מאמר שיטה

מיפוי מרחבי משופר של שכבות שרירי הקיבה בעכברים באמצעות טכניקת גלגול שוויצרית מותאמת

DOI:

10.3791/69673

⸱

25 בנובמבר 2025

 ,  ,  ,  , 
1Enteric Neuroscience Program and Department of Physiology and Biomedical Engineering, Mayo Clinic College of Medicine and Science, 2Gastroenterology Research Unit, Division of Gastroenterology and Hepatology, Department of Medicine, Mayo Clinic College of Medicine and Science, 3Division of Gastroenterology and Hepatology, Department of Medicine, Mayo Clinic College of Medicine and Science

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר שיטת צביעת חיסון לכל הקיבה, שעובדה על ידי טכניקת "Swiss roll" שפותחה במקור למעי העכברים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טכנולוגיות "אומיקס" מרחביות מספקות הזדמנויות חסרות תקדים לחקור את הביולוגיה והאינטראקציות של תאים בודדים במערכת הנוירומוסקולרית של הקיבה בסביבת הרקמה הטבעית שלהם. עם זאת, יישום מוצלח של גישות אלו והערכת הבדלים מבניים ומולקולריים בין הקרקעית, הקורפוס והאנטרום דורשים דגימה עקבית וכיוון רקמות. כאן, אנו מדווחים על טכניקת "גלגול שווייצרי" מותאמת לקיבת העכבר, המאפשרת להטמיע ולהמחיש את כל האזורים האנטומיים המרכזיים בקריוסקציה אחת. גישה זו מדגישה קיבוע שטוח ומיקום מדויק ליצירת חתכים עם כיוון ואיכות שחזוריים. מחקר זה גם אופטימיזציה של תנאי צביעת אימונופלואורסצנציה כדי להבטיח ויזואליזציה איכותית של סמנים תאיים. פרוטוקול זה מאפשר השוואות מקיפות וצמודות של אזורי קיבה תוך מזעור אובדן רקמות ושונות ניסיונית. על ידי שיפור שימור הרקמות והכיוון המרחבי, שיטה זו מציעה כלי מעשי וניתן להרחבה לחוקרים החוקרים ביולוגיה קיבתית הן בהקשרים פיזיולוגיים והן בהקשרים פתולוגיים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הקיבה היא איבר מורכב בצורת J שמחבר את הוושט לתריסריון1. הוא מחולק לשלושה אזורים אנטומיים עיקריים: הקרקעית, הקורפוס והאנטרום1. כל אזור בטוניקה מוסקולריס של הקיבה ממלא תפקיד פיזיולוגי מובחן, ותורם לתפקודים קיבתיים מרכזיים כגון התאמות, ציות, ריכוז מזון וריקון 1,2. חקר שינויים בפיזיולוגיה ובפתולוגיה של הקיבה דורש ניתוח מפורט של אזורים אלו ושל מבנה התאים שלהם.

כדי להמחיש שטחים גדולים של רקמה, חוקרים לעיתים קרובות מאמצים את טכניקת "גליל שוויצרי", שפותחה במקור למעי העכברים 3,4,5,6. מחקר זה שינה את טכניקת הגלגול השווייצרי לשימוש בקיבת העכברים כדי לקבוע פרוטוקול חדש. הקיבה מופרדת תחילה לאזורים אנטומיים שלה ומקובעת במצב שטוח. הרקמה מגולגלת ומעובדת בזהירות לצורך קריוסקציה. גלגול שוויצרי לא נכון עלול לפגוע במבנים אפיתליים שבריריים, במיוחד במעי, מה שמוביל לאיכות רקמה ירודה לצביעת חיסונים. שמירה על רקמה קבועה ומכוונת היטב עם מבנים תאיים שלמים היא חיונית להדמיה ברזולוציה גבוהה. עבודה זו מציגה שיטה חדשה ליצירת גלילים שוויצריים הכוללים את כל אזורי הקיבה בתוך בלוק קריובלוק אחד. בנוסף, מתואר פרוטוקול צביעה אופטימלי לאימונופלואורסצנציה עבור הטוניקה הקיבתית המוסקולריס, המאפשר הערכה מפורטת של תפקוד הקיבה. פרוטוקול זה מספק מדריך מקיף לקבלת תמונות אימונופלואורסצנציה איכותיות באמצעות הכנה קפדנית של רקמת קיבה, עיבוד גלילים שוויצריים וצביעה. על ידי שימור המורפולוגיה המורכבת של הטוניקה הקיבית המוסקולריס, שיטה זו מאפשרת הבנה עמוקה יותר של מבנה ותפקודה הן בבריאות והן במחלות.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניסויים בבעלי חיים נערכו לפי ההנחיות המפורטות במדריך המכון הלאומי לבריאות לטיפול ושימוש בבעלי חיים במעבדה. הפרוטוקולים אושרו על ידי ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים של Mayo Clinic (A48315-15). תוכניות ומתקני הטיפול והשימוש בבעלי חיים של Mayo Clinic נבדקו והוסמכו במלואם על ידי האגודה להערכה והסמכה של Laboratory Animal Care International (AAALAC). החומרים והציוד בהם משתמשים מופיעים בטבלת החומרים.

