מאמר שיטה

בדיקת ניימכן המוסטזיס: מדידה פלואורוגנית סימולטנית של יצירת תרומבין ופלסמין בבאר אחת

DOI:

10.3791/69701

⸱

27 בפברואר 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Hematology, Radboud university medical center, 2Hemophilia Treatment Center Nijmegen-Eindhoven-Maastricht, 3Enzyre BV, Noviotech Campus, 4Department of Laboratory Medicine, Radboudumc Laboratory of Diagnostics, Radboud university medical center, 5Department of Laboratory Medicine, Laboratory of Hematology, Radboud university medical center

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר את מבחן ניימכן המוסטזיס, המאפשר מדידה סימולטנית ובזמן של יצירת טרומבין ופלסמין כדי לספק הערכה משולבת של קרישה ופיברינוליזה. המבחן שואף לשפר את אפיון האיזון ההמוסטאטי במחקרים ובהקשרים קליניים, מעבר להיקף הבדיקות המוסטטיות המקובלות.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תרומבין ופלסמין שניהם ממלאים תפקיד מרכזי בהמוסטזיס, ומווסתים קרישה ופיברינוליזה, בהתאמה. בדיקות המוסטטיות קונבנציונליות מתמקדות לעיתים קרובות ברכיבים מבודדים או בשלבים מוגבלים של המוסטזיס; לדוגמה, זמן פעיל חלקי של תרומבופלסטין וזמן פרותרומבין מעריכים רק את תחילת היווצרות הפיברין, בעוד שבדיקות פעילות גורמים מעריכים את תפקידם של גורמי קרישה בודדים. למרות שהן יקרות ערך, הבדיקות הללו חסרות מבט מקיפה על התהליך הכולל של המוסטזיס ופיברינוליזה משניים, המתרחשים דינמית לאורך זמן. בדיקת ניימגן המוסטזיס (NHA) מתמודדת עם מגבלה זו על ידי אפשרות מדידה סימולטנית ומדויקת של יצירת תרומבין ופלסמין בבאר מיקרופלטה אחת. באמצעות שני סובסטרטים פלואורוגניים סינתטיים עם ספקטרום גירוי ופליטה מובחנים וללא תגובתיות צולבת, הבדיקה מאפשרת כימות מדויק של שני האנזימים במקביל. המוסטזיס מתחיל בפלזמה דלה בטסיות באמצעות גורם רקמה, סידן ומפעיל פלזמינוגן מסוג רקמה, ופלואורסצנציה נרשמת כל 30 שניות במשך 70 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. עקומות פעילות האנזימים נוצרות באמצעות תקני כיול, שממנו נגזרים פרמטרים כמו זמן השהייה, פוטנציאל תרומבין, זמן ניתוק פיברין וגובה שיא הפלסמין. הבדיקה לוכדת באופן אמין יצירת תרומבין ופלסמין בו-זמנית בדיוק טוב בתוך ובין הבדיקות, ומזהה מודולציה של קרישה ופיברינוליזה על ידי אפקטורים כמו הפארין, חלבון C מופעל וחומצה אפסילון-אמינוקפרואית. בדגימות קליניות, נצפה ירידה משמעותית ביצירת תרומבינים אצל חולים עם ליקויים בגורם קרישה, בעוד שמטופלים עם הפרעות פיברינוליטיות הראו פרופיל ייצור פלסמינים מוגבר. על ידי שילוב מדידות של תרומבינים וייצור פלסמין, ה-NHA מספק תובנה מקיפה לאיזון ההמוסטטי מעבר לבדיקות קונבנציונליות. גישה משולבת זו מבטיחה מחקר ויישומים קליניים, כגון אפיון פנוטיפים המוסטטיים, הערכת סיכון לדימום וטרומבוטיה, ומעקב אחר התערבויות טיפוליות ממוקדות. פרוטוקול זה מפרט את הליך ה-NHA שמטרתו להעמיק את ההבנה וההערכה של איזון ההמוסטטי.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המוסטזיס הוא תוצאה של איזון דינמי בין קרישה לפיברינוליזה. תרומבין ופלסמין הם האנזימים המרכזיים שמניעים את התהליכים הללו: תרומבין ממיר פיברינוגן לפיברין, בעוד שפלסמין מפרק פיברין כדי להמיס קרישים. הפרעה של איזון זה עלולה להוביל לדימום או לאירועים טרומבוטיים 1,2. עם זאת, הבדיקות המעבדתיות המשמשות להערכת המוסטזיס בפרקטיקה קלינית מתמקדות בדרך כלל בשלבים בודדים של קרישה או פיברינוליזה, ומספקות תובנה מוגבלת לגבי האיזון ההמוסטטי הכולל. אצל מטופלים עם נטייה חשודה לדימום, בדיקות סקר שגרתיות כגון זמן פרותרומבין (PT) וזמן תרומבופלסטין חלקי מופעל (aPTT) משמשות לעיתים קרובות לסינון ליקויים בגורמי קרישה. עם זאת, בדיקות אלו מודדות את זמן היווצרות פיברין ראשוני ואינן תופסות יצירת טרומבין מעבר לתחילת קרישת הקרישה, שם מתרחשת רוב פעילות התרומבינים הפיזיולוגיתהרלוונטית 1,2,3. כתוצאה מכך, הם עשויים להניב תוצאות תקינות בחולים עם חסרים קלים בגורם קרישה 3,4,5,6,7,8. כדי לזהות ליקויים ספציפיים אלו, נעשה שימוש בבדיקות פעילות פקטור קרישה. למרות שהן אינפורמטיביות לאבחון, בדיקות אלו בוחנות חלבונים בודדים בנפרד ואינן משקפות את האיזון ההמוסטטי הכולל. כתוצאה מכך, אצל מטופלים עם ליקויים קלים, רמות הגורמים לעיתים קרובות מתואמות בצורה לקויה עם פנוטיפ הדימום 9,10. דבר זה מסבך את הערכת הסיכונים הקלינית ואת אופטימיזציה של ניהול המטופל, כולל תזמון ומינון הטיפול, וכן התערבויות בתגובה לאירועים טרומבוטיים או דימומים חמורים. מגבלות אלו מדגישות את הצורך בבדיקות שמציעות תמונה מקיפה יותר של תהליך ההמוסטה לאורך זמן ועשויות לסייע לגשר על הפער בין תוצאות המעבדה להצגה קלינית.

