מאמר שיטה

שיטות לכימות במקום של מורפולוגיית מיטוכונדריה בתאי שריר וסופיים של עכברים

DOI:

10.3791/69732

⸱

10 באפריל 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Kinesiology and Sport Management, College of Education and Human Development, Texas A&M University, College Station, 2National Institutes of Health

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הזרקות מקומיות של תווית צבע מיטוכונדריאלי סופית של מיטוכונדריה תא שוואן ב-vivo למיקרוסקופיה קונפוקלית. שיטה זו משתמשת בהוכחת היתכנות שהודגמה ברקמת שריר שלד של עכברים עם שריר בריא או חולה, כדי לספק הדמיה מיטוכונדרית ברזולוציה גבוהה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מורפולוגיה של רשת מיטוכונדריאלית משמשת באופן נרחב כאינדיקטור לבריאות התאים; עם זאת, כימות הארכיטקטורה המיטוכונדרית בתוך רקמות שלמות נותר אתגר טכני. תאי שוואן סופיים (tSCs), החיוניים לתחזוקה והתחדשות של מפגשים נוירומוסקולריים, קשים במיוחד לניתוח במקום בשל מיקומם האנטומי ורגישותם להפרעות ברקמות. פרוטוקול זה מתאר גישה ניתנת לשחזור לתיוג וכימות של מורפולוגיית רשת מיטוכונדריאלית תלת-ממדית בשריר שלד שלם וב-tSCs בעכברים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית סטנדרטית. השיטה עושה שימוש במתן צבע מיטוכונדריאלי הרגיש לפוטנציאל ממברנה בחיים ואחריו עיבוד רקמות מהיר ודימות קונפוקלי ברזולוציה גבוהה. ערימות תמונות מנותחות כדי לכמת את הקישוריות, השטח והפיצול של רשתות מיטוכונדריה. הפרוטוקול מאומת לראשונה בשריר השלד הדיסטרופי והבריא כדי לאשר הבדלים צפויים במורפולוגיה המיטוכונדריאלית, ולאחר מכן מותאם להמחשה וכימות רשתות מיטוכונדריה ב-tSCs שזוהו באמצעות עכברי מדווח S100β. גישה זו מאפשרת ניתוח מורפולוגיה של מיטוכונדריה בתוך רקמות נוירומוסקולריות שלמות מבלי לדרוש מדווחי מיטוכונדריה טרנסגניים או פלטפורמות הדמיה מיוחדות. הפרוטוקול דורש רק ציוד הזמין בדרך כלל במתקני הליבה של האוניברסיטה וניתן להתאים אותו לרקמות דקות או נגישות לשטח.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיטוכונדריה הן אברונים פלסטיים להפליא הפועלים כריאות התא, צורכים חמצן במהלך נשימת התא כדי לתמוך בייצור אדנוזין טריפוספט (ATP) בתגובה לדרישה מטבולית1. בעבר נחשבו כאברונים נפרדים, אך כיום מבינים שהמיטוכונדריה משולבת מאודב-2,3,4, ומשתפת את מצע האנרגיה בכל הרשת שלהם בהתאם לדרישות המקומיות. אינטגרציה מספקת יתרון ברור על פני בידוד: מיטוכונדריה מחוברת תומכת בחסרי אנרגיה, ושומרת על גרדיאנטים אלקטרוכימיים לזרחון חמצוני בזמן דרישה מטבולית מוגברת. אכן, התפלגה, הנפח והמורפולוגיה של המיטוכונדריה מתאימים לצרכי האנרגיה בסביבתן5. בבריאות, תחלופה סדירה של רשתות מיטוכונדריה נשמרת באמצעות ביוגנזה מיטוכונדרית, אירועי מיזוג וביקוע, ומיטופגיה 2,3. ביוגנזה מיטוכונדריאלית נדרשת לשמירה והרחבת מיטוכונדריה בריאה. דרישה מטבולית, כגון פעילות גופנית, מגבירה את הביטוי של הקולטן המופע על ידי פרוקסיזום γ קו-אקטיבטור 1α (PGC-1α)5. תהליך זה מתרחש באמצעות אותות סיבולת ראשוניים, ובמיוחד העלאת קינאז חלבון מופעל על ידי AMPK (AMPK), סידן וחמצן תגובתי 6,7. היתוך מרחיב רשתות, מקדם הישרדות ומשלימה ליקויים, בעוד שפיצול מפחית נזק מיטוכונדריאלי נוסף באמצעות הדרה מועדפת של אזור 2,3,8. לאחר ההסרה, אזורים מודרים חייבים לעבור מיטופגיה, מה שמונע הצטברות של אברונים וחלבונים לא מתפקדים 6,9.

