מאמר שיטה

הליך שלב אחר שלב לייצור כימרה של קו נבט בעוף באמצעות השתלת תאי נבט פרימורדיאליים

777 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/69704

⸱

5 בדצמבר 2025

 ,  , 
1Department of Agricultural Biotechnology and Research Institute of Agriculture and Life Sciences, Seoul National University, 2Department of International Agricultural Technology & Institute of Green Bioscience and Technology, Seoul National University

במאמר זה

סיכום

כימרות נבט של עופות, שנוצרות מהשתלת תאי נבט פרימורדיאליים (PGCs) לעוברים מקבלים, מאפשרות יישומים בתהליך טרנסגנזה, עריכת גנים ושימור מינים. פרוטוקול זה מפרט נהלים לבידוד PGC, הרחבה במבחנה , מיקרוהזרקה ואימות תורמים, ומספק פלטפורמה אמינה לייצור כימרות בקו הנבט ולקידום ביוטכנולוגיה של עופות.

תקציר

יצירת כימרות נבט בעופות באמצעות השתלת תאי נבט פרימורדיאליים (PGCs) מספקת פלטפורמה חזקה וניתנת לשחזור לטרנסגנזה של עופות, עריכת גנום ושימור מינים. גישות מסורתיות המשתמשות בתאי בלסטודרמל מעוברים בשלב X של EGK מוגבלות בשל יעילות העברת קווי נבט נמוכה עקב הפרדה מוקדמת של שושלת תאים. לעומת זאת, אסטרטגיות המתווכות על ידי PGC מנצלות את היכולת הגנטית הפנימית של תאים אוניפוטנטיים אלו, ומאפשרות שילוב אמין בגונדות המקבלות. כאן, אנו מציגים פרוטוקול שלבי לבידוד PGCs מעוברים בשלב HH 26-28, שמירה והרחבה שלהם במבחנה, והשתלתם לאאורטה הגבית של עוברים בשלב HH 14-17. השתלה קצרה מתבצעת באמצעות סמנים פלואורסצנטיים כמו PKH26, בעוד שתרומת קו הנבט לטווח ארוך מאושרת על ידי ניתוח PCR של הגונדות המקבלות. גישה זו מבטיחה יצירה עקבית של כימרות גנרליין תוך שמירה על הקיימות והיכולת התפקודית של PGCs תורמים. בנוסף, השיטה תואמת לכלי עריכת גנום כגון CRISPR/Cas9 ווקטורים מבוססי טרנספוזונים, ומאפשרת ייצור מודלים טרנסגניים וערוכים גנטיים של עופות. מעבר למחקר בסיסי, אסטרטגיה זו תומכת במאמצי שימור באמצעות העברת קווי הנבט הבין-מינים ושימור משאבים גנטיים. בסך הכול, פרוטוקול זה מספק מסגרת מקיפה ואמינה למניפולציה של קו הנבט של העופות, ומציע פלטפורמה ורסטילית למחקרים יסודיים ויישומיים בביוטכנולוגיה של עופות.

מבוא

העברת קו נבט בתאי נבט פרימורדיאליים (PGC) היא השיטה היעילה ביותר להעברת מידע גנטי לדור הבא בציפורים 1,2,3. כימרות נבט, המוגדרות כפרטים הנושאים תאי נבט שמקורם בתורם ובמאכסן, מאפשרות העברת חומר גנטי מתורם לצאצאים, ותומכים ביישומים בתהליך טרנסגנזה, גנומיקה פונקציונלית ושימור מינים בסכנת הכחדה 4,5,6,7,8. בניגוד לגישות המתבססות על תאי בלסטודרמל, אסטרטגיות המתווכות על ידי PGC מספקות יעילות גבוהה יותר של העברת קווי הנבט ויכולת שחזור גבוהה יותר, מה שהופך אותן למתאימות למניפולציה גנטית מדויקת.

במינים של עופות, PGCs מקורם באזור הפלוסידה המרכזי של הבלסטודרם בשלב Eyal-Giladi ו-Kochav (EGK) שלבX 9, ולאחר מכן נודדים לסהר הנבטה על ידי Hamburger and Hamilton (HH) שלב 410. בין שלבי HH 9 ל-12, PGCs מסתובבים דרך כלי דם עובריים לפני שהם מתיישבים ברכס הגונדלי 11,12,13. דפוסי ההגירה הייחודיים הללו מאפשרים בידוד של PGCs בשלבים שונים, כולל הסהר הגרמינלי, הדם הזורם והגונדות14. ראוי לציין כי PGCs שנקטפו מגונדות HH בשלב 26-28 והושתלו לעוברים בשלב HH 14-17 הוכחו כמפגינים יכולת מיטבית בקו הנבט ויעילות ההשתלה, מה שמספק מסגרת מעשית ליישום סטנדרטי של פרוטוקול זה.

ניתן לתחזק ולהרחיב PGCs במבחנה תוך שמירה על זהות קו הנבט ויכולת ההעברה, מה שמאפשר שימוש בהן לשינוי גנטי יציב. ייצור כימרה בקו הנבט המתווך על ידי PGC שימש ליצירת ציפורים טרנסגניות המבטאות חלבונים רקומביננטיים, שושלת נבט עקבות, מניפולציה של מסלולי קביעת מין והענקת עמידות למחלות זיהומיות 6,15,16,17,18,19. יתרה מזאת, השתלת PGC מקלה על העברת קווי הנבט הבין-מינים ושימור הגנפלזמה הגנטית של עופות בסכנת הכחדה 7,8,20,21,22,23, ושימור PGC מאפשר שימור משאבים גנטיים לטווח ארוך 24,25.

למרות שסוגי תאי גזע נוספים, כולל תאי גזע עובריים (ESCs)26,27,28,29, תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs)30,31,32, ותאי גזע זרע (SSCs)33,34, נחקרו לשינוי בקו הנבט בעופות, יעילות העברת קו הנבטה שלהם נותרת נמוכה מזו של מערכות מבוססות PGC, הנחשבות כיום למשמעותיות ביותר מקור אמין לתאים המתאימים לקו הנבט.

במחקרי כימרה על קו הנבט, בחירת גזע התורם קריטית להבחנה בין תאי נבט שמקורם בתורם לתאים שמקורם במארח. עוף אוגיי קוריאני (KOC) מחזיק באלל i/i רצסיבי האחראי לעור שחור ונוצות, שניתן להבחין בו בקלות מקו הלגהורן הלבן הנושא את האלל הדומיננטי I/I 35,36. הבדל נראה זה מאפשר זיהוי חד-משמעי של צאצאים שמקורם בתורמים במהלך ניתוח העברת קווי הנבט, תוך תמיכה בשימור המגוון הביולוגי בזכות הערך הגנטי המקומי של KOC.

בסך הכול, ייצור כימרות נבט בתיווך PGC מספק פלטפורמה איתנה לביוטכנולוגיה של עופות (איור 1). על ידי קביעת שלבי התורם האופטימלי (HH26-28) והמקבל (HH14-17) ושילוב שלבי תרבית ואימות מוגדרים, פרוטוקול זה מאפשר העברה יעילה בקו הנבט ומספק מסגרת מעשית ליצירת עופות טרנסגניים ועברי גנום, וכן לשימור משאבים גנטיים יקרי ערך לעופות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים תרנגולות אושרו על ידי המכון למשאבי בעלי חיים במעבדה, אוניברסיטת סיאול הלאומית, דרום קוריאה (מספר אישור IACUC: SNU-250226-4). בעלי החיים טופלו בתנאים מבוקרים והיגייניים עם מים ומזון מחוטאים. בנוסף, כל הפסולת הכימית והביולוגית שנוצרה במהלך ההליכים, כולל תמיסות טריפסין/EDTA, תאים מסומנים ב-PKH26 ורקמות עובריות או גונדליות, טופלה והושלקה בהתאם להנחיות הבטיחות הביולוגית המוסדית וניהול פסולת מסוכנת של אוניברסיטת סיאול הלאומית. כל החומרים והציוד המשמשים בפרוטוקול זה מופיעים בטבלת החומרים. PGCs, מדיה וריגנטים המשמשים לדגימת גונדות ותרבות תאים מעוברים תורמים חייבים להיות סטריליים.

