מאמר שיטה

בידוד פריציטים מרקמת קורטיקת העכבר באמצעות FACS לצורך ריצוף תא יחיד

DOI:

10.3791/69749

⸱

30 בינואר 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Microcirculation, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, 2International Center of Microvascular Medicine, Chinese Academy of Medical Sciences, 3College of Acupuncture-Moxibustion and Tuina, Beijing University of Chinese Medicine

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדי להשיג פריציטים קורטיקליים במוח העכבר העומדים בדרישות scRNA-seq, אנו מציגים פרוטוקול FACS מותאם באופן קריטי המבוסס על בחירת CD13⁺/CD31⁻. השיפורים המרכזיים שלנו משפרים משמעותית את חיוניות התא ואת שלמות ה-RNA, ומאפשרים פרופיל טרנסקריפטומי אמין.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פריציטים, כרכיב מרכזי ביחידת הנוירווסקולרי, ממלאים תפקיד חיוני בשמירה על שלמות מחסום הדם-מוח ובוויסות הומאוסטזיס המודינמי המוחי באמצעות ויסות טון מיקרווסקולרי. תפקוד לקוי של פריציטים נחשב למגוון הפרעות נוירולוגיות. כדי לחקור את ההטרוגניות של פריציטים ולהבהיר את המנגנונים שלהם במחלות נוירו-וסקולריות ברזולוציה של תא יחיד, הקמנו פרוטוקול אופטימלי וניתן לשחזור לבידוד פריציטים במוח העכברים המתאימים לריצוף RNA חד-תאי (scRNA-seq). שיטה זו בונה על אסטרטגיית המיון של CD13+/CD31 שנקבעו, אך משלבת שיפורים מרכזיים המותאמים במיוחד ליישומי scRNA-seq. בקצרה, מוחות נאספו משלושה עכברים בוגרים מסוג C57BL/6. רקמות המוח עברו פירוק מכני ועברו עיכול אנזימטי כדי לקבל תלויות חד-תאיות. לאחר צנטריפוגציה רציפה, הכדור האחרון של התא הושעה מחדש בתמיסת אלבומין סרום בקר (BSA) של 20%, שלב מכריע שהכנסנו למזעור לחץ והצטברות, ובכך למקסם את החיוניות ואיכות ה-RNA לריצוף. גישה אופטימלית זו המבוססת על FACS מאפשרת בידוד חזק של פריציטים במוח העכבר העמידים בדרישות המחמירות של scRNA-seq, ומציעה כלי עוצמתי לניתוח הטרוגניות של פריציטים ותפקידיהם הפתולוגיים במחלות נוירו-וסקולריות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פריציטים הם סוג חשוב של תא הממוקם לאורך כלי דם, בדרך כלל מוטמעים בתוך ממברנת הבסיס הקפילרי ומקיפים את תאי האנדותל1. במוח, פריציטים, יחד עם תאי אנדותל, אסטרוציטים וסוגי תאים נוספים, יוצרים את היחידה הנוירווסקולרית והם חלק בלתי נפרד ממבנה ותפקוד מחסום הדם-מוח (BBB). הפריציטים ממלאים תפקידים חיוניים בוויסות זרימת הדם המוחית, בשיקום כלי הדם ובתחזוקת ההומאוסטזיס הווסקולרי. הם שומרים על שלמות ה-BBB באמצעות אינטראקציות פיזיות קרובות ואיתות פרקריני עם תאים סמוכים2; מווסת באופן דינמי את ההובלה הטרנסאנדותליאלית באמצעות אנדוציטוזה וביטוי חלבוני נשא ספציפיים; ותורמים ליציבות המודינמית מוחית באמצעות פעילויות כיווץ ומרפה3. תפקוד לקוי של פריציטים, כמו גם שינויים בכיסוי או בצפיפות שלהם, עלולים להוביל להפרעות וסקולריות ולחסרים נוירולוגיים, ובסופו של דבר להוביל לשינויים פתולוגיים הקשורים להפרעות נוירולוגיותשונות. עם זאת, ההטרוגניות הטבועה בפריציטים מציבה אתגרים משמעותיים למחקרים מכניים נוספים.

עם התקדמות טכנולוגיית ריצוף RNA חד-תאי (scRNA-seq), מספר הולך וגדל של מחקרים השתמשו ב-scRNA-seq כדי לחקור הטרוגניות תאית ולזהות מטרות מרכזיות בפתוגנזה ובהתקדמות המחלות. סמנים נפוצים של פריציטים כוללים קולטני גדילה בטא (PDGFR-β)5, אנטיגן נוירון-גליאלי 2 (NG2), ואקטין אלפא-חלק-שריר (α-SMA). עם זאת, לסימנים אלו יש ספציפיות נמוכהיחסית 6, שכן הם יכולים לתייג בו זמנית תאים וסקולריים אחרים, כמו תאי שריר חלק, ותאי קדם עצביים כמו תאי אב אוליגודנדרוציטים, מה שמקשה להבחין בין פריציטים לתאי מוח אחרים. בחיפוש אחר חלופה חזקה יותר, פנינו ל-CD13 (Aminopeptidase N, APN), סמן המוכר בביטוי החזק והעקבי שלו בפריציטים מוחיים במחקרים קודמים 7,8,9,10. במחקר שלנו ביצענו צביעת אימונופלואורסצנציה על חלקי רקמת המוח, והתוצאות אישרו את ביטוי CD13 בפריציטים, מה שהדגים את יעילותו בהבחנה בין פריציטים לתאי אנדותל, שכן אות CD13 היה קשור אך ורק לתאי פריוסקולר וחסר בתאי אנדותל CD31⁺. (איור 1A). עם זאת, חשוב לציין שביטוי CD13 אינו בלעדי לחלוטין לפריציטים; רמות ניתנות לזיהוי נצפות גם בתאי שריר חלק של עורקים וורידיים (איור 1B,C).

figure-introduction-1
איור 1: צביעת אימונופלואורסצנציה מראה ביטוי CD13 בפריציטים וסקולריים של המוח ובתאי שריר חלק, ללא אות שניתן לזהות בתאי האנדותל. (א) הדמיית אימונופלואורסצנציה מייצגת של אזור המעבר בין עורקים לנימי דם במיקרווסקולטורה של המוח. התמונה המאוחדת מראה את הפריציט הירוק של CD13⁺ המכיל את תאי האנדותל של CD31⁺ (אדום). תאי השריר החלק α-SMA+ (ציאן) ממוקמים באזור העורקי ואינם מופיעים בנימים. (ב) חתך רוחב של עורק. התמונות מראות קולוקליזציה ברורה של תאי השריר החלק CD13⁺ (ירוק) ותאי השריר החלק של α-SMA+ (ציאן) בשכבת השריר החלק הסובבת, מה שמאשר את ביטוי CD13 בתאי שריר חלק עורקיים. (ג) חתך רוחב של וריד. באופן דומה, CD13 (ירוק) ניתן לזיהוי בתאי השריר החלק α-SMA (ראשי החץ) של דופן הווריד. פס סולם: 20 מיקרון (A-C). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

כדי להשיג פריציטים וסקולריים בקורטקס העכבר העומדים בדרישות scRNA-seq, ביצענו מיון תאים מופעלים בפלואורסצנציה (FACS) באמצעות תיוג נוגדנים CD13⁺/CD31⁻ לבידוד פריציטים11. בתחילה, סמני CD45 ו-CD41 שימשו להוצאת תאים המטופואטיים מתספי רקמת המוח12. בהמשך, פריציטים הועשרו על ידי בחירה לתאי CD13+ , ותאי אנדותל הוצאו עוד יותר על ידי גייטינג לאוכלוסיות CD31, ובכך בודדו את אוכלוסיית הפרציטים היעד13.

אנו מכירים בכך ששלב הבחירה החיובי ל-CD13 לוכד במקביל תאי שריר חלק המבטאים את CD13 הן מהעורקים והן מהוורידים. כדי לעמוד בדרישות הקריטיות ל-scRNA-seq ולמקסם את שמירת הפרציטים, בחרנו אסטרטגית בשילוב הסמן הזה כדי לתת עדיפות לתפוקת הפרציטים בשלב המיון. למרות שגישה זו מובילה לבידוד משותף של אוכלוסייה קטנה של תאי שריר חלק, היא למעשה ממקסמת את ההתאוששות של כל הפרציטים הפוטנציאליים במהלך שלב ההעשרה הראשוני. אסטרטגיית השער המדורגת הזו ממזערת משמעותית את אובדן התאים ההתחלתי. בנוסף, כדי למקסם את החיוניות והתפוקה של הפריציטים, השתמשנו גם בפתרון BSA של 20% להשליה מחדש וסינון של תאים לאחר דיסוציאציה, תוך הסרת פסולת יעילה תוך שמירה על חיוניות וטוהר התאים הממוינים14.

באמצעות שיטה זו, הצלחנו להבחין בין פריציטים וסקולריים במוח לסוגי תאים אחרים, והשגנו הכנות פריציטים בעלות טוהר וחיוניות גבוהות העומדות בדרישות המחמירות של scRNA-seq. טכניקה זו מספקת בסיס איתן לחקירות מעמיקות נוספות על תפקידי פריציטים בהקשרים שונים של מחלה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במחקר זה השתמשנו בשלושה עכברים בוגרים מסוג C57BL/6J (בני 3 חודשים, 20-25 גרם). כל העכברים הוחזקו במחזור אור/חושך של 12 שעות עם טמפרטורה ולחות מבוקרות בקפדנות, עם גישה חופשית למזון ומים לפני הניסויים. כל ההליכים הניסיוניים שכללו בעלי חיים במעבדה אושרו על ידי ועדת הטיפול והאתיקה של בעלי חיים במעבדה של מכון המיקרוסירקולציה, האקדמיה הסינית למדעי הרפואה והמכללה הרפואית של איחוד פקין, ובוצעו בהתאם בקפדנות להנחיות רווחת בעלי החיים הרלוונטיות.

1. הכנת מגיב

  1. 30% (משקל/נפח) תמיסת גלוקוז: המיס 15 גרם גלוקוז ב-50 מ"ל של UltraPure DNase/RNase ללא dH2O. כדי להבטיח המסה מלאה, מוסיפים תחילה גלוקוז ל-20 מ"ל של UltraPure DNase/RNase ללא dH2O ומערבבים היטב. לאחר מכן הוסף dH2O ללא UltraPure DNase/RNase לנפח סופי של 50 מ"ל. סנן את התמיסה ואחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד 6 חודשים.
  2. DNase I (10 mg/mL): המיס 50 מ"ג DNase I ב-5 מ"ל של ddH2Oסטרילי. תמיסת המלאי יכולה להיאחסן בטמפרטורה של מינוס 20°C למשך עד חודשיים.
    הערה: יש להימנע בקפדנות ממחזורי הקפאה-הפשרה חוזרים כדי למנוע אובדן פעילות אנזימטית. כדי למזער השפעות הקפאה והפשרה, יש לפרק 150 מיקרוליטר מהתמיסה לצינורות מיקרוצנטריפוגות סטריליים לפני ההקפאה הראשונית, ולהפשיר אליקווטים בודדים לפי הצורך לניסויים.
  3. 2% (נפח/נפח) סרום בקר עוברי (FBS) במי מלח מפוזר-זרחן (PBS): הכינו 1× PBS על ידי ערבוב 5 מ"ל של 10× PBS עם 45 מ"ל של UltraPure DNase/RNase dH2O. הוסיפו 1 מ"ל FBS ל-49 מ"ל של 1× PBS וערבבו היטב.
    הערה: הכינו את הפתרון הזה מחדש במהלך שלב 2.1.2. הקצה 15 מ"ל לכל דגימת רקמה.
  4. תמיסת אנזימי קולגנאז ודיספאז (CD): ממיסים 100 מ"ג דיספאז ו-100 מ"ג קולגנאז בנפרד ב-1 מ"ל של UltraPure DNase/RNase-free-dH2O כל אחד. לשלב תמיסות כדי לקבל נפח סופי של 2 מ"ל (ריכוז אנזימים של 100 מ"ג/מ"ל).
    הערה: עלייקוט 500 מיקרוליטר לתוך צינורות מיקרוצנטריפוגות סטריליים ואחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס. מערבולת לפני השימוש כדי למנוע אובדן פעילות במחזורי הקפאה-הפשרה. חשוב לציין שצורת האבקה עלולה לגרום לגירוי חמור בעור/בעיניים ולבעיות נשימה. תמיד תטפל בזה עם קפוצ'ון אדים כימי תוך כדי שימוש בכפפות ניטריל ומסכת N95. במקרה של חשיפה, יש להשקות מיד את האזור הפגוע במים רבים ולפנות לטיפול רפואי.
  5. תמיסת אנזימי CD: מערבבים 1.5 מ"ל תמיסת אנזימי CD עם 43.5 מ"ל של 2% (נפח/נפח) FBS ב-PBS (מהשלב 1.3) באמצעות היפוך עדין.
    הערה: הכן מיד לפני ניתוק הרקמות (שלב 2.3.4). נפח זה מותאם לשלושה עכברים; התאם באופן פרופורציונלי לפי הצורך.
  6. תמיסת פרקול 22% (נפח/נפח): שילוב של 11 מ"ל פרקול, 5 מ"ל של 10× PBS, ו-34 מ"ל של UltraPure DNase/RNase ללא dH2O להכנת תמיסה של 50 מ"ל.
    הערה: מסנן-סטריליזציה דרך ממברנת PES של 0.22 מיקרון. ניתן לאחסן אותו בטמפרטורה של 4°C למשך חודש ללא אובדן משמעותי של יציבות.
  7. בופר דיסוציאציה מכני: מוסיפים 1 מ"ל DNase I (10 מ"ג/מ"ל) ל-10 מ"ל של 2% (נפח/נפח) FBS ב-PBS (משלב 1.3). ערבב על ידי פיפטינג.
  8. פתרונות BSA: הכינו פתרונות BSA של 1%, 20% ו-35% (משקל/נפח) בנפרד כדלקמן:
    1. 1% (משקל/נפח) BSA: המיס 0.15 גרם של BSA ב-15 מ"ל של מלח פוספט (DPBS) של Dulbecco.
    2. 20% (משקל/נפח) BSA: המיס 3 גרם של BSA ב-15 מ"ל DPBS.
    3. 35% (משקל/נפח) BSA: המיס 0.7 גרם BSA ב-2 מ"ל DPBS.
      הערה: סנן את כל התמיסות דרך ממברנת PES של 0.22 מיקרון לפני השימוש.
  9. תמיסת מלח מאוזנת של הנקס (HBSS)/BSA/בופר גלוקוז: הוסף 167 מיקרוליטר של 30% גלוקוז (משקל/נפח) (משלב 1.1) ו-1.4 מ"ל של 35% (משקל/נפח) BSA (משלב 1.8) ל-50 מ"ל של HBSS, מערבבים בעדינות.
    הערה: הכינו את התמיסה הזו טרייה בתנאים סטריליים במהלך שלב 2.1.2. אחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
  10. בופר איסוף רקמות: תוספת של 12 מ"ל של HBSS/BSA/בופר גלוקוז (משלב 1.9) עם 800 מיקרוליטר DNase I (10 מ"ג/מ"ל). לשימוש לאחסון זמני של רקמות ולשטיפת פיפטות.
    הערה: הכינו את התמיסה הזו טרייה בתנאים סטריליים במהלך שלב 2.1.2.
  11. תמיסת טריברומואתנול של 1.25% (ללא כיוון): ממיס 1.25 גרם של 2,2,2-טריברומואתנול ב-2.5 מ"ל של 2-מתיל-2-בוטנול, ואז מוסיפים תערובת זו ל-97.5 מ"ל של ddH2O סטרילי או תמיסת מלח פיזיולוגית לקבלת תמיסה שקופה של 1.25% טריברומואתנול.
    הערה: הכינו את התמיסה טרייה לפני כל שימוש. אחסן אותו מוגן מאור בטמפרטורת החדר והשתמש בו במהירות.

2. הליך ניסויי (באמצעות שלושה עכברים כדוגמה)

  1. הכנה לפני הניסוי (תזמון: 30 דקות)
    1. האוטוקלאב דרש חומרים מתכלים וחיטוי כלי ניתוח עם 75% (נפח/נפח) של אתנול.
    2. הכינו פתרונות עובדים: 1× PBS (מהשלב 1.3), 2% (נפח/נפח) FBS ב-PBS (מהשלב 1.3), תמיסת HBSS/BSA/גלוקוז (מהשלב 1.9), ובופ איסוף רקמות (משלב 1.10).
    3. שפוך 10 מ"ל של 1× PBS לתוך צלחת תאים בגודל 10 ס"מ ושמור על הקרח.
    4. הכינו שלוש אמפולות, הוסיפו 3 מ"ל של בופר לאיסוף רקמות לכל אחת, ושמרו אותן על קרח.
    5. הכינו שלושה צינורות צנטריפוגה בנפח 15 מ"ל, הוסיפו 10 מ"ל FBS של 2% (נפח/נפח) ב-PBS לכל אחד, ושמור אותם על הקרח.
  2. איסוף מוח עכבר (תזמון: 30 דקות)
    1. העכברים עברו הרדמה עמוקה בהזרקה תוך-פריטוניאלית של טריברומואתנול (משלב 1.11) במינון של 0.2 מ"ל ל-10 גרם משקל גוף. לאחר אובדן רפלקסי הפדלים, בוצעה המתת חסד באמצעות פריקת צוואר הרחם.
      הערה: אם העכבר לא הגיע למישור ניתוחי של הרדמה (שהוערך בהיעדר רפלקס גמילה של הדוושה) בתוך 5-10 דקות לאחר ההזרקה, ניתן מינון תוך-פריטוניאלי נוסף של טריברומואתנול, השווה לשליש מהמנה הראשונית.
    2. רסס את אזור הראש/צוואר ב-75% אתנול. בצע חתך קו אמצע בקרקפת מהאזור האוקסיפיטלי לאזור המצחי כדי לחשוף את הגולגולת. מבצעים חתך רוחבי קדמי למסלולים הדו-צדדיים, ואחריו חתכים צדדיים לאורך השוליים התחתונים של המוחון כדי לנתק את בסיס הגולגולת. לבסוף, חתך את הקלווריום לאורך התפר הסגיטלי מהאחורי לקדמי. הרם את הפתח הגולגולתי כדי לחשוף את המוח הסגור בדורה. הרם בעדינות את המוח תוך ניתוק עצבי הראייה וחיבור המדולה האובלונגטה-חוט השדרה באמצעות מספריים כירורגיים15. הנח את המוח השלם בצלחת בגודל 10 ס"מ המכילה 10 מ"ל של 1× PBS קר.
      הערה: לטפל ברקמה בעדינות כדי למנוע נזק.
    3. להעביר את המוח לנייר אלומיניום. באמצעות מלקחיים, הרם את הדורה מטר מהשוליים וחתוך אותו לאורך קו האמצע. לאחר הסרת הדורה המלאה, חשפו את מרחב התת-עכביש. שטוף את החלל התת-עכבישי עם תמיסת HBSS, ואז נתח כלי דם עם מחט קהה והסר בזהירות את הפיאה מטר16. חתוך את המוח לפרוסות בעובי 2-3 מ"מ באמצעות להב גילוח. השליכו את הבורה הריחנית ואת החלקים הזנביים ביותר. לבודד את הקורטקס המוחי לאורך הקורפוס קלוסום ולהעביר את רקמת הקורטקס לאמפולות המכילות 3 מ"ל של בופר איסוף רקמות קרח11.
    4. בידוד פריציטים בפרוטוקול זה מכוון במיוחד לקורטקס המוח. לאזורים נוספים שמעניינים: מקם חתכי קורונל במגלשה עם שתי בארות עם טיפה אחת של 2% (נפח/נפח) FBS ב-PBS. לזהות אזורים יעדיים תחת מיקרוסקופיית חיתוך, לבודד ידנית, ולהמשיך בשלבי עיבוד זהים לאחר מכן.
  3. דיסוציאציה של רקמות (תזמון: 3-3.5 שעות)
    1. טחון רקמות באמפולות באמצעות סכינים כירורגיים לשברים בגודל של כ-1 מ"מ × 1 מ"מ.
      הערה: קיצוץ מלא תוך 5 דקות כדי לשמור על טריות הרקמה.
    2. שטוף מראש את קצות הפיפטה עם בופר איסוף רקמות. שואף לאט שברים חרוכים לכיוון קצה הקצה תוך שמירה על כיוון אנכי (קצה כלפי מטה). הוצא בעדינות שברים לצינורות צנטריפוגה מקוררים מראש בנפח 15 מ"ל (הוכן בשלב 2.1.5).
      הערה: הימנעו משאיפת שברים אל הקנה העליון כדי למנוע היצמדות לדופן הפיפטה.
    3. שטוף אמפולות המכילות שברי שברים (משלב 2.3.1) עם 2% FBS (נפח/נפח) ב-PBS והעבר את השטיפה לצינורות צנטריפוגה. צנטריפוגה ב-300 x g ב-4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
    4. להשליך סופרנטנטים לאחר הצנטריפוגה. החזירו את הכדורים ל-3 מ"ל של תמיסת CD אנזימי עבודה (משלב 1.5) לכל צינור. מפרקים כל מתלה באופן שווה לשלושה צינורות (סה"כ 9 צינורות, 1 מ"ל לצינור), ואז מוסיפים 4 מ"ל תמיסת אנזימי CD (נפח סופי: 5 מ"ל/צינור).
    5. דגרו צינורות בתנור היברידיזציה של 37°C למשך 100 דקות עם ניעור אורביטלי ב-100 x g14.
    6. הכינו תמיסת פירוק רקמות במהלך הדגירה על ידי הוספת 1 מ"ל תמיסת DNase I ל-10 מ"ל של 2% (נפח/נפח) FBS ב-PBS (משלב 1.10).
    7. סיימו את העיכול בצנטריפוגה ב-300 x גרם בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
      הערה: הערכו את יעילות העיכול מיקרוסקופית באמצעות אליקוט של 10-20 מיקרוליטר. נקודת הסיום האידיאלית מתבטאת כקטעי כלי דם דמויי חרוזים; מקטעים וסקולריים מוארכים מעידים על תת-עיכול, בעוד שתאים בודדים דומיננטיים מצביעים על עיכול יתר.
    8. החזירו את הכדורים ל-1 מ"ל של תמיסת פירוק רקמות לכל צינור. תתנתק מכנית על ידי פיפטינג 100 פעמים11.
      הערה: הימנעו משאיפת נפח פיפטות מלא כדי למזער את היווצרות בועות ולשמור על חיוניות התא.
    9. אסוף את כל התליות (מתוך 9 צינורות עיכול המייצגים את רקמות המוח של 3 עכברים) לצינור צנטריפוגה בנפח 50 מ"ל. שטוף כל צינור עיכול ב-2 מ"ל של 2% FBS (נפח/נפח) ב-PBS ושלב שטיפות. צנטריפוגה ב-300 x g ב-4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
    10. לאחר הצנטריפוגה, נראות שכבות מובחנות. יש להשליך בזהירות את השכבה העליונה (המכילה זיהומים ופסולת תאית קטנה), תוך שמירה על השכבה הבינונית (המורכבת מתאים או אשכולות תאים בצפיפות נמוכה יותר) והשכבה התחתונה (תאים שלמים ושברי רקמה חלקית לא מעוכלים). הוסיפו 12.5 מ"ל של תמיסת BSA של 20% והפכו בעדינות את הצינור כדי להחזיר את הכדורים. צנטריפוגה שוב ב-1000 × גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
    11. אסוף את הכדור התחתון (מועשר בתאים שלמים עם טוהר גבוה יותר) והעבר את הסופרנטנט (המכיל בעיקר שאריות מיאלין, שומנים ומספר קטן של תאים) לצינור צנטריפוגה חדש בנפח 50 מ"ל. השעתי מחדש באמצעות היפוך עדין וצנטריפוגה חוזרת על 1,000 x g בטמפרטורה של 4°C למשך 20 דקות.
    12. החזירו כל כדור שהושג משני שלבי הצנטריפוגציה (שלב 2.3.10 ושלב 2.3.11) ב-2 מ"ל של 2% (נפח/נפח) FBS ב-PBS כל (נפח משולב סופי: 4 מ"ל).
      הערה: הימנעו מלגעת בדפנות הצינור במהלך ההשעיה מחדש כדי למזער זיהום מהפסולת.
    13. משלבים את שני המתלים המוחלפים מהשלב הקודם לצינור צנטריפוגה בנפח 15 מ"ל. צנטריפוגה ב-300 × גרם, 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. להשליך את הסופרנטנט (בופר פסולת המכיל BSA, שאריות תאים, וכמויות זעירות של שרירי ליפידים של מיאלין). החזירו את הכדור (תאי המטרה השלמים האחרונים המטוהרים והשטופים) ב-2 מ"ל תמיסת PBS המכילה 2% FBS.
      הערה: שלב זה הוא להעביר את התאים למאגר תלייה נקי ומתאים ליישומים במורד הזרם.
    14. הכן ארבעה צינורות צנטריפוגה בנפח 15 מ"ל, כל אחד מכיל 4 מ"ל של תמיסת פרקול 22%. שכב בעדינות 0.5 מ"ל אליקווטים של ההתלייה מחדש על גרדיאנט פרקול (ארבעה אליקווטים בסך הכל) כדי למקסם את תפוקת התא. צנטריפוגה ב-560 x g בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
      הערה: כוון את הצנטריפוגה ל"ללא בלמים" כדי למנוע הפרעה של גרדיאנט הצפיפות שנגרם על ידי מערבולת, ולהבטיח שפסולת המיאלין תישאר יציבה בסופרנטנט.
    15. שאפו בזהירות סופרנטנטים. החזירו את הכדורים ב-1 מ"ל של HBSS/BSA/בופר גלוקוז לכל צינור. מתלים בבריכה לצינור חדש בנפח 15 מ"ל. שטוף שפופרות פרקול עם 2 מ"ל של HBSS/BSA/בופר גלוקוז ושטיפת קומביין. צנטריפוגה ב-300 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות).
  4. הכנה ורכישה למיון ציטומטריית זרימה (תזמון: 50 דקות)
    1. שאפו בזהירות את הסופרנטנט. החזירו את כדור התא ל-1 מ"ל של HBSS/BSA/בופר גלוקוז.
    2. הוסיפו 5 מיקרוליטר של תגובת חוסם קולטני Fc (FcR) לתליית התא ודגרו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
    3. הוסיפו את הנוגדנים המצומדים פלואורסצנטית למתלה התא בנפחים המצוינים (מספיקים לרקמה שמקורה ב-3 עכברים): 5 מיקרוליטר CD45-PE; 5 מיקרוליטר של CD41-PE; 20 מיקרוליטר של CD31-APC; 15 מיקרוליטר של CD13-FITC.
    4. דגרו את התאים על קרח למשך 20 דקות בחושך.
      הערה: להגן מפני אור. הימנע מערבוב.
    5. הוסף 6 מ"ל של HBSS/BSA/בופר גלוקוז כדי לשטוף את התאים. צנטריפוגה ב-300 x g ב-4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
    6. שאפו את הסופרנטנט. החזירו את כדור התא ל-1 מ"ל של HBSS/BSA/בופר גלוקוז. הוסיפו 200 מיקרוליטר של תמיסת 7-אמינואקטינומיצין D (7-AAD) (כדי להוציא תאים מתים) ודגרו על קרח למשך 10 דקות. לאחר מכן, כוון את הנפח ל-2 מ"ל עם HBSS/BSA/בופר גלוקוז.
      הערה: להגן מפני אור.
    7. הוסיפו 1% תמיסת BSA למיון צינורות האיסוף (צינורות חרוטיים של 15 מ"ל), סובבו בעדינות כדי לשטוף את המשטחים הפנימיים. שואף תמיסה עודפת, ומשאיר בדיוק 1 מ"ל של תמיסת BSA 1% בכל צינור לקבלת תאים ממוינים. אחסון זמני על הקרח.
    8. תליית תא מסנן דרך מסננת של 40 מיקרון מיד לפני המיון.
    9. הקמת שער התחלתי המבוסס על פרמטרים של פיזור קדמי (FSC-A) ופיזור צד (SSC-A) כדי למנוע פסולת תאית המציגה אותות FSC-A/SSC-A נמוכים.
    10. דלדול תאי שושלת המטופואטית הושגה באמצעות שער כפול שלילי ל-CD45 ו-CD41, ובכך ביטל למעשה זיהום מלוקוציטים, תאי חיסון וטסיות.
    11. לכידת פריציטים משוערים באמצעות בחירה חיובית ל-CD13 מתאי דופן כלי דם.
    12. הערכת שלמות הממברנה באמצעות בדיקת פלואורסצנטיות 7-AAD; החריג תאים אפופטוטיים באמצעות גייטינג 7-AAD⁻.
      הערה: אספו פריציטים CD31⁻/CD13⁺ בטוהר גבוה באמצעות סלקציה שלילית CD31. אסוף את הפריציטים הממוינים ישירות לצינורות המכילים 1% BSA (מהשלב 2.4.7) והניח אותם על קרח. הכינו מיד מתלים חד-תאיים לספירה. אחר כך טען את הדגימות ישירות לריצוף בלי שלבי תרבית ביניים.
  5. סקייליון וניתוח scRNA (מחזור: 3-4 ימים)
    1. הוכנו השעיות חד-תאיות של פריציטים ממוינים בהתאם לפרוטוקול ממדריך המשתמש של 10x Genomics "GEM-X Universal 3' Gene Expression v4 4-plex Regain Kits (CG000731)17,18. המתלה התא שהוכן לטעינה היה בעל כדאיות של >-90% והוא מדולל לריכוז המומלץ של 300-2000 תאים/מיקרוליטר.
    2. משלבים תלייה חד-תאית עם חרוזי ג'ל ואנזימים מקודדים, ואז מתחלקים ל-Gel Beads-in-Emmulsion (GEMs) באמצעות עטיפת טיפות מיקרופלואידית19. לבצע ניתוק תאים במקום , שעתוק הפוך וקישור ברקוד-cDNA.
    3. שבור GEMs כדי לשחזר מוצרים. הגברה של cDNA באמצעות PCR באמצעות הפרוטוקול הבא: דנאטורציה ראשונית ב-9 מעלות צלזיוס למשך 4 שניות; לאחר מכן מחזורים (13 מחזורים ל-<500 תאי מטרה, 12 מחזורים ל-501-6000 תאי מטרה) הכולל דנאטורציה ב-9 מעלות צלזיוס למשך 2 שניות, אנילה ב-9 מעלות צלזיוס למשך 3 שניות, והארכה ב-7 מעלות צלזיוס למשך 6 שניות למחזור; והארכה אחרונה ב-72 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת ואחריה עצירה ב-4 מעלות צלזיוס. אימות התוצרים המוגברים מבחינת גודל המקטעים (200-300 bp) ותפוקה.
      הערה: ניתן לאחסן את מוצרי ההגברה בטמפרטורה של 4°C עד 72 שעות או ב-2- מעלות צלזיוס למשך שבוע, או לעיבוד ישיר בשלב הבא.
    4. ל-cDNA מוסמך: פרגמנט, לבצע תיקון קצה, ליגציה של מתאם P7, והגברה עם פריימרים אינדקס. בחר פרגמנטים בגודל לבניית ספריות רצף.
    5. ספריות רצף בפלטפורמת Illumina NovaSeq לאחר אימות בקרת איכות.
    6. נתוני ריצוף דה-מולטיפלקס לחילוץ ברקודים של תאים, מזהה מולקולרי ייחודי (UMIs) ורצפי RNA. Align קורא לגנום ההתייחסות.
    7. כימות ספירות UMI, הערכת מספרי תאים תקפים, ויצירת מטריצת ביטוי גנים-ברקוד20.
    8. הסר דאבלטים באמצעות חבילת DoubletFinder (v2.0.6) ב-R. חזה על בסיס זיהוי מלאכותי של שכן קרוב כדי להבטיח איכות נתונים.
    9. לבצע ניתוח רכיבים עיקריים (PCA) והפחתת ממד של קירוב והיטל אחיד (UMAP) באמצעות Seurat (גרסה 5.0). לזהות אשכולות תאים ולהמחיש גנים ספציפיים לפריציטים כדי לאמת זהות תאית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדי להשיג בידוד מדויק של פריציטים במוח, תאים שהתנתקו מרקמת המוח צובעו ב-PE Texas Red-conjugated Anti-Mouse CD41/CD45, FITC-conjugated anti-עכבר CD13, ו-APC-conjugated anti-עכבר CD31, ובכך ייסד אסטרטגיית מיון רב-שלבית המשלבת סימני משטח וזיהוי חיוניות (איור 2). שער התחלתי המבוסס על פרמטרים של פיזור קדמי (FSC-A) ופיזור צד (SSC-A) שלל למעשה פסולת תאית (איור 2, רבע שמאל עליון). דלדול תאים דו-חיוביים של CD45⁺/CD41⁺ לאחר מכן הסיר תאים ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה מתאר אסטרטגיית FACS שיטתית ומאומתת בהתבסס על תיוג רב-צבעי CD13⁺/CD31⁻ לבידוד יעיל מאוד שלפריציטים וסקולריים במוח העכברים. ציטומטריות זרימה וניתוחי scRNA-seq לאחר מכן אישרו שהשיטה מבחינה מדויקת בין פריציטים לתאי אנדותל ומניבה תאים העומדים בעקביות בכל מדדי בקרת האיכות הקריטיים ל-scRNA-seq, כולל כדאיות, קצב הצטברות, ריכוז תאים חיים ויחס תאים גרעיניים. המתודולוגיה המבוססת הזו מספקת בסיס טכני איתן לחקירה מעמיקה עתידית של תפקודי פריציטים בהפרעות מוח שונות באמצעו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין ניגוד עניינים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי קרן המדע הטבעי של בייג'ינג (מענק מס' 7242222), פרויקט תוכנית המדע והטכנולוגיה המחוזית של מחוז חביי (מענק מס' 203777110D), והמכון למחקר מיקרו-זרימה של המכללה הרפואית של איחוד פקינג, האקדמיה הסינית למדעי הרפואה (מענק מס' CAMS-IM-2023-02).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Fetal Bovine Serum (FBS)גיביקולA5669701לחלק לאליקוטים ולשמור ב-20°C; ניתן לשמור ב-4°C למשך שבוע לאחר הפשרה
Phosphate Buffered Saline(10×PBS, pH 7.4)Life Technologies70011-044לדלל לפני השימוש לשטיפת תאים
D-(+)-Glucoseסיגמה-אלדריךG7021-1KGלהכנת מאגר אנרגיה לתאים
Bovine Serum Albumin (BSA)סיגמה-אלדריךA1933-25gמגן על התאים ומונע הידבקות
Dulbecco's  Phosphate Buffered Saline (DPBS,1×)גיבקו14190-144
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS,1×)Life Technologies14175-095לשטיפת תאים ולמרחה מחדש
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled WaterLife Technologies10977-015להכנת מערכות תגובה נקיות מנוקלאזות
Collagenase/Dispaseסיגמה-אלדריך11097113001-100mgלעיכול רקמות ולהפרדת תאים; לחלק לאליקוטים ולשמור ב-20°C
DNaseI(RNase-Free)TIANGENRT411-1500Uמונע צבירת DNA; לחלק לאליקוטים ולשמור ב-20°C
Percollסיגמה-אלדריךP1644-100MLלהפרדת תאים; לשמור ב-4°C
FITC Rat Anti-Mouse CD13BD Biosciences558744צמיד פלואורסצנטי; לשמור מוגן מפני אור ב-4°C למשך חודש
APC Rat Anti-Mouse CD31BD Biosciences551262לשמור מוגן מפני אור ב-4°C למשך מספר חודשים
PE Rat Anti-Mouse CD41BD Biosciences558040לשמור מוגן מפני אור ב-4°C למשך מספר חודשים
PE Rat Anti-Mouse CD45BD Biosciences553081לשמור מוגן מפני אור ב-4°C למשך מספר חודשים
FITC Rat IgG1, κ Isotype ControlBD Biosciences552916בקרת פלואורסצנציה; לשמור מוגן מפני אור ב-4°C
APC Rat IgG2a, κ Isotype ControlBD Biosciences553932לשמור מוגן מפני אור ב-4°C למשך מספר חודשים
PE Rat IgG2b, κ Isotype ControlBD Biosciences553989לשמור מוגן מפני אור ב-4°C למשך מספר חודשים
RNase AWAY Decontamination ReagentAmbion10328011להסרת זיהום RNase
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)BD Pharmingen553141למניעת קישור נוגדנים לא ספציפי
7-Aminoactinomycin D (7-AAD)BD Pharmingen559925להדרה של תאים מתים.
2,2,2-Tribromoethanolסיגמה-אלדריךT48402-25gלהכנת תמיסת טריברומואתונול 1.25% (w/v)
2-Methyl-2-butanolPsaitongM20008-500mLלהכנת תמיסת טריברומואתונול 1.25% (w/v)
C57BL/6 mouseJiangsu Huachuang Xinnuo Pharmaceutical Technology Co., Ltd.SYXK (Su) 2020-0041
50 mL centrifuge tubeקורנינג430291
15 mL centrifuge tubeקורנינג430791
cell cluture dish 100mm×20mmקורנינג430167
Cell Ranger3.1.0/4.0.0תוכנת ניתוח נתוני רצף תאים בודדים
Loupe Cell Browser4.1דפדפן תאים
STAR2.5.1bיישור RNA
irlbpy-ניתוח רכיבים עיקריים
tsne0.15ניתוח Barnes-Hut t-SNE (t-Distributed Stochastic Neighbor Embedding)
k-means0.17קלאסטרינג K-Means
graph-based clustering0.17קלאסטרינג מבוסס גרף
FastQCv0.11.2בקרת איכות נתונים (QC)

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Payne, L. B., et al. The pericyte microenvironment during vascular development. Microcirculation. 26 (8), e12554(2019).
  2. Ma, Q., et al. Blood-brain barrier-associated pericytes internalize and clear aggregated amyloid-β42 by LRP1-dependent apolipoprotein E isoform-specific mechanism. Mol Neurodegener. 13 (1), 57(2018).
  3. Mäe, M. A., et al. Single-cell analysis of blood-brain barrier response to pericyte loss. Circ Res. 128 (4), e46-e62 (2021).
  4. Li, P., Fan, H. Pericyte loss in diseases. Cells. 12 (15), 1931(2023).
  5. Oliveira, F., et al. Cultured brain pericytes adopt an immature phenotype and require endothelial cells for expression of canonical markers and ECM genes. Front Cell Neurosci. 17, 1165887(2023).
  6. Yao, Y. Challenges in pericyte research:pericyte-specific and subtype-specific markers. Transl Stroke Res. 13 (6), 863-865 (2022).
  7. Vanlandewijck, M., et al. A molecular atlas of cell types and zonation in the brain vasculature. Nature. 554 (7693), 475-480 (2018).
  8. Alliot, F., et al. Pericytes and periendothelial cells of brain parenchyma vessels co-express aminopeptidase N, aminopeptidase A, and nestin. J Neurosci Res. 58 (3), 367-378 (1999).
  9. Huang, Y., et al. Isolation, culture, and characterization of primary endothelial cells and pericytes from mouse sciatic nerve. J Neurosci Methods. 416, 110366(2025).
  10. Armulik, A., et al. Pericytes regulate the blood-brain barrier. Nature. 468 (7323), 557-561 (2010).
  11. Crouch, E. E., Doetsch, F. FACS isolation of endothelial cells and pericytes from mouse brain microregions. Nat Protoc. 13 (4), 738-751 (2018).
  12. Eichhorn, T., et al. Expression of tissue factor and platelet/leukocyte markers on extracellular vesicles reflect platelet-leukocyte interaction in severe COVID-19. Int J Mol Sci. 24 (23), 16886(2023).
  13. Smyth, L. C. D., et al. Markers for human brain pericytes and smooth muscle cells. J Chem Neuroanat. 92, 48-60 (2018).
  14. Wu, Q., et al. Epitranscriptomic mechanisms of N6-methyladenosine methylation regulating mammalian hypertension development by determined spontaneously hypertensive rats pericytes. Epigenomics. 11 (12), 1359-1370 (2019).
  15. Mirzadeh, Z., et al. The subventricular zone en-face:wholemount staining and ependymal flow. J. Vis. Exp. (39), e1938(2010).
  16. Zappaterra, M. W., et al. Isolation of cerebrospinal fluid from rodent embryos for use with dissected cerebral cortical explants. J. Vis. Exp. (73), e50333(2013).
  17. Zou, Z., et al. A single-cell transcriptomic atlas of human skin aging. Dev Cell. 56 (3), 383-397.e8 (2021).
  18. Bahl, E., et al. Using deep learning to quantify neuronal activation from single-cell and spatial transcriptomic data. Nat Commun. 15 (1), 779(2024).
  19. Klein, A. M., et al. Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells. Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).
  20. Zheng, G. X. Y., et al. Massively parallel digital transcriptional profiling of single cells. Nat Commun. 8 (1), 14049(2017).
  21. Song, H. W., et al. Transcriptomic comparison of human and mouse brain microvessels. Sci Rep. 10 (1), 12358(2020).
  22. He, L., et al. Analysis of the brain mural cell transcriptome. Sci Rep. 6, 35108(2016).
  23. Stebbins, M. J., et al. Human pluripotent stem cell-derived brain pericyte-like cells induce blood-brain barrier properties. Sci Adv. 5 (3), eaau7375(2019).
  24. Crouch, E. E., et al. Regional and stage-specific effects of prospectively purified vascular cells on the adult V-SVZ neural stem cell lineage. J Neurosci. 35 (11), 4528-4539 (2015).
  25. Ruan, J., et al. Screening and identification of muscle pericyte selective markers. Sci Rep. 15 (1), 28874(2025).
  26. Dias, D. O., et al. Pericyte-derived fibrotic scarring is conserved across diverse central nervous system lesions. Nat Commun. 12 (1), 5501(2021).
  27. Thalgott, J. H., et al. Non-invasive characterization of pericyte dysfunction in mouse brain using functional ultrasound localization microscopy. Nat Biomed Eng. , (2025).
  28. Grant, R. I., et al. Organizational hierarchy and structural diversity of microvascular pericytes in adult mouse cortex. J Cereb Blood Flow Metab. 39 (3), 411-425 (2019).
  29. O'flanagan, C. H., et al. Dissociation of solid tumor tissues with cold active protease for single-cell RNA-seq minimizes conserved collagenase-associated stress responses. Genome Biol. 20 (1), 210(2019).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

FACSCD13CD31

מאמרים קשורים