שריר השלד מהווה כ-40% ממסת הגוף ומסתמך על מיטוכונדריה למטבוליזם אירובי ואיתות תאי לשמירה על הומאוסטזיס10. ביחד, במצבים של תפקוד לקוי של שרירי השלד, מנגנוני בקרת האיכות המיטוכונדריאלית נפגעים10. חקירות של תפקוד לקוי של שרירים מודדות בדרך כלל נשימת מיטוכונדריאל, נפח, מורפולוגיה וייצור מיני חמצן תגובתי (ROS) כדי להעריך את איכות המיטוכונדריה 3,10. בהקשר זה, במהלך תפקוד שרירים ממושך, הנשימה המיטוכונדריאלית מצטמצמת, בעוד ש-ROS עולה והרשתות מפורקות 3,10. הפרעות במורפולוגיה המיטוכונדריאלית נובעות בעיקר מהפעלת חלבוני ביקוע מיטוכונדריאליים, חלבון הקשור לדינמין 1 (DRP1) וביקוע מיטוכונדריאלי 1 (FIS1)2,8,11. בתגובה לניוון שריר, FIS1, השוכנת על פני הממברנה החיצונית של המיטוכונדריה, מגייסת את DRP1 לאוליגומריזציה עם מספר דימרים של DRP1 ליצירת סיב סביב המיטוכונדריה, שמצטמצם בגודלו עד שמקטע מסוים של מיטוכונדריה "נקטע" ומעודד פיצול 3,11. ביחד, פעילות יתר של ביקוע מיטוכונדריאלי, הפחתות במיזוג של מיטוכונדריה שנוצרה לאחרונה, ומיטופגיה לקויה אחראים להופעה מפוצלת של רשתות מיטוכונדריה לקויות, כמו אלו המתוארות בשריר לא פעילאו חולה 2,12.

הצומת הנוירומוסקולרית (NMJ) היא אתר ההתעוררות השרירית. פוטנציאלי פעולה שמתחילים בסומה מתפשטים לאורך אקסונים, מוקפים בתאי שוואן המיאליניים (SCs), ומסתיימים ב-NMJs, המכוסים בתאי שוואן סופיים (tSC). NMJ יכולים להתחדש לאחר פציעה. עם זאת, הסבירות והמהירות להתחדשות מצטמצמות ככל שהמרחק בין אתר הפציעה ל-NMJ עולהב-13.14. לאחר פגיעת עצב על ידי חתך, ריסוק או מתיחה, ה-SCs מתפרקים למצב דמוי קדם דמיאליני15,16. SCs מדמיילינים מתרבים ופועלים בשיתוף עם מקרופאגים כדי לעצב מחדש את הסביבה המקומית להתחדשות על ידי ניקוי פסולת בין אתר הפציעה לגדם האקסון הפרוקסימלי דרך ניוון וולריאני17,18. SCs נודדים מסמנים תגובה דלקתית שמשנה את הסביבה לקראת התחדשות עצבים מוצלחת18. התחדשות עצבית מתרחשת בתוך המעטפת העצבית שנוצרה על ידי ה-SCs הדמויי אבות, היוצרים רצועות של בונגר, דרכן האקסים גדלים מחדש19. הגדם האקסון מרחיב אז את הפילופודיה כדי להתחיל את העצבוב מחדש14. לאחר העצבוב מחדש, הפרה-סינפסה יכולה להתחדש לחלוטין, בתנאי ש-tSCs משקיעים מחדש ב-NMJ20.

המורפולוגיה של המיטוכונדריה משתנה באופן ניכר בין סוגי התאים, ומתאימה לתפקוד הרקמה21. דיווחים מרקמות כבד מצביעים על כך שהמיטוכונדריה קומפקטית וכדורית יותר, בעוד שהחומר הלבן במוח מוארכת וצינוריתיותר. בעת אתגר, כמו במצבים של הזדקנות ולחץ חמצוני, המיטוכונדריה ברקמות אלו מציגות פנוטיפ דמוי סופגניה. עם זאת, באוסטאובלסטים, היווצרות ופיצול סופגניה מיטוכונדריאלית נקשרו להפרשה מוגברת של מיטוכונדריה ווזיקולות שמקורן במיטוכונדריה, ועם הבשלה של האוסטאובלסטים23. בעוד שרשתות המיטוכונדריה של שריר השלד נבדקו בהרחבה במספר מינים, קיימות מגבלות בהדמיית רשתות מיטוכונדריה מ-tSCs של מערכת העצבים ההיקפית. קשה ללכוד אותם בסביבתם הטבעית, שכן מבנה התאים משתנה משמעותית לאחר בידוד, ורקמות אלו קשות למיקוד בצבע ב-vivo מבלי להעמיס גם על שריר השלד המצורף.

טכניקות הדמיה המשמשות ללכידת מורפולוגיה מיטוכונדריאלית במערכות חיות יכולות להיות מסווגות כמיקרוסקופ אור או מיקרוסקופ אלקטרוני5. במיקרוסקופ לכידת אור מסורתי, צבעים יכולים לסמן תאים חיים, תאים קבועים יכולים להיות מסומנים באימונו, וניתן לסמן את המינונים גנטית 5,24. הדמיית תאים חיים דורשת בדרך כלל דגירה של תאים למשך 20–60 דקות לפני ניתוח פלואורסצנציה. צבעים מופונים למיטוכונדריה באמצעות פוטנציאל ממברנה, ולכן עשויים להשתנות בתנאים של פוטנציאל ממברנה משתנה5. לכידת מורפולוגיה מיטוכונדריאלית של tSCs בתוך שריר השלד באמצעות טעינת צבע אפשרית תיאורטית; עם זאת, זה ידרוש הדמיה של רקמות שלמות וטכניקות תיוג מפורטות. במיוחד, הוא לוכד מיטוכונדריה בתוך מבנים שלמים, ללא הפרעה מתיוג שריר שלד. כדי להתגבר על מגבלות אלו, שימש הכתם הפלואורסצנטי המיטוכונדריאלי לסימון שריר שלד חי בעכברים בריאים ודיסטרופיים, ולאחר מכן סימון מיטוכונדריה tSC להדמיה במצב חי ובמקום. שריר טיבאליס הקדמי (TA) נבחר לאופטימיזציה של דימות שריר השלד בשל מיקומו האנטומי השטחי, נפח ההזרקה המאופיין היטב ופיזור המיופאשיה 25,26,27, והתאמתו למדידות פונקציונליות מקבילות. שריר הישבן מקסימוס (GM) נבחר להדמיה tSC בהתבסס על פרוצדורת ההזרקה המוכרת28,29, הארכיטקטורה הדקה שלו, שמזערת פלואורסצנציה רקעית, והמיקום הגחוני השטחי של הצמתים הנוירומוסקולריים בין ה-GM לגלוטאוס מדיוס, מה שמאפשר סימון מועדף של tSCs לפני סיבי שריר שלד.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

זכר בוגר בן שישה חודשים (n=3) DBA/2J [סוג בר (WT)] (RRID: IMSR_JAX:000671) ו-D2.B10-DMDD2.mdx/J [D2.mdx (mdx)] (RRID: IMSR_JAX:013141), בעוד זכר ונקבה בוגרים בני שלושה עד חמישה חודשים (n=8) B6; D2-Tg(S100-EGFP)1Wjt/J (S100B) (RRID: IMSR_JAX:005621) [גם הוא מאוחד עם WT ללא הבדלים מ-DBA] שימשו ממושבה מתמשכת של עכברים שנשמרו על ידי החוקרים. תהליך הניסוי הכולל להזרקות TA ו-GM, עיבוד רקמות והדמיה מסוכם באיור 1. D2 נוסף. עכבר MDX נתרם על ידי חוקר להדמיית tSC ב-MDX (n=1). כל ההליכים לבעלי חיים אושרו על ידי ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים מוסדית באוניברסיטת טקסס A&M (AUP 2022-0215) ונערכו בהתאם למדריך המועצה הלאומית למחקר לטיפול ושימוש בבעלי חיים במעבדה (מהדורה 8)30. המתת חסד בוצעה על ידי פריקה צווארית תחת מנת יתר של איזופלורן בהרדמה.

1. הכנת תמיסת צביעה פלואורסצנטית של 2 מיקרומטר

  1. השעה את הכתם המיטוכונדריאלי (50 מיקרוגרם) ב-322 מיקרו ליטר דימתיל סולפוקסיד (DMSO) בהתאם להוראות היצרן להכנת תמיסת קיא של 200 מיקרומטר.
  2. להכנת 30 מ"ל של תמיסת עבודה של 2 מיקרומטר, העבר 300 מיקרוליטר של תמיסת מאגר של 200 מיקרומום ל-29.7 מ"ל של תמיסת מלח סטרילית. ערבב היטב.
  3. עליקווט 250 מיקרוליטר מהתמיסה של 2 מיקרומטר לתוך צינורות מיקרוצנטריפוגות ואחסון בטמפרטורה של -80°C עד לשימוש.
    הערה: לא נצפה ירידה ניתנת לזיהוי באות לאחר 3 שנות אחסון בטמפרטורה של -80°C.

2. צבע והכנת בעלי חיים

  1. הפשיר קפוא אחד 15 דקות לפני הניסוי. משוך את התמיסה למזרק אינסולין בנפח 30 G, 1 סמ"ק.
  2. הרדימו את בעל החיים עם איזופלורן. מרחו משחה עינית, גילחו את אזור ההזרקה, ושמרו על טמפרטורת הגוף באמצעות מנורת חימום עם גלש טמפרטורה הממוקם בין החיה למקור החום.
  3. נקה את אתר ההזרקה המגולח עם אלכוהול איזופרופיל של 70%.

3. מתן ותפקוד צבע מיטוכונדריאלי לשרירי Tibialis Anteerior (TA)

