מאמר זה מתאר: (1) העברת מולקולות בדיקה לעכברים יילודים כבר ב-DOL 6; ו-(2) הערכה חיצונית של תפקוד מחסום אפיתל המעי הגס בביופסיות מגורי DOL 10 לגמילה (DOL 20) על ידי הערכת חדירות פארא-תאית וטרנס-תאית עם תאי Ussing.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
גוואג' אורלי בגורי עכבר יילודים והערכה תפקודית של שלמות מחסום המעי באמצעות תאי שימוש
במאמר זה
סיכום
תקציר
עדויות הולכות וגדלות מדגישות את חשיבות 1,000 הימים הראשונים של החיים בעיצוב ציר המעיים-מיקרוביום. חלון החיים המוקדם הזה קריטי לקביעת מסלולים פיזיולוגיים ארוכי טווח והתאמות חיסוניות, ועלול להשפיע על רגישות למחלות הקשורות לדיסביוזה ולדיספונקציה של מחסום. הבנה מעמיקה יותר של המנגנונים הבסיסיים דורשת הערכה מקיפה של פרמטרים פיזיולוגיים מרכזיים, כולל חדירות פארא-תאית וטרנס-תאית של מערכת העיכול התינוקת. הערכת פרמטרים אלו חיונית להבהרת האופן שבו חשיפות מוקדמות למולקולות חיצוניות עשויות להשפיע על שלמות המעי ועל תוצאות בריאותיות ארוכות טווח. לכן, החלק הראשון של מאמר זה מתאר את מתן המולקולות המעניינות בגורי עכבר כבר ביום 6, תוך הפחתת לחץ, סיכון לפציעה וקניבליזם. מחטי האכלה משומנות עם קצה מעוגל ומשומנת משמשות לאיסוף גורי עכברים במשקל מינימלי של 2.5 גרם. החלק השני מתאר את ההערכה החוצה של חדירות פארא-תאית וטרנס-תאית באמצעות בדיקות תא Ussing על דגימות קולו של גורים בין DOL-10 לגמילה. סליידרים ללא סיכות המותאמים לביופסיות קטנות משמשים בשילוב עם תאי אוסינג להרכבת דגימות קולוניקה של יילודים. הגשוש הפרתאלי FITC-Dextran 4 kDa והסמן הטרנס-תאי פרוקסידאז חזרת 44 kDa סוג VI מתווספים לתא האפיקלי של המערכת בתחילת הבדיקה. הדגימות נאספות בתא הבזולטרלי ב-0 דקות, 30 דקות, 60 דקות, 90 דקות ו-120 דקות כדי לכמת את מעבר הגשוש. מעבר שני הסמנים נמדד ישירות (FITC) ועקיפין (HRP) באמצעות קורא לוחות, המחושב באמצעות עקומות סטנדרטיות, ומובא כפלוקס.
מבוא
שלמות מחסום המעי ממלאת תפקיד יסודי בשמירה על בריאות כללית על ידי תיאום תגובת החיסון הרירית וויסות החדירות הסלקטיבית של אפיתל המעי. מערכת מחסום זו שולטת במעבר חומרים מזינים תוך מניעת העברת פתוגנים, אנטיגנים ורעלים למחזור הדם הסיסטמי1. הפרעה כרונית בממשק זה, הקשורה לעלייה בחדירות המעיים, המכונה בדרך כלל "מעי דולף", מזוהה כיום לא רק כתוצאה אלא גם כגורם למצבים דלקתיים כרוניים ולמגוון פתולוגיות חוץ-מעיים2.
לדוגמה, פגיעה בתפקוד מחסום המעי הוכחה כמרכיב מרכזי בהפרעות אוטואימוניות ומטבוליות כגון מחלת מעי דלקתית (IBD), דלקת מפרקים אידיופתית לנוער (JIA) וסוכרת סוג 1 (T1D). דבר זה מדגיש את מצב מחסום המעי כסמן ביולוגי מרכזי, אך גם כמטרה טיפולית למניעת התחלת תהליכים פתופיזיולוגיים מוקדם ככל האפשר ולמניעת התקדמות דלקת חריפה למצב כרוני 3,4,5,6.
בהקשר זה, התקופה הניונאטלית מייצגת חלון התפתחות ייחודי ורגיש מאוד, שבו היווצרות והבשלת ממשק המעי-מיקרוביום משפיעות עמוקותעל בריאות המעי והמערכתית לאורך כל החיים. בשלב מוקדם זה, האפיתל המעי ומערכת החיסון מראים רגישות מוגברת לגורמים אנדוגניים וחיצוניים, עוברים גדילה והתמיינות מהירה תוך התאמה לקולוניזציה מיקרוביאלית ולשינויים תזונתיים. הפרעות הפוגעות בשלמות מחסום המעי במהלך חלון ההתפתחות הקריטי הזה עשויות למלא תפקיד מרכזי בהופעת מגוון רחב של הפרעות חריפות וכרוניות בהמשך החיים. מצבים אלו כוללים מחלות המתווכות על ידי מערכת החיסון כגון אלרגיה למזון, ומחלות כרוניות חמורות יותר, כגון IBD, JIA ו-T1D 7,8,9. מחלות אלו מדגישות כיצד תהליכים פתופיזיולוגיים מתחילים לעיתים קרובות מוקדם, שכן ההופעה הראשונית מתרחשת בדרך כלל בין ילדות לבגרות מוקדמת10,11. לכן, הבנת המנגנונים השולטים בתפקוד מחסום המעי אצל תינוקות היא חיונית לפיתוח אסטרטגיות מניעתיות וטיפוליות שמטרתן להפחית את העומס של מחלות כרוניות רבות.
בהקשר זה, יש צורך דחוף בכלים אמינים ורלוונטיים פיזיולוגית לחקר שלמות מחסום המעי, מנגנוני מחלות כרוניות ודלקת, במיוחד בתוך הסביבה הניונאטלית. כלים כאלה חייבים לאפשר שכפול של בדיקות ניסיוניות שכבר הוכחו בהקשר המבוגר מבלי לוותר על דיוק ויעילות. בנוסף, נעשה דחוף יותר ויותר לחקור השפעות קצרות וארוכות טווח של מועמדים מולקולריים רבים שמעניינים אותם, אשר צפויים להיות בעלי השפעות מועילות או מזיקות על הומאוסטזיס המעי בהקשר של יילודים. מבין הכלים הזמינים, מתן גז אוראלי בגורי עכבר יילודים מהווה שיטה אמינה ביותר להעברת מולקולות מעניינות בשלב התפתחותי מוגדר. הוא מאפשר חקירות מבוקרות של השפעות של תרכובות ביואקטיביות שונות, תרופות או מטבוליטים מיקרוביאליים על הבשלה ותפקוד המחסום.
החלק הראשון של מאמר זה מתאר שיטה להגדלת גורי עכברים כבר ביום החיים (DOL) 6, המאפשרת חקר התערבויות לפני, במהלך ואחרי ההתרחבות העצומה של מספר מיני המיקרוביוטות במעי שנגרמה על ידי גיוון במזון. לכן, טכניקה זו מאפשרת ניתוח אורך של השפעות הטיפול על בריאות המעיים כאשר הגורים גדלים ומתפתחים.
בחלק השני של מאמר זה ובהשלמה לגישה זו, הערכה אקס-ביבו של תפקוד מחסום אפיתל המעי הגס באמצעות תאי אוסינג מספקת מדד רגיש וכמותי של מאפייני חדירה. הערכת חדירות פארא-תאית וטרנס-תאית בביופסיות של מעי הגס מעכברים יילודים (למשל, גורי DOL 10) מאפשרת קביעה מדויקת של השפעתם של מספר מועמדים מרכזיים על שלמות ותפקוד מחסום האפיתלי. ההובלה הפרתאלית היא מנגנון פסיבי במהותו, המתרחש במרחב הבין-תאי של שכבת האפיתל. הוא מאפשר מעבר של מומסים קטנים המונעים על ידי גרדיאנטים אלקטרוכימיים ואוסמוטיים מהלומן לצד הבזולטרלי. מנגנון זה מוסדר בעיקר על ידי חלבונים ממשפחת הצמתים הצמודים, כגון קלודינים ואוקלודין. לעומת זאת, ההובלה הטרנס-תאית היא מנגנון פעיל, המאפשר ספיגת מומסים גדולים יותר ולהתרחש דרך תאי האפיתל דרך ערוצים, נשאים ומשאבות ספציפיות.
פלואורסציאן איזותיוציאנאט (FITC)-דקסטרן (4 קילו-דאלטון) עובר בעיקר הובלה פארא-תאית בשל גודלו, בעוד שפרוקסידאז חזרת (HRP; 44 kDa) מועבר באופן סלקטיבי לצד הבזולטרלי דרך מסלולים טרנס-תאיים. כימות הסמנים הלא-אנדוגניים הללו מאפשר הערכה ברורה של חדירות פארא-תאית וטרנס-תאית, בהתאמה. מבחן תא אוסינג עם FITC ו-HRP שומר על ארכיטקטורת הרקמה ומאפשר מדידה בזמן אמת של חדירות פארא-תאית וטרנס-תאית של כל מקטע במערכת העיכול. השילוב הזה של ניתוח תא יילודים וניתוח תא אוסינג מציע אסטרטגיה עוצמתית לחקר האופן שבו מולקולות מסוימות משפיעות על תפקוד מחסום המעי הן באופן מיידי והן לאורך תקופות זמן ארוכות יותר, ומספק אסטרטגיות להפחתת דלקת ומניעת מחלות כרוניות כבר בשלבים המוקדמים ביותר של החיים.
לסיכום, פרוטוקול זה מתאר שני הליכים ניסיוניים משלימים המאפשרים: (1) מתן מולקולות מעניינות בתקופה המוקדמת לגורי עכברים (שלב 1); (2) הערכת חדירות פרא-תאית וטרנס-תאית במקטעי מערכת העיכול מגורים יילודים ועד גמילה באמצעות תאי אוסינג (שלבים 2-6).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל הליכי בעלי החיים בוצעו בהתאם לתקנות הלאומיות החלות ואושרו על ידי משרד ההשכלה הגבוהה, המחקר והחדשנות הצרפתי דרך פלטפורמת APAFIS (מספר הרשאה: APAFIS#23855) ומענקים מהסוכנות הלאומית למחקר (ANR): 11-IDEX-0005-02, ANR-24-CE15-7152, ו-18-IDEX-0001. החומרים והציוד בהם משתמשים מופיעים בטבלת החומרים.
1. גוואג' של גורי עכברים יילודים
הערה: השיטה הבאה מותאמת מפרנסיס ואחרים. בעוד שהפרוטוקול המקורי מאפשר בדיקת גורי עכברים כבר ב-DOL 2, לא בוצע כאן לפני DOL 6, שכן הדרישות הטכניות בגילאים מוקדמים הפכו את ההליך למאתגר משמעותית. בנוסף, שימוש בגורים צעירים מסבך את המחקרים כי הוא מעלה את הסיכון לאובדן בעלי חיים בימים הראשונים של הטיפול, ולכן דורש קבוצות גדולות יותר.
- הכנה והקמה של פתרונות Gavage
- שקלו כל גור בנפרד.
- כוונן את הריכוז והנפח של תמיסת הגוואג' כך שהנפח הכולל לא יעלה על 20 מיקרוליטר לגרם משקל גוף.
הערה: בתנאים סטנדרטיים, גורי עכברים כמעט אף פעם לא שוקלים פחות מ-2.5 גרם ב-DOL 6. - שטוף מחט הזנה עגולה של 24 גרם על ידי שטיפה יסודית עם מים דה-יוניים, ואז 70% אתנול באמצעות מזרק, ואז אוטוקלאב.
הערה: מומלץ להשתמש במחט האכלה נפרדת לכל קבוצת טיפול כדי למנוע זיהום צולב. - הניחו מגבות נייר נקיות על כרית חימום מחוטאת על ~38 מעלות צלזיוס.
- שטוף כפפות עם 70% אתנול לפני פתיחת כלובי החיות כדי להגביל את העברת הריח לגורים ולהפחית את הסיכון לקניבליזציה.
- העבר את הסכר לכלוב נפרד בחדר אחר כדי לצמצם לחץ שנגרם מהקולות האפשריים של הגורים.
- שפשפו כפפות ניקוי עם חומרי קינון כדי לצמצם את הסיכון להעברת ריחות חיצוניים לגורים במהלך הקינון.
- מדדו את האורך בין תהליך הזיפואיד (הקצה התחתון של עצם החזה) לבין החוטם של הגור כדי לסמן את אורך ההחדירה המקסימלי על מחט ההזנה (איור 1A,B).
- גאווג' תוך-הוושט של גורי עכברים
- חבר את ראש המחט למזרק בצורה סטרילית ומשוך יותר מנפח תמיסת הגאבג' הרצוי כדי להזריק את כל הנפח הנדרש ללא סיכון להזרקת בועות אוויר, שכן הן מגדילות משמעותית את הסיכון לשאיבה.
- באמצעות האגודל והאצבע של היד הלא-דומיננטית, צבוט בעדינות את העור בין השכמות כדי להרים את הגור.
הערה: אין למשוך יותר מדי עור מגב הגור, שכן הדבר עלול לגרום לחנק. - מחזיקים את הגור במצב כמעט אופקי ומכניסים בעדינות את מחט ההזנה לחלל הפה, מקדים אותו בניצב ללוע עד שהוא מגיע לאחור הגרון (איור 1C).
- תוך שמירה על אותו זווית ועומק, החליק את המחט לחלק הימני או השמאלי של חלל הפה כדי להימנע מהלשון.
- כוונו לאט את זווית המחט תוך הטיית ראש הגור לאחור בעדינות עד שהמזרק, הראש והגב מיושרים, כאשר הראש מוטה מעט לאחור (איור 1D).
- ללא הפעלת לחץ, אפשר למזרק לרדת לאט תחת משקלו עד שסימן ההחדירה המקסימלי קרוב או מגיע לגובה החרטום (איור 1E).
הערה: אם יש התנגדות, סובבו בעדינות את המזרק על ידי גלגולו קדימה ואחורה בין האצבעות כדי להקל על הירידה. אם המזרק עדיין לא מתקדם, נסה לכוון את זווית ההכנסה או להתחיל מחדש את ההליך באמצעות מחט הזנה משומנת בתמיסת הגאוויג'. המחט לא צריכה להישאר מוכנעת יותר מ-20 שניות כדי למנוע חנק. - כאשר סימן הכניסה המקסימלי הושג או נסגר, יש לחלק במהירות את הנפח הרצוי. אם מתקיימת התנגדות בעת חלוקת הנפח, בדוק את יישור ראש המזרק לאחור והתאם מעט את עומק ההכנסה.
הערה: מומלץ לחלק במהירות את הנפח, שכן החדרת המחט הממושכת מעלה משמעותית את הסיכון לחנק, מאבק ופציעה אפשרית לבעל החיים. - לאחר מתן הנפח הנכון, משכו בעדינות את המחט באותה זווית שבה השתמשו בהחדרה.
- הנח את הגור על מגבת נייר שהונחה קודם על כרית החימום ועקוב אחרי ההתאוששות. דפוס נשימה תקין אמור לחזור בפחות מ-20 שניות.
הערה: הופעת בועות מהפה או החרטום של החיה מצביעה על שאיבה ודורשת המתת חסד מיידית בגורים צעירים מ-DOL 14. נוכחות של כמות קטנה מאוד של דם בפה של בעל החיים, הנגרמת מנגע בין האורופרינקס לוושט דורשת מעקב אחר החיה, אך לא מעקב אחר המתת חסד שיטתית. אם ההחלמה של הגור אינה ודאית, הנח אותו על הצד. אם הוא לא מנסה לתקן את עצמו, יש להמית מיד. - לאחר אישור החלמת החיה, מחזירים את הגור לקן ומארגנים אותו מחדש עם אמא שלו.
הערה: עד DOL 10, לגורים יש תנועה נמוכה והם יכולים להישאר על כרית החימום עד להשלמת הערכה של כל גור בכלוב. אסור להשאיר גורים מבוגרים ללא השגחה על הפד, שכן הם עלולים לנסות לברוח.
איור 1: גוואג' של גור עכבר יילוד ב-DOL 10. המרחק בין החוטם לתהליך הקסיפואיד נמדד (A), מה שמאפשר סימון אורך החדרה מקסימלי על מחט ההזנה (B). מחט ההזנה מוחדרת לחלק השמאלי או הימני של חלל הפה (C). כאשר מגיעים לחלק האחורי של הגרון, זווית המחט מכוונת עד שהמזרק, הראש והגב של החיה מיושרים (D). המחט מורשה להחליק בעדינות כלפי מטה ללא התנגדות עד שסימן ההחדרה המקסימלי כמעט מגיע או מושג (E). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.
2. המתת חסד של גור עכבר יילוד ושלבת מעי גס
- לבצע המתת חסד בשיטה המתאימה שנקבעה על פי החקיקה הלאומית.
הערה: מומלץ לערות ראש של גורים עד DOL 10 ופריקת צוואר הרחם של גורים בגיל גבוה מ-DOL 10. המתת חסד עם CO2 או חומרי הרדמה אינה מומלצת, שכן הגורים מציגים סבילות גבוהה לשיטות אלו. - הניחו את החיה שהושמתה תחת מיקרוסקופ בינוקולרי.
- מרחו 70% אתנול על בטן בעל הבית.
- באמצעות מלקחיים, צבוטים את עור הבטן ואת הפריטונאום התחתון ומבצעים חתך בטני רחב באמצעות מספריים עדינים (בניצב לציר הרוסטרלי-קאודלי) מבלי לחתוך את המעי.
- הכנס בעדינות את המספריים הדקים לחתך והאריך את החתך לרוחב דרך הפריטונאום משני הצדדים.
- באמצעות מלקחיים ומספריים דקים, חתכו את החלקים העליונים והתחתונים של הפריטונאום, מהאזור החזה ועד לאזור האגן התחתון (איור 2A).
- זהה את החלק הדיסטלי של המעי הגס ויצר חתך במקביל לצירו, לכיוון הרקטום.
- בצע חתך בחלק הסופי/הרקטלי של המעי הגס כדי להניע אותו.
- משכו בעדינות את המעי הגס והתקדמו לעבר הסקום, תוך הסרת חלקים אפשריים של רקמת חיבור או שומן.
- שחרר את המעי הגס מהבטן על ידי חיתוך בצומת האילאוסקלי, מעל הצקום (איור 2B).
- השליכו את הסקום ואת המילימטרים הראשונים של המעי הגס הפרוקסימלי, ואז אספו דגימה או שתיים מהמעי הגס הפרוקסימלי שהן בגודל הפתח של סליידר אוסינג (איור 2C).
הערה: מומלץ לאסוף שתי ביופסיות גדולות מדי, שכן המעי הגס התינוקי עדין מאוד וניתן בקלות להיקרע, להיחתך או לנקב במהלך הניקוי וההתקנה. - כאשר המספריים סגורים, הסר בעדינות את תכולת הצואה מהביופסיה השטוחה על ידי הפעלת לחץ קל והחלקה מהפרוקסימלי לקצה הדיסטלי.
- שים את החלק הריקה של המעי הגס בבופר KRB קר כקרח.
איור 2: כריתה של המעי הגס של גור DOL 10. האפידרמיס והפריטונאום של הגור נחתכים ונפתחים בשני שלבים כדי למנוע חתך בלתי רצוני של המעי הגס, עד שכל חלל הבטן נחשף (A). המעי הגס משתחרר מהבטן דרך חתך ראשון של החלק הדיסטלי/רקטלי, ואחריו חתך שני מעל הצקום (B). המילימטרים הראשונים של המעי הגס הפרוקסימלי נזרקים, ונאספים דגימה אחת או שתיים של המעי הגס הגדול מגודל הפתח של סליידר אוסינג (C). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.
3. בדיקת חדירות המעי הגס באמצעות ביופסיות עכברים בתאי אוסינג
- הכנת הבדיקה
- ביום שלפני יום ניסוי אוסינג. כדי להבטיח תנאי בדיקה מיטביים, מומלץ להכין מספר תמיסות ביום שלפני הניסוי. פתרונות אלו מוכנים לפי ההוראות בטבלה 1.
הערה: הטבלאות הבאות מציינות את הסכומים הנדרשים ל-12 לשכות Ussing, כאשר ה-KRB עודף פי 10 כדי לאפשר העלות.
הערה: תמיסת KRB 10x יכולה להיאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך עד 6-12 חודשים. - ביום הניסוי, 30 דקות לפני המתת החסד של בעלי חיים:
- הכינו 400 מ"ל של בופר KRB, כפי שמצוין בטבלה 2.
הערה: ה-KRB 10x, מים דה-יוניים וביקרבונט חייבים להיות מעורבבים מראש ומבעבעים באמצעות גז קרבוגן (95% O2; 5%CO2) למשך 15 דקות לפני הוספת CaCl2 כדי למנוע משקעים. - באמצעות מערכת קרבוגן (95% O2; 5% CO2), בועות את בופר ה-KRB הטרי למשך 15 דקות.
- חלק את 400 מ"ל בופר KRB לשניים והכין 200 מ"ל קרבס-גלוקוז, 200 מ"ל קרבס-מניטול, ותמיסת HRP כפי שמתואר בטבלה 3.
- הכינו 400 מ"ל של בופר KRB, כפי שמצוין בטבלה 2.
- הגדרת מערכת באמצעות שימוש
- חממו מראש את מערכת ה-ussing ל-37 מעלות צלזיוס.
- הרכיבו מראש את התאים כך:
- הרם את המנעולים של כל חריץ.
- שים את התאים בחריצים שלהם בלי להדק את המערכת.
- הכנס את שני צינורות אספקת הגז לכל חלק של התאים.
- הכניסו את ארבעת האלקטרודות לפתחים הקדמיים (אם יש - לא מוסכם כאן) או אטימו את ארבעת הפתחים באמצעות קונוסים של 200 מיקרוליטר מלאים בדבק לפני הניסוי.
- הניחו מגשים מתחת לתאים לקראת דליפות אפשריות.
- הרכבת רקמות
- ייבשו בעדינות את דגימת המעי הגס שנוקתה קודם לכן עם מגבת נייר כדי להסיר לחות עודפת.
- הנח את חתיכת המעי מתחת לזכוכית מגדלת והכנס בעדינות אחת מהלהבים של המספריים העדינים לחלק הלומינלי כדי לחתוך אותו (איור 3A).
הערה: ניתן לבצע את החיתוך בתנועה אחת לאחר שהמספריים מוכנסים במלואם. החלק של המעי הגס חייב להיות ישר ככל האפשר תוך הימנעות מפיתול. - באמצעות מלקחיים עדינים, התקן את הרקמה על החלק הלבן של הסליידר תוך שמירה על החלק הלומינלי כלפי מעלה, לכיוון המפעיל. הרקמה חייבת להיות נטולת עקבות שומן, צואה, קמטים, חורים וחתכים, וחייבת לכסות את הפתח באופן נרחב (איור 3B).
- סגור את הסליידר תחת המיקרוסקופ הבינוקולרי ובדוק אם יש הזזות אפשריות של הרקמה. עיוות קל של הרקמה חייב להיות נראה כאשר מופעל לחץ על הסליידר, מה שמעיד שהסליידר סגור היטב.
הערה: התקן את הסליידרים בתא האוסינג (איור 4) והתחל את שלב האיזון בנפרד ברגע שהוא מוכן, כדי למנוע התייבשות בדגימה. - תוך שמירה על לחץ קל על הסליידר כדי לשמור עליו סגור, הכנס את הסליידר לתא האוסינג, כדי לוודא שהלומן (החלק השקוף של הסליידר) פונה שמאלה.
- סגור את שני המנעולים והדק את הבורג שממוקם מימין עד שהתא אטום והסליידר לא יכול לזוז.
- ההגדרה והאיזון הסופיים
- הוסיפו 4 מ"ל קרבס-מניטול לתא השמאלי (האפיקלי) של החדר.
- הוסיפו 4 מ"ל של קרבס-גלוקוז לתא הימני (בזולטרלי) של החדר.
- הנח חתיכה קטנה של פאראפילם בין שני התאים כדי למנוע זיהום צולב.
- פתח את פתח הגז (95% O2 / 5%CO2) וקבע את היציאה בין 1-2 בועות לשנייה.
- הסר בועות גדולות הממוקמות על הרקמה או במערכת באמצעות פיפט פסטר.
- תן למערכת לאזן עד 20-30 דקות.
- הכינו את תמיסת FITC 4kDa + HRP + מניטול כפי שמתואר בטבלה 4.
- ביום שלפני יום ניסוי אוסינג. כדי להבטיח תנאי בדיקה מיטביים, מומלץ להכין מספר תמיסות ביום שלפני הניסוי. פתרונות אלו מוכנים לפי ההוראות בטבלה 1.
- התחלת בדיקת חדירות המעי הגס
- לאחר השגת שיווי משקל במערכת, החלף 200 מיקרוליטר של קרבס-מניטול מהתא האפיקלי (משמאל) ב-200 מיקרוליטר של תמיסת FITC 4Kd + HRP + מניטול ומיד מתחילים טיימר. שטוף את הקצה על ידי עליות ומורדות עדינות בתא והזרוק את הקצה בין כל תא.
- לכל תא, אספו 2 × 100 מיקרוליטר (כפילויות) מהתא הבסיסי (הימני) ומניחים את הנפחים בלוח שחור עם 96 בארות. כסה את הפלטה בנייר אלומיניום כדי למנוע פוטוגרדמציה של ה-FITC הקיים בלוחה.
- החלף מיד את 200 מיקרוליטר שנאספו קודם ב-200 מיקרולטר קרבס-גלוקוז טרי.
- חזור על השלבים (2) ו-(3) כל 30 דקות עד שמגיעים לנקודת הזמן של 2 שעות, כדי לקבל את נקודות הזמן: T0, T30, T60, T90 ו-T120.
- אוטם את הלוח בנייר אלומיניום כדי למנוע פוטוגרדגרציה של ה-FITC והמשיך לכימות FITC.
| MgCl2 1M | |||
| MW (g/mol) | נפח סופי = 20 מ"ל | ריכוז סופי | |
| מילי-קיו H2O | הביאו לכרך הסופי | ||
| MgCl2, 6H2O | 203.3 | 4.066 גרם | 1 מ' |
| KRB 10X | |||
| MW (g/mol) | כרך סופי = 1L | ריכוז סופי | |
| milli-Q H20 | הביאו לכרך הסופי | ||
| NaCl | 58.44 | 70 גרם | 1.198 מ' |
| KCl | 74.55 | 3.4 גרם | 45.6 מ"מ |
| Na2HPO4 , 2H2O | 177.99 | 1 גרם | 5.62 מ"מ |
| NaH2PO4 , 2H2O | 156.01 | 2.3 גרם | 14.7 מ"מ |
| MgCl2 1M | 5 מ"ל | 5 מ"מ | |
| ביקרבונט 750 מ"מ | |||
| MW (g/mol) | נפח סופי = 250 מ"ל | ריכוז סופי | |
| מילי-קיו H2O | הביאו לכרך הסופי | ||
| NaHCO3 | 84 | 15.75 גרם | 750 מ"מ |
| CaCl2 2M | |||
| MW (g/mol) | נפח סופי = 50 מ"ל | ריכוז סופי | |
| מילי-קיו H2O | הביאו לכרך הסופי | ||
| CaCl2 | 111 | 11.098 גרם | 2 מ' |
טבלה 1: הכנת התמיסה ביום שלפני ניסוי אוסינג.
| בופר KRB (400 מ"ל) | ||
| כרך | ריכוז סופי | |
| KRB 10X | 40 מ"ל | 1X |
| H2O (מילי-קיו) | 352 מ"ל | |
| ביקרבונט 750 מ"מ | 8 מ"ל | 15 מ"מ |
| CaCl2 2M | 240 מיקרוליטר | 1.2 מ"מ |
טבלה 2: הכנת מאגר KRB ביום ניסוי אוסינג.
| קרבס-גלוקוז/מניטול (200 מ"ל כל אחד) | ||||
| נפח סופי = 200 מ"ל | ריכוז סופי | |||
| מאגר KRB | הביאו לכרך הסופי | |||
| גלוקוז | 360 מ"ג | 10 מ"מ | ||
| או | ||||
| מניטול | 364 מ"ג | 10 מ"מ | ||
| פתרון HRP | ||||
| נפח סופי = 1480 מיקרוליטר | ריכוז סופי | |||
| קרבס-מניטול | הביאו לכרך הסופי | |||
| HRP | 13 מ"ג | 8.8 מ"ג/מ"ל | ||
טבלה 3: הכנת תמיסות קרבס-גלוקוז/מניטול ו-HRP ביום ניסוי אוסינג.
| FITC 4kDa + HRP + פתרון מניטול | ||
| ל-12 חדרים | כרך | ריכוז סופי |
| HRP (8.8mg/ml) | 1345 מיקרוליטר | |
| קרבס-מניטול | 1155 מיקרוליטר | |
| FITC 4Kd | 166.6 מ"ג | 16.66 מ"מ |
טבלה 4: הכנת תמיסת FITC 4kDa + HRP + מניטול ביום ניסוי אוסינג.
איור 3: התקנת דגימת מעי מעי מגור DOL 9. להב אחד מזוג מספריים דקים מוכנס למקטע הלומינלי של הדגימה כדי לחתוך אותו בתנועה אחת (A). הדגימה הפתוחה מותקנת על פתח הסליידר של אוסינג כאשר הצד הלומינלי פונה למפעיל (B). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.
איור 4: תמונה של חדרי אוסינג מוכנים במלואם. אנא לחצו כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של האיור.
4. הערכת חדירות פארא-תאית במעי הגס באמצעות כימות FITC
- הכנת תקני FITC
- דילל את תמיסת FITC 4Kd + HRP + מניטול בקרבס-גלוקוז להכנת הדילול הסטנדרטי כפי שמתואר בטבלה 5 ובאיור 5.
- הפקדה של 2 x 100 מיקרוליטר (כפול) מכל דילול סטנדרטי מ-n°1 עד n°7 בצלחת. אטום את הפלטה בנייר אלומיניום כדי להגן מפני אור עד שמתחילה קריאת הצלחה.
- איסוף נתונים: באמצעות קורא לוחות, הגדר את אורך גל הגירוי ל-485 ננומטר ואת הפליטה ל-535 ננומטר, וקרא את הפלטת בהקדם האפשרי.
הערה: מומלץ לקרוא את הלוחית הן בקצב אופטימלי והן בהגבר ידני כדי להקל על השוואת ערכים בין הלוחות ולאפשר אינטרפולציה של הנתונים במקרה של טעות במהלך דילול התקנים. - אחסון לוחות: לאחר שמירת נתוני כימות FITC, יש לאחסן את הלוחות אטומים בנייר אלומיניום בטמפרטורה של 4°C במהלך הלילה אם יש לבצע כימות HRP בימים הבאים, או הקפיא ב-80°C לאחסון ארוך יותר.
איור 5: ייצוג חזותי של הכנת דילול תקני FITC. אנא לחצו כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.
| דילול תקני FTIC | |||||||
| מספר | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 |
| דילול | 1:10000 של פתרון FITC | 1:2 של דילול מס' 1 | 1:2 של דילול מס' 2 | 1:10 של דילול מס' 1 | 1:2 של הדילול מס' 4 | 1:2 של הדילול מס' 5 | |
| קרבס-גלוקוז | |||||||
| FITC (מיקרומטר) | 1.66 | 0.83 | 0.415 | 0.166 | 0.083 | 0.0415 | 0 |
טבלה 5: הכנת דילול תקני FITC ביום ניסוי אוסינג.
5. הערכת חדירות טרנס-תאית במעי הגס באמצעות כימות HRP
- ביום שלפני יום בדיקת כימות HRP:
- להבטיח תנאים מיטביים ביום הבדיקה; נדרש הכנת מספר פתרונות ביום שלפני הניסוי. פתרונות אלו מוכנים כפי שמתואר בטבלה 6.
הערה: הטבלאות הבאות מציינות את הכמויות הנדרשות ללוח אחד עם 96 בארות. תקני HRP יכולים להיות מאוחסנים בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס או -80 מעלות צלזיוס למשך מספר חודשים. בגלל חוסר יציבות, השתמש רק במאגרי פחמת/ביקרבונט טריים. - לאחר הכנת תמיסת נוגדנים אנטי-HRP, יש לצפות מיד מיקרופלטה Clear 96 בארות Clear Clear Flat Bottom High Binding ב-100 מיקרוליטר לכל באר. עטוף אותו בנייר אלומיניום ודגר אותו במשך הלילה בטמפרטורה של 4°C.
- להבטיח תנאים מיטביים ביום הבדיקה; נדרש הכנת מספר פתרונות ביום שלפני הניסוי. פתרונות אלו מוכנים כפי שמתואר בטבלה 6.
- ביום בדיקת הכימות של HRP:
- הכינו את מאגר החסימה של 5% BSA כפי שמתואר בטבלה 7.
- להשליך את תכולת הצלחת ולשטוף עם 280 מיקרוליטר PBS טווין 4 פעמים עם דקה של ניעור במהירות 350 סל"ד בין כל שטיפה.
- הוסף 200 מיקרוליטר של בופר חסימת BSA לכל באר.
- אטום את הפלטה בנייר אלומיניום ודוגר על שייקר במהירות 500 סל"ד למשך לפחות שעה. בינתיים, יש להפשיר ולדלל דגימות (1:10 או 1:50) ולהכין את דילול התקנים כפי שמתואר בטבלה 8.
- להשליך את תכולת הצלחת ולשטוף עם 280 מיקרוליטר PBS טווין 4 פעמים עם דקה של ניעור במהירות 350 סל"ד בין כל שטיפה.
- הוסף 50 מיקרוליטר של דגימות סטנדרטיות או מדוללות, אוטם את הפלטה, ודגרה ב-300 סל"ד לשעה אחת ב-RT.
- במהלך הדגירה, הביאו את מגיבי QuantaBlu ל-RT והכינו את הפתרון העובד כפי שמתואר בטבלה 9.
- להשליך את תכולת הצלחת ולשטוף עם 280 מיקרוליטר PBS טווין 4 פעמים עם דקה של ניעור במהירות 350 סל"ד בין כל שטיפה.
- הוסף 100 מיקרוליטר של תמיסת QuantaBlu לכל באר בטמפרטורה של RT או 37 מעלות צלזיוס (1.5-90 דקות, 30 דקות בממוצע).
הערה: התקדמות הבדיקה יכולה להיות מלווה בהופעת פלואורסצנציה כחולה חזקה תחת מקור אור UV. - הוסף 100 מיקרוליטר של תמיסת QuantaBlu Stop לכל באר כדי לעצור את פעילות הפרוקסידאז. סגרו את לוח האיטום והדגרו במשך 10 דקות ב-RT תחת ערבוב ב-350 סל"ד.
- באמצעות קורא לוחות, כוון את אורך גל העירור ל-315 ננומטר ואת הפליטה ל-470 ננומטר. קרא את הלוחית בהקדם האפשרי.
הערה: מומלץ לקרוא את הלוחית הן בקצב אופטימלי והן בהגבר ידני כדי להקל על השוואת ערכים בין הלוחות ולאפשר אינטרפולציה של הנתונים במקרה של טעות במהלך דילול התקנים. לחלופה לערכת QuantaBlu Fluorogenic Peroxidase Substrate, ניתן להשתמש בסובסטרטים אחרים של פרוקסידאז כגון טטרמתילבנזידין (נמדדים ב-450 או 650 ננומטר עם או בלי תמיסת סטופ, בהתאמה), אך השימוש בחלופה זו בא על חשבון רגישות נמוכה יותר.
| פתרון BSA | |||
| MW (g/mol) | נפח סופי = 12.7 מ"ל | ריכוז סופי | |
| מילי-קיו H2O | הביאו לכרך הסופי | ||
| BSA | 66430 | 1.27 גרם | 100 מ"ג/מ"ל |
| קרבס-גלוקוז + BSA | |||
| MW (g/mol) | נפח סופי = 30 מ"ל | ריכוז סופי | |
| קרבס-גלוקוז | הביאו לכרך הסופי | ||
| פתרון BSA | 60 מיקרוליטר | 0.2 מ"ג/מ"ל | |
| PBS טווין | |||
| MW (g/mol) | נפח סופי = 500 מ"ל | ריכוז סופי | |
| PBS 1X | הביאו לכרך הסופי | ||
| טווין-20 | 500 מיקרוליטר | 0.1% | |
| נתרן פחמתי סול. | |||
| MW (g/mol) | נפח סופי = 3.22 מ"ל | ריכוז סופי | |
| מילי-קיו H2O | הביאו לכרך הסופי | ||
| Na2CO3 | 105.99 | 34.13 מ"ג | 0.1 מ' |
| נתרן ביקרבונט סול. | |||
| MW (g/mol) | נפח סופי = 12.7 מ"ל | ריכוז סופי | |
| מילי-קיו H2O | הביאו לכרך הסופי | ||
| NaHCO3 | 84 | 106.68 מ"ג | 0.1 מ' |
| בופר ציפוי pH 9.6 | |||
| כרך סופי ≈ 11 מ"ל | |||
| נתרן פחמתי סול. | 2.58 מ"ל | ||
| נתרן ביקרבונט סול. | הוסף עד ל-pH = 9.6 (~8.4 מ"ל) | ||
| תקן 10 מיקרומום HRP | |||
| ריכוז התחלתי | נפח סופי = 5 מ"ל | ריכוז סופי | |
| קרבס-גלוקוז | הביאו לכרך הסופי | ||
| פתרון HRP | 8.8 מ"ג/מ"ל | 50 מיקרוליטר | 0.088 מ"ג/מ"ל |
| פתרון BSA | 100 מ"ג/מ"ל | 10 מיקרוליטר | 0.2 מ"ג/מ"ל |
| תקן HRP 1.5 ננומטר | |||
| ריכוז התחלתי | נפח סופי = 15 מ"ל | ריכוז סופי | |
| קרבס-גלוקוז | הביאו לכרך הסופי | ||
| תקן 2.0 מיקרומום HRP | 0.088 מ"ג/מ"ל | 2.25 מיקרוליטר | 13.2 ng/mL |
| פתרון BSA | 0.2 מ"ג/מ"ל | 3 מיקרוליטר | 40 ng/mL |
| פתרון נוגדנים נגד HRP | |||
| ריכוז התחלתי | נפח סופי = 10 מ"ל | ריכוז סופי | |
| בופר ציפוי | הביאו לכרך הסופי | ||
| נוגדן אנטי-HRP | 5.6 מ"ג/מ"ל | 8.93 מיקרוליטר | 5 מיקרוגרם/מ"ל |
טבלה 6: הכנת התמיסה ביום שלפני ניסוי HRP.
| מאגר חסימת BSA | |||
| ריכוז התחלתי | נפח סופי = 25 מ"ל | ריכוז סופי | |
| PBS 1X | 12.5 מ"ל | ||
| פתרון BSA | 100 מ"ג/מ"ל | 12.5 מ"ל | 50 מ"ג/מ"ל |
טבלה 7: הכנת בופר חוסם BSA ביום ניסוי HRP.
| סטנדרט | קרבס-גלוקוז + BSA | תקן HRP 1.5 ננומטר | Fmol HRP/50 μL |
| Blank | 1000 מיקרוליטר | 0 מיקרוליטר | 0 |
| 1 | 993.75 מיקרוליטר | 6.25 מיקרוליטר | 0.09375 |
| 2 | 987.5 מיקרוליטר | 12.5 מיקרו-ליטר | 0.1875 |
| 3 | 975 מיקרו-ליטר | 25 מיקרוליטר | 0.375 |
| 4 | 950 מיקרוליטר | 50 מיקרוליטר | 0.75 |
| 5 | 900 מיקרוליטר | 100 מיקרוליטר | 1.5 |
| 6 | 850 מיקרוליטר | 150 מיקרוליטר | 2.25 |
| 7 | 800 מיקרוליטר | 200 מיקרוליטר | 3 |
| 8 | 700 מיקרוליטר | 300 מיקרוליטר | 4.5 |
| 9 | 600 מיקרוליטר | 400 מיקרוליטר | 6 |
| 10 | 400 מיקרוליטר | 600 מיקרוליטר | 9 |
| 11 | 200 מיקרוליטר | 800 מיקרוליטר | 12 |
טבלה 8: הכנה סטנדרטית ל-HRP ביום ניסוי ה-HRP.
| פתרון עבודה של QuantaBlu | |
| נפח סופי = 12 מ"ל | |
| פתרון מצע QuantaBlu | 10.8 מ"ל |
| תמיסת מי חמצן QuantaBlu יציבה | 1.2 מ"ל |
טבלה 9: הכנת פתרון עבודה ב-QuantaBlu ביום ניסוי HRP.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
כימות עקומה סטנדרטית וריכוז באר
הערך הממוצע של כדורים ריקים הופחת מכל באר בפלטה. עם ערכי הספיגה בציר Y וריכוזים בציר X, נוצרה עקומה סטנדרטית באמצעות פונקציית "אינטרפולציה של עקומה סטנדרטית" מפריזמת GraphPad. אם כל הנקודות הסטנדרטיות מיושרות, מודל ה"קו" מספק את התוצאות הטובות ביותר. חלופה נוספת היא מודל "סיגמואידלי, 4 PL, X הוא ריכוז" מציע גמישות ודיוק רב עם אינטרפולציה עקומה סטנדרטית לא ליניארית (איור 6). ערכי הספיגה של דגימות בציר Y הודבקו מתחת לתקן והחזירו את הריכוזים מ...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
גאווג' אורלי מאפשר מתן חוזר של מינון לומינלי מדויק ומוגדר לעכברים יילודים בודדים. לעומת זאת, האכלה וולונטרית, אף שהיא חלופה ישימה, דורשת הארכת זמן מתן לכל בעל חיים כדי לספק כמות תרכובת נמוכה יותר עם דיוק מינון מופחת12. יתרה מזאת, גאווז אוראלי מאפשר נפחים גדולים יותר מאלו האפשריים בדרכי הזרקה, מה שמקל על מינונים כוללים גבוהים יותר בריכוזים נמוכים וכך מפחית את הרעילות הפוטנציאלית במתן13. מעבר דרך מערכת העיכול מגביל עוד יותר את נפח הת...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.
תודות
עבודה זו בוצעה בתמיכה כספית מ-ANR-11-IDEX-0005-02 Laboratoire d'excellence INFLAMEX, פרס מקרן האבן (2025, AP-RM-24-012), ומענקי ANR Diab1GUT (ANR-24-CE15-7152). המחקר נערך במסגרת קונסורציום INFIBREX ונהנה מתמיכת תוכנית ההשקעות "צרפת 2030", שהושקה על ידי ממשלת צרפת ויושמה על ידי אוניברסיטת פריז סיטי במסגרת תוכנית IdEx "יוזמת המצוינות" (ANR-18-IDEX-0001). אנו מודים בהכרת תודה לפלטפורמת הטכנולוגיה של לשכת אוסינג במרכז מחקר הדלקת על תמיכתם היקרה, ומודים במיוחד לאלכסנדרה וילמץ ולמוד לה גאל על עזרתן המומחית. אנו גם רוצים להביע את תודתנו הכנה לפלטפורמת מתקני בעלי החיים במרכז מחקר הדלקת על תמיכתם החיונית, עם תודה מיוחדת לאיזבל רנו וגיום אנסלמה.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 10x DPBS ללא Ca & מ"ג | דולבקוס | 14200091 | |
| נוגדן אנטי-HRP | האתר הביולוגי הנורדי | GTX10183 | פרוקסידאז פרוקסידאז של עכבר מונוקלונלי [2H11] |
| לופה בינוקולרית | אולימפוס | SZ61 | אין צורך במפרט. |
| פלט שחור עם 96 בארות שטוח | תרמופישר סיינטיפיק | 137101 | הלוחות חייבים להיות שחורים ומותאמים לקריאות פלואורסציה. יש להסיר את המכסה בזמן הקריאה. |
| BSA | מרק | A4503 | |
| עכברים C57BL/6J | נהר צ'ארלס | 632C57BL/6J | |
| CaCl2 | מרק | 2382 | |
| קשורה שקופה עם 96 בארים, קשוף שטוח תחתית גבוהה | קורנינג | 9018 | |
| D-(+)-גלוקוז | מרק | G8270 | |
| H2O מזוקק | |||
| D-מניטול | מרק | M4125 | |
| מלקחיים עדינים | FST | 11445-12 | |
| מספריים עדינים | FST | 14058-09 | |
| FITC-Dextran 4Kd | FD4 | TdB Labs | רגיש לפירוק פוטוגרפיטי. |
| כרית חימום | מינרוב | 20 031 01 | |
| HRP | מרק | P8375 | |
| MgCl2, 6H2O | מרק | M2670 | |
| מילי-קיו H2O | |||
| מערכת ושימוש ב-P2300 EasyMount לשכות | כלים פיזיולוגיים | EM6-C-CE | מערכות, תאים וסליידרים חייבים להיות תואמים כולם. |
| סליידר תא Ussing P2306 | כלים פיזיולוגיים | PI-P2306 | דגמים שונים של סליידרים זמינים לגדלים וצורות שונות של רקמות. |
| ערכת מצע פרוקסידאז פלואורוגנית של QuantaBlu | תרמופישר סיינטיפיק | 15169 | |
| מחטים רב-פעמיות עם קצה עגול | FST | 18061-24 | 24 גייג', קצה בקוטר 1.25 מ"מ, קצה עגול. יש לכבס במים סטריליים, אתנול 70% ולהיות מאוטוקלב לפני השימוש. |
| נתרן ביקרבונט | מרק | S6297 | |
| פחמת נתרן | מרק | S7795 | |
| ספקטרופוטומטר | TECAN | Spark 10M | נדרש קורא לוחות עם רכישה עליונה אם משתמשים בלוחות השחורים 137101. |
| טווין-20 | מרק | P7949 |
מקורות
- Di Vincenzo, F., Del Gaudio, A., Petito, V., Lopetuso, L. R., Scaldaferri, F. Gut microbiota, intestinal permeability, and systemic inflammation: A narrative review. Intern Emerg Med. 19 (2), 275-293 (2024).
- Mu, Q., Kirby, J., Reilly, C. M., Luo, X. M. Leaky gut as a danger signal for autoimmune diseases. Front Immunol. 8, 598(2017).
- Sorini, C., et al. Loss of gut barrier integrity triggers activation of islet-reactive T cells and autoimmune diabetes. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (30), 15140-15149 (2019).
- An, J., et al. The role of intestinal mucosal barrier in autoimmune disease: a potential target. Front Immunol. 13, 871713(2022).
- Picco, P., et al. Increased gut permeability in juvenile chronic arthritides: a multivariate analysis of the diagnostic parameters. Clin Exp Rheumatol. 18 (6), 773-778 (2000).
- Dunleavy, K. A., Raffals, L. E., Camilleri, M. Intestinal barrier dysfunction in inflammatory bowel disease: underpinning pathogenesis and therapeutics. Dig Dis Sci. 68 (12), 4306-4320 (2023).
- Borrego-Ruiz, A., Borrego, J. J. