Nursery Supply Inc.	03GA-0350S
סוקרוזה	סיגמא-אלדריץ'	S0389-5KG
Sunshine #4 אדמת תערובת גידול מקצועי	Sun GRO הורטיקולטורה	1341CFL0028P S
סרפקקטנט - סילווט L-77	פישר סיינטיפיק	NC1791615
מייבש ואקום	מחסן המעבדה	55207
מזון צמחי רב-שימושי מסיס במים	מירקל-גרו	160101