1. טכניקת גלגול שוויצרי לקינוח קיבה קבוע של פאראפורמלדהיד (PFA)

  1. הרדמו עכבר C57BL/6J (בן 8-10 שבועות) באמצעות שאיפת פחמן דו-חמצני (CO₂) למשך לפחות 3 דקות, ולאחר מכן פריקת צוואר הרחם כדי להבטיח המתת חסד (בהתאם לפרוטוקולים מאושרים על ידי המוסד).
  2. חתכו את הוושט, התריסריון, והמזוגסטריה הוונטרלית והדורסלית כדי להסיר את הקיבה.
  3. הניחו את הקיבה בצלחת מצופה סיליקון המכילה מלח קר עם בופר פוספט (PBS). הצמיד את הוושט, הקרקעית, הגופן והתריסיון כדי לשמש כהפניות לכיוון (איור 1A). כיוון החיתוך מסומן על ידי קו אדום מקווקף באיור 1A.
  4. הסר בזהירות כל שומן מחובר באמצעות מספריים ומלקחיים.
  5. חתכו לאורך המזנטריה הוונטרלית של התריסריסריון והקיבה עד לסיכה בגוף, ואז שטחו בעדינות את הרקמה (איור 1B).
  6. השתמש בפיפטה העברה מלאה ב-PBS כדי לשטוף כל שאריות מזון מהלומן הקיבה.
  7. מתוח בעדינות את הבטן הפתוחה כדי להגיע לכיוון שטוח (איור 1C).
    זהירות: הימנע ממתיחה מוגזמת (כלומר, יותר מ-110% מהממדים המקוריים) כדי לשמור על ארכיטקטורת הרקמות.
  8. טבלו את הקיבה ב-PFA קר של 4% למשך 2 דקות כדי לקבע בעדינות את הרקמה ולהקל על הגלגול.
  9. הצמיד את הרקמה שטוחה שוב אחרי הקיבוע הקצר.
  10. גזמו את הבטן לאורך קו המתאר המקווקט ליצירת צורה אחידה המתאימה לגלגול (איור 1C).
  11. הניחו את רקמת הקיבה הגזור על נייר סינון רטוב ב-PBS (איור 1D).
  12. גלגלו את הטישו לצורת גלגול שוויצרי ואבטחו אותה על ידי הכנסת קיסם דרך המרכז.
    אזהרה: ודאו שהצד הרירי פונה כלפי מעלה במהלך תהליך הגלגול. החזק את קצה התריסריון עם מלקחיים ביד אחת תוך כדי הכוונת קיסם ביד השנייה, בהתאם לשינויים קלים בשיטות שפורסמו.
  13. לאחר הגלגול, הכנס מחט 30-G כדי לקבע את צורתה וכופף אותה בזווית של 90° לייצוב הבטן המגולגלת (איור 1E).
  14. תקבע את הרקמה המגולגלת ב-4% PFA בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 6 שעות.
  15. העבר את הרקמה הקבועה לסוכרוז של 30% ב-PBS ודגר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 12-16 שעות להגנה קריופרוטיבית ומניעת היווצרות גבישי קרח.
  16. הסר בעדינות את מחט המייצב.
  17. הטמיעו את הרקמה בתרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית (O.C.T.) באמצעות תבניות בסיס חד-פעמיות, ואז הקפיאו על קרח יבש (איור 1F).
  18. לאחר הקפאה מלאה, יש לאחסן את התבנית בטמפרטורה של -80°C.
    זהירות: הימנעו מבועות אוויר ב-O.C.T., במיוחד סביב הרקמה, שכן הן מפריעות לחתך. ניתן לאחסן חסימות רקמה בטמפרטורה של מינוס 80°C למשך לפחות שנה אחת.
  19. לפני החיתוך, יש לאזן את הבלוק בטמפרטורה של מינוס 20°C למשך לפחות שעה.
  20. חתך את הרקמה בעובי 5 מיקרון באמצעות קריוסטט.
    אזהרה: עובי של 5-12 מיקרון מתאים בדרך כלל לחלקי קיבה בעכברים 7,8, וניתן לכוונתו בהתאם לצרכים ניסיוניים. ניתן לאחסן את החתכים בטמפרטורה של מינוס 20°C עד 3 חודשים.

2. צביעה אימונופלואורסצנטית ברקמת שריר הקיבה

  1. באמצעות עט מחסום הידרופובי, צייר מחסום דוחה מים סביב כל חלק רקמה במגלשית המיקרוסקופ.
  2. שטפו את החלקים עם PBS קר במשך 5 דקות כדי להמיס את תרכובת O.C.T. שנותרה.
  3. חסום קישור לא ספציפי על ידי דגירה של החתכים עם אלבומין סרום בקר (BSA) של 1% ב-PBS למשך שעה בטמפרטורת החדר (RT; 21-23 °C).
  4. הסר את ה-1% BSA באמצעות יניקה, ואז שטוף את החלקים שלוש פעמים עם PBS קר למשך 10 דקות כל אחד ב-RT (21-23 מעלות צלזיוס).
  5. חסום נוסף את הקישור הלא-ספציפי על ידי דגירה של החתכים עם תמיסת חסימת IgG עכבר על עכבר ב-PBS למשך שעה ב-RT (21-23 מעלות צלזיוס), מה שמפחית את הקשר של IgG אנדוגני ומשפר את הספציפיות בשימוש בנוגדן IgG לעכברים.
  6. הסר את תמיסת החסימה באמצעות יניקה, ואז שטוף את החלקים שלוש פעמים עם PBS קר למשך 10 דקות כל אחד ב-RT (21-23 מעלות צלזיוס).
  7. חזור על חסימת BSA למשך שעה ב-RT (21-23 מעלות צלזיוס).
  8. דגרו את החלקים בנוגדנים ראשוניים. אנוקטמין-1 (ANO1), KIT, בטא-טובולין מחלקה III (TUBB3) מדולל ב-BSA קר של 1% עם 0.3% טריטון X-100. בניסוי נפרד, השתמשו בשרשרת כבדה של מיוסין 11 (MYH11), E-cadherin ו-KIT. דגרו במהלך הלילה (12-16 שעות) בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  9. הסר את תמיסת הנוגדן הראשית באמצעות יניקה עדינה. שטפו את החלקים עם PBS קר שלוש פעמים למשך 10 דקות כל אחד ב-RT (21-23 מעלות צלזיוס).
  10. דגרו את החלקים עם נוגדנים משניים. Alexa Fluor (AF) 488 IgG נגד ארנבים, AF555 אנטי-עכברים IgG, ו-AF647 אנטי-עכבר IgG (כולם ב-5 מיקרוגם/מ"ל; 1:400) ב-1% BSA לשעה אחת ב-RT (21-23 מעלות צלזיוס).
  11. הסר את תמיסת הנוגדן המשנית באמצעות יניקה, ואז שטוף את החתכים שלוש פעמים עם PBS קר למשך 10 דקות כל אחד ב-RT (21-23 מעלות צלזיוס).
  12. צבעו את החתכים ב-4′,6-דיאמידינו-2-פנילינדול (DAPI, ב-1:300 דילול) למשך שעה ב-RT (21°-23 °C).
    אזהרה: גרעיני נוירונים בדרך כלל מראים אותות DAPI חלשים יותר מאשר סוגי תאי מערכת העיכול האחרים; מומלץ דגירה מינימלית של שעה אחת לצורך הדמיה מיטבית.
  13. שטוף את החלקים פעם אחת במים אולטרה-טהורים כדי להסיר מלחים שנותרו.
  14. התקן את המחסניות באמצעות Antifade Mountant.
  15. אטום את פינות הכיסוי עם לק לכה שאינו פלואורסצנטי. הסר כל מדיום התקנה עודף באמצעות יניקה עדינה. לאחר מכן, אטום את כל היקף הכיסוי.

3. הדמיית אימונופלואורסצנציה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי

  1. הקמת רכישת Z-stack רב-ערוצית בתוכנת ההדמיה הקונפוקלית על ידי הגדרת לייזרים וגלאיים ל-DAPI, AF488, AF555 ו-AF647, תוך הבטחת הפרדה ספקטרלית והימנעות מרוויית אותות.
    זהירות: כוון את עוצמת הלייזר וזמן החשיפה בנפרד לכל פלואורופור כדי למנוע דיבור צולב ולשמור על האות בטווח הדינמי בכל הערוצים (איור 2A).
  2. הגדר פרמטרי חשיפה בתוכנת ההדמיה הקונפוקלית כדי להימנע מרוויית פיקסלים ולשמור על פרטי האות באזורים בעוצמה גבוהה (איור 2B).
    זהירות: ודא שהאותות בכל הערוצים נשארים בטווח הדינמי ואינם מגיעים לרוויה.
  3. כדי ללכוד את כל גליל הקיבה השווייצרי, יש להשתמש בהגדרת תמונה גדולה (למשל, 6 × 6 שדות) (איור 2C); עם זאת, יש להתאים את ההגדרה הזו בהתאם לגודל הכללי ולהידוק של הרקמה המגולגלת.
  4. רכוש תמונות תלת-ממד באמצעות רכישת סדרת Z בתוכנת ההדמיה הקונפוקלית. תהליך העבודה המפורט לרכישה N-ממדית (ND) מוצג באיור 2D.
  5. בחר באפשרות Z-stack כדי להפעיל הדמיית סדרה Z.
  6. הגדר את טווח ה-Z על ידי קביעת מיקומי המוקד העליון והתחתון הכוללים את כל עובי הבטן כולה.
  7. הביאו את החלק העליון של הבטן לפוקוס ולחצו על כפתור העליון כדי להגדיר את מגבלת ה-Z העליונה.
  8. כוון את המיקוד לתחתית שריר הקיבה ולחץ על כפתור Bottom כדי להגדיר את מגבלת ה-Z התחתונה.
  9. הגדר את מספר צעדי ה-Z-stack ל-8 כדי לכסות את כל עומק שריר הקיבה.
  10. לחץ על Run עכשיו כדי להתחיל רכישת תמונות ב-Z-stack.
  11. ליצור הקרנות בעוצמה מקסימלית לערוצי פלואורסצנציה בודדים וממוזגים כדי להמחיש נתונים תלת-ממדיים בתמונה דו-ממדית.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בשיטה החדשה, גלילי הקיבה השווייצריים של עכברים כללו את שלושת האזורים העיקריים בקיבה: הקרקעית, הקורפוס והאנטרום, יחד עם חלק קטן מהוושט והתריסריון במקטע אחד. הכללת כל הקיבה בחלק אחד מאפשרת ניתוח אזורי מקיף (איור 1). צביעת המטוקסילין ואאוזין (H&E) של תמונות שלמות של גלילי הקיבה השווייצריים הדגימה ארכיטקטורה קיבתית שמורה היטב בכל האזורים, ואפשרה ויזואליות ברורה של שכבות הריר, התת-רירית והשרירים (איור 3). איור 4 מציג צביעה אימונופלואורסצנטית מייצגת של תאי בין-תאי Cajal (ICC; תאי קוצב הלב המייצרים גלים איטיים קצביים הבסיס לתנועתיות המעי הפזית; מזוהה על ידי KIT ו-ANO1), נוירונים מעיים (נוירונים במערכת העצבים המעיים המתאמים את תנועתיות מערכת העיכול; מזוהים על ידי צביעת חיסון TUBB3), וגרעינים (DAPI). ברירית הקיבה, KIT מתבטא גם בתאי פנת' וגביע כפי שדווח קודם 9,10,11. ANO1 מתבטא גם באופן נרחב באפיתל הקיבה, במיוחד בתאי האפיתל העמודיים של הקרקעית, בהתאם לתפקידו בהעברת כלוריד ובהפרשה רירית11. בנוסף, TUBB3 מתבטא בתאים אנדוקריניים מסוימים בקיבה ובתאים מפרישי ריר, לפי נתוני אטלס חלבון אנושי12,13. איור 5 מציג צביעות אימונופלואורסצנטיות מייצגות של תאי שריר חלק המסומנים על ידי MYH11, תאי אפיתל רירית קיבה המסומנים על ידי E-cadherin, ו-ICC המסומנים על ידי KIT. MYH11 מתבטא גם במיופיברובלסטים ברירית הקיבה, כפי שדווח קודםלכן ב-14. יחד, תוצאות האימונופלואורסצנציה הללו מאשרות שהפרוטוקול שלנו שומר על ארכיטקטורת הרקמות.

איור 1
איור 1: הכנת "גליל שווייצרי" של קיבת העכבר לצורך קריוסקציה. (א) כל הקיבה מונחת בצלחת כריתה מצופה סיליקון שחור המלאת במי מלח קר עם פוספאט (PBS) מיד לאחר ההסרה לשמירת שלמות הרקמה. (ב) הקיבה נפתחת לאורך נקודת האמצע של התריסריריון. (ג) הבטן נמתחת בעדינות ומהודקת בצלחת כדי לשכב שטוח ללא מתח מופרז. קו אדום מקווקו מסומן לאורך הרקמה כדי להצביע היכן יש לגזור אותה כדי להקל על הגלגול. (ד) הבטן הפתוחה והקבועה מונחת על נייר סינון רטוב ב-PBS כהכנה לגלגול למצב קומפקטי. החץ האדום מראה את כיוון התהפכות הבטן. (ה) חלקי הרקמה מוטמעים בתרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית (O.C.T.) ומוקפאים על קרח יבש כהכנה לקריוסקציה. (F) הבלוקים המוקפאים מאוחסנים בטמפרטורה של −80°C ומבצעים קריו-סקציה בעובי של 5 מיקרון לניתוח במורד הזרם. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 2
איור 2: הגדרת רכישת ND וויזואליזציה של רוויה במהלך צילום Z-stack. (א) הגדרות לייזר וגלאי מוגדרות בתוכנת הדמיה קונפוקלית להדמיה ספקטרלית רב-ערוצית. נעשה שימוש בארבעה פלואורופורים: 4′,6-דיאמידינו-2-פנילינדול (DAPI), אלקסה פלור 488 (AF488), אלקסה פלור 555 (AF555), ואלקסה פלור 647 (AF647), כל אחד מהם משולב עם לייזרי עירור וגלאי פליטה מתאימים. הגרף הספקטרלי מציג עקומות עירור ופליטה, ומאפשר התאמה למזעור דיבור צולב ואופטימיזציה של זיהוי אותות. (ב) הגדרות החשיפה מותאמות בנפרד לכל פלואורופור כדי למנוע רוויה של פיקסלים ולשמר פרטים באזורים בעוצמה גבוהה. (ג) הגדרת צילום תמונה גדולה (למשל, 6 × 6 שדות) מאפשרת ויזואליזציה של כל גליל הקיבה השווייצרי; יש להתאים את גודל שדה התמונה בהתאם לגודל ולקומפקטיות של הרקמה המגולגלת. (D) חלון רכישה ND המציג הגדרות פרמטר Z-stack. טווח ה-Z מוגדר על ידי בחירת המיקום העליון והתחתון של שריר הקיבה, עם שמונה שלבים המוגדרים ללכידת עומק הרקמה המלא לניתוח תלת-ממדי (3D). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 3
איור 3: תמונה של גליל שוויצרי בקיבת עכבר מוכתמת בהמטוקסילין ואאוזין. סריקת אריחים מדגימה את היכולת לדמיין את כל גלגול הקיבה השווייצרי של עכבר נקבה בת 8 שבועות מדגם C57BL/6J. אזורים אנטומיים עיקריים מסומנים, כולל הוושט (קו אדום מקווקו), הסוגר התחתון של הוושט (קו סגול מקווקו), קרקעית (קו שחור מקווקו), קורפוס (קו כחול מקווקו), אנטרום (קו ירוק מקווקו), ותריסריון (קו כתום מנוקד). פס קנה מידה: 1000 מיקרון. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של האיור הזה.

איור 4
איור 4: תמונות קונפוקליות של גליל שווייצרי של קיבת עכברון שלמה: ANO1, KIT, TUBB3. פאנלים עליונים: תמונות קונפוקליות תפורות מייצגות של גליל שוויצרי קיבה של עכבר נקבה בת 8 שבועות מסוג C57BL/6J, המראות צביעת חיסון ל-ANO1 (ירוק), KIT (תכלת), TUBB3 (צהוב) וגרעינים (כחול). כל הבטן המגולגלת, כולל הקרקעית, הקורפוס והאנטרום, מוצגת לאור. פסי קנה מידה: 1000 מיקרון. פאנלים תחתונים: תצוגות מוגדלת של האזור המסומן על ידי הקופסה הלבנה במקווים בלוחות העליונים, המדגישים פרטים תאיים בין-תאי קחל (ANO1+ ו-KIT+; חצים צהובים) ונוירונים מעיים (TUBB3⁺; חצים אדומים). פסי קנה מידה: 100 מיקרון. אנא לחצו כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של הדמות הזו.

איור 5
איור 5: תמונות קונפוקליות של גליל שווייצרי של קיבת עכוס שלמה: MYH11, KIT, E-cadherin. פאנלים עליונים: תמונות קונפוקליות תפורות מייצגות של גליל שוויצרי קיבה של עכבר נקבה בת 8 שבועות מסוג C57BL/6J, המראות צביעת חיסון ל-MYH11 (ירוק), KIT (תכלה), E-cadherin (צהוב) וגרעינים (כחול). כל הבטן המגולגלת, כולל הקרקעית, הקורפוס והאנטרום, מוצגת לאור. פסי קנה מידה: 1000 מיקרון. פאנלים תחתונים: תצוגות מוגדלת של האזור כפי שמסומן על ידי הקופסה הלבנה במקווים בלוחות העליונים. קווים לבנים מנוקדים מסמנים את האפיתל הרירי (E-cadherin) ואת השכבה השרירית (MYH11). חצים לבנים מציינים תאי ביניים KIT+ של קחל (ICC). פסי קנה מידה: 100 מיקרון. אנא לחצו כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של הדמות הזו.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בשיטת הקיבה החדשה והאופטימלית, כל שלושת מקטעי הקיבה (פנדוס, קורפוס ואנטרום), יחד עם הוושט והתריסריון, נכללים על שקופית אחת. הטמעה מקיפה זו מאפשרת לחוקרים לנתח שינויים מבניים ומולקולריים בכל רחבי הקיבה ומפחיתה את עלות החתך והצבעה (איור 1).

חשיפת כל אזורי הקיבה לאותם תמיסות צביעה בו-זמנית במהלך צביעת החיסון מבטיחה עקביות ומשפרת את הדיוק. צביעת חיסון של גלילי שוויץ בקיבה חושפת בבירור את השכבות הייחודיות של דופן הקיבה. כפי שמוצג באיור 4 ובאיור 5, שיטה זו מאפשרת המחשה של הבדלים מורפולוגיים בין מקטעי הקיבה ומאפשרת זיהוי של ICC (KIT ו-ANO1)10, נוירונים (TUBB3)15, תאי שריר חלק (MYH11), תאי אפיתל רירית (E-cadherin) וגרעינים.

ניתן לבצע שינויים קלים בהתאם למצב הרקמה ולמטרת המחקר. לדוגמה, הסרת שומן נוסף שמחובר יכולה לעזור לשמור על צורת הגליל במהלך הקיבע. התאמת עובי החתך עשויה גם לסייע בשמירה על מבנה הרקמה או לשפר את ההידבקות למגלשה. שיפור פוטנציאלי נוסף כולל שימוש בתבנית מתכת לחיתוך עקבי יותר, כפי שנעשה עם גלילי שוויצרימעיים 16. למרות שפרוטוקול זה מתמקד בקריוסקטים, ייתכן שהוא מותאם לרקמות מוטמעות בפרפין. בעוד שהטמעת פרפינים שומרת על שלמות המבנה של הרקמה, הקריוסקציה מאפשרת עיבוד מהיר יותר ושימור אנטיגנים טוב יותר, מה שהופך אותה למתאימה יותר לאימונופלואורסצנציה.

לשיטה הזו יש מגבלות. קיבה מוגדלת, פיברוטית או מסוידת, הנפוצה במצבים כמו דלקת, השמנת יתר, סוכרת או הזדקנות, עלולה להיות קשה יותר לגלגול ועלולה להוות אתגרים לצביעה אופטימלית 17,18,19,20. למרות מגבלה זו, טכניקה זו מציעה יתרונות משמעותיים על פני הטמעה אזורית מסורתית. עיבוד כל אזורי הקיבה בתנאים זהים משפר עקביות, מפחית שונות, וחוסך הן בזמן והן על תגובות.