מבחן ניימכן המוסטזיס (NHA) פותח כדי להתמודד עם מגבלות אלו על ידי אפשרות מדידה סימולטנית ומדויקת של יצירת תרומבין ופלסמין בפלזמה 8,9 ענייה בטסיות דם. הוא משתמש בשני תת-קרקעי פלואורוגניים סינתטיים עם ספקטרום גירוי ופליטה מובחנים כדי לכמת את שני האנזימים באותו באר מיקרופלטה ללא תגובתיות צולבת. עקומות יצירת אנזימים מאפשרות לגזור פרמטרים כמותיים המשקפים את הדינמיקה של קרישה משנית ופיברינוליזה, כולל זמן השהייה, גובה שיא הטרומבין, זמן ניתוק פיברין וגובה שיא הפלסמין. ה-NHA מספק מספר יתרונות על פני בדיקות יצירת תרומבינים קיימות, כגון תרומבוגרם אוטומטי מכוון (CAT), Ceveron s100 ו-ST Genesia, המספקות מידע חשוב על דינמיקת הטרומבין אך אינן מעריכות פעילות פיברינוליטית 10,11,12,13. בדיקות ליזיס קריש, בתורן, לוכדות היבטים של פיברינוליזה אך חסרות מידע על דור14 של התרומבינים. דבר זה מגביל את יעילותם בהערכת האינטראקציות המורכבות שקובעות את האיזון ההמסטטי הכולל. בעוד שחלק מהגישות שפותחו במעבדה משלבות מדידות ייצור תרומבין ופלסמין, הן בדרך כלל דורשות בארות נפרדות או בדיקות מקבילות, מה שמגביל יישור זמני ותפוקה15. בדיקות גלובליות כגון תרומבוולסטוגרפיה (TEG) ותרומבואלסטומטריה סיבובית (ROTEM) מספקות מידע משלים על ידי לכידת המוסטזיס ראשוני, קרישה משנית ופיברינוליזה 16,17. מערכות תא זרימה מייצגות גישה נוספת מתפתחת אך ניסויית להערכת המוסטזיס הכולל בתנאי זרימה18. בעוד שבדיקות גלובליות אלו מציעות הקשר פיזיולוגי רחב יותר, הן בדרך כלל פחות רגישות להפרעות דימום קלות 19,20,21. על ידי מדידת יצירת תרומבין ופלסמין באותה תגובה בו-זמנית, ה-NHA משלבת את הרגישות של TGAs קונבנציונליים עם מבט משולב של בדיקות גלובליות, ומאפשרת הערכה ישירה של המוסטזיס המשנית, פיברינוליזה והאינטראקציות ביניהן.

בדיקות יצירת תרומבינים כבר הראו פוטנציאל משמעותי ליישומים תרגומיים, כגון פרופילינג סיכוני דימום ותרומבוטי מותאם אישית ומעקב טיפולי 22,23,24,25. במחקר קליני, ה-NHA הראה ירידה בייצור תרומבין בחולים עם המופיליה A, המופיליה B וחסרים נדירים בגורמי קרישה, וכן ייצור גבוה של פלסמינים במצבים היפרפיברינוליטיים כגון חוסר ב-α2-אנטיפלזמין 26,27,28,29. הבדלים בשני המסלולים נצפו גם אצל מטופלים עם היפופיברינוגנמיה, הפרעה הקשורה הן לדימום והן לסיכון מוגבר לטרומבוזיס. באוכלוסייה זו, רמות פיברינוגן נמוכות היו בתיאם עם ירידה בייצור פלסמין, ככל הנראה בשל היעדר אתרי קישור לפלסמינוגנים, בעוד שמטופלים עם היסטוריה של טרומבוזה הראו עלייה בדור הטרומבין30. בנוסף, הבדיקה מזהה את השפעות החומרים הטיפוליים, כולל נוגדי קרישה, פרוקוגולנטים ואנטיפיברינוליטיים. במחקר קודם, הצענו גישת סטנדרטיזציה ונרמול לשיפור השחזוריות ולאפשר השוואת תוצאות בין ריצות ומעבדות, צעד חיוני לקראת יישום קליני28. פרוטוקול זה מפרט את כל הפרוצדורה והגישה האנליטית של ה-NHA ליישום במחקר קליני או בהקשרים תרגומיים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל ההליכים הכוללים דגימות פלזמה אנושית בוצעו בהתאם להנחיות מוסדיות ואושרו על ידי ועדת האתיקה הרפואית של ארנהם-ניימכן. התקבלה הסכמה בכתב מדעת מכל התורמים לפני איסוף הדגימה.

