הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

בידוד וטיהור של וזיקולות חוץ-תאיות של צמחים מעלי ארבידופסיס באמצעות שיטת איסוף אופטימלית של שטיפה אפופלסטית

1.1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/69715

⸱

24 במרץ 2026

 ,  ,  , 
1Department of Plant Pathology and Microbiology, Texas A&M University

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר שיטה אופטימלית לבידוד וזיקולות חוץ-תאיות (EVs) מעלי Arabidopsis thaliana לתמיכה בניתוחים מולקולריים ותפקודיים במורד הזרם.

תקציר

וזיקולות חוץ-תאיות (EVs) הן ננו-חלקיקים קשורים לממברנה המופרשים על ידי אורגניזמים וסוגי תאים מגוונים, ומוכרים יותר ויותר כמתווכים חשובים בתקשורת בין-תאית ובין-ממלכותית. בעוד שביולוגיית ה-EV מבוססת היטב במערכות יונקים, מחקר ה-EV של צמחים הוא יחסית חדש ומתרחב במהירות, בין היתר על ידי ראיות לכך ש-EVs צמחיים יכולים לספק RNA קטנים, mRNA, חלבונים ומטענים אחרים המעורבים במערכת החיסון ובאינטראקציות בין צמחים למיקרובים. עם זאת, בידוד EVs צמחיים טוהרים נותרת מאתגרת טכנית בשל דפנות תאים קשיחות, שפע מטבוליטים משניים וסיכון לזיהום ציטוזולי במהלך איסוף נוזלי אפופלסטי. פרוטוקול זה מתאר תהליך תהליך יעיל לבידוד וטיהור של רכבי EV צמחיים מרקמת עלים של Arabidopsis thaliana . שלב חדירה עדין מבוסס מזרק משמש למזעור נזק תאי ודליפה ציטוזולית, בעוד ששימוש בלהבי עלה בודדים (ללא פטיולות/רקמת כלי דם) מסייע להפחית זיהום מתכולת כלי דם ותוך-תאית. EVs מועשרים בתחילה באמצעות צנטריפוגציה דיפרנציאלית וניתן לטהר אותם עוד באמצעות שבירת גרדיאנט בצפיפות סוכרוז או כרומטוגרפיה של הדרת גודל (SEC). פרוטוקול זה מניב רכבים חשמליים עם שלמות מבנית נשמרת והפחתת זיהום תאי על ידי מזעור נזק לתאים ודליפה ציטופלזמית במהלך איסוף נוזלי אפופלסטי, כפי שנבחן באמצעות ניתוח מעקב ננו-חלקיקים ומיקרוסקופיית אלקטרונים מעברית. דגימות EV אלו מתאימות ליישומים במורד הזרם, כולל פרופיל RNA, פרוטאומיקה ובדיקות פונקציונליות למחקרי אינטראקציה בין צמחים למיקרובים. בסך הכול, שיטה זו מספקת גישה ניתנת לשחזור וגמישה לקבלת רכבים חשמליים איכותיים לצמחים.

מבוא

וזיקולות חוץ-תאיות (EVs) הן חלקיקי ממברנה הדו-שכבתיים הקשורים לליפידים, המופרשים על ידי מגוון רחב של אורגניזמים, מחיידקים ועד בני אדם 1,2. במערכות בעלי חיים, EVs מסווגים בדרך כלל לאקסוזומים, מיקרוווסיקולות וגופים אפופטוטיים בהתבסס על מסלולי הביוגנזה שלהם וגודל3. אקסוזומים (בקוטר ~30-150 ננומטר) נוצרים ממיזוג של גופים רב-וזיקולריים (MVBs) עם ממברנת הפלזמה, מה שמוביל לשחרור וזיקולות תוך-לומינליות4, בעוד שמיקרווזיקולות (בקוטר ~100-1000 ננומטר) נובטים ישירות מממברנתהפלזמה 5. בנוסף לאקסוזומים ולמיקרווזיקולות, תאי יונקים מייצרים גם גופים אפופטוטיים, שמשתחררים במהלך מוות תאי מתוכנת6. וזיקולות אלו היו מעורבות במודולציה חיסונית, התקדמות הגידול והעברה טיפולית, מה שהופך אותן לנושא למחקר ביו-רפואי אינטנסיבי 7,8. בצמחים, סיווג ה-EV פחות מוגדר היטב מאשר בבעלי חיים. מחקרים ב-Arabidopsis thaliana זיהו מספר תת-סוגים של צמחים EV בהתבסס על הבדלים בסמני חלבון, גודל ומסלולי ביוגנזה משוערים. אלה כוללים EVs חיוביים לטטראספנין (TET), הנחשבים לווזיקולים דמויי אקסוזום שמקורם בגופים רב-ווסיקולריים 9,10, EVs11 חיוביים לחדירת חלבון סינטקסין 1(PEN1), EVs12,13 שמקורם באברון אקסוציסט חיובי (EXPO), וכן אוכלוסיות EV נוספות כגון EVs הקשורים לאוטופגיה14 ואבחנות15.

עדויות הולכות וגדלות מצביעות על כך שצמחים מפרישים EVs כחלק מאסטרטגיית ההגנה שלהם מפני פתוגנים. EVs צמחיים מספקים מטענים מולקולריים מגוונים, כולל RNA קטנים, mRNA ומולקולות רגולטוריות נוספות, המדכאות את האלימות של פתוגנים פטרייתיים ואומיקוטים 10,16,17,18,19. ממצאים אלו מדגישים את ה-EVs ככלי ל"מלחמת RNA", המאפשרים לצמחים לדכא ישירות ביטוי גנים של פתוגנים, מנגנון בעל השלכות עמוקותעל הגנת הגידולים. מעבר לחסינות, EVs צמחיים עשויים גם לתרום לעיצוב מחדש של דופן התא, לתגובות ללחץ ולאיתות התפתחותי21. בניגוד למחקר בתחום החשמל החשמלי של בעלי חיים, שבו פרוטוקולי בידוד ואפיון סטנדרטיים קיימיםבאופן נרחב, תחום הרכבים החשמליים של הצמחים עדיין נמצא בשלביו הראשוניים. דבר זה מגביל את השחזוריות וההשוואה בין מחקרים, ויוצר צורך דחוף במתודולוגיות חזקות וסטנדרטיות לבידוד ולימוד הוזיקולות אלו.

בידוד רכבים חשמליים צמחיים מציב אתגרים טכניים ייחודיים שלא נתקלו בהם במערכות בעלי חיים. רקמות צמחים פגועות, מכילות מטבוליטים משניים רבים, שברי דופן התא ושברי אברונים שיכולים לטהר יחד עם EVs, מה שמסבך את האפיון במורד הזרם23. יתרה מזאת, נוזל השטיפה האפופלסטי (AWF), המשמש בדרך כלל כחומר התחלתי לבידוד וטיהור EV של צמחים, לעיתים קרובות מניב תערובת הטרוגנית של וזיקולות ומזהמים. בעוד שצנטריפוגציה דיפרנציאלית נשארת גישה יסודית נפוצה, היא אינה יכולה לפרק לחלוטין תת-אוכלוסיות EV מובחנות או להפריד בין EVs לבין קומפלקסים מקרומולקולריים מבודדיםיחד 25,26. סקירות ומחקרים מתודולוגיים עדכניים סיפקו הנחיות חשובות ושיקולי פרקטיקה מיטביים לבידוד ואפיון EV של מפעל 27,28,29,30,31. עם זאת, יישום ושילוב מעשי של גישות אלו נותר מאתגר, ולעיתים נדרשים שלבי טיהור נוספים כגון צנטריפוגציה של גרדיאנט צפיפות וכרומטוגרפיה של הדרת גודל לשיפור טוהר ויכולת השחזור של EV בין מחקרים.

כאן אנו מציגים פרוטוקול יעיל לבידוד רכבים חשמליים מנוזל שטיפה אפופלסטי של Arabidopsis באמצעות אסטרטגיית טיהור רב-שלבית. בניגוד לגישות נפוצות לבידוד EV של צמחים, המתבססות על חדירה לכל הצמח עם משאבות ואקום11, פרוטוקול זה נמנע הכללת פטיולות ורקמות וסקולריות, שעלולות להגדיל זיהום ממבני כלי דם. במקום זאת, משתמשים בלהבי עלים מבודדים ושיטת חדירה עדינה מבוססת מזרק לשיפור איסוף האפופלסטים תוך הפחתת הפרעות ברקמות. טיפול זהיר בעלים, בכיוון ובצנטריפוגציה מפחיתים עוד יותר זיהום מרכיבים תוך-תאיים, ומספקים חומר התחלתי נקי יותר לבידוד EV. לאחר צנטריפוגציה דיפרנציאלית, ניתן לטהר את ה-EVs עוד יותר באמצעות שבירת גרדיאנט צפיפות סוכרוז או כרומטוגרפיה של הרחקת גודל להשגת טוהר ורזולוציה גבוהה יותר של הוולסיקולות. ההכנות המתקבלות ל-EV מתאימות היטב ליישומים במורד הזרם, כולל ריצוף RNA, פרופיל פרוטאומי ובדיקות פונקציונליות כגון אינטראקציה פתוגנים ומחקרי קליטת EV, ובכך משפרים את השחזוריות והפרשנות במחקר EV בצמחים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הערה: יש לבצע שלבי צנטריפוגה בצנטריפוגה מקוררת בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס כדי לשמור על שלמות הרכב החשמלי. יש להשתמש בצינורות סטריליים. כל שלבי טיפול בדגימות צריכים להתבצע במהירות וביעילות, רצוי על ידי מספר אנשים העובדים במקביל, כדי למזער נזק לרקמות ולמנוע זיהום שעלול לפגוע באיכות הרכב החשמלי.