1. בידוד PGCs של תרנגולות

  1. דגרו ביצי עוף טריות ומופרות בשלב X של אייל-גילדי וכואב (EGK) בטמפרטורה של 37°C למשך 5.5 ימים עד שהעוברים מגיעים לשלבי HH 26-28.
    הערה: שמרו על לחות של 60%-65% כדי להבטיח התפתחות עוברית תקינה.
  2. בודדו בקפידה עוברים מהביציות בשלבים HH 26-28 באמצעות מלקחיים.
  3. שטוף עוברים עם 1× PBS, ואז מניח את העובר על צלחת פחם ואבטח אותו עם סיכות חרקים. באמצעות סטריאומיקרוסקופ, נתח בזהירות את הגונדות העובריות הזוגיות באמצעות מלקחיים מחודדים.
    הערה: יש לטפל ברקמות בעדינות כדי למנוע נזק ולהבטיח בידוד מדויק של הגונדות. עקב קרבתם לכליה המזונפרית בשלבי HH 26-28, כמות קטנה של רקמת כליה עלולה להיאסף בטעות; עם זאת, פירוק קפדני תחת מיקרוסקופ סטריאומיקרוסקופ ותנאי תרבית סלקטיביים מבטיחים שרק PGCs יתרבו, תוך שמירה על טוהר.
  4. העבירו את הגונדות הזוגיות שנאספו משלושה עוברים לצינור בנפח 1.5 מ"ל המכיל 500 מיקרוליטר של 0.05% טריפסין/EDTA ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות כדי להפריד את התאים.
  5. הוסף 50 מיקרול FBS כדי לנטרל את הטריפסין.
  6. צנטריפוגה ב-200 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (כ-20-25 מעלות צלזיוס). הסר בזהירות את הסופרנטנט מבלי להפריע לכדור התא.
  7. החזירו את תאי הגונדה המנותקים ל-1 מ"ל של 1× PBS.

2. התרבות חוץ גופית של תרנגולות PGC

  1. הכינו מדיום תרבית PGC (KO-DMEM בתוספת 20% FBS, 2% סרום עוף, נוקלאוזידים, GlutaMAX, חומצות אמינו לא חיוניות MEM, 2-מרקפטואנול, 10 מ"מ פירובט נתרן פירובאט, אנטיביוטיקה-אנטימיקוטית, 10 ng/mL bFGF) וחמם את המדיום ל-37 מעלות צלזיוס.
  2. הוסיפו תאי גונדה מפורקים שנאספו משלושה עוברים בשלבי HH 26-28 (כ-100-150 PGCs לעובר 37,38) ל-1 מ"ל של מדיום תרבית מחומם מראש בכל באר וציפו את התאים על פלטת תרבית בת 12 בארות.
  3. נדנדו בעדינות את הפלטה כדי להבטיח פיזור אחיד של התאים.
  4. לשמור על PGC ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% CO₂, לעקוב אחרי מורפולוגיה וצפיפות תאים מדי יום. תאי PGC נשארים עגולים, שבירותיים ובדרך כלל צפים, בעוד שתאי הסומטיקה נדבקים (איור 2A).
    הערה: תנאי התרבית תומכים באופן סלקטיבי בהתרבות ה-PGCs, ומאפשרים להם להתרחב בעוד שתאים סומטיים מושלים בהדרגה.
  5. PGCs המגודלים בצלחת של 12 בארות נשמרים על ידי החלפת מדיום הגידול כל 3-4 ימים כדי לתמוך בהתרבות ויכולת היתכנות מיטבית (איור 2B).
  6. באופן אופציונלי, יש להשתמש בסמנים ספציפיים ל-PGC (למשל, CVH, DAZL, NANOG ו-POUV) כדי לאמת טוהר ולקביעת מין באמצעות PCR (טבלה 1).
    1. הכינו דגימות PGC להפקת RNA באמצעות מערכת RNA Miniprep בהתאם להוראות היצרן.
    2. בצע RT-PCR (למשל, CVH, DAZL, NANOG ו-POUV) או צביעת חיסון באמצעות סמנים ספציפיים ל-PGC (SSEA1 ו-DAZL) בהתאם לפרוטוקולים סטנדרטיים39 (איור 2C,D).
    3. בצע ניתוח PCR לפי הפרוטוקולים הסטנדרטיים40 (איור 2E).

