יצירת ויזואליזציות מרחביות אינטראקטיביות תלת-ממדיות של שפע מיקרוביאלי בחול עופות באמצעות RStudio

Summary

כאן אנו מציגים פרוטוקול ליצירת ויזואליזציה תלת-ממדית אינטראקטיבית של ספירות מיקרואורגניזמים ו-pH על פני כלוב עופות באמצעות נתוני דגימה מבוססי רשת.

Abstract

הערכות מסורתיות של מיקרוביולוגיה של חול עופות והרכב פיזיקוכימי מסתמכות לעיתים קרובות על טבלאות סטטיות או ויזואליזציות דו-ממדיות שאינן לוכדות את ההטרוגניות המרחבית בסביבת העלילה. פרוטוקול זה מתאר ויזואליזציות אינטראקטיביות תלת-ממדיות (תלת-ממדיות) המשלבות נתוני מניין מיקרוביאלי ופרמטרים סביבתיים לאורך כלובת עופות. פריסה מבוססת רשת שימשה לקרב דגימת עט, ותחילה נוצרו מערכי נתונים מדומים כדי להדגים את תהליך העבודה. מאגר הנתונים הניסיוני שימש להערכת גרדיאנטים מרחביים ביחס למאפיינים סביבתיים, כולל קו המים, המזינים וכניסת המכל. הנתונים עובדו ב-RStudio באמצעות plotly ליצירת גרפים תלת-ממדיים אינטראקטיביים. עומסי חיידקים אירוביים נעו בין 5.9 ל-8.6 log₁₀ CFU/g, עם שפע גבוה משמעותית בקרבת קו המים (P = 0.023) וספירות נמוכות יותר במרחק הולך וגדל מהתכונה. הגרפים החיצוניים שהתקבלו הדגישו ויזואלית את ההתקבצות של אוכלוסיות מיקרוביאליות סביב אזורים עשירים בלחות והדגים את התועלת של המסגרת לפרשנות דפוסים מרחביים של קהילות מיקרוביאליות בחול עופות. למרות שיש צורך בהערכה נוספת בתנאי עופות מסחריים, הפרוטוקול הנוכחי מספק שיטה שחזורית להמחשה וניתוח הטרוגניות מרחבית במאגרי פסולת עופות.

Introduction

תעשיית העופות כוללת מערכות ייצור שכבות ופרחים בשר, שכל אחת מהן מייצרת כמויות משמעותיות של פסולת עופות באמצעות הצטברות חומרי מצת, צואה, חלקיקי מזון, נוצות, קליפות ביצים שבורות ולחות לאורך זמן ^1,2,3. שגר זה יכול לתמוך באוכלוסיות מיקרוביאליות שונות, שמקורן בציפורים, חרקים, מכרסמים ואירוסולים ^2,3. חלק מהמיקרואורגניזמים יכולים לכלול פתוגנים, כמו סלמונלה, שיכולים לגרום למחלות בציפורים ולייצג דאגה בריאותית ציבורית². מכיוון שפסולת עופות עשויה להיות מיושמת כדשן ^4,5, הבנת התפוצה המיקרוביאלית משפיעה על ניטור סביבתי, בריאות עדרים ובטיחות מזון.

דגימת חול ייצוגית של עופות חשובה לכן לאפיון קהילות מיקרוביאליות ולזיהוי פתוגנים פוטנציאליים. גישות לדגימת חול עופות נבדקו כבר כמה עשורים, כולל דגימת גרר, איסוף צואה, איסוף ישיר של חול, כיסויי נעליים חד-פעמיים או גרביים למגפיים ^6,7. עם זאת, מיקום איסוף הדגימה קובע בבירור עד כמה הנתונים מייצגים את תנאי החול הכלליים של העופות. מכיוון שציפורים נעות ברחבי הבית ותכונות סביבתיות כמו משקיות, מאכילים, מאווררים וכריות קירור או חימום יוצרות סביבה מקומית, אוכלוסיות מיקרוביאליות וגורמי תזונה אינם מתחלקים באופן אחיד 3,8,9,10. לכן, התחשבות בהטרוגניות בעת פירוש נתונים הקשורים לפסולת היא חיונית לניהול יעיל ולשמירה על בריאות העדר.

גישות מיפוי מרחבי יושמו באופן נרחב באגרונומיה ובמדעי הקרקע כדי להמחיש הטרוגניות מיקרוביאלית ופיזיקוכימית ומוקדי חום מקומיים^11,12. עם זאת, כאשר נתוני חול עופות נאספים באזורים שונים בתוך כלוב, מגמות מרחביות עלולות להיות קשות לפרשנות מתוך ערכים מספריים ^8,9. הדמיה תלת-ממדית (תלת-ממדית) מציעה גישה מעשית לשילוב מדידות מיקרוביאליות ופיזיקוכימיות עם קואורדינטות מרחביות ליצירת מודלים אינטראקטיביים של פני שטח^13,14. בהשוואה למודלים דו-ממדיים סטטיים, מודלים תלת-ממדיים מאפשרים סיבוב, הגדלה פנימה והקטנה, והדמיה מבוססת עומק של גרדיאנטים על פני רשת הדגימה, מה שעשוי לשפר את פרשנות הדפוסים המרחביים בסביבת בית העופות.

הפרוטוקול הנוכחי מתאר גישה מובנית וניתנת לשחזור ליצירת ויזואליזציות תלת-ממדיות אינטראקטיביות של נתוני מיקרוביאליים ופיזיקוכימיים של חולי עופות, שנאספו באמצעות פריסה מבוססת רשת ונותחו ב-RStudio. נתונים מיקרוביאליים ופיזיקוכימיים מדומים משמשים תחילה להדגמת תהליך הוויזואליזציה, ולאחר מכן יישום הגישה לספירות מיקרוביאליות ניסיוניות של חולת עופות. מטרת פרוטוקול זה היא לספק מסגרת שחזורית להמחשת הטרוגניות מרחבית במאגרי חול עופות ולתמוך בפרשנות דפוסי התפלגות מיקרוביאליים ביחס לתכונות בית עופות.

Protocol

פרוטוקול זה עושה שימוש במאגר נתונים מדומה לערכי מיקרוביאלים ו-pH כדי להדגים כל שלב בתהליך הוויזואליזציה, ולאחר מכן יישום בספירות מיקרוביאליות ניסיוניות של חולי עופות כדי להמחיש שימוש בנתונים ניסיוניים ולתמוך בפרשנות סטטיסטית של קשרים מיקרוביאליים הקשורים למרחק. לא בוצעו הליכים עם בעלי חיים חיים. דגימות אשפה נאספו ממכלוב עופות ללא מגע ישיר עם בעלי החיים. לכן, לא נדרש אישור מוסדי לטיפול בבעלי חיים.

1. איסוף דגימות פסולת עופות ויצירת נתוני שפע מיקרוביאלי

1. קבע פריסת דגימה מבוססת רשת על פני עט הגרוילר באמצעות ריווח עקבי בין העט.
   הערה: בעטים קטנים יותר, ניתן לעשות זאת באמצעות מערכת רשת מחרוזת, בעוד שעטים גדולים יותר עשויים להשתמש בסימוני דגלים לסימון כל מיקום דגימה. הרשת בדרך כלל מתחילה בפינה השמאלית התחתונה של העט, שנחשבת לנקודת ההתחלה. כל מיקום דגימה מתועד באמצעות מיקום הרשת שלו.
2. רשמו את קואורדינטות X ו-Y של כל מיקום דגימה ונקודות סביבה כמו מזינים, קו מים, מנורת חימום וכניסה בתוך אותה רשת באמצעות מיקום יחיד או קו המייצג את מיקומם.
   הערה: כיוון ה-X עובר לאורך העט, וכיוון ה-Y עובר לאורך הרוחב.
3. כלול עמודת "עט" במאגר הנתונים כדי לזהות את העט או קבוצת הטיפול לכל מיקום דגימה (למשל, "P1", "P2").
   הערה: קיבוץ לפי עט מבטיח שניתוחים מרחביים יתבצעו בסביבת מגורים נכונה. להדגמה זו, הוגדר רשת מובנית של 6 × 10 על פני טביעת הרגל של העט, שהניב 60 מיקומי דגימה (n = 60) מעט אחד. רשת 6 × 10 נבחרה כדי לספק כיסוי מרחבי אחיד על פני העט, עם פריסה סימטרית ומרווחת באופן שווה. דוגמה לפריסת הרשת מוצגת באיור 1.
4. בכל מיקום דגימה, אספו שלוש דגימות לניתוח מיקרוביאלי או פיזיקוכימי. לבדיקות מיקרוביאליות, שקלו 10 גרם חול לכל שכפול והניחו אותו ב-90 מ"ל של מי פפטון סטריליים עם בופר כדי לבצע את הדילול הראשון (10⁻¹). ערבב את הדגימה היטב כדי להומוגן את המתלוי.
5. הכינו דילול סדרתי של 10 פעמים של דגימת החול המעורבת וצלחת 0.1 מ"ל מכל דילול על פלטות אגר.
   הערה: ניתן להשתמש במדיות שונות בהתאם לקבוצת החיידקים הנמדדת. לדוגמה, חיידקים אירוביים עשויים להיות מצופים על אגר סויה טריפטי (TSA), חיידקי חומצה לקטית על אגר MRS, ואנטרובקטריאצאה על אגר מקונקי.
6. דגרו את הלוחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות, ואז ספורו את המושבות הנראות. חשב שפע מיקרוביאלי כיחידות יוצרות מושבה לגרם חול (CFU/g) באמצעות:
   CFU/g = (מושבות נספרות × מקדם דילול) ÷ נפח מצופה
7. דווח על הערך הממוצע בין השכפולים.
   הערה: מגבלת הגילוי נקבעת על ידי נפח הציפוי (0.1 מ"ל), התואם לכ-10 CFU/mL במתלה המצופה, או 100 CFU/g של חול בדגימה המקורית.
8. רישום מינורי מיקרוביאלי מוביל לגיליון אלקטרוני בפורמט מספרי לניתוח סטטיסטי והדמיה עתידית.
9. צור קובץ CSV עם העמודות הבאות: מזהה דגימה, X (קואורדינטה מרחבית), Y (קואורדינטה מרחבית), Xnum (סדר מיון מספרי עבור X, אופציונלי), וספירות מיקרוביאליות או פרמטרים פיזיקוכימיים כמו pH. דוגמה לגיליון הטבלה המדומה מוצגת באיור 2.
10. יצירת ערכי שפע מיקרוביאליים מדומים באמצעות ערכים אקראיים מתפלגים נורמלית. הגדר את הממוצע, סטיית התקן והטווח בהתבסס על מדידות אמפיריות. יש להחיל זרע אקראי קבוע כדי להבטיח שחזוריות. הכניסו גרדיאנטים מרחביים על פני הרשת והוסיפו שונות אקראית קלה כדי להימנע מדפוסים אחידים.
    הערה: פרמטרי הסימולציה המשמשים ליצירת נתונים, כולל סוג התפלגה, טווח ומבנה מרחבי, מסוכמים בטבלה 1.

2. הקמת סביבת המחשוב

1. התקן וטעין את חבילות המחשוב הסטטיסטיות הנדרשות.
   install.packages(c("plotly"))
   ספרייה (Plotly)
2. ייבא את מערך הנתונים של CSV לסביבת המחשוב והגדר תיקיית עבודה.
   setwd ("path/to/your/folder")
   מערך נתונים <- read.csv("path_to_your_file.csv")
   הערה: מערך הנתונים של הקלט צריך להיות מאורגן בפורמט גיליון אלקטרוני (קובץ CSV), כאשר כל שורה מייצגת מיקום דגימה יחיד. מבנה הנתונים הנדרש של הקלט והגדרות המשתנים מסוכמים בטבלה 2.

3. הכנה ועיצוב נתונים

1. בדוק את קובץ ה-CSV אם יש ערכי נתונים חסרים או לא עקביים.
   סיכום (מערך נתונים)
   any(is.na(dataset))
2. נקה את מערך הנתונים לפי הצורך על ידי הסרת ערכי 'NA'.
   מערך נתונים < - na.omit(dataset)
3. כדי לנרמל ולשפר את הוויזואליזציה של הגרפים, מבצעים ספירות מיקרואורגניזם בטרנספורמציה.
4. סטנדרטיזציה של שמות משתנים באמצעות סימון עקבי מבוסס קו תחתון (למשל, log10_CFU_A ו-log10_CFU_B) לשיפור הקריאות והשחזוריות.
5. יישמו טרנספורמציה של log10 על נתוני ספירת מיקרואורגניזמים כדי לייצב שונות ולהתאים את עצמם לפרקטיקות הדיווח הסטנדרטיות של CFU.
   DataSet$Log10_CFU_A <- log10(dataset$OrganismA_counts + 1)
   dataset$Log10_CFU_B <- log10(dataset$OrganismB_counts + 1)
6. ודא שערכי הקואורדינטות X וה-Y הם נומריים. אם הנתונים הם אלפביתיים, יש להמיר לערכים מספריים כדי להתאים במדויק למיקומי הדגימה ברשת.
   הערה: מערך הנתונים הסופי צריך לכלול את כל המזהים הייחודיים בתוך מערכת קואורדינטות העץ, קואורדינטות מרחביות מספריות, וספירות מיקרוביאליות שעברו טרנספורמציה לוגריתמית.

4. יצירת ויזואליזציות תלת-ממדיות אינטראקטיביות

1. לפני בניית המטריצה המרחבית, יש לאמת את מבנה מערך הנתונים כדי לוודא שניתן ליצור את הרשת כראוי. לאחר מכן, הכינו מטריצות נתונים מרחביים על ידי שילוב מספר חלקים, כגון קואורדינטות מרחביות וספירות חיידקים שעברו שינוי לוגריתם, כדי להתאים לפריסת הרשת של העט.
   הערה: הקוד מסדר תצפיות לפי Pen, X ו-Y, מחשב את Log10_CFU_A הממוצע בכל נקודת רשת, ואז מעצב מחדש את הערכים למטריצה המבוססת על הקואורדינטות הייחודיות X ו-Y במאגר הנתונים.
   org1_means <- מצטבר(Log10_CFU_A ~ עט + Y + X,
   data = מערך נתונים,
   כיף = אומר,
   na.rm = נכון)
   org1_P1 <- תת-קבוצה (org1_means, Pen == "P1")
2. סדר את הנקודות כך שהמטריצה תמופה נכון
   x_vals <- sort(unique(org1_P1$X))
   y_vals <- sort(unique(org1_P1$Y))
   ncol_grid < - אורך (x_vals)
   nrow_grid <- אורך(y_vals)
   org1_mat_P1 <- matrix(org1_P1$Log10_CFU_A,
   nrow = nrow_grid,
   ncol = ncol_grid,
   byrow = שקר)
3. ודא שאין ערכים חסרים לגרף שנראה חלק.
   for(i in 1:ncol(org1_mat_P1)) {
   org1_mat_P1[is.na(org1_mat_P1[,i]), i] <- mean(org1_mat_P1[,i], na.rm=TRUE)
   }
4. הדמיינו את ספירת המיקרואורגניזמים במרחב כתלת-ממד.
   הערה: בגרף זה, גודל הרשת שיקף את הפריסה המרחבית של מאגר הנתונים
   figA <- plot_ly(
   x = x_vals,
   y = y_vals,
   z = org1_mat_P1,
   סוג = "משטח", קנה מידה צבע = רשימה(
   c(0, "כחול כהה"),
   c(1, "ירוק")
   )
   )
5. הוסף תכונות סביבתיות, כמו קו מים, כדי לסייע בהמחשת המרחק של ספירות מיקרוביאליות או פרמטרים אחרים של החול לנקודה זו, ולאפשר למשתמשים לראות דפוסים מרחביים.
   figA <- figA %>%
   add_trace(
   x = c(1, 5),
   y = c(6, 6),
   z = c(8.5, 8.5),
   סוג = "scatter3d",
   mode = "קווים",
   קו = רשימה(צבע = "#1f77b4", רוחב = 8),
   שם = "קו מים"
   ) %>%
   add_text(
   x = 3, y = 6, z = 8.6,
   טקסט = "קו מים",
   טקסטפונט = רשימה (גודל = 14, צבע = "כחול כהה"),
   showlegend = FALSE
   ) %>%
   פריסת(
   כותרת = "אורגניזם מדומה A",
   סצנה = רשימה(
   xaxis = רשימה(title = "קואורדינטת X", tickvals = x_vals),
   yaxis = רשימה(כותרת = "קואורדינטת Y", tickvals = y_vals),
   zaxis = רשימה(כותרת = "log10 CFU")
   )
   )
   figA
6. עיין בקובץ משלים 1 לקוד המשמש להמחשת רמות ה-pH בתוך כלוב העופות.

5. יישום המודל התלת-ממדי לספירות מיקרוביאליות ניסיוניות של חול עופות

1. אסוף דגימות חול של עופות מפריסה מוגדרת בתוך המכלאה ותיעד מיקומי דגימה באמצעות קואורדינטות מרחביות.
   הערה: במחקר זה נאספו דגימות ממכלוב עופות באוניברסיטת ויסקונסין, מדיסון, ויסקונסין, תוך שימוש בפריסת רשת מוגדרת. הדגימות נאספו באמצעות פריסת רשת של 5 × 7 מטר.
2. שקלו כמות מוגדרת של חול מכל מקום דגימה והשינו אותו במי מלח מפוזר-פספט (PBS) או מדלל מקביל להכנת דילול ראשוני.
   הערה: במחקר זה, נאסף 1 גרם של חול בכל מקום באמצעות שקיות Whirl-Pak ודולל ביחס של 1:10 בתמי מלח מפוזר פוספט (PBS).
3. לבצע ספירת מיקרוביאליים על ידי ציפוי דגימות חול על מדיום גדילה מתאים ודגירה בתנאים מתאימים.
   הערה: במחקר זה, דגימות צויפו בכפיל באמצעות שיטת ציפוי נקודות על אגר סויה טריפטי (TSA) ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. החומרים הנדרשים לספירת מיקרואורגניזמים מפורטים בטבלת החומרים.
4. כמת שפע מיקרוביאלי כיחידות יוצרות מושבות (CFU) ויישום טרנספורמציה log₁₀ על הנתונים לניתוח.
5. לשלב את נתוני המיקרוביאלים המעובדים בזרימת העבודה החישובית ולעצב אותם לפי מבנה הקלט הנדרש.
6. יצר ויזואליזציה מרחבית תלת-ממדית באמצעות השיטות שתוארו לעיל כדי לייצג שפע מיקרוביאלי על פני העט.
   הערה: במחקר זה, נוצרה ההדמיה כדי להציג שפע חיידקים אירובי על פני העט שנדגם.

6. ניתוח סטטיסטי

1. לבצע ניתוחים סטטיסטיים בסיסיים לסיכום דפוסים מרחביים בשפע מיקרוביאלי ובמשתנים סביבתיים.
2. בצע ניתוחים סטטיסטיים רק על מאגר הנתונים הניסיוני של חול עופות. השתמש במאגרי הנתונים המדומים אך ורק להדגמות ויזואליזציה ואל תכלול אותם בבדיקות סטטיסטיות.
3. חשב ערכים ממוצעים לכל מיקום ברשת כאשר היו מדידות משוכפלות זמינות.
4. השתמש בניתוח רגרסיה ליניארית כדי להעריך את הקשרים בין שפע מיקרוביאלי לבין המרחק מאתרים סביבתיים.
5. חשב מרחקים מנקודות ציון סביבתיות באמצעות מיקומי הרשת הידועים שלהם בתוך העט. התייחס למרחקים כמשתנים רציפים.
6. השתמשו בתוצאות כדי לחקור מגמות מרחביות ולתמוך בפרשנות ויזואליזציה במקום לבסס קשרים ביולוגיים סיבתיים.

Results

נתונים מיקרוביאליים ופיזיקוכימיים מדומים להמחשת המודל התלת-ממדי
המחקר הנוכחי מספק קוד להמחשת שפע האורגניזמים המיקרוביאליים (אורגניזם A ואורגניזם B) ו-pH של חול בתוך כלוב עופות, בהתבסס על נתונים מדומים. הגרפים התלת-ממדיים שהתקבלו הציגו ספירות מיקרוביאליות (איור 3A,B) ו-pH (איור 3C; לחוויה אינטראקטיבית, ראו קובץ משלים 3) בהתבסס על מודל מבוסס רשת. ערכי ה-pH המדומים הראו שונות מרחבית לאורך העט, עם שינויים הדרגתיים לאורך הרשת שהתאימו למדרונות המרחביים שהוטלו. הקוד המלא, ללא הפרעות טקסטואליות, זמין בקובץ המשלים 1.

יישום המודל התלת-ממדי לספירות מיקרוביאליות ניסיוניות של חול עופות
כדי להדגים כיצד המודל פועל עם נתונים אקולוגיים אמיתיים, מופו ונותחו סטטיסטית ספירות חיידקים אירוביים מאכלי עופות כדי להעריך את השפעת המרחק מנקודות סביבתיות, כגון מזינים וקווי מים, על שפע חיידקים באמצעות מודל רגרסיה ליניארית (LRM). מערך הנתונים הניסויי המשמש לניתוח מסופק בקובץ המשלים 2. ההדמיה התלת-ממדית הראתה הבדלים ברורים בספירות אירוביות ברחבי העט, מה שמראה כי הגישה יכולה להציג ביעילות התפלגויות מיקרוביאליות אמיתיות בתוך סביבות מגורי עופות (איור 4; לחוויה אינטראקטיבית, ראו קובץ משלים 3). ויזואליזציות אלו חשפו התפלגות מרחבית הטרוגנית, עם אזורים ממוקדים עם שפע חיידקים גבוה יותר בקרבת תכונות סביבתיות ספציפיות. ברחבי כלוב העופות, ספירות אירוביות נעו בין 5.9 ל-8.6 לוג'ימטריות CFU/g, כאשר הריכוזים הגבוהים ביותר זוהו סמוך לקו המים וספירות נמוכות יותר נצפו סביב המאכילים המרכזיים ומרוחק מקו המים. השפע האירובי הממוצע ירד מ-8.0 לוגריתם₁₀ CFU/g סמוך לקו המים ל-7.4 לוגריתם₁₀ CFU/g במרחק הרחוק ביותר שנרשם. ספירות מיקרוביאליות מייצגות את הערכים הממוצעים של מדידות שכפול בכל מיקום דגימה. יתרה מזאת, המרחק מקו המים היה מנבא משמעותי לעומס חיידקים אירובי (LRM, P < 0.05), בעוד שהמרחקים מהמזינים ומהכניסה לא היו (LRM, P > 0.05). תוצאות כמותיות אלו מאשרות את המגמה הוויזואלית שנצפתה בגרפים התלת-ממדיים של פני השטח, ומדגימות ירידה ברורה בשפע המיקרוביאלי עם גובר המרחק ממקורות הלחות. בסופו של דבר, תוצאות אלו מראות כי מסגרת הרשת התלת-ממדית מספקת גישה מעשית להמחשה וניתוח של הטרוגניות מרחבית במאגרי נתוני חול עופות. באמצעות נתונים מדומים וניסיוניים, מודל זה תפס דפוסי התפלגות מיקרוביאליים מקומיים ואפשר פרשנות סטטיסטית של הקשר בין שפע חיידקים לתכונות סביבתיות בתוך העט.

איור 1: פריסת רשת של כלוב עופות לאיסוף דגימות. ייצוג סכמטי של מסגרת הדגימה מבוססת הרשת המשמשת להגדרת קואורדינטות מרחביות ומיקומי דגימה ברחבי כלוב העופות. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 2: דוגמה לפריסת נתונים מדומים בפורמט גיליון אלקטרוני. מבנה גיליון אלקטרוני מייצג המציג מזהי דגימה, קואורדינטות מרחביות (X ו-Y), ומשתנים מיקרוביאליים או פיזיקוכימיים המשמשים לניתוח. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 3: התפלגויות מרחביות מדומה של ספירות מיקרוביאליות ו-pH על פני כלוב העופות. (א) ספירות מדומות של אורגניזם א', (ב) ספירות מדומות של אורגניזם ב', ו -(ג) ערכי pH מדומים המוצגים באמצעות מודל מרחבי תלת-ממדי מבוסס רשת. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 4: התפלגות מרחבית של ספירות חיידקים אירוביים ברחבי כלוב העופות. גרף פני השטח התלת-ממדי מראה שונות בספירות חיידקים אירוביים (log CFU/g) במרחקים (קואורדינטות X–Y). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

פרמטר	ערך
תפוצה	נורמלי
בינוני (μ)	8.26
SD (σ)	0.77
תפוצה	7.10–9.37
דפוס מרחבי	גרדיאנט ליניארי (כיוון Y)
רעש	נורמלי (μ=0, שונות קטנה)
זרע אקראי	10

טבלה 1: הפרמטרים המשמשים ליצירת מערכי נתונים מיקרוביאליים מדומים. סיכום פרמטרי התפלגות, כולל ממוצע, סטיית תקן, טווח ערכים והגדרות גרדיאנט מרחבי המשמשות ליצירת נתונים מיקרוביאליים מדומים.

שם עמודה	תיאור	סוג נתונים	נדרש
עט	מזהה עבור עט או קבוצת טיפול	טקסט	כן
X	מיקום קואורדינטות X על הרשת	נומרי	כן
Y	מיקום קואורדינטות Y על הרשת	נומרי	כן
Log10_CFU_A	ספירת מיקרואורגניזמים שעברו שינוי ריבוי (אורגניזם א')	נומרי	כן
Log10_CFU_B	ספירת מיקרואורגניזמים בשינוי לוג (אורגניזם B)	נומרי	אופציונלי
pH	ערך pH שנמדד	נומרי	אופציונלי
מרחק ציון דרך	מרחק מתכונה סביבתית (למשל, קו מים)	נומרי	אופציונלי

טבלה 2: מבנה נתוני קלט נדרש לניתוח מרחבי. רשימת משתנים נדרשים, כולל מזהי דגימות, קואורדינטות מרחביות, ומדידות מיקרוביאליות או פיזיקוכימיות, יחד עם פורמטים של נתונים מתאימים.

קובץ משלים 1: קוד ליצירת ויזואליזציות מרחביות מדומות של מיקרוביאלים ו-pH.סקריפט R משמש לעיבוד מערכי נתונים מדומים וליצירת גרפים תלת-ממדיים של אורגניזם A, אורגניזם B ו-pH על פני כלוב העופות. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

קובץ משלים 2: מאגר נתונים מיקרוביאלי ניסיוני של חול עופות. גיליון אלקטרוני המכיל ספירות חיידקים אירוביים וקואורדינטות מרחביות נלוות המשמשים לוויזואליזציה תלת-ממדית וניתוח סטטיסטי. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

קובץ משלים 3: קישורי גישה ויזואליזציה תלת-ממדיים אינטראקטיביים וקודי QR. קודי QR וקישורי אינטרנט מתאימים לגישה לגרפים תלת-ממדיים אינטראקטיביים של מאגרי נתונים מדומים וניסיוניים.אנא לחצו כאן להורדת קובץ זה.

Discussion

הגרפים המבוססים על סימולציה שהוצגו במחקר זה פותחו כדי להדגים את הפוטנציאל של מיפוי מרחבי תלת-ממדי לשיפור ההמחשה של התפלגויות מיקרוביאליות ופיזיקוכימיות בסביבות חול עופות (קובץ משלים 3). יתרה מזאת, שילבנו גישה זו עם נתוני מניין מיקרוביאליים וסמנים סביבתיים ומרחביים בתוך העט כדי להעריך דפוסי התפלגות מקומיים ולזהות קשרים תלויי מרחק (קובץ משלים 3).

שלב קריטי בפרוטוקול הנוכחי הוא הקמה מדויקת של מסגרת דגימה מבוססת רשת. מכיוון שהמשטח התלת-ממדי תלוי בקואורדינטות מרחביות אמינות, הסימון הנכון של נקודות המוצא, ריווח אחיד ורישום מדויק של מיקומי X ו-Y הם חיוניים. החלק שדורש עבודה רבה ביותר בשיטה הוא פריסת הרשת ואישור שכל דגימה תואמת לקואורדינטות ולסימן הסביבתי שהוקצה לה, כגון מזינים (מזנים), קווי מים, נקודות כניסה או אזורי חימום. טעויות מיקום קטנות בשלב זה עשויות להשפיע על ניתוחים מאוחרים יותר. בסביבות גדולות או מסחריות, כלי מדידה מבוססי לייזר או עזרי מיקום דומים עשויים להפחית את העבודה ולשפר את השחזור. הערות מדויקות של נקודות ציון בעט חשובה גם כן, שכן תכונות אלו מספקות הקשר אקולוגי להבנת גרדיאנטים מיקרוביאליים בסביבות חול, הנוצרים על ידי פעילות ציפורים, לחות ותפוצת חומרים מזינים².

הפרוטוקול הנוכחי ניתן להתאמה ליישומים חקלאיים רחבים יותר. בנוסף לספירות מיקרוביאליות ו-pH, ניתן ליישם אותה גם על משתנים נוספים הקשורים לחול או לרצפת, כולל לחות, טמפרטורה, התפלגות מזינים, מדדים הקשורים לאמוניה, או תכונות קהילות מיקרוביאליות שמקורן בריצוף. שינויים מעשיים כוללים קיבוץ נתונים לפי עט, יצירת מטריצות דינמית ממאגרי נתונים מוקלטים, וסינון ערכים חסרים לפני השרטוט. שלבים נפוצים לפתרון בעיות כוללים המרת תוויות קואורדינטות לערכים מספריים, ממוצע ערכי שכפול בנקודות משותפות, בדיקת קואורדינטות כפולות או חסרות, ואישור שמבנה המטריצה תואם לפריסת העט המקורית. ניתן גם להרחיב את המסגרת לכלול ניתוחים רב-משתניים ועומק אשפה, מה שמאפשר הערכה של הטרוגניות אופקית ואנכית.

יש להכיר גם בכמה מגבלות. השיטה אינה משפרת באופן מהותי את רזולוציית הדגימה או הייצוג הביולוגי; במקום זאת, היא משפרת את הארגון המרחבי והפרשנות של הנתונים לאחר איסוף. לכן, איכות המודל הסופי עדיין תלויה בעיצוב הדגימה ובעקביות בביצוע השטח. בניית רשת יכולה להיות תובענית פיזית וגוזלת זמן. בנוסף, יישום מוצלח דורש גישה למחשב וכישורי עיבוד נתונים בסיסיים. שגיאות בתבניות שמות, כניסת קואורדינטות או תאי רשת חסרים עלולות להפריע ליצירת מטריצות או ליצור ויזואליזציות מטעות. בסך הכול, יש לראות בגישה הנוכחית מסגרת חקרנית המבוססת על ויזואליזציה ולא תחליף לסטטיסטיקה מרחבית פורמלית או הסקה מכנית.