1. הכנת בופרים, מגיבים ודגימות פלזמה

  1. הכנת פתרונות בופר
    1. שקלו 1.2 גרם טריס (p.a.) והתמסו ב-180 מ"ל של 0.9% NaCl.
    2. כוון את ה-pH ל-7.4 בעזרת HCl.
    3. הביאו את הנפח הסופי ל-200 מ"ל עם 0.9% NaCl כדי לקבל בופר NaCl (TBS) של 50 מ"מ טריס-150 מ"מ.
    4. חבר את ה-TBS לשני צינורות של 50 מ"ל.
    5. השתמשו ב-100 מ"ל TBS הנותרים להכנת הבופר המכיל סידן. המיס 7.34 גרם CaCl2·2H2O ב-100 מ"ל TBS כדי לקבל בופר Tris-NaCl-CaCl2 (TBS-Ca, pH 7.4).
    6. חבר את ה-TBS-Ca לשני צינורות של 50 מ"ל.
    7. אחסן את שני המנגנים ב-4 מעלות צלזיוס והשתמש תוך שבוע.
  2. הכינו מצעים פלואורוגניים
    1. המיס 53.2 מ"ג של תת-תרומבין (Bz-beta-Ala-Gly-Arg-AMC) ב-4 מ"ל של בופר Tris-NaCl.
      הערה: הקופסה מכילה עלון עם תעודת ניתוח. נפח הבופר שיש להוסיף תלוי בריכוז המוגדר ויש לכוונן כך ש-1 מיקרו-ליטר של תרומבין אנושי נוסף ב-120 מיקרוליטר מגיב יניב ריכוז סופי של 76 ננומול/ליטר.
    2. Aliquot 100 מיקרוליטר בצינורות אפנדורף ומאוחסנים בטמפרטורה של −80 מעלות צלזיוס.
    3. הפשיר אליקו של תת-פלט פלואורוגני ספציפי לטרומבין למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר לפני השימוש. Vortex ולשמור על הקרח במהלך הניסוי.
    4. המיס את תכולת בקבוקון אחד של תת-פלזמין (CBZ-L-Phe-Arg-rhodamine) ב-1,955 מיקרוליטר DMSO.
      הערה: הקופסה מכילה עלון עם תעודת ניתוח. נפח הבופר שיש להוסיף תלוי בריכוז המוגדר ויש לכוונן כך שמיקרוליטר פלזמין אנושי נוסף ב-120 מיקרוליטר יניב ריכוז סופי של 200 ננומול/ליטר.
    5. Aliquot 60 מיקרוליטר בצינורות אפנדורף ומאוחסנים ב-−80°C.
    6. הפשרה של תת-פלט פלואורוגני ספציפי לפלסמין למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר לפני השימוש. מערבולת ולשמור על טמפרטורת החדר במהלך הניסוי.
      הערה: מצע זה מומס בדימתיל סולפוקסיד (DMSO) ואין לקרר אותו כדי למנוע משקעים.
  3. הכינו תגובות טריגר
    1. שחזרו את הצפאלין הליופילי על ידי הוספת 1 מ"ל מים מזוקקים. מערבולת עד שהתמסה לחלוטין.
      הערה: צפאלין מורכב מחדש כדי לספק פוספוליפידים, החיוניים לזרז תגובות קרישה מרובות המאפשרות קרישה פיזיולוגית רלוונטית בבדיקה.
    2. Aliquot 60 מיקרוליטר בצינורות אפנדורף (מספיק ל-20 בארות) ומאוחסן בטמפרטורה של −20°C.
    3. הפשיר אליקו לפני השימוש ושמור אותו על קרח. מערבולת לרגע לפני שפיפסת.
    4. לשחזר את תכולת בקבוקון אחד של פקטור רקמה אנושית רקומביננטי (TF) ב-4 מ"ל מים מזוקקים.
    5. Aliquot 60 מיקרוליטר בצינורות אפנדורף ומאוחסנים ב-−80°C.
    6. הפשיר אליקו של TF ו-Vortex לזמן קצר.
    7. הכן דילול של 1:500 של TF על ידי דילול רציף:
      1. הוסף 6 מיקרוליטר של TF ל-54 מיקרוליטר של בופר TBS. מערבולת.
      2. קח 6 מיקרוליטר מדילול זה והוסיף ל-54 מיקרוליטר של TBS. מערבולת.
      3. קחו 20 מיקרוליטר מהדילול השני הזה והוסיפו ל-80 מיקרו-ליטר TBS כדי להגיע לריכוז סופי של 0.28 pM. מערבולת.
    8. לשחזר את תכולת בקבוקון אחד (20 מ"ג) של מפעיל פלזמינוגן מסוג רקמה (tPA) ב-20 מ"ל מים מזוקקים כדי לקבל ריכוז סופי של 580,000 IU/mL (אימות ריכוז ספציפי לאצווה).
    9. Aliquot 50 מיקרוליטר בצינורות אפנדורף ומאוחסן בטמפרטורה של −80°C.
    10. הפשיר אליקו של tPA ו-Vortex לזמן קצר.
    11. הכינו דילול של 1:50 של tPA על ידי הוספת 20 מיקרוליטר tPA ל-980 מיקרוליטר של בופר Tris-NaCl, ולהגיע לריכוז סופי של 11,600 IU/mL. מערבולת.
  4. הכינו דגימות פלזמה
    1. אסוף דם ורידי לצינורות של 3 מ"ל ציטראט המכילים 3.2% ציטראט, תוך הבטחת איסוף של לפחות 2.7 מ"ל (מילוי 90%).
    2. אין להשתמש בצינור הראשון לאחר הווניפונקטור; להשליך אותו כדי להימנע מהפעלה על ידי גורם רקמה.
    3. הפוך את הצינור לפחות 10 פעמים מיד לאחר האיסוף.
    4. צנטריפוגה תוך שעתיים בטמפרטורת החדר, תחילה ב-2,500 × גרם למשך 5 דקות, ואחר כך 10,000 × גרם ל-10 דקות.
    5. השתמש בפיפטה חד-פעמית כדי לאסוף את הפלזמה ממש מעל שכבת התא.
    6. אליקווט פלזמה לקריוביאלים מסומנים, הקפאה במהירות בחנקן נוזלי, ואחסון בטמפרטורה של −80 מעלות צלזיוס.
      הערה: ודא שהדגימה נקייה מקרישי דם. השתמש רק בפלזמה טרייה או פעם אחת שהופשרה. צינור CTAD אחד מספיק לניתוח כפול.