3. אימות יכולת קו הנבט של PGCs מתורבתים באמצעות תיוג PKH26

  1. קצור PGCs כאשר הם מגיעים לשלב צמיחת הגזעים, בדרך כלל בצפיפות של כ-1-5 ×-10-5 תאים בכל באר בלוח של 12 בארות.
  2. הפל את התאים על ידי צנטריפוגה ב-200 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (כ-20-25 מעלות צלזיוס), השעיה מחדש ב-1× PBS, והעריך את הקיימות באמצעות טרייפן בלו.
  3. הכינו מדלל C מערכת קישור התאים הפלואורסצנטיים האדומה PKH26 לתיוג כללי של ממברנת התא ואיזונו לטמפרטורת החדר (כ-20-25 מעלות צלזיוס).
  4. לשחזר את צבע PKH26 ולהכין תמיסה עובדת בדילול C בריכוז סופי של כ-1-2 מיקרומון.
  5. החזירו את כדור ה-PGC ל-1 מ"ל מדלל C. הוסיפו במהירות תמיסת PKH26 של 1 מ"ל (יחס 1:1), ערבבו בעדינות, ודוגרו במשך 2-5 דקות בטמפרטורת החדר (כ-20-25 מעלות צלזיוס).
  6. מוסיפים במהירות 1 מ"ל תמיסת PKH26 לתליית התא (יחס 1:1), מערבבים בעדינות באמצעות פיפטינג, ודגרו בטמפרטורת החדר (כ-20-25 מעלות צלזיוס) למשך 2-5 דקות.
    הערה: אל תחרוג מזמן הדגירה המומלץ.
  7. עצור את הכתמים על ידי הוספת פי 2-4 נפח של FBS או 1%-5% BSA ב-PBS.
  8. צנטריפוגה ב-200 × גרם, 5 דקות בטמפרטורת החדר (כ-20-25 מעלות צלזיוס); שטוף שלוש פעמים עם תרבית PGC medium או 1× PBS + 0.1% BSA.
  9. החזירו את התאים לבופר הזרקה (מדיום תרבית PGC או 1× PBS + 0.1% BSA) בריכוז של 1-5 × 10,4 עד 1 × 105 תאים/מיקרוליטר. שמרו אותם על הקרח לזמן קצר כדי לשמור על החיוניות.
  10. בדוק את הסימון תחת מיקרוסקופ פלואורסצנציה לפני ההזרקה (איור 3A).
  11. הזרקו יותר מ-3,000 PGCs מתויגים ברי קיימא, נספרים בכחול טרייפן, לעוברים בשלב HH 14-17 ודגרו עד היום השישי (איור 3B).
  12. אשר קולוניזציה של הגונדות המקבל עד יום 6 (איור 3C).

4. השתלת PGCs תורמים לכלי הדם העוברי של המקבל

  1. דגרו את ביצי המקבל לשלב HH 14-17 (37°C, 60-70% לחות, נדנוד ב-45° כל שעה).
  2. הכינו מיקרופיפטה קפילרית מזכוכית באמצעות צינור זכוכית בורוסיליקט (קוטר חיצוני 1.0 מ"מ, קוטר פנימי 0.5-0.75 מ"מ). מושכים את הקפילריה באמצעות מושך מיקרופיפטות ומבריקים את הקצה לקוטר פנימי של כ-10-20 מיקרון.
  3. צרו חלון קטן (כ-0.5 ס"מ × 0.5 ס"מ) בקצה המחודד של הביצית כדי לאפשר גישה למיקרו-הזרקה תוך מזעור הפרעה לעובר.
    הערה: סטריליזציה של משטח קליפת הביצה עם 70% אתנול לפני פתיחת החלון כדי למנוע זיהום.
  4. הזרקו 2 מיקרוליטר של תלייה המכילה יותר מ-3,000 PGC ב-1× PBS או HBSS אל האאורטה הגבית תחת מיקרוסקופ סטריאו.
    הערה: בצע את ההזרקה תחת מיקרומיקרוסקופ סטריאומיקרוסקופ כדי למנוע נזק לעובר או לכלי הדם, ולשלוט בזהירות במחט המיקרו-הזרקה כדי למנוע פציעה.
  5. לאטום את חלון הביצים עם סרט פרפין; מקם את קצה הביצה המחודד כלפי מטה ודגר עד לבקיעה בטמפרטורה של 37.5 מעלות צלזיוס, לחות של 60-70%, מתנדנד במהירות של 45° כל שעה.
    הערה: שמרו על טמפרטורה ולחות מתאימות כדי להבטיח את חיוניות העובר והתפתחותו המוצלחת.

5. אימות כימרה של קו הנבט

  1. אספו את האשך או השחלה מגוזל G0 לאחר הבקיעה.
  2. להוציא DNA גנומי מרקמות הגונדות שנאספו כדי לאשר את היווצרות כימרות גנרליין. בצע חילוץ DNA גנומי מרקמות הגונדות שנאספו כך:
    1. אוספים את רקמת האשכים או השחלה, הומוגניזציה ב-300 מיקרוליטר של בופר ליזיס (2 מ"מ טריס-HCl (pH 8.0), 10 מ"מ EDTA, 1% SDS) המכיל 1.5 מיקרו-ליטר פרוטאנאז K, ודגרו בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס למשך H כדי להבטיח ליזיס מלא.
    2. הוסף 100 מיקרוליטר של תמיסת משקעים חלבונית (7 מיליון אמוניום אצטט), ערבב היטב, וצנטריפוגה ב-12,000 × גרם למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
    3. העבר את הסופרנטנט (פאזה מימית) לצינור חדש, הוסף 500 מיקרוליטר איזופרופנול להשקעת DNA, וצנטריפוגה ב-12,000 × גרם למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
    4. זרקו את הסופרנאנט, הוסיפו 1 מ"ל של 70% אתנול, וצנטריפוגה ב-12,000 × גרם למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
    5. הסר את האתנול, ייבש את כדור ה-DNA בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
    6. יש לשחרר את ה-DNA עם 50 מיקרו-ליטר מים ללא RNase ולמדוד את ריכוז ה-DNA והטוהר באמצעות ספקטרופוטומטר (A260/A 280 ≈ 1.8).
    7. כוון את ה-DNA ל-10-5 ng לכל תגובה PCR.
  3. בצע הגברה של PCR באמצעות פריימרים ספציפיים למין שתוכננו (טבלה 1) בתנאים הבאים: 94 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות, ואחריהם 35 מחזורים של 94 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, 68 מעלות צלזיוס ל-30 שניות, ו-72 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, בנוסף להארכה סופית בטמפרטורה של 72 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות (איור 4א).
  4. איסוף זרע מזכרים בוגרים מינית מסוג G0, חילוץ DNA זרע באותו פרוטוקול, וביצוע PCR באמצעות פריימרים ספציפיים למין (איור 4B).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

התרבות ואפיון של תרנגולת PGC במבחנה
תאי גונדה שלמים המכילים PGC בודדו מעוברים בשלבים 26-28 של HH וגודלו בתנאי תרבית PGC מוגדרים. עם הזמן, תאי סטרומל גונדליים נדבקו לפני השטח של התרבית או עברו התדרדרות, בעוד שתאי PGC נשארו במצב תלוי והחלו להתרבות באופן פעיל (איור 2A). לאחר כשבועיים של תרבית, אוכלוסיית ה-PGC התרחבה ליותר מ-1 ×-10תאים , והדגימה רבייה חזקה והעשרה סלקטיבית של PGCs בתנאים מוגדרים אלו (איור 2B)....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

השתלת תאי נבט פרימורדיאליים מתורבתים (PGCs) לעוברים מקבלים מספקת שיטה אמינה לייצור כימרות גנט בעופות. פרוטוקול זה מנצל את הפוטנציאל הגנטי הפנימי של PGCs ומשפר עקביות ניסויית בהשוואה למערכות מסורתיות מבוססות בלסטודרם, הנוטות לפסיפסיזם ולשונות התפתחותית. יתרון קריטי של שיטה זו הוא ההרחבה הסלקטיבית במבחנה של PGCs בתנאי תרבית מוגדרים, השומרת על זהות קו הנבט שלהם. במהלך תקופת התרבית, PGCs שומרים על מורפולוגיה אופיינית, מציגים שיעורי רבייה גבוהים, ומבטאים סמנים ספציפיים לתאי הנבט כגון...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי מענק הקרן הלאומית למחקר של קוריאה (NRF) במימון ממשלת קוריאה (MSIT) [RS-2024-00418297] ותוכנית מחקר שיתופית לפיתוח מדעי וטכנולוגי חקלאי [RS-2025-02213489] ממנהל הפיתוח הכפרי של קוריאה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
1x PBS הייקלוןSH30256
2-מרקפטואנולגיבקו21985023
תמיסת אנטימיקוטית אנטיביוטית (100X)גיבקו15240062
נוגדן אנטי-DAZLאבקאםAB215718
סרום עוף סטרילרוקלנדD102-00-0500
דאוקסיריבונוקלאז I מהלבלב הפרסיגמא אלדריץ'9003-98-9
מיקרוקפסים חד-פעמיים של דרומונד מיקרופיפטים  חברת דרומונד המדעית1-000-0500
נוקלאוזידים של EmbryoMax (100X)מרקES-008-D
FBS (מאפיין סרם בקר עוברי, מקור אמריקאי, 500 מ"ל)הייקלוןSH30919
תוסף GlutaMAXגיבקו35050061
נוקאאוט DMEMגיבקו10829018
תמיסת חומצות אמינו לא חיוניות MEMגיבקו11140050
Parafilm M Laboratory FilmאמקורPM996 
ערכת קישור תאים פלואורסצנטיים אדומים PKH26 לתיוג כללי של ממברנת התאסיגמא אלדריץ'PKH26GL-1KT
נוגדן אנטי-עכבר/אדם מטוהר CD15 (SSEA-1)ביולג'נד125602
FGF אנושי רקומביננטי בסיסי/FGF2/bFGF (146 aa) חלבון R& מערכות D  233-FB
ReliaPrep RNA Miniprep SystemsפרומגהZ6011
נתרן פירובט (100 מ"מ)גיבקו11360070
תמיסת טרייפן בלוסיגמאT8154-100ML
טריפסין-EDTA (0.5%), ללא פנול אדוםGibco™15400054

מקורות

  1. van de Lavoir, M. C., et al. Germline transmission of genetically modified primordial germ cells. Nature. 441 (7094), 766-769 (2006).
  2. Macdonald, J., Glover, J. D., Taylor, L., Sang, H. M., McGrew, M. J. Characterisation and germline transmission of cultured avian primordial germ cells. PLoS One. 5 (11), e15518(2010).
  3. Choi, J. W., et al. Basic fibroblast growth factor activates MEK/ERK cell signaling pathway and stimulates the proliferation of chicken primordial germ cells. PLoS One. 5 (9), e12968(2010).
  4. Macdonald, J., et al. Efficient genetic modification and germline transmission of primordial germ cells using piggyBac and Tol2 transposons. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (23), E1466-E1472 (2012).
  5. Park, T. S., Han, J. Y. PiggyBac transposition into primordial germ cells is an efficient tool for transgenesis in chickens. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (24), 9337-9341 (2012).
  6. Lee, H. J., et al. DMRT1 gene disruption alone induces incomplete gonad feminization in chicken. FASEB J. 35 (9), e21876(2021).
  7. Kang, S. J., et al. Reproduction of wild birds via interspecies germ cell transplantation. Biol Reprod. 79 (5), 931-937 (2008).
  8. Wernery, U., et al. Primordial germ cell-mediated chimera technology produces viable pure-line Houbara bustard offspring: potential for repopulating an endangered species. PLoS One. 5 (12), e15824(2010).
  9. Eyal-Giladi, H., Kochav, S. From cleavage to primitive streak formation: A complementary normal table and a new look at the first stages of the development of the chick. I. General morphology. Dev Biol. 49 (2), 321-337 (1976).
  10. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J Morphol. 88 (1), 49-92 (1951).
  11. Ukeshima, A., Yoshinaga, K., Fujimoto, T. Scanning and transmission electron microscopic observations of chick primordial germ cells with special reference to the extravasation in their migration course. J Electron Microsc (Tokyo). 40 (2), 124-128 (1991).
  12. Fujimoto, T., Ukeshima, A., Kiyofuji, R. The origin, migration and morphology of the primordial germ cells in the chick embryo. Anat Rec. 185 (2), 139-145 (1976).
  13. Meyer, D. B. The migration of primordial germ cells in the chick embryo. Dev Biol. 10, 154-190 (1964).
  14. Kim, Y. M., Han, J. Y. The early development of germ cells in chicken. Int J Dev Biol. 62 (1-2-3), 145-152 (2018).
  15. Park, T. S., et al. Deposition of bioactive human epidermal growth factor in the egg white of transgenic hens using an oviduct-specific minisynthetic promoter. FASEB J. 29 (6), 2386-2396 (2015).
  16. Kim, Y. M., et al. The transgenic chicken derived anti-CD20 monoclonal antibodies exhibits greater anti-cancer therapeutic potential with enhanced Fc effector functions. Biomaterials. 167, 58-68 (2018).
  17. Rengaraj, D., et al. Dissecting chicken germ cell dynamics by combining a germ cell tracing transgenic chicken model with single-cell RNA sequencing. Comput Struct Biotechnol J. 20, 1654-1669 (2022).
  18. Park, J. S., et al. Production of recombinant human IgG1 Fc with beneficial N-glycosylation pattern for anti-inflammatory activity using genome-edited chickens. Commun Biol. 6 (1), 589(2023).
  19. Idoko-Akoh, A., et al. Creating resistance to avian influenza infection through genome editing of the ANP32 gene family. Nat Commun. 14 (1), 6136(2023).
  20. Ono, T., Yokoi, R., Aoyama, H. Transfer of male or female primordial germ cells of quail into chick embryonic gonads. Exp Anim. 45 (4), 347-352 (1996).
  21. Reynaud, G. The transfer of turkey primordial germ cells to chick embryos by intravascular injection. J Embryol Exp Morphol. 21 (3), 485-507 (1969).
  22. Liu, C., et al. Production of chicken progeny (Gallus gallus domesticus) from interspecies germline chimeric duck (Anas domesticus) by primordial germ cell transfer. Biol Reprod. 86 (4), 101(2012).
  23. van de Lavoir, M. C., et al. Interspecific germline transmission of cultured primordial germ cells. PLoS One. 7 (5), e35664(2012).