  1. מתן צבע TA
    1. הזרקו 50 מיקרוליטר של כתם מיטוכונדריאלי של 2 מיקרומום לשריר ה-TA הימני של עכברי WT ו-D2.mdx שהורדמו.
    2. הכנס את המחט בגיד הדיסטלי לכיוון הברך ולוחץ על הבוכנה תוך משיכת המחט לאורך מסלול ההזרקה.
    3. דגרו את הצבע ב-vivo למשך שעה לפני הניתוח.
  2. מדידות תפקוד שריר TA
    1. לאחר 45 דקות של דגירה לצבע, יש להרדים את העכבר באמצעות איזופלוראן (השראה של 2%–3%, תחזוקה של 1.5%–2% חמצן).
    2. חשפו בניתוח את שריר ה-TA השמאלי תוך שמירה על הרקמות הסובבות. קשר את הגיד הדיסטלי לקרן העומס של מערכת בדיקת השריר.
    3. עטוף את השריר החשוף במגבון מעבדה ושטף ב-3 מ"ל דקה עם 0.9% מלח סטרילי מחומם ל-40 מעלות צלזיוס. שמור על טמפרטורת שריר ב-32 מעלות צלזיוס באמצעות מנורת חום.
    4. מקם את אלקטרודות חוט הפלטינה/אירידיום לאורך הבטן השרירית לגירוי ישיר.
    5. חבר את קרן העומס למיקרומטר וכוון את האורך האופטימלי (L0) באמצעות כיווצים מהירים (Tw) ב-1 הרץ. הקליט את L0 עם קליפר דיגיטלי.
    6. הגרמו להתכווצויות טטניות מקסימליות (P0) שלוש פעמים ב-140 הרץ עם מנוחה של 60 שניות בין ההתכווצות. רשום את ערך הכוח הגבוה ביותר (g). רכשו נתונים באמצעות מערכת תפקוד השרירים באמצעות תוכנת ניתוח.
  3. עיבוד רקמות TA
    1. לאחר הדגירה, בודדים ומנתחים את שריר ה-TA לפני המתת החסד.
    2. הנח חבילות סיבי שריר מבודדות ב-4% פאראפורמלדהיד בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות תוך כדי גירוי עדין של סיבים תחת מיקרוסקופ סטריאו.
      אזהרה: פאראפורמלדהיד הוא רעיל ויש לטפל בו עם מכסה אדים כימי תוך לבישת ציוד מגן אישי מתאים (חלוק מעבדה, כפפות והגנה על עיניים).
    3. הוסיפו צביעת חומצה גרעין מתאית לריכוז סופי של 5–10 מיקרוגרם/מ"ל כדי לסמן גרעינים.
    4. שטוף דגימות שלוש פעמים במי מלח מפוזר (PBS) למשך 5 דקות כל אחת כדי להסיר צבע עודף.
    5. ייבשו דגימות ברצף ב-50%, 75% ו-100% אתנול למשך 5 דקות כל אחד.
    6. דגמו דגימות ברצף בתמיסות ניקוי רקמות I ו-II למשך 30 דקות כל אחת בטמפרטורת החדר, תוך שימוש בנפח מספק לטבילה מלאה של רקמה.
    7. הניחו חבילות TA נקיות על כיסוי ושטחו בעדינות באמצעות בלוק זכוכית (2.5 ס"מ × 2 ס"מ × 1 ס"מ; משקל 7.8 גרם)26.

4. הדמיית דגימות שריר TA

  1. צילם דגימות שריר באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי לקבלת חתכים אופטיים תלת-ממדיים (תלת-ממדיים) ברזולוציה גבוהה.
  2. לצלם תמונות Z-stack בעומק של כ-100 מיקרון לשריר באמצעות עדשת אובייקטיב בהגדלה של 63x (N.A. 1.40).
  3. השתמש בתוכנת הקונפוקל של מערכת ההדמיה עם אורך גל עירור של 646 ננומטר כדי לספק את הבהירות המרבית עם הרקע הנמוך ביותר.
  4. רכוש תמונות באמצעות מצב דה-קונבולוציה, תוך שימוש בפרמטרים של "System Optimized" עם גודל צעדים של 1 מיקרון.
    הערה: כדי להילחם בהתייבשות ובהלבנת פוטו, העבר את הרקמות לתמיסת ניקוי רקמות II ומניח אותן על כיסוי כיסוי. הנח שתי טיפות של תמיסת ניקוי 2 ישירות על הרקמה לפני ההדמיה.

5. טעינת צבע tSC בשריר GM והדמיה

  1. השתמש בעכברים S100β לזיהוי פלואורסצנטי ספציפי של tSCs.
  2. בצע חתך קטן בעור מעל השריר הגנטי. הזרקו 75 מיקרוליטר של כתם מיטוכונדריאלי אדום קשיח בגודל 2 מיקרומטר מתחת ל-GM, לפני סגירת הפצע25.
  3. סגור את הפצע ומאפשר לצבע לדגור במשך 45 דקות כדי לסמן באופן סלקטיבי את ה-tSCs ללא סימון משמעותי של סיבי השריר התחתונים.
  4. נתח את שרירי ה-GM והניח אותם מיד בסליין סטרילי מקורר עם 0.9%. גזם במהירות שומן עודף ורקמת חיבור.
  5. העבר את ה-GMs המנותחים לכיסוי לצורך הדמיה.
  6. רק אם משתמשים בעכברי D2.mdx, הוסף צבע קולטן אצטילכולין פלואורסצנטי (AChR) בדילול של 1:500 לאמבט המיקרודיסקציה. דגרו את הרקמה למשך 30 דקות כדי לראות את הרכיבים הפוסט-סינפטיים של הצומת הנוירומוסקולרית (NMJ).
  7. השתמש בגישה זו של תיוג כפול כדי להבדיל בין מיטוכונדריה פוסט-סינפטית לבין מיטוכונדריה ספציפית ל-tSC.
    אזהרה: יש להגביל את הדיסקציה והניקוי של ה-GM לפחות 10 דקות לפני ההצבה על כיסוי לצורך הדמיה, כדי למזער שינויים מורפולוגיים לאחר הניתוח. מגבלת הזמן הזו קריטית למזעור שינויים מורפולוגיים לאחר הפריצה ופירוק מיטוכונדריה.
  8. לבצע מיקרוסקופיה קונפוקלית לקבלת חתכים אופטיים תלת-ממדיים (תלת-ממדיים) ברזולוציה גבוהה.
  9. רכוש תמונות Z-stack בעומק של כ-16 מיקרון עבור tSCs באמצעות עדשת אובייקטיב בהגדלה של 20x (N.A. 0.75). רכוש תמונות מייצגות ברזולוציה גבוהה של tSCs בודדים באמצעות עדשת מטרה בהגדלה של 63x.
  10. יישמו הליכי התקנה למזעור התייבשות רקמות והלבנת פוטו-לאצ'ה במהלך מפגש ההדמיה.
    זהירות: העבר רקמות במי מלח לכיסוי כיסוי, כדי לוודא שהצד הגחוני פונה כלפי מטה למיקרוסקופיה הפוכה.
  11. מרח 2 מיקרו ליטר של מדיום התקנה כללי על פני השטח הגבי של ה-GM.
  12. שטחו בעדינות את הרקמה באמצעות בלוק זכוכית מכויל (2.5 ס"מ × 2 ס"מ × 1 ס"מ; מסה 7.8 גרם) כדי להבטיח מישור הדמיה אחיד.