2. הכנת מכשירים והגדרת תוכנה

  1. הכינו את קורא לוחות הפלואורסצנציה
    1. הפעל את קורא הלוחות ואפשר לו להתאזן ל-37 מעלות צלזיוס.
    2. הגדר את הפרמטרים הבסיסיים הבאים:
      1. גריינר 96-באר, תחתית שטוחה, שחור.
      2. הגדרות כלליות: עיכוב במיקום: 0.1 שניות; מספר החלונות הקינטיים: 1.
      3. חלון קינטי: מספר מחזורים: 140; זמן התחלת מדידה: 0.0 שניות; מספר הבזקים לכל באר למחזור: 10; זמן מחזור: 30 שניות.
      4. אופטיקה: אופטיקה עליונה
      5. הגדרות מסנן: מספר מונוכרומטיים: 2. מסנן עירור: 355 ננומטר לתרומבין; 485 ננומטר לפלסמין. מסנן פליטה: 460 ננומטר לתרומבין, 520 ננומטר לפלסמין. רווח: 600.
    3. הגדר את הפריסה עם מקסימום של 20 בארות לכל פלטה.
    4. עבור לריכוזים/נפחים/ניעורים ואשר את ההגדרות הבאות. משאבה 1 = 20 מיקרוליטר; משאבה 2 = 0 מיקרוליטר; מהירות = 420 מיקרוליטר לשנייה.
  2. הכן את מערכת ההזרקה
    1. הסר ושטף את מחטי ההזרקה במיכל עם בופר.
    2. כוון את נפח השטיפה ל-2,500 מיקרוליטר ושטוף את המשאבות עם בופר Tris/NaCl של 37 מעלות צלזיוס.
    3. אפס את נפח השטיפה ל-500 מיקרוליטר.

3. הגדרת מבחן בפורמט מיקרופלטה

  1. הגדרת מנענע מיקרופלטה
    1. כוון את המיקרופלטה ל-37 מעלות צלזיוס ובדוק את הטמפרטורה לפני השימוש.
    2. כוון את עוצמת הרעידות ל-1100 סל"ד.
    3. השתמש בשייקר זה לכל שלבי הערבוב במבחן כדי להבטיח התפלגות הומוגנית של תגובות ופעילות אנזימטית עקבית.
  2. הוסף מגיבים לבארות
    1. הפשרו את הפלזמה של המטופל ואת הפלזמה המצטברת (NPP) באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך עד 10 דקות.
    2. ערבבו היטב וודאו הפשרה מלאה (ללא קריופרציפיט).
    3. הוסף 80 מיקרוליטר של פלזמה או NPP לבארות שנבחרו מראש. השתמש בקצה פיפטה טרי לכל דגימה.
      הערה: כלול מדגם NPP בכל ריצת בדיקה כדי להתחשב בשונות בין ריצות (ראו בהמשך בשלב 5.6).
    4. הוסף 2 מיקרו ליטר צפלין.
    5. הוסף 2 מיקרוליטר של פקטור רקמה (דילול של 1:500). מערבבים לזמן קצר עם מנער צלחות.
    6. הוסף 10 מיקרוליטר של בופר Tris-NaCl. מערבבים לזמן קצר עם מנער צלחות.
    7. הוסף 4 מיקרוליטר של מצע ת'רומבין.
    8. הוסף 2 מיקרו ליטר של מצע פלסמין. מערבבים לזמן קצר עם מנער צלחות.
  3. טרום-דגירה
    1. הכנס את המיקרופלטה לקורא הלוחות.
    2. תן לצלחת להתאזן ב-37 מעלות צלזיוס למשך כמה דקות.

4. הכנה והזרקה של המגיב ההתחלתי

  1. הכינו את המגיב למשאבה 1
    1. שילוב 672 מיקרוליטר של בופר Tris/NaCl, 192 מיקרוליטר של בופר Tris/NaCl/CaCl₂, ו-96 מיקרוליטר tPA (מהשלב 1.2.5). מערבולת ביסודיות.
    2. חורצים שני חורים במכסה של צינור הריאגנט.
    3. הכנס את צינור המשאבה דרך חור אחד לתחתית הצינור.
  2. פריים ותחילת הבדיקה
    1. השתמש בתוכנה כדי להכין 500 מיקרוליטר של המשאבה מהמפעיל.
    2. החזירו את מחטי ההזרקה למיקומם המיועד.
    3. תתחיל מיד את מדידת הפלואורסצנציה.
  3. התחלה ידנית של הבדיקה
    הערה: הליך ההפעלה הידני הזה מספק חלופה לתהליך הזרקה האוטומטי המתואר בשלבים 2.2, 4.1 ו-4.2.
    1. הכינו את המגיב ההתחלתי כפי שמתואר ב-4.1.1 מיד לפני השימוש.
    2. הסר את המיקרופלטה מקורא הלוחות והוסף במהירות 20 מיקרו-ליטר מהתגובת ההתחלתית ידנית לכל באר באמצעות פיפטה מכויילת או פיפטה רב-ערוצית לטיפול מהיר יותר.
    3. החזר מיד את הלוחית לקורא והתחל את מדידת הפלואורסצנציה ללא דיחוי.
      הערה: מזער את הזמן בין הוספת המגיב להתחלת המדידה (<10 שניות לשורה) כדי להפחית את השונות.
  4. קריאה קינטית
    1. רישום פלואורסצנציה כל 30 שניות למשך 70 דקות.
    2. שמור על הפלטה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס במהלך המדידה.