למרות מגבלות אלו, הפרוטוקול מספק יתרונות ברורים על פני גישות טיפוסיות המבוססות על דגימות מאוחדות ומדידות נקודתיות מבודדות, שיכולות להסתיר שונות מרחבית בקנה מידה דק בתוך כלוב או בית 3,4,5,6,7. במחקר הנוכחי, יישום המסגרת לספירות חיידקים אירוביות הראה כי אוכלוסיות מיקרוביאליות יכולות להתקבץ במרחב בתוך פסולת העופות. באופן ספציפי, שפע החיידקים היה גבוה יותר בקרבת קו המים וירד לכיוון מרכז העט, מה שיצר גרדיאנט ברור בגרף המשטח התלת-ממדי (קובץ משלים 3). תבנית זו תומכת בפרשנות שתנאי סביבה מקומיים שונים, במיוחד לחות, עשויים להשפיע מאוד על התפוצה המיקרוביאלית בחול העופות. משתנים נוספים, כגון pH והרכב חומרים מזינים עשויים להבהיר עוד יותר את הקשרים הללו. עבודות קודמות הראו באופן דומה כי קהילות מיקרוביאליות של חולי עופות ותנאי סביבה משתנים במרחב ביחס ל-pH, שפיכת מזון ופעילות ציפורים². על ידי קישור מדידות מיקרוביאליות או פיזיקוכימיות למיקומים מוגדרים בסביבת בעלי החיים, שיטה זו הופכת את הדפוסים הללו ליותר גלויים וניתנים לפרשנות. הוא גם מקביל לגישות מיפוי מרחבי המשמשות במדעי הקרקע והאגרונומיה לזיהוי גרדיאנטים, כתמים ונקודות מוקד מקומיות, תוך יישום מושגים אלה על מערכות ייצור בעלי חיים 11,12,13. בעתיד, מיפוי מרחבי חוזר בין כלובים, עדרים ומחזורי ייצור עשוי לתמוך במודלים חיזויים של מוקדי חום מיקרוביאליים ובניהול ממוקד יותר של אזורים אקולוגיים בסיכון גבוה.

למרות שהדמיה תלת-ממדית אינה משפרת את הדיוק או הדיוק של הנתונים, היא משפרת את הפרשנות של גורמים סטטיסטיים רלוונטיים המשפיעים על דפוסי מיקרוביאלים ומגמות בחול עופות. ויזואליזציה נגישה יותר עשויה לתמוך בתקשורת ובקבלת החלטות מושכלות בנוגע לתיקוני חול, בריאות הציפורים והחלפת מצעים 14,15,16. מעבר ליישומי מחקר, לכלי זה יש ערך מעשי למגדלי עופות ולאנשי הדרכה אקדמיים¹⁷. גרפים תלת-ממדיים אלו יכולים לשמש כלים יעילים להצגת נתונים מיקרוביאליים מורכבים בפורמט נגיש ומעשי יותר עבור מנהלי חוות, בעלי עניין ומגדלי עופות קטנים¹⁷. היכולת לגשת למגרשים אלו בטלפון נייד באמצעות קוד QR עשויה להגדיל עוד יותר את השימושיות שלהם לתמיכה טכנית בשטח. ככל שייצור העופות ממשיך להתקדם בטכנולוגיית חיישנים וביצירת נתונים, גישות אלו עשויות להפוך לשימושיות יותר ויותר באינפורמטיקה אינטגרטיבית של עופות^18,19.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
איזון אנליטי	פישר סיינטיפיק	15997490	לשקילת חול (למשל, 10 גרם לדגימה)
מחשב עם גישה לאינטרנט	כל	לא זמין	להפעלת RStudio
חממה (37 ומעלה; C)	תרמו-סיינטיפיק	50125590H	לצמיחת חיידקים של 24 שעות
מדיה מיקרוביולוגית (TSA)	BD Difco	236950	למנות חיידקים אירוביים
סליין ממוגן בפוספט (PBS)	תרמו פישר סיינטיפיק	10010023	משמש לדילול ותליות מיקרוביאליות
דגימות חול עופות	בית בשר עופות או מחקר.	לא זמין	אשפה טרייה שנאספה באמצעות עיצוב מבוסס רשת
חבילות R: plotly, dplyr, htmlwidgets	קראן	https://cran.r-project.org	לוויזואליזציה תלת-ממדית וטיפול בנתונים
סביבת מחשוב סטטיסטית R (גרסה 4.3 או מאוחר יותר)	פרויקט R	https://cran.r-project.org	cran.r-project.org
RStudio (v2024.12.0.467 או מאוחר יותר)	הנחה	https://posit.co/download/rstudio-desktop	posit.co
תוכנות גיליונות אלקטרוניים (Excel, Google Sheets)	מיקרוסופט/גוגל	https://www.microsoft.com/exce	לארגן נתונים לפני הייבוא ל-RStudio
צינורות חרוטיים סטריליים בקוטר 10 מ"ל	תרמו פישר סיינטיפיק	339650	להובלת אליקווטים
פיפטות סטריליות וחומרים טיפים	פישר סיינטיפיק	לא זמין	לטיפול מדויק וסטרילי בנוזלים
שקיות סטריל של Whirl-Pak	נאסקו	B01062	לאיסוף דגימות והומוגניזציה
מערבל מערבולת	VWR	10153-838	להומוגניזציה של דגימות