6. מיקרוסקופיית קרן יונים ממוקדת

  1. ביצוע מיקרוסקופיית אלקטרונים סריקה של קרן יונים ממוקדת (FIB-SEM) בהתאם לפרוטוקולים שנקבעו בעבר26.
    1. יש ליישם FIB-SEM במיוחד כדי לאשר ולהמחיש תכונות מורפולוגיות חדשות שזוהו במהלך הדמיה קונפוקלית.

7. ניתוח תמונות

  1. דגימות שריר TA
    1. לבצע ניתוח כמותי של חתכים אופטיים קונפוקליים (1 מיקרון) של סריקות TA (בעובי של כ-75–112 מיקרון) באמצעות תוכנת ניתוח תמונה מונעת בינה מלאכותית.
      הערה: בצע מספר מפגשי הדרכה מפוקחים לפני סגמנטציה אוטומטית כדי לשפר את התאמת האלגוריתמים.
    2. ייבא קטעים אופטיים בודדים (Z-slices) כדי ללמד את התוכנה לשמור על מידע פיקסלי המייצג צבע מיטוכונדריאלי לבן תוך השלמת הרקע השחור.
    3. פתח מסכות תמונה לסקירת חוקרים כדי להבטיח ניתוח איכותי ודיוק.
    4. הפרדת ערימות תמונות תלת-ממדיות לחלקים אופטיים בודדים לפי אופטימיזציה של אלגוריתם.
    5. בחר כל פרוסת Z חמישית מכל תמונה תלת-ממדית לניתוח, כאשר כל נקודת נתונים מייצגת את הממוצע של החלקים הבודדים לכל דגימה.
    6. כמת מורפולוגיה מיטוכונדריאלית כדי לגזור מדדי התפלגות מרחבית וקישוריות רשת.
    7. סטנדרטיזציה של ספי עוצמה, הגדרות זיהוי קצוות וכיול גודל הווקסלים בכל הדגימות כדי למזער שונות ניסיונית.
  2. tSCs על דגימות GM
    1. הרכיבו מקטעים אופטיים בקוטר 1 מיקרון לערימות Z (בעובי של כ-6–25 מיקרון) והפרדו תמונות לערוצי צבע נפרדים באמצעות תוכנת ניתוח תמונות דו-ממדית.
    2. כיולו תוכנה באמצעות פסי קנה מידה והחלו סף כדי לאופטימיזציה של ויזואליזציה של מיטוכונדריה tSC עם הפרעות רקע מינימליות.
    3. בצע בינריזציה והסרת רעש רקע כדי לבודד מיטוכונדריה או tSC של tSC למדידת שטח וספירת חלקיקים.
    4. שמירת תמונות בינאריות כדי להבטיח עיבוד עקבי וביצוע כל ניסויי ההדמיה בתנאים זהים כדי להבטיח שחזוריות בין שכפולים ביולוגיים.

8. אימונוהיסטוכימיה

  1. הטמעת דגימות שריר TA שמאלי בתרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT) להערכת שטח חתך (CSA).
    1. דגימות חתך בעובי 10 מיקרון באמצעות קריוסטט על -17°C ונאספות על שקופיות מיקרוסקופ.
    2. צבע חתכי שריר ללמינין לזיהוי גבולות מיופייבר באמצעות נוגדן ראשוני נגד למינין של ארנב (1:400) ונוגדן משני רודאמין נגד ארנב (1:400).
    3. הרכבת החלקות באמצעות מדיום התקנה מתאים לפני ההדמיה.
  2. שקופיות תמונה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי על ידי בחירה אקראית של 2–3 אזורי עניין (580 x 580 מיקרון) לכל דגימה עם מטרה של 20x (N.A. 0.75).
  3. ערכים ממוצעים בין אזורים לכל שריר ומנתחים כ-400 מיופייברים לכל חתך שריר TA.
  4. השתמש בתוכנת סגמנטציה חצי-אוטומטית של שריר כדי לקבוע CSA (מיקרומטר 2) על ידי הסתרת סיבי השריר.