1. הכנת העלים וחדירה

  1. הכינו בופר בידוד של 1 ליטר (VIB) הכולל 20 מ"מ MES הידראט, 2 מ"מ CaCl2, 0.1 מיליון NaCl, pH 6.
  2. קצור את אזורי הלהב המרוחקים של העלים על ידי חיתוך בבסיס הלהב כדי להסיר את הפטיולה.
    הערה: מומלץ לפחות 100 צמחים בני ארבעה שבועות לכל טיפול או גנוטיפ כדי להבטיח תפוקת EV מספקת. צמחי ארבידופסיס גודלו במחזורי אור של 8 שעות ו-16 שעות חושך. אל תשתמש בעלים שמראים סימני לחץ נראים לעין, כמו הלבנת עלים וקימוט.
  3. שטפו את העלים עם מים באוסמוזה הפוכה (RO) שלוש פעמים. מניחים אותם על מגבות נייר וייבשו אותם בעדינות.
  4. טעין כ-50 מ"ל עלים לתוך מזרק של 120 מ"ל. הקישו בעדינות על המזרק כדי לייצב את העלים.
  5. הוסיפו כ-60 מ"ל של VIB למזרק עד שהעלים טבולים במלואם. שחרר אוויר לכוד על ידי לחיצה עדינה על הבוכנה. לחץ חתיכת פרפילם מקופלת ארבע פעמים על קצה המזרק כדי למנוע דליפה.
    הערה: בעת ביצוע חדירת ואקום מבוססת מזרק, ודא שהמזרק והפומפה מורכבים היטב לפני יישום הוואקום. הפעילו כוח בהדרגה ושמרו על אחיזה יציבה במזרק כדי למנוע תנועה פתאומית של הבוכנה או אובדן שליטה.
  6. החדירה את העלים על ידי משיכת הבוכנה לאט החוצה ליצירת ואקום. החזק את הבוכנה במצב המורחב במשך 5 שניות, ואז שחרר לאט. חזור על מחזור החדירה הזה 2-3 פעמים עד שהעלים נראים כהים ושקופים יותר, מה שמעיד על חדירה מוצלחת.
  7. הערה: משיכת הבוכנה דורשת כוח בינוני עקב התנגדות לוואקום. יש להחזיק את המזרק בחוזקה בזמן שהבומפה נמשכת באיטיות כדי לשמור על חדירה מבוקרת.
  8. לאחר שהעלים חודרו, משוך את הבוכנה החוצה. שפוך את עודף הבופר לכיור.
  9. חזור על השלבים 1.4-1.7 עד שכל העלים שנקצרו חודרים (איור 1A).

2. איסוף נוזל שטיפה אפופלסטי (AWF)

  1. חתכו רצועת דבק סקוטש באורך ~12 אינץ' והניחו אותה בצד הדביק כלפי מעלה. אבטח קצה אחד של הסרט על ידי עטיפתו סביב מזרק ריק ומיותר של 1 מ"ל ממש מתחת לקצה הרחב. סדר בזהירות כ-50-70 עלים חדורים בשכבות חופפות לאורך המשטח הדביק, תוך מיקום כך שבסיס כל להב פונה אל המזרק התחתון והקצוות מופנים כלפי מעלה לאיסוף (איור 1B).
    הערה: שכבת מספר עלים על רצועת דבק אחת עוזרת למנוע נזק. יישר את כל העלים כאשר הלהב פונה לקצה אחד ומכוון לתחתית צינור האיסוף כדי לאפשר חילוץ יעיל של נוזל אפופלסטי במהלך הצנטריפוגה.
  2. עוטפים את העלים הקשורים בסרט היטב סביב המזרק, ואז מהדקים את החלק העליון של החבילה עם שתי רצועות סרט דבק סקוטש. הכנס את המזרק העטוף לצינור של 50 מ"ל כאשר קצה העלים החתוך ובסיס המזרק מכוונים לתחתית הצינור. ודאו שהעלים מהודקים היטב, שכן עטיפה רופפת עלולה לגרום לנזק לעלה ולשחרר תאים שבורים שמזהמים את נוזל השטיפה של האפופלסט (איור 1B).
  3. צנטריפוגה את המזרק העטוף המכיל חדירה עולה ב-900 × גרם למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, באמצעות צנטריפוגה מקוררת המצוידת ברוטור בזווית קבועה. אסוף את נוזל השטיפה האפופלסטי בצינור קוני חדש בנפח 15 מ"ל ושמור את הדגימה על קרח. חזור על השלבים 2.1-2.3 עד שכל העלים ישמשו לאיסוף AWF.
    הערה: ה-AWF צריך להיות שקוף, לא ירוק או אפילו ירוק בהיר. AWF ירוק מצביע על נוכחות כלורופלסטים/כלורופיל ויכול גם להעיד על זיהום תאים. כדי למזער נזק לעלים, השתמשו ברוטור בזווית קבועה.

3. בידוד EV של ארבידופסיס מ-AWF באמצעות צנטריפוגה דיפרנציאלית

  1. צנטריפוגה את נוזל השטיפה האפופלסטי שנאסף ב-2,000 גרם למשך 20 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס באמצעות צנטריפוגה מקוררת המצוידת ברוטור דלי מתנדנד, עם הגדרות תאוצה והאטה סטנדרטיות. לאחר הצנטריפוגה, השתמשו במסנן תאי ניילון בגודל 0.45 מיקרון להסרת פסולת תאית גדולה מהסופרנאנט. זרוק את הכדור. העבר את הסופרנטנט המסונן לצינורות צנטריפוגה חדשים (איור 2).
  2. צנטריפוגה את הסופרנטנט המסונן בעוצמה של 10,000 × גרם למשך 30 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס באמצעות צנטריפוגה מקוררת המצוידת ברוטור בזווית קבועה, עם הגדרות תאוצה והאטה סטנדרטיות. זרוק את הכדור ושמור על הסופרנטנט לאולטרה-צנטריפוגה. שלב זה מסיר עוד יותר פסולת תאית גדולה ווסיקולות גדולות (איור 2).
  3. העבר את הסופרנטנט לצינורות אולטרה-צנטריפוגה בנפח 17 מ"ל ואולטר-צנטריפוגה ב-100,000 × גרם למשך שעה אחת ב-4 מעלות צלזיוס, באמצעות אולטרה-צנטריפוגה המצוידת ברוטור דלי מתנדנד, עם הגדרות תאוצה והאטה סטנדרטיות. לאחר הצנטריפוגה, יש להשליך את הסופרנטנט ולתלות את הכדור בכ-16 מ"ל של בופר VIB לצורך שטיפה. חזור על סיבוב האולטרה-צנטריפוגציה כדי לאסוף רכבים חשמליים (איור 2).
    הערה: צנטריפוגציה בעוצמה של 100,000 x גרם מתבצעת לצורך השקיעה של וזיקולות קטנות כגון אקזוזומים. שלבי השטיפה הבאים מסייעים בהסרת חלבונים שאינם EV על ידי השעיית הכדור בבופר. צינורות אולטרה-צנטריפוגה חייבים להיות מאוזנים בקפידה לפי מסה בהתאם למפרט היצרן לפני הצנטריפוגה. בדוק את הצינורות והרוטורים לאיתור פגמים לפני השימוש וודא שהרוטור מאובטח כראוי לפני תחילת הריצה.
  4. זרוק את הסופרנטנט ותשהה מחדש את הכדור ב-VIB. השתמש בקצה פיפטה כדי לגרד בעדינות את תחתית הצינור כדי להקל על התאוששות מלאה של כדור ה-EV (איור 2).
    הערה: כדור ה-EV לעיתים שקוף ועלול שלא להיות ניתן לזיהוי ויזואלי לאחר השעיה מחדש. גירוד עדין של תחתית הצינור מקל על תהליך ההשעיה מחדש של הרכב. כוונו את נפח המתלים מחדש כדי להשיג את הריכוז הרצוי של הרכבים החשמליים, שכן נפחי תלייה קטנים יותר בדרך כלל מובילים להכנות מרוכזות יותר לרכב חשמלי. בדרך כלל, השעיית EVs ב-50 מיקרוליטר מניבה ריכוזי חלבון של כ-1-1.5 מיקרוגרם/מיקרוליטר וריכוזי חלקיקים המתקרבים ל-10 9-10 חלקיקים למילילטר.
  5. אחסן את הרכבים החשמליים המוחזרים בטמפרטורה של 4°C לשימוש מיידי או ב-80- מעלות לאחסון ארוך טווח ללא הקפאה פתאומית בחנקן נוזלי.
    הערה: אחסון לטווח ארוך עלול להפחית את שלמות הרכב החשמלי. השתמשו ברכבים חשמליים טריים ככל האפשר.

4. שימוש בפרקציית גרדיאנט צפיפות סוכרוז לטיהור EV

הערה: אולטרה-צנטריפוגציה לבדה משלימה סוגים שונים של וזיקולות. כדי להשיג רזולוציה עדינה יותר, ניתן להשתמש בפרקציית גרדיאנט צפיפות, להפריד את הוזיקולות לפי צפיפות הציפה ותכונות הציפה שלהן. בגישה זו, גרדיאנטים של סוכרוז משמשים להעשיר תת-אוכלוסיות מוגדרות של EV. חלופה נוספת היא להשתמש בגרדיאנטים של יודיקסנול.

  1. הפרדת גרדיאנט סוכרוז בטעינה עליונה של רכבים חשמליים
    1. הכינו מלאי גרדיאנט סוכרוז של 10-90% הכוללים את הריכוזים הבאים: 10%, 16%, 22%, 28%, 34%, 40%, 46%. 52%, 58%, 64%, 70% ו-90% משתמשים ב-VIB. השתמש באמבט מים בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס כדי לסייע בהמסה של 70% ו-90%.
    2. הכינו גרדיאנט לא רציף על ידי שכבת 1 מ"ל מכל תמיסת סוכרוז בצינור אולטרה-צנטריפוגה בנפח 17 מ"ל, החל מהתמיסה המרוכזת ביותר בתחתית וממשיכים ברצף אל התמיסה הפחות מרוכזת. יש להוציא את שכבת הסוכרוז של 10% בעת הרכבת הגרדיאנט.
      הערה: יש לפזר בזהירות כל שכבת צפיפות לאורך הדופן הפנימית של הצינור כדי למזער ערבוב בין השכבות הסמוכות. מומלץ להשתמש בפיפטה אוטומטית על מהירות הזרקה איטית כדי לספק זרימה רציפה ומבוקרת ולשפר את יציבות הגרדיאנט. אם משתמשים בפיפטה ידנית רגילה, יש לבצע פיפטה לאט ובאופן יציב, כאשר קצה הפיפטה ממוקם ממש מעל הממשק של השכבה הקודמת, ויש להיזהר להימנע מהיווצרות בועות אוויר.
    3. מערבבים את כדור ה-EV התלוי מחדש (~100 מיקרוגרם חלבון EV) עם 1 מ"ל של תמיסת סוכרוז 10%. לאחר מכן, שכבת התערובת הזו כשכבה הסופית של השכבה הלא רציפה. הנפח הכולל יהיה ~12.1 מ"ל.
    4. צנטריפוגה ב-100,000 גרם למשך 16 שעות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
      הערה: לריצות אולטרה-צנטריפוגציה ממושכות, יש לוודא שהצינורות, הפקקים והרוטורים מדורגים לפעולה ממושכת במהירות גבוהה וכי נהלי איזון מומלצים על ידי היצרן.
    5. אסוף שישה שברים של 2 מ"ל לכל דגימה על ידי פיפטינג מלמעלה. העבר כל חלק לצינור אולטרה-צנטריפוגה חדש בנפח 17 מ"ל.
    6. החזירו את השברים שנאספו לבופר VIB של ~16 מ"ל וצנטריפוגה ב-100,000 גרם למשך שעה אחת בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
    7. זרוק את הסופרנטנט, ואז תלה כל כדור ב-50 מיקרוליטר של VIB.
      הערה: גלולת ה-EV אינה נראית. גרדו בעדינות את תחתית הצינור עם קצה הפיפטה כדי להחזיר את הצינור לתלייה. כוון את נפח הבופר לפי הצורך (למשל, 10 מיקרוליטר לריכוז גבוה יותר).
  2. הפרדת גרדיאנט סוכרוז בטעינה תחתית של רכבים חשמליים
    1. הכינו מלאי גרדיאנט סוכרוז של 10-90% הכוללים את הריכוזים הבאים: 10%, 16%, 22%, 28%, 34%, 40%, 46%, 52%, 58%, 64%, 70% ו-90% באמצעות בופר VIB. השתמש באמבט מים בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס כדי לסייע בהמסה של 70% ו-90%.
    2. מערבבים את כדור ה-EV התלוי (~100 מיקרוגרם חלבון EV) עם תמיסת סוכרוז של 1 מ"ל של 90%. לאחר מכן, שכבת התערובת הזו כשכבה הראשונה של שכבה לא רציפה.
    3. הכינו את גרדיאנט הסוכרוז הלא רציף הנותר על ידי שכבה רציפה של 1 מ"ל מכל תמיסת סוכרוז מעל תערובת סוכרוז EV-90%, החל מ-70% סוכרוז וממשיך בהדרגה לריכוזים נמוכים יותר (64%, 58%, 52%, 46%, 40%, 34%, 28%, 22%, 16% ו-10%). פזרים בזהירות כל שכבה לאורך דופן הצינור באמצעות פיפטה כדי למזער ערבוב בין השכבות הסמוכות. הנפח הכולל יהיה ~12.1 מ"ל.
    4. צנטריפוגה ב-100,000 גרם למשך 72 שעות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
      הערה: לריצות אולטרה-צנטריפוגציה ממושכות, יש לוודא שהצינורות, הפקקים והרוטורים מדורגים לפעולה ממושכת במהירות גבוהה וכי נהלי איזון מומלצים על ידי היצרן.
    5. אסוף שישה שברים של 2 מ"ל לכל דגימה על ידי פיפטינג מלמעלה. העבר כל חלק לצינור אולטרה-צנטריפוגה חדש בנפח 17 מ"ל.
    6. החזירו את החלקים שנאספו ב-~16 מ"ל של בופר VIB וצנטריפוגה ב-100,000 גרם למשך שעה אחת בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
    7. זרוק את הסופרנטנט, ואז תלה כל כדור ב-50 מיקרוליטר של בופר VIB.
      הערה: גלולת ה-EV אינה נראית. גרדו בעדינות את תחתית הצינור עם קצה הפיפטה כדי להחזיר את הצינור לתלייה. כוון את נפח הבופר לפי הצורך (למשל, 10 מיקרוליטר לריכוז גבוה יותר).