גישה זו שימושית במיוחד למחקרים של שינוי ספציפי לאזור. היא גם תומכת בניתוח מרחבי של סוגי תאים מרובים וניתן לשלב אותה עם כימות מבוסס תמונה. בסך הכול, שיטת ה-Swiss-roll החדשה והאופטימלית הזו מספקת פלטפורמה מעשית וניתנת להרחבה לניתוח מקיף של רקמת קיבה בבריאות ובמחלות.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מענקי המכון הלאומי לבריאות R01 DK057061 (T.O.), R01 DK121766 (Y.H.), R01 DK126827 (T.O.), R01 DK131455 (T.O.), ו-P30 DK084567 (ליבת אפיגנומיקה וביולוגיה מרחבית, מרכז מאיו קליניק לאיתות תאים בגסטרואנטרולוגיה). לסוכנויות המימון לא היה תפקיד בעיצוב מחקרים, ניתוח נתונים או הכנת כתבי יד. התוכן הוא באחריות הכותבים בלבד. אנו מודים לד"ר דארן ג'יי. בייקר ולחברי מעבדת ד"ר בייקר (המחלקה לביוכימיה וביולוגיה מולקולרית, Mayo Clinic, רוצ'סטר, מינסוטה) על שיתוף משאבי מעבדה ותמיכה טכנית בצביעת H&E.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
#5SF מלקחייםכלי מדע מדויק11252-00
סרום בקר אלבומין סיגמה-אלדריץ'A7906
מקור אור LED של ColdVision MC-LSשוטMC-LS
תוכנה קונפוקלית ניקוןתוכנת הדמיה של Nikon NIS-Elements
Cryoseal XYLאפרדידה9312-4
DAPI (4',6-דיאמידינו-2-פנילינדול, דילקטט)תרמו פישר סיינטיפיקD3571
צלחות ניתוח, גדולותמערכות חיים   כלי נגינהSKU: DD-90
חמור נגד עז AF647 pAbטכנולוגיות חייםA21447מגרש: 1739289 RRID:AB_2535864
חמור נגד עכבר AF555 pAbטכנולוגיות חייםA31570Lot: 1774719 RRID:AB_2536180
חמור נגד ארנב AF488 pAbטכנולוגיות חייםA21206מגרש: 2668665 RRID:AB_2535792
E-cadharin (1:400 דילול)ביוסיינס BD610181פריט: 25510 RRID:AB_397580
אאוסיןELITechGroup$SS-071C
מלקחיים מצופים אפוקסיכלי מדע מדויק11210-10
אתנולסיגמה-אלדריץ'459828-4L
צינור גמיש 1.5 מ"לאפנדורף22364111
ספוגי גזהפישרסיינטיפיקט22-362-178
מספריים דקים ומחוספסיםכלי מדע מדויק14090-09
המטוקסיליןאפרדיה7211
KIT (0.2 ומיקרו; g/mL; דילול 1:1000)R& D SystemsAF1356חלק: IEO0217101 RRID: AB_354750
תמיסת ניקוי עדשות בקבוק ספריי בנפח 1 אונקיהניקון77013066
זכוכית כיסוי מיקרוסקופפישר סיינטיפיק12541016
שקופיות מיקרוסקופCardinalHealthM6133A
פינים קטניםכלי מדע מדויק26002-20
MYH11 (דילול 1:400)טכנולוגיות ביו-רפואיותBT-562RRID:AB_10013421
לק לציפורנייםצבעים חוטאים7.33855E+11
מחט 30 גרם x חצי אינץ' ביוסיינס BD305106
פאראפורמלדהידסיגמה-אלדריץ'158127-500G
להבי קצה יחיד של פרסונהחברת רייזור בלייד.76247-652
פתרון חסימת עכבר על עכבר ReadyProbes (30x)תרמו פישר סיינטיפיקR37621חלק: 3226230
SlowFade Diamond Antifade Mountant (מדיה להרכבה)תרמו פישר סיינטיפיקS36972
מערכת צביעת שקופיות StainTray 10Simport ScientificM918-2
מיקרוסקופ סטריאו 0.8x-5xניקוןSMZ645
Sucrose סיגמה-אלדריץ'S9378-1KG
מגברי שטח X-100 (טריטון X)תרמו פישר סיינטיפיק28314
TMEM16A (ANO1: דילול 1:400)אבקאםAB53212 מגרש: GP3295656-1 RRID: AB_883075
פיפט העברהפלקון357575
TUBB3 (דילול 1:400)טכנולוגיית איתות סלולרי4466מגרש: 5 RRID: AB_1904176
Xylenes פישר סיינטיפיקX3P-1GALהרבה 206238