  24. Naito, M., Tajima, A., Tagami, T., Yasuda, Y., Kuwana, T. Preservation of chick primordial germ cells in liquid nitrogen and subsequent production of viable offspring. J Reprod Fertil. 102 (2), 321-325 (1994).
  25. Tajima, A., Naito, M., Yasuda, Y., Kuwana, T. Production of germline chimeras by transfer of cryopreserved gonadal primordial germ cells (gPGCs) in chicken. J Exp Zool. 280 (3), 265-267 (1998).
  26. Carsience, R. S., Clark, M. E., Verrinder Gibbins, A. M., Etches, R. J. Germline chimeric chickens from dispersed donor blastodermal cells and compromised recipient embryos. Development. 117 (2), 669-675 (1993).
  27. Petitte, J. N., Liu, G., Yang, Z. Avian pluripotent stem cells. Mech Dev. 121 (9), 1159-1168 (2004).
  28. Petitte, J. N., Clark, M. E., Liu, G., Verrinder Gibbins, A. M., Etches, R. J. Production of somatic and germline chimeras in the chicken by transfer of early blastodermal cells. Development. 108 (1), 185-189 (1990).
  29. Pain, B., et al. Long-term in vitro culture and characterisation of avian embryonic stem cells with multiple morphogenetic potentialities. Development. 122 (8), 2339-2348 (1996).
  30. Rossello, R. A., et al. Mammalian genes induce partially reprogrammed pluripotent stem cells in non-mammalian vertebrate and invertebrate species. Elife. 2, e00036(2013).
  31. Lu, Y., et al. Avian-induced pluripotent stem cells derived using human reprogramming factors. Stem Cells Dev. 21 (3), 394-403 (2012).
  32. Kim, Y. M., Park, Y. H., Lim, J. M., Jung, H., Han, J. Y. Technical note: Induction of pluripotent stem cell-like cells from chicken feather follicle cells. J Anim Sci. 95 (8), 3479-3486 (2017).
  33. Han, J. Y., et al. Production of quail (Coturnix japonica) germline chimeras by transfer of Ficoll-enriched spermatogonial stem cells. Theriogenology. 154, 223-231 (2020).
  34. Pramod, R. K., et al. Isolation, characterization, and in vitro culturing of spermatogonial stem cells in Japanese Quail (Coturnix japonica). Stem Cells Dev. 26 (1), 60-70 (2017).
  35. Park, T. S., et al. Improved germline transmission in chicken chimeras produced by transplantation of gonadal primordial germ cells into recipient embryos. Biol Reprod. 68 (5), 1657-1662 (2003).
  36. Chang, I. K., et al. Production of germline chimeric chickens by transfer of cultured primordial germ cells. Cell Biol Int. 21 (8), 495-499 (1997).
  37. Nakamura, Y., et al. Migration and proliferation of primordial germ cells in the early chicken embryo. Poult Sci. 86 (10), 2182-2193 (2007).
  38. Kuwana, T. Migration of Avian Primordial Germ Cells toward the Gonadal Anlage: (avian/PGC/migration/presumptive gonad/chimera). Dev Growth Differ. 35 (3), 237-243 (1993).
  39. Jung, K. M., Kim, Y. M., Ono, T., Han, J. Y. Size-dependent isolation of primordial germ cells from avian species. Mol Reprod Dev. 84 (6), 508-516 (2017).
  40. Ogawa, A., et al. Molecular characterization and cytological mapping of a non-repetitive DNA sequence region from the W chromosome of chicken and its use as a universal probe for sexing carinatae birds. Chromosome Res. 5 (2), 93-101 (1997).
  41. Park, K. J., et al. Gamma-irradiation depletes endogenous germ cells and increases donor cell distribution in chimeric chickens. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 46 (10), 828-833 (2010).
  42. Nakamura, Y., et al. Germline replacement by transfer of primordial germ cells into partially sterilized embryos in the chicken. Biol Reprod. 83 (1), 130-137 (2010).
  43. Song, Y., D'Costa, S., Pardue, S. L., Petitte, J. N. Production of germline chimeric chickens following the administration of a busulfan emulsion. Mol Reprod Dev. 70 (4), 438-444 (2005).
  44. Lee, H., et al. Compensatory proliferation of endogenous chicken primordial germ cells after elimination by busulfan treatment. Stem Cell Res Ther. 4 (6), 136(2013).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

PGCCRISPR Cas9PCR

מאמרים קשורים