5. שימוש בכרומטוגרפיה של הוצאת גודל (עמודת 35 ננומטר) לטיהור רכבים חשמליים

  1. הכנת בופר ואיזון עמודה
    1. הכינו את VIB ואת כל הבופרים הנוספים טריים. סנן את כל המנגנון דרך ממברנה של 0.22 מיקרון והסרת גזים תחת ואקום לפני השימוש כדי למנוע היווצרות בועות אוויר וחסימת נקבוביות.
      הערה: דה-גזים לא מלאים או שימוש בבופרים לא מסוננים עלולים להכניס בועות אוויר או חלקיקים למיטת השרף, מה שמוביל להפרעות זרימה וירידה ביעילות הפרדת הרכבים החשמליים. אם נצפים בועות בעמודה, יש לעצור את הריצה ולאזן את העמודה מחדש.
    2. אפשר לעמודה ולבופרים להתאזן לטמפרטורת החדר (18-24 מעלות צלזיוס) לפני הסרת פקקי העמודה.
      הערה: יש לאזן את העמודה והמנגנים לטמפרטורת החדר לפני הסרת המכסה. החלת בופר בטמפרטורת החדר על עמודה קרה עלולה לגרום להיווצרות בועות בתוך השרף, מה שמוביל לעיוות פרופילי שטיפה וירידה בשחזוריות.
    3. עמוד את העמוד במצב זקוף והסר בזהירות את המכסה העליון של העמוד.
    4. הסר את המכסה התחתון ותן לבופר להתנקז לחלוטין מהעמוד.
      הערה: ודאו שבופר האחסון התרוקן לחלוטין מהעמודה לפני השיווי משקל.
    5. איזון העמודה על ידי שטיפה עם שלושה נפחי עמודה (25.5 מ"ל) של בופר VIB של 0.22 מיקרון שדה-גז.
  2. טעינת רכב חשמלי ואיסוף דגימות
    1. השתמש ב-100 מיקרוגרם של חלבון EV כולל לכל טיהור SEC. לפני הטעינה על עמודת ה-SEC, כוון דגימות EV לנפח סופי של 500 מיקרוליטר באמצעות VIB.
    2. הניחו את מתלה ה-EV בנפח 500 מיקרולטר ישירות על סריגת הטעינה בראש העמודה.
    3. אפשרו לדגימה להיכנס לגמרי למיטת השרף לפני הוספת בופר VIB. שמור על זרימת עמוד רציפה לאורך כל ההפרדה כדי להבטיח שחרור מדויק לפי גודל.
      הערה: זרימת העמודה צריכה להישאר רציפה לאורך כל ההפרדה. מתן התייבשות של העמודה או הפסקת הזרימה לפרקי זמן ממושכים מפריע להפרדה מבוססת גודל ועלול לגרום לחפיפה חלקית ולהפחתת העשרת EV.
    4. לאחר שדגימת ה-EV (500 מיקרוליטר) נכנסה במלואה למשטח השרף, הוסיפו 2 מ"ל של VIB ואפשרו לה להיפלט לחלוטין. אלואט זה מתאים לנפח המת של העמודה ויש להשליך אותו. חלקי EV נאספו לאחר מכן על ידי הוספת 400 מיקרוליטר של VIB ברצף ואיסוף ה-eluate, תוך חזרה על תהליך זה לקבלת חלקים 1-6 בצינורות מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל.
      הערה: הנפח המת לא אמור להכיל רכבים חשמליים. בהתבסס על אימות באמצעות עמודת 35 ננומטר, ה-EVs בדרך כלל מתאוששים בחלקים 1-3. במידת הצורך, ניתן להעריך את הנפח המת באמצעות ניתוח מעקב ננו-חלקיקים (NTA) או אימונובלוטינג לסמנים חשמליים כדי לאשר את היעדר ה-EVs.
  3. ניקוי ואחסון עמודים
    1. מיד לאחר איסוף החלקים, שטפו את העמודה בנפח עמודה אחד (8.5 מ"ל) של 0.5 M NaOH לחיטוי השרף. לאחר מכן, שטף את העמודה ב-17 מ"ל של VIB כדי להחזיר את ה-pH הנייטרלי. העמודה מוכנה לטעינה של הדגימה הבאה.
      הערה: שטיפה של העמודה עם בופר בלבד אינה מספיקה להסרת חלבונים או וזיקולות שנותרו. שלב ניקוי NaOH חיוני למניעת העברה בין הדגימות, במיוחד בניתוחי חומצות גרעין או RNA במורד הזרם.
    2. לאחסון ארוך טווח, שטפו את העמודה בשני נפחי עמודה של מים דה-יוניים לאחר הניקוי, ואחריהם שני נפחי עמודה של 20% אתנול לאחסון. תסכם את העמודה ותשמור אותה זקופה.
      הערה: שטיפת העמודה במים דה-יוניים לפני אגירת האתנול מונעת התגבשות מלח בתוך מיטת השרף, מה ששומר על ביצועי העמודה.

6. אימות, כימות והערכת גודל/מורפולוגיה של EV

  1. ניתוח מעקב ננו-חלקיקים (NTA)
    1. מדוד את התפלגות גודל ה-EV וריכוז החלקיקים לפי NTA.
    2. מדלל את דגימות ה-EV ב-1:100 ב-VIB סטרילי, מסונן ב-0.2 מיקרומטר כדי להגיע לריכוז חלקיקים בטווח הגילוי האופטימלי (כ-10⁷-10⁹ חלקיקים למ"ל).
    3. ערבבו בעדינות את הדגימות המדוללות כדי למנוע היווצרות בועות והעמיסו אותן למכשיר המצויד בלייזר 532 ננומטר ומצלמת sCMOS ברגישות גבוהה.
    4. ביצוע איסוף וניתוח נתונים באמצעות תוכנת NS Xplorer עם סף זיהוי של 10 ננומטר (עד 1,000 ננומטר), תוך יישום אלגוריתם ריכוז דינמי מבוסס נפח תצפית.
  2. ניתוח כתם מערבי של סמנים חשמליים
    1. לניתוח כתם מערבי, יש לשטוף ולהשעות מחדש את חלקי ה-EV שהתקבלו לאחר הפרדת גרדיאנט סוכרוז ב-50 מיקרו-ליטר של VIB. מערבבים אליקו של 10 מיקרוליטר מכל חלק עם בופר טעינה SDS, מנותקים ופתרנו על ג'ל טריס-גליצין 12% לפני אימונובלוט עם נוגדנים TET8 של סמן EV.
    2. לחלקי EV שמקורם ב-SEC, תחילה ריכזו 400 מיקרוליטר מכל שבר ל-50 מיקרוליטר באמצעות פילטר צנטריפוגלי חיתוך של 100 kDa. לאחר מכן, השתמשו ב-10 מיקרוליטר של הדגימה המרוכזת לניתוח ווסטרן בלוט כפי שתואר לעיל.
  3. מיקרוסקופ אלקטרונים בהעברה (TEM)
    1. הפקדו 5 מיקרו ליטר של רכבים חשמליים תלויים ב-VIB על רשתות פחמן-פורמוואר 300-רשת עם פריקת זוהר. לאחר מכן, סחוט את הדגימה העודפת בעזרת נייר סינון.
    2. לאחר מכן, צבע את הרשת באופן שלילי עם 3 מיקרוליטר של מיקרוסקופ אלקטרונים, הסר עם נייר סינון, ותן לה להתייבש באוויר לפני הדמיה עם 300 קילו-וולט TEM.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

כדי להעריך האם פרוטוקול איסוף ה-AWF האופטימלי מפחית נזק לרקמות וזיהום ציטופלזמי, ה-AWF שהושג בשיטה שלנו (שיטה 1) הושווה ישירות לשיטה חלופית (שיטה 2) המבוססת על חדירת משאבת ואקום לכל הצמח11. נזק תאי לאחר חדירה הוערך באמצעות צביעת Trypan Blue, שחשף ירידה משמעותית בצביעת עלים שעובדו באמצעות שיטה 1, מה שמעיד על רמות נמוכות יותר של קרע תאים (איור 3A). כדי להעריך עוד את זיהום הציטופלזמה ב-AWF שנאסף, נבדקו תכולת הכלורופיל וחלבון הסמן הכלורופ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

רכבי EV צמחיים הפכו לשחקנים מרכזיים במערכת החסינות של הצמחים, במיוחד בתיווך תקשורת חוצה ממלכות עם פתוגנים פטרייתיים32. עדויות הולכות וגדלות מראות שצמחים מפרישים EVs לתוך האפופלסט, שם הם פועלים לספק RNA קטנים (sRNA), mRNA וחלבונים שיכולים לדכא אלימות בפתוגנים פולשים, כגון Botrytis cinerea, Rhizoctonia solani, ופתוגן אומיצט Phytophthora capsici 10,18,33

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים לא חושפים ניגוד עניינים.

תודות

תואר B.D. נתמך על ידי Pathways to the Doctorate Fellowship מאוניברסיטת טקסס A&M. B.H. נתמכת על ידי קרנות התחלה מאוניברסיטת טקסס A&M וממשרד החקלאות של ארצות הברית (HATCH 7009138 פרויקט מספר TEX08074.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.45 ומיקרו; מסנני ניילון MVWR76479-032
1 מ"ל מזרק מיותרBD ביוסיינסס309659
מסנן אולטרה צנטריפוגלי בהספק 100 קילו-דלטוןאמיקוןUFC 910008
100 מ"ל מזרק מיותרBD ביוסיינסס551721050
צינורות חרוטיים בגודל 15 מ"לVWR89039-664
צינורות קוניים של 50 מ"לVWR89039-656
Arabidopsis thaliana (Col-0)קווים מנוהלים על ידי המעבדהלא רלוונטי
רשתות Carbon-formvar 300-meshטד פלה01753-F
סרט נקיסרט קסם סקוטיS-9783
פאראפילםפישר סיינטיפיק13-374-12
בופר PBSיוצר בתוך הביתלא רלוונטי
qEV עמודה מקורית דור 2 35 ננומטרמדעי IZONICO-35
צנטריפוגה מקוררתאפנדורף5810R
רוטור בזווית קבועה של צנטריפוגה מקורראפנדורףF-34-6-38
רוטור דלי מתנדנד בצנטריפוגה מקורראפנדורףA-4-62
סוקרוזהVWR470302-810
אולטרה-צנטריפוגהבקמן קולטרXPN-100
צינורות אולטרה-צנטריפוגהבקמן קולטר337986
UranyLess stainמדעי מיקרוסקופיית אלקטרונים250218-01

מקורות

  1. Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends. J Cell Biol. 200 (4), 373-383 (2013).
  2. Zhou, X., et al. Small extracellular vesicles: The origins, current status, future prospects, and applications. Stem Cell Res Ther. 16 (1), 184(2025).
  3. Colombo, M., Raposo, G., Théry, C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annu Rev Cell Dev Biol. 30, 255-289 (2014).
  4. Akers, J. C., Gonda, D., Kim, R., Carter, B. S., Chen, C. C. Biogenesis of extracellular vesicles (EV): Exosomes, microvesicles, retrovirus-like vesicles, and apoptotic bodies. J Neurooncol. 113 (1), 1-11 (2013).
  5. Ratajczak, M. Z., Ratajczak, J. Extracellular microvesicles/exosomes: Discovery, disbelief, acceptance, and the future. Leukemia. 34 (12), 3126-3135 (2020).
  6. Hristov, M., Erl, W., Linder, S., Weber, P. C. Apoptotic bodies from endothelial cells enhance the number and initiate the differentiation of human endothelial progenitor cells in vitro. Blood. 104 (9), 2761-2766 (2004).
  7. Marar, C., Starich, B., Wirtz, D. Extracellular vesicles in immunomodulation and tumor progression. Nat Immunol. 22 (5), 560-570 (2021).
  8. Ruan, S., et al. Extracellular vesicles as an advanced delivery biomaterial for precision cancer immunotherapy. Adv Healthc Mater. 11 (5), e2100650(2022).
  9. Cai, Q., et al. Message in a bubble: Shuttling small RNAs and proteins between cells and interacting organisms using extracellular vesicles. Annu Rev Plant Biol. 72, 497-524 (2021).
  10. Cai, Q., et al. Plants send small RNAs in extracellular vesicles to fungal pathogen to silence virulence genes. Science. 360 (6393), 1126-1129 (2018).
  11. Rutter, B. D., Innes, R. W. Extracellular vesicles isolated from the leaf apoplast carry stress-response proteins. Plant Physiol. 173 (1), 728-741 (2017).
  12. Ding, Y., et al. Exo70e2 is essential for exocyst subunit recruitment and expo formation in both plants and animals. Mol Biol Cell. 25 (3), 412-426 (2014).
  13. Wang, J., et al. Expo, an exocyst-positive organelle distinct from multivesicular endosomes and autophagosomes, mediates cytosol to cell wall exocytosis in Arabidopsis and tobacco cells. Plant Cell. 22 (12), 4009-4030 (2010).
  14. Jeon, H. S., et al. Pathogen-induced autophagy regulates monolignol transport and lignin formation in plant immunity. Autophagy. 19 (2), 597-615 (2023).
  15. Prado, N., et al. Nanovesicles are secreted during pollen germination and pollen tube growth: A possible role in fertilization. Mol Plant. 7 (3), 573-577 (2014).
  16. Samuel, M., Bleackley, M., Anderson, M., Mathivanan, S. Extracellular vesicles including exosomes in cross kingdom regulation: A viewpoint from plant-fungal interactions. Front Plant Sci. 6, 766(2015).
  17. Pinedo, M., De La Canal, L., De Marcos Lousa, C. A call for rigor and standardization in plant extracellular vesicle research. J Extracell Vesicles. 10 (6), e12048(2021).
  18. Huang, Y., et al. Rice extracellular vesicles send defense proteins into fungus rhizoctonia solani to reduce disease. Dev Cell. 60 (8), 1168-1181.e6 (2025).
  19. Wang, S., et al. Plant mrnas move into a fungal pathogen via extracellular vesicles to reduce infection. Cell Host Microbe. 32 (1), 93-105.e6 (2024).
  20. He, B., et al. Publisher correction: Rna-binding proteins contribute to small rna loading in plant extracellular vesicles. Nat Plants. 7 (4), 539(2021).
  21. Rutter, B. D., Innes, R. W. Extracellular vesicles as key mediators of plant-microbe interactions. Curr Opin Plant Biol. 44, 16-22 (2018).
  22. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (misev2018): A position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. J Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  23. Regente, M., et al. Plant extracellular vesicles are incorporated by a fungal pathogen and inhibit its growth. J Exp Bot. 68 (20), 5485-5495 (2017).
  24. Mu, J., et al. Interspecies communication between plant and mouse gut host cells through edible plant derived exosome-like nanoparticles. Mol Nutr Food Res. 58 (7), 1561-1573 (2014).
  25. Baldrich, P., et al. Plant extracellular vesicles contain diverse small RNA species and are enriched in 10- to 17-nucleotide "tiny" RNAs. Plant Cell. 31 (2), 315-324 (2019).
  26. Regente, M., et al. Vesicular fractions of sunflower apoplastic fluids are associated with potential exosome marker proteins. FEBS Lett. 583 (20), 3363-3366 (2009).
  27. Rutter, B. D., Innes, R. W. Growing pains: Addressing the pitfalls of plant extracellular vesicle research. New Phytol. 228 (5), 1505-1510 (2020).
  28. Thieron, H., et al. Practical advice for extracellular vesicle isolation in plant-microbe interactions: Concerns, considerations, and conclusions. J Extracell Vesicles. 13 (12), e70022(2024).
  29. Borniego, M. L., et al. Diverse plant Rnas coat Arabidopsis leaves and are distinct from apoplastic RNAs. Proc Natl Acad Sci U S A. 122 (1), e2409090121(2025).
  30. Chen, A., He, B., Jin, H. Isolation of extracellular vesicles from Arabidopsis. Curr Protoc. 2 (1), e352(2022).
  31. Koch, B. L., Rutter, B. D., Innes, R. W. Arabidopsis produces distinct subpopulations of extracellular vesicles that respond differentially to biotic stress. bioRxiv. , (2024).
  32. Hamby, R., Cai, Q., Jin, H. RNA communication between organisms inspires innovative eco-friendly strategies for disease control. Nat Rev Mol Cell Biol. 26 (2), 81-82 (2025).
  33. Hou, Y., et al. A phytophthora effector suppresses trans-kingdom RNAi to promote disease susceptibility. Cell Host Microbe. 25 (1), 153-165.e5 (2019).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

בידוד וסיקולותצנטריפוגה דיפרנציאליתמדרג סוכרוזכרומטוגרפיית הרחקה של גודלמעקב אחר ננו-חלקיקיםמיקרוסקופיה אלקטרונית חודרתאינטראקציה בין צמחים למיקרובים
בידוד וטיהור של וזיקולות חוץ-תאיות של צמחים מעלי ארבידופסיס באמצעות שיטת איסוף אופטימלית של שטיפה אפופלסטית
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.