9. ניתוח סטטיסטי

  1. דווח על נתוני סיכום כממוצע ± שגיאת תקן של הממוצע (S.E.M.).
  2. בצע ניתוח סטטיסטי באמצעות תוכנה סטטיסטית ייעודית, תוך שימוש במבחני t פרמטריים ובלתי מזווגים של סטודנטים כדי לקבוע מובהקות בין הבדלים ממוצעים בקבוצות.
  3. לבצע רגרסיות ליניאריות פשוטות על CSA וכוח שריר משרירי TA, תוך שימוש בהם כסמנים לפתולוגיה של DMD להשוואה בין מורפולוגיה מיטוכונדריאלית משרירי TA לבין tSCs מהונדסים גנטיים.
  4. הערכת מקדמי המתאם של Pearson r כדי לקבוע את המתאם בין פתולוגיית DMD לפתולוגיה מיטוכונדריאלית. הגדר מובהקות סטטיסטית כ-P ≤ 0.05.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

רשתות מיטוכונדריאליות הציגו ירידה צפויה בקישוריות
מוצגות תמונות פלואורסצנטיות תלת-ממדיות מייצגות של סריקות קונפוקליות של שריר TA בשתי קבוצות, WT ו-mdx, (איור 2). בהשוואה לקבוצת ה-WT, הקישוריות המיטוכונדריאלית נראית מופחתת בעכברי mdx בהשוואה ל-WT (איור 2A–D). נצפו מספר גדול יותר של שברי מיטוכונדריה קטנים בעכברי mdx [<100 מיקרון2] (WT, 17.3 ± 3.5%; mdx, 36.3 ± 4.9%; P = 0.01...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיקום המיטוכונדריה במבנים תאיים, כמו גם המורפולוגיה שלהם, קשורים לבריאות המיטוכונדריה ולביקוש מטבולי21. בהינתן הרלוונטיות הקלינית של בריאות המיטוכונדריה, בשילוב עם קינטיקה ומורפולוגיות שונות של סוגי תאים שונים, פותחה שיטה מבוססת מיקרוסקופיה קונפוקלית ליישום בקלות להערכת מורפולוגיות מיטוכונדריאליות ב-tSCs לאחר הערכת השיטה בשריר שלד, המספקת מידע על בריאות המיטוכונדריה כפי שמציין במורפולוגיה, בסוג רקמה שקשה לשמור עליו ב-vivo מבנה על בידוד. בהקשר זה, טעינה מב...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין אינטרסים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מודים לד"ר מריאפן מוטוצ'אמי, מנדל ריימר ופיטר נגיים על סיפקתם בנדיבות את עכברי D2.mdx המשמשים להערכת מיטוכונדריה tSC. עבודה זו נתמכה על ידי מענק מחקר סטודנטים לרפואה ספורטיבית וביצועי אדם של מכון סידני ו-J.L. Huffines וכן על ידי מימון מהפקולטה לחינוך ופיתוח אנושי באוניברסיטת טקסס A&M. A.B.M. נתמכה גם על ידי NIH LRP (NIAMS, 2L40AR077899-02A3).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
3-in-1 Whole Animal SystemAurora Scientific, Ontario, Canada1300AMuscle funciton system with analysis software
AIVIA Leica Microsystems, Bellevue, WA, USA15AI driven image analysis software
anti-laminin MilliporeSigmaL9393-.2mLmyofiber boarder label
B6; D2-Tg(S100-EGFP)1Wjt/J Mouse StrainJackson Labs, Bar Harbor, MEJAX:005621S100β
Cryostar NX50 CryostatEpredia, Kalamazoo, MI, USAhttps://www.epredia.com/products/histology-instruments/cryotomy/cryostar-nx50Cryostat
D2.B10-DMDD2.mdx/J Mouse StrainJackson Labs, Bar Harbor, MEJAX:13141D2.mdx
DBA/2J Mouse StrainJackson Labs, Bar Harbor, MEJAX:00671WT
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)Fisher Scientific; Hampton, NJ, USABP231-100Mitochondrial stain reconstitution reagent
Hoechst 33342Thermo Fisher ScientificH1399Cell-permeant nucleic acid stain
ImageJ/Fiji National Institutes of Health, Bethesda, MD, USASCR_0022852D analysis software
Invitrogen ProLong Gold antifade reagent with DAPI Fisher Scientific, Hampton, NJ, USAP36941Mounting medium
KimWipeKimberly-Clark, Irving, TX, USA06-666ALaboratory wipes
Leica LAS_X software Leica Biosystems, Wetzlar, GermanySCR_013673Confocal software
MitoView Fix 640Biotium70075-50ugFar-red fluorescent mitochondrial stain
NIS-Elements Advanced Research software Nikon, Melville, NY, USASCR_014329Cross sectional area analysis software
Permount Mounting Medium Fisher Scientific, Waltham, MA 02454, USA#SP15-100General mounting media
Prism 9 software GraphPad Software, La Jolla, CA, USARRID: SCR_002798Statistical analysis software
Rhodamine (TRITC)Fisher Scientific; Hampton, NJ, USAAP132RMISecondary antibody
Stellaris 5 White Light Confocal Microscope and corresponding deconvolution softwareLeica Microsystems, Wetzlar, Germany158301313:158201310:158004752:
158301312:158301314:158401100:
158209011:158301130:158204510:
158301120:158401140:158204511:
15500332:15506428:15506517:155
13859:15521522:15525226:155252
32:15525314:15555009:15555017:
15555046:27100022:155933660:
155933666:155933668:158000640
:158002407:158003150:158004141
:158004201:158004421:158004423
:158200681:158202140:158203114:
158203200:158203220:158204201:
158204510:158204709:158301200:
9I_LL_STELLARIS_C:9T-CLSM-APP
_CLASSC:9WE_LAS_405:9WE_
LAS_WLL:9WE_LL_STELLARIS_C		Confocal microscope
SZ61Olympus, Breinigsville, PA, USAsz61Stereo microscope
Tissue-Plus O.C.T. Compound Scigen, Fischer Scientific, Hampton, NJ, USA23-730-571Optimal cutting temperature compound
Visikol ISigma-Aldrich, St. Louis, MO, USAH1-30Tissue clearing solution 1
Visikol IISigma-Aldrich, St. Louis, MO, USAH2-30Tissue clearing solution 2
α-bungarotoxin 552Biotrend, Koln, Germany00014Acetylcholine receptor dye

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Memme, J. M., Slavin, M., Moradi, N., Hood, D. A. Mitochondrial bioenergetics and turnover during chronic muscle disuse. Int J Mol Sci. 22 (10), 5179(2021).
  2. Iqbal, S., Hood, D. A. The role of mitochondrial fusion and fission in skeletal muscle function and dysfunction. Front Biosci. 20 (1), 157-172 (2015).
  3. Hyatt, H. W., Powers, S. K. Mitochondrial dysfunction is a common denominator linking skeletal muscle wasting due to disease, aging, and prolonged inactivity. Antioxidants. 10 (4), 588(2021).
  4. Katti, P., et al. Mitochondrial network configuration influences sarcomere and myosin filament structure in striated muscles. Nat Commun. 13, 6058(2022).
  5. Glancy, B. Visualizing mitochondrial form and function within the cell. Trends Mol Med. 26 (1), 58-70 (2020).
  6. Yan, Z., Okutsu, M., Akhtar, Y. N., Lira, V. A. Regulation of exercise-induced fiber type transformation, mitochondrial biogenesis, and angiogenesis in skeletal muscle. J Appl Physiol. 110 (1), 264-274 (2011).
  7. Powers, S. K., Nelson, W. B., Hudson, M. B. Exercise-induced oxidative stress in humans: Cause and consequences. Free Radic Biol Med. 51 (5), 942-950 (2011).
  8. Hyatt, H., Deminice, R., Yoshihara, T., Powers, S. K. Mitochondrial dysfunction induces muscle atrophy during prolonged inactivity: A review of the causes and effects. Arch Biochem Biophys. 662, 49-60 (2019).
  9. Drake, J. C., Yan, Z. Mitophagy in maintaining skeletal muscle mitochondrial proteostasis and metabolic health with ageing. J Physiol. 595 (20), 6391-6399 (2017).
  10. Chen, X., et al. Mitochondrial dysfunction: Roles in skeletal muscle atrophy. J Transl Med. 21 (1), 503(2023).
  11. Zhang, Z., Sliter, D. A., Bleck, C. K. E., Ding, S. Fis1 deficiencies differentially affect mitochondrial quality in skeletal muscle. Mitochondrion. 49, 217-226 (2019).
  12. Silva, K. A. S., et al. Angiotensin II suppresses autophagy and disrupts ultrastructural morphology and function of mitochondria in mouse skeletal muscle. J Appl Physiol. 126 (6), 1550-1562 (2019).
  13. Cattin, A. L., et al. Macrophage-induced blood vessels guide Schwann cell-mediated regeneration of peripheral nerves. Cell. 162 (5), 1127-1139 (2015).
  14. Caillaud, M., Richard, L., Vallat, J. M., Desmoulière, A., Billet, F. Peripheral nerve regeneration and intraneural revascularization. Neural Regen Res. 14 (1), 24-33 (2019).
  15. Girouard, M. P., Bueno, M., Julian, V., Drake, S., Byrne, A. B., Fournier, A. E. The molecular interplay between axon degeneration and regeneration. Dev Neurobiol. 78 (10), 978-990 (2018).
  16. Belanger, K., Dinis, T. M., Taourirt, S., Vidal, G., Kaplan, D. L., Egles, C. Recent strategies in tissue engineering for guided peripheral nerve regeneration. Macromol Biosci. 16 (4), 472-481 (2016).
  17. Waller, A. Experiments on the section of the glossopharyngeal and hypoglossal nerves of the frog, and observations of the alterations produced thereby in the structure of their primitive fibers. Philos Trans R Soc Lond. 140, 423-429 (1850).
  18. Napoli, I., et al. A central role for the ERK-signaling pathway in controlling Schwann cell plasticity and peripheral nerve regeneration in vivo. Neuron. 73 (4), 729-742 (2012).
  19. Jessen, K. R., Mirsky, R. The repair Schwann cell and its function in regenerating nerves. J Physiol. 594 (13), 3521-3531 (2016).
  20. Hastings, R. L., Mikesh, M., Lee, Y. I., Thompson, W. J. Morphological remodeling during recovery of the neuromuscular junction from terminal Schwann cell ablation in adult mice. Sci Rep. 10 (1), 11132(2020).
  21. Glancy, B., Kim, Y., Katti, P., Willingham, T. B. The functional impact of mitochondrial structure across subcellular scales. Front Physiol. 11, 541040(2020).
  22. Stahon, K. E., Bastian, C., Griffith, S., Kidd, G. J., Brunet, S., Baltan, S. Age-related changes in axonal and mitochondrial ultrastructure and function in white matter. J Neurosci. 36 (39), 9990-10001 (2016).
  23. Suh, J., et al. Mitochondrial fragmentation and donut formation enhance mitochondrial secretion to promote osteogenesis. Cell Metab. 35 (2), 345-360.e7 (2023).
  24. Laker, R. C., et al. A novel MitoTimer reporter gene for mitochondrial content, structure, stress, and damage in vivo. J Biol Chem. 289 (17), 12005-12015 (2014).
  25. Fernando, C. A., Pangan, A. M., Cornelison, D., Segal, S. S. Recovery of blood flow regulation in microvascular resistance networks during regeneration of mouse gluteus maximus muscle. J Physiol. 597 (5), 1401-1417 (2019).
  26. Hammers, D. W., et al. The D2.mdx mouse as a preclinical model of the skeletal muscle pathology associated with Duchenne muscular dystrophy. Sci Rep. 10 (1), 14070(2020).
  27. Willingham, T. B., Ajayi, P. T., Glancy, B. Subcellular specialization of mitochondrial form and function in skeletal muscle cells. Front Cell Dev Biol. 9, 757305(2021).
  28. Ramos, S. V., Hughes, M. C., Delfinis, L. J., Bellissimo, C. A., Perry, C. G. R. Mitochondrial bioenergetic dysfunction in the D2.mdx model of Duchenne muscular dystrophy is associated with microtubule disorganization in skeletal muscle. PLoS One. 15 (10), e0237138(2020).
  29. Rosen, H. G., et al. Inhibition of mitochondrial fission protein Drp1 ameliorates myopathy in the D2-mdx model of Duchenne muscular dystrophy. bioRxiv. , (2024).
  30. National Research Council. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , 8th ed, National Academies Press. Washington, DC. (2011).
  31. Ino, D., Iino, M. Schwann cell mitochondria as key regulators in the development and maintenance of peripheral nerve axons. Cell Mol Life Sci. 74 (5), 827-835 (2017).
  32. Pareyson, D., Piscosquito, G., Moroni, I., Salsano, E., Zeviani, M. Peripheral neuropathy in mitochondrial disorders. Lancet Neurol. 12 (10), 1011-1024 (2013).
  33. Schröder, J. M., Sommer, C. Mitochondrial abnormalities in human sural nerves: Fine structural evaluation of cases with mitochondrial myopathy, hereditary and non-hereditary neuropathies, and review of the literature. Acta Neuropathol. 82 (6), 471-482 (1991).
  34. Schröder, J. M. Neuropathy associated with mitochondrial disorders. Brain Pathol. 3 (2), 177-190 (1993).
  35. Santosa, K. B., Keane, A. M., Jablonka-Shariff, A., Vannucci, B., Snyder-Warwick, A. K. Clinical relevance of terminal Schwann cells: An overlooked component of the neuromuscular junction. J Neurosci Res. 96 (7), 1125-1135 (2018).
  36. Morton, A. B., et al. Inducible deletion of endothelial cell Efnb2 delays capillary regeneration and attenuates myofibre reinnervation following myotoxin injury in mice. J Physiol. 602 (19), 4907-4927 (2024).
  37. Morton, A. B., Norton, C. E., Jacobsen, N. L., Fernando, C. A., Cornelison, D. D. W., Segal, S. S. Barium chloride injures myofibers through calcium-induced proteolysis with fragmentation of motor nerves and microvessels. Skelet Muscle. 9 (1), 27(2019).
  38. Sukhorukov, V. M., Dikov, D., Reichert, A. S., Meyer-Hermann, M. Emergence of the mitochondrial reticulum from fission and fusion dynamics. PLoS Comput Biol. 8 (10), e1002745(2012).
  39. Ferramosca, A., Zara, V. Mitochondrial carriers and substrate transport network: A lesson from Saccharomyces cerevisiae. Int J Mol Sci. 22 (16), (2021).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Mitochondrial MorphologyIn Situ QuantificationSkeletal MuscleTerminal Schwann CellsConfocal MicroscopyMitochondrial NetworkMembrane Potential DyeMitochondrial FragmentationNeuromuscular JunctionS100 Reporter Mice

מאמרים קשורים