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chaudhry, S. R., Liman, M. N. P., Omole, A. E., Peterson, D. C. Anatomy, abdomen and pelvis: Stomach. , StatPearls. (2025).
  2. Sanders, K. M., Drumm, B. T., Cobine, C. A., Baker, S. A. Ca(2+) dynamics in interstitial cells: Foundational mechanisms for the motor patterns in the gastrointestinal tract. Physiol Rev. 104 (1), 329-398 (2024).
  3. Moolenbeek, C., Ruitenberg, E. J. The "Swiss roll": A simple technique for histological studies of the rodent intestine. Lab Anim. 15 (1), 57-59 (1981).
  4. Li, S., You, S., Mao, K. Protocol for multiplex immunofluorescence imaging of mouse intestinal tumors. STAR Protoc. 6 (2), 103776(2025).
  5. Bialkowska, A. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. Improved Swiss-rolling technique for intestinal tissue preparation for immunohistochemical and immunofluorescent analyses. J Vis Exp. (113), e54161(2016).
  6. Dooley, S. A., et al. Optimized protocol for intestinal Swiss rolls and immunofluorescent staining of paraffin-embedded tissue. J Vis Exp. (209), e66977(2024).
  7. Hayashi, Y., et al. Platelet-derived growth factor receptor-alpha regulates proliferation of gastrointestinal stromal tumor cells with mutations in KIT by stabilizing ETV1. Gastroenterology. 149 (2), 420-432.e16 (2015).
  8. Hayashi, Y., et al. TRP53-mediated cell cycle arrest of precursors underlies interstitial cell of Cajal depletion during aging. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 11 (1), 117-145 (2021).
  9. Rothenberg, M. E., et al. Identification of a cKit(+) colonic crypt base secretory cell that supports Lgr5(+) stem cells in mice. Gastroenterology. 142 (5), 1195-1205 (2012).
  10. Gomez-Pinilla, P. J., et al. Ano1 is a selective marker of interstitial cells of Cajal in the human and mouse gastrointestinal tract. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 296 (6), G1370-G1381 (2009).
  11. Lee, B., et al. Anoctamin 1/TMEM16A controls intestinal Cl(-) secretion induced by carbachol and cholera toxin. Exp Mol Med. 51 (8), 1-14 (2019).
  12. Uhlen, M., et al. Tissue-based map of the human proteome. Science. 347 (6220), 1260419(2015).
  13. Uhlen, M., et al. A human protein atlas for normal and cancer tissues based on antibody proteomics. Mol Cell Proteomics. 4 (12), 1920-1932 (2005).
  14. San Roman, A. K., Jayewickreme, C. D., Murtaugh, L. C., Shivdasani, R. A. Wnt secretion from epithelial cells and subepithelial myofibroblasts is not required in the mouse intestinal stem cell niche in vivo. Stem Cell Reports. 2 (2), 127-134 (2014).
  15. Drokhlyansky, E., et al. The human and mouse enteric nervous system at single-cell resolution. Cell. 182 (6), 1606-1622.e23 (2020).
  16. Jiang, Y., et al. Mapping and tracing Grem1(+) stromal cells in an Apc (Min/+) mouse utilizing cryopreserved intestinal sections prepared via modified Swiss-roll technique. iScience. 27 (11), 111173(2024).
  17. Izbeki, F., et al. Loss of Kitlow progenitors, reduced stem cell factor and high oxidative stress underlie gastric dysfunction in progeric mice. J Physiol. 588 (Pt 16), 3101-3117 (2010).
  18. Hayashi, Y., et al. Hyperglycemia increases interstitial cells of Cajal via MAPK1 and MAPK3 signaling to ETV1 and KIT, leading to rapid gastric emptying. Gastroenterology. 153 (2), 521-535.e20 (2017).
  19. Gao, F., et al. Hypoxia-inducible factor 1alpha stabilization restores epigenetic control of nitric oxide synthase 1 expression and reverses gastroparesis in female diabetic mice. Gastroenterology. 165 (6), 1458-1474 (2023).
  20. Kuro-o, M., et al. Mutation of the mouse klotho gene leads to a syndrome resembling ageing. Nature. 390 (6655), 45-51 (1997).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Swiss Roll TechniqueGastric Muscle LayersSpatial OmicsImmunofluorescence StainingMouse StomachTissue OrientationCryosection EmbeddingGastric RegionsInterstitial CellsSmooth Muscle Cells

מאמרים קשורים