5. ניתוח נתונים

  1. הכינו את הנתונים לניתוח
    1. ייצא את נתוני הפלואורסצנציה הקינטית מקורא הלוחות כטבלה עם נקודות זמן וערכי פלואורסצנציה לכל באר.
    2. המרו את נתוני הפלואורסצנציה הגולמיים לעקומות יצירת אנזימים על ידי חישוב הנגזרת הראשונה באמצעות Excel או תוכנית אחרת.
    3. צייר את עקומות יצירת האנזימים לכל באר כדי להמחיש את התגובה האנזימטית.
      הערה: עקומות אלו מייצגות את קצב יצירת התרומבינים או הפלסמין לאורך זמן ומתאימות לתוצאה הגרפית המוצגת באישומים.
  2. ניתוח עקומות יצירת תרומבין
    1. זהה את הפרמטרים הבאים מעקומת יצירת התרומבין (ראו איור 1):
      1. זמן השהייה: נקודת הזמן שבה עקומת יצירת התרומבינים עולה בעקביות ומגיעה ל-8% מגובה השיא של התרומבין.
      2. גובה שיא ת'רומבין: ערך האות המקסימלי בציר ה-y (כלומר, קצב יצירת ת'רומבין מקסימלי).
      3. זמן שיא התרומבין: הזמן מתחילת הבדיקה ועד לגובה השיא של התרומבין.
      4. פוטנציאל ת'רומבין (שטח מתחת לעקומת יצירת הת'רומבין): השטח מתחת לעקומה מזמן ההשהיה ועד לאות הת'רומבין שחוזר לקו הבסיס.
        הערה: פוטנציאל התרומבין משקף את סך קיבולת ייצור התרומבינים של הדגימה בתנאי הבדיקה.
  3. ניתוח עקומות יצירת פלסמינים
    1. זהה את הפרמטרים הבאים מעקומת יצירת הפלסמין (ראו איור 2):
      1. זמן פירוק פיברין: הזמן מתחילת יצירת הפלסמין (כלומר, נקודת הזמן שבה עקומת יצירת הפלסמין עולה בעקביות ומגיעה ל-8% מגובה שיא הפלסמין) ועד לנקודה שבה מגיעים לשיא הפלסמין.
      2. גובה שיא הפלסמין: המקסימום המובחן הראשון בעקומה, התואם לפיצוץ הראשוני ביצירת פלסמין, נקבע בנקודה שבה הנגזרת השנייה של עקומת יצירת הפלסמין (המבוססת על ממוצע נע של שלוש דקות) מגיעה לאפס לאחר תחילת יצירת הפלסמין.
      3. פוטנציאל הפלזמין (השטח מתחת לעקומת יצירת הפלסמין): השטח מתחת לעקומה מתחילת יצירת הפלסמין ועד לזמן שיא הפלסמין.
        הערה: תנודות האות אכן מתרחשות לאחר שיא הפלסמין הראשוני, ואינן נכללות בניתוח פרמטרי יצירת הפלסמין.
  4. חילוץ פרמטרים ידנית או באמצעות תוכנה מותאמת אישית
    1. השתמש ב-Microsoft Excel, GraphPad Prism, או סקריפט מותאם אישית (למשל, בפייתון או R) כדי לחלץ פרמטרים קינטיים.
    2. שמור את הנתונים הגולמיים, העקומות המצוירות והפרמטרים המחושבים בפורמט מובנה לארכיון והפניה עתידית.
      הערה: אם משתמשים במקרו, בדוק את נכונות כל הפרמטרים ויזואלית וידנית לפני שתסתמך על פלט אוטומטי. המקרו שלנו להמרת נתונים זמין לפי בקשה.
  5. תקינה ונרמול
    1. קבע ייחוס פיזיולוגי על ידי מדידת 40 דגימות בודדות מתורמים בריאים במקביל לדגימת NPP המשמשת לנרמל. בצע את השלב הזה פעם אחת בכל אצווה של NPP.
    2. חשב את ערכי הפרמטרים הממוצעים של תרומבין ויצירת פלסמינים של התורמים הבריאים, וקבע את היחס שלהם לערכי ה-NPP המתאימים שהתקבלו באותו ריצה.
    3. עבור כל דגימת מטופל בריצה נתונה, תחילה נרמל את פרמטר יצירת התרומבין או הפלסמין לערך NPP שנמדד באותה ריצה.
    4. חלק תוצאה זו ביחס התורם ל-NPP הבריא שנקבע קודם לכן עבור אותה אצווה של NPP (ראו שלב 5.6.2). זה מניב ערך יחסי שמנורמל לממוצע של אדם בריא, עם סטנדרטיזציה של שונות בין ריצות באמצעות NPP.
    5. ערכי פרמטרים מבטאים כאחוזים יחסית לערך הממוצע של יחידים בריאים (מוגדר כ-100%). הצג את תוצאות מדגם המטופלים בהתאם.
      הערה: ערכי הפרמטרים היחסיים לכל מדגם מטופל מחושבים באמצעות הנוסחה הבאה, כאשר ריצה a מתייחסת לרצת המדידה של דגימת המטופל, וריצה b מתייחסת לריצה שבה דגימות תורם בריאות נמדדו במקביל לאותה מחזור NPP. קובץ האקסל שלנו המכיל את החישובים לנרמול נתונים זמין לפי בקשה.
      figure-protocol-1

6. יצירת עקומות כיול

  1. הכינו את עקומת כיול התרומבין
    1. שחזר את α-תרומבין האנושי הליופילי כפי שמצוין בגיליון הנתונים של היצרן.
      הערה: לדוגמה, אם גיליון הנתונים מציין שיקום במים של 100 מיקרוליטר להניב 3.34 מ"ג/מ"ל, זה מתייחס ל-0.334 מ"ג ב-100 מיקרוליטר.
    2. מדלל את התרומבין המשוחזר ביחס של 1:10 בבופר Tris/NaCl.
      הערה: זה מניב ריכוז מלאי של כ-9.1 ננומול/מ"ל (0.0091 ננומול/מיקרוליטר), בהתבסס על משקל מולקולרי של 36,700 גרם/מול.
    3. הכינו סדרת דילול בבופר Tris/NaCl כדי להשיג ריכוזי תרומבינים סופיים בבדיקה הנעים בין 0 ל-152 nmol/L.
    4. פיפט ת'רומבין לבארות נבחרות שכבר מכילות בופר כדי להגיע לנפח כולל של 100 מיקרו-ליטר לבאר.
    5. הכינו את תמיסת הסובסטרט למשאבה 1 על ידי ערבוב 300 מיקרוליטר של בופר Tris/NaCl עם 200 מיקרוליטר מצע תרומבין משלב 1.2.2.
    6. יש לדלל עוד תמיסה זו על ידי שילוב של 400 מיקרוליטר מהתערובת עם 360 מיקרוליטר של בופר Tris/NaCl.
    7. הוסיפו 20 מיקרוליטר מתערובת תת-קרקעית זו לכל באר כיול, ומביאים את נפח הבדיקה הכולל ל-120 מיקרוליטר.
    8. ערבבו בעדינות את הצלחת והכניסו אותה לקורא הצלחות. הרץ את הבדיקה הקינטית במשך 25 מחזורים, תוך שימוש באותן הגדרות פלואורסצנציה המתוארות בסעיף 2.
    9. ייצוא את נתוני הפלואורסצנציה הגולמיים וקבעו את השיפוע ההתחלתי (קצב עלייה בפלואורסצנציה למחזור) עבור כל ריכוז ת'רומבין באמצעות GraphPad Prism או תוכנה מקבילה.
    10. יצר עקומה סטנדרטית על ידי ציור השיפוע ההתחלתי מול ריכוז הת'רומבין.
      הערה: ודאו שכל הבופרים מחוממים מראש ל-37 מעלות צלזיוס ומטפלים באנזימים על קרח. תמיד הכינו דילול טרי וערבבו היטב. העקומה הסטנדרטית המתקבלת משמשת לחישוב פעילות התרומבין היחסית בדגימות לא ידועות באמצעות המקרו המתואר בסעיף 5.
  2. הכנת עקומת כיול הפלזמין
    1. לשחזר פלזמין ליופילי במים מזוקקים (למשל, 0.543 מ"ל) לפי הוראות היצרן.
      הערה: לפלסמין יש משקל מולקולרי של 75,400 גרם למול. ריכוז המלאי המתקבל הוא כ-24.3 ננומול/מ"ל (0.024 ננומול/מיקרוליטר), בהנחה של 1 מ"ג ל-0.543 מ"ל.
    2. הכינו סדרת דילול בבופר Tris/NaCl להשגת ריכוזי פלזמין סופיים במבחן הנעים בין 66 ל-532 nmol/L.
    3. פיפט פלזמין לבארות המכילות בופר Tris/NaCl כדי להגיע לנפח סופי של 100 מיקרוליטר לבאר.
    4. הכינו את תמיסת המצע למשאבה 1 על ידי ערבוב 680 מיקרוליטר של בופר Tris/NaCl עם 80 מיקרוליטר של מצע פלסמין/רודמין (מדולל מראש 1:1 במידת הצורך) החל משלב 1.2.5.
    5. הוסף 20 מיקרו-ליטר של תמיסת תת-קרקע זו לכל באר כיול, ומביאים את הנפח הכולל ל-120 מיקרוליטר.
    6. ערבבו בעדינות את הצלחת והכניסו אותה לקורא הצלחות. הרץ את הבדיקה הקינטית במשך 25 מחזורים תוך שימוש באותן הגדרות פלואורסצנציה כפי שמתואר בסעיף 2.
    7. ייצוא את נתוני הפלואורסצנציה הגולמיים וקבעו את השיפוע ההתחלתי של עליית הפלואורסצנציה עבור כל ריכוז פלזמין על ידי יישום רגרסיה ליניארית על הפאזה הליניארית של העקומה הקינטית באמצעות GraphPad Prism או תוכנה מקבילה.
    8. יצירת עקומה סטנדרטית על ידי ציור השיפוע ההתחלתי מול ריכוז הפלסמין.
      הערה: בשל שונות בפעילות הפלסמין בין אצווה, יש לחזור על הכיול בכל אצווה חדשה. אם נצפתה פעילות גבוהה באופן בלתי צפוי, מומלץ לדלול 1:2 של המלאי לפני הכנת סדרת הכיול.
  3. השתמש בעקומת הכיול לכימות
    1. השתמש בעקומות הכיול שנוצרו בסעיף 6 כדי להמיר ערכי שיפוע פלואורסצנציה לפעילות אנזימטית יחסית.
    2. השתמשו רק בחלק הליניארי של עקומת הכיול לאינטרפולציה של דגימות לא ידועות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עקומות יצירה מייצגות של תרומבין ופלסמין שהושגו באמצעות מבחן ניימכן המוסטזיס (NHA) מוצגות באיור 3. עוצמת האות של כל עקומה מבוטאת כאחוז יחסית לדגימת הפלזמה הנורמלית (NPP) הנמדדת במקביל. דגימה עם NPP נכללת בכל ריצה כבקרה פנימית לאימות תוקף הבדיקה ולהבטיח השוואה בין הרצות.

תצוגת איור 3A,B נובעת משלושה בקרים בריאים ופלזמה מקובלת נורמלית (NPP), המציגה עקומות תרומבין ופלסמין ניתנות לשחזור עם...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מבחן ניימגן המוסטזיס (NHA) הוא מבחן פלואורוגני דו-אנזימי המאפשר מדידה סימולטנית ומדויקת של יצירת תרומבין ופלסמין בפלזמה דלה בטסיות. על ידי לכידת שני התהליכים בבאר אחת, השיטה מקלה על ניתוח קינטי ברזולוציה גבוהה של המוסטזיס ופיברינוליזה משנית. הקריאה הכפולה הזו מציעה יתרונות מתודולוגיים ברורים על פני בדיקות קונבנציונליות, והיא יושמה בהצלחה במחקר ליקויים בגורמי קרישה, מצבים היפרפיברינוליטיים והפרעות נוספות של איזון המוסטטי.

מספר היבטים טכניים קריטיים לאמינות ולשח...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W.L. ואן הירדה הוא מייסד ועובד של Enzyre BV ובעלים שותף של Van Heerde Holding BV, שהיא בעלת מניות ב-Enzyre. אנזייר קיבלה מימון למחקר חוזי מטקדה ונובו נורדיסק. ו.ל. ואן הירדה קיבל גם תמיכה במענקי נסיעות מ-SOBI ומ-CAF-DCF. המחברים הנותרים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה נערך בהתאם למטרות EuroBloodNet.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>חומרים
סידן כלורידדיהידרט (CaCl2.2H2O)מרק1.02382
קפאלין (ערכת תגובת APTT של C.K. Prest 5)סטאגו00847יציב במשך 6 חודשים ב--20- &00;°C 
מים מזוקקיםרשום את תאריך הפתיחה. השתמש תוך יום אחד מהפתיחה הראשונה.
דימתילסולפוקסיד (DMSO)מרק1.02950.0500
אלפא-תרומבין אנושימעבדות מחקר אנזימיםHT 1002aהקופסה מכילה עלון עם תעודת ניתוח. נפח הבופר שיש להוסיף תלוי בריכוז שצוין ויש לכוונן כך ש-1 ומיקרו; L של תרומבין אנושי נוסף ב-120 ומיקרו; תגובת L מניבה ריכוז סופי של 76 ננומול לליטר.
פלאסמין אנושימעבדות מחקר אנזימיםHPlasהקופסה מכילה עלון עם תעודת ניתוח. נפח הבופר שיש להוסיף תלוי בריכוז שצוין ויש לכוונן כך ש-1 ומיקרו; L של פלאסמין אנושי נוסף ב-120 ומיקרו; תגובת L מביאה לריכוז סופי של 200 ננומול/ליטר.
פלזמה מצטברת רגילההכנה פנימיתלא רלוונטייציב ל-3 שעות אחרי ההפשרה אם נשאר על הקרח.
פלזמת המטופללא רלוונטילא רלוונטי
מצע פלזמין (CBZ-L-פנילאניל-L-ארגינין אמיד)-רודמין-מורפולינו אוריאהסימרסיציב במשך 6 חודשים ב-80- °C 
גורם רקמה אנושית רקומביננטי (TF): אינוביןדייד בהרינגB4212יציב במשך 6 חודשים ב-80- °C 
מפעיל פלסמינוגן מסוג רקומביננטי (tPA): אלטפלז/אקטיליזבוהרינגר אינגלהייםיציב ל-12 חודשים ב-80- &°C 
טריס(הידרוקסילמתיל)אמינומתאן (H2NC(CH2OH)3)מרק1.08382.2500
בופר Tris-NaCl, pH 7,4 (TBS)הכנה פנימיתלא רלוונטי
בופר Tris-NaCl-CaCl2, pH 7,4 (TBS-Ca)הכנה פנימיתלא רלוונטי
מצע תרומבין Bz-beta-Ala-Gly-Arg-7-amino-4-methylcoumarinסימרסיציב במשך 6 חודשים ב-80- °C 
<חזק>ציוד
פלואורמטר Fluostar Optima / קורא מיקרופלטה עם בקרת טמפרטורה ומזרקי תגובהBMG Labtech
לוח מיקרוטיטר 96 בארים, פוליסטירן, משטח קישור בינוני עם תחתית שטוחה, שחור (מקביל למיקרולון)גריינר ביו-וואן655076
איזון אנליטי (איזון עומס עליון)
קצות פיפטה כחולים (ל-100-1000 ומיקרו; L)
צינורות איסוף דם ציטראט 3 מ"ל (3.2% ציטראט)BD וקוטיינר
דלי קרח
מכונת קרח
חממה / מיקרופלטה מנערת
מערבל מגנטי
מתקן צינורות מיקרוצנטריפוגה
צינורות מיקרוצנטריפוגה, ניתנים לסגירה
מד pH
טיפים של פיפטה 0.1-10 ומיקרו; L, לא סטרילי
פיפטות (2, 10, 20, 100, ו-1000 ומיקרו; L)
מברג (משמש כגשש)
מיקסר צינורות
אמבט מים
קצות פיפטה צהובים (ל-20-200 ומיקרו; L)

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chapin, J. C., Hajjar, K. A. Fibrinolysis and the control of blood coagulation. Blood Rev. 29 (1), 17-24 (2015).
  2. Furie, B. Pathogenesis of thrombosis. Hematology. 2009 (1), 255-258 (2009).
  3. Teruya, J., et al. A normal aPTT does not guarantee adequate coagulation factor levels. Anesthesiology. 94 (3), 542(2001).
  4. Puetz, J., Hugge, C., Moser, K. Normal aPTT in children with mild factor XI deficiency. Pediatr Blood Cancer. 65 (4), pbc.26910(2018).
  5. Toulon, P., et al. In vitro sensitivity of different activated partial thromboplastin time reagents to mild clotting factor deficiencies. Int J Lab Hematol. 38 (4), 389-396 (2016).
  6. Massignon, D., et al. Prothrombin time sensitivity and specificity to mild clotting factor deficiencies of the extrinsic pathway:evaluation of eight commercial thromboplastins. Thromb Haemost. 75 (4), 590-594 (1996).
  7. Burns, E. R., et al. Paradoxic effect of multiple mild coagulation factor deficiencies on the prothrombin time and activated partial thromboplastin time. Am J Clin Pathol. 100 (2), 94-98 (1993).
  8. van Geffen, M., et al. A novel hemostasis assay for the simultaneous measurement of coagulation and fibrinolysis. Hematology. 16 (6), 327-336 (2011).
  9. van Geffen, M., et al. Pharmacodynamics of recombinant activated factor VII and plasma-derived factor VII in a cohort of severe FVII deficient patients. Thromb Res. 132 (1), 116-122 (2013).
  10. Hemker, H. C., et al. The calibrated automated thrombogram (CAT):a universal routine test for hyper- and hypocoagulability. Pathophysiol Haemost Thromb. 32 (5-6), 249-253 (2002).
  11. Kristensen, S. R., et al. Thrombin generation measured on ST Genesia, a new platform in the coagulation routine lab:assessment of analytical and between-subject variation. Res Pract Thromb Haemost. 6 (1), e12654(2022).
  12. Hemker, H. C., Béguin, S. Phenotyping the clotting system. Thromb Haemost. 84 (5), 747-751 (2000).
  13. Tripodi, A. Thrombin generation assay and its application in the clinical laboratory. Clin Chem. 62 (5), 699-707 (2016).
  14. Valke, L., et al. Fibrinolytic assays in bleeding of unknown cause:improvement in diagnostic yield. Res Pract Thromb Haemost. 6 (2), e12681(2022).
  15. van Geffen, M., van Heerde, W. L. Global haemostasis assays, from bench to bedside. Thromb Res. 129 (6), 681-687 (2012).
  16. Luddington, R. J. Thrombelastography/thromboelastometry. Clin Lab Haematol. 27 (2), 81-90 (2005).
  17. Hartmann, J., et al. Viscoelastic testing:an illustrated review of technology and clinical applications. Res Pract Thromb Haemost. 7 (1), 100031(2023).
  18. Schoeman, R. M., et al. Flow chamber and microfluidic approaches for measuring thrombus formation in genetic bleeding disorders. Platelets. 28 (5), 463-471 (2017).
  19. Bavinck, A. P., et al. Viscoelastic testing in patients with very rare bleeding disorders of secondary hemostasis:a scoping review. Thromb Res. 2025, 109449(2025).
  20. Mansouritorghabeh, H., et al. The utility of total thrombus-formation analysis system (T-TAS) in the thrombosis and hemostasis field:a scoping review. Int J Lab Hematol. 47 (2), 201-211 (2025).
  21. Lecchi, A., et al. Flow-chamber device (T-TAS) to diagnose patients suspected of platelet function defects. Blood Transfus. 22 (1), 55-64 (2024).
  22. Zekavat, O. R., et al. Comparison of thrombin generation assay with conventional coagulation tests in evaluation of bleeding risk in patients with rare bleeding disorders. Clin Appl Thromb Hemost. 20 (6), 637-644 (2014).
  23. Brummel-Ziedins, K. E., et al. Thrombin generation and bleeding in haemophilia A. Haemophilia. 15 (5), 1118-1125 (2009).
  24. Al Dieri, R., et al. Thrombin generation:what have we learned. Blood Rev. 26 (5), 197-203 (2012).
  25. Binder, N. B., et al. Clinical use of thrombin generation assays. J Thromb Haemost. 19 (12), 2918-2929 (2021).
  26. Verhagen, M. J. A., et al. In patients with hemophilia, a decreased thrombin generation profile is associated with a severe bleeding phenotype. Res Pract Thromb Haemost. 7 (2), 100062(2023).
  27. Haisma, B., et al. Enhanced thrombin and plasmin generation profiles in alpha-2-antiplasmin-deficient patients:data from the Rare Bleeding Disorders in the Netherlands study. Res Pract Thromb Haemost. 8 (7), 102604(2024).
  28. Haisma, B., et al. Comparative analysis of thrombin generation platforms for patients with coagulation factor deficiencies:a comprehensive assessment. Thromb Res. 240, 109045(2024).
  29. van Geffen, M., et al. Retrospective evaluation of bleeding tendency and simultaneous thrombin and plasmin generation in patients with rare bleeding disorders. Haemophilia. 18 (4), 630-638 (2012).
  30. Haisma, B., et al. genotype, and laboratory assessment of congenital fibrinogen disorders:data from the Rare Bleeding Disorders in the Netherlands study. Thromb Res. 249, 109317(2025).
  31. Bouma, B. N., Meijers, J. C. Thrombin-activatable fibrinolysis inhibitor (TAFI, plasma procarboxypeptidase B, procarboxypeptidase R, procarboxypeptidase U). J Thromb Haemost. 1 (7), 1566-1574 (2003).
  32. Marx, P. F. Thrombin-activatable fibrinolysis inhibitor. Curr Med Chem. 11 (17), 2335-2348 (2004).
  33. Rijken, D. C., Lijnen, H. R. New insights into the molecular mechanisms of the fibrinolytic system. J Thromb Haemost. 7 (1), 4-13 (2009).
  34. Depasse, F., et al. Thrombin generation assays are versatile tools in blood coagulation analysis:a review of technical features, and applications from research to laboratory routine. J Thromb Haemost. 19 (12), 2907-2916 (2021).
  35. Subcommittee on Control of Anticoagulation of the SSC of the ISTH. Towards a recommendation for the standardization of the measurement of platelet-dependent thrombin generation. J Thromb Haemost. 9 (9), 1859-1861 (2011).
  36. Duarte, R. C. F., et al. Standardization and evaluation of the performance of the thrombin generation test under hypo- and hypercoagulability conditions. Hematol Transfus Cell Ther. 41 (3), 244-252 (2019).
  37. Dargaud, Y., et al. Effect of standardization and normalization on imprecision of calibrated automated thrombography:an international multicentre study. Br J Haematol. 139 (2), 303-309 (2007).
  38. Ninivaggi, M., et al. Recommendations for the measurement of thrombin generation:communication from the ISTH SSC Subcommittee on Lupus Anticoagulant/Antiphospholipid Antibodies. J Thromb Haemost. 19 (5), 1372-1378 (2021).
  39. Duchemin, J., et al. Influence of coagulation factors and tissue factor concentration on the thrombin generation test in plasma. Thromb Haemost. 99 (4), 767-773 (2008).
  40. Miszta, A., et al. A high-fat diet delays plasmin generation in a thrombomodulin-dependent manner in mice. Blood. 135 (19), 1704-1717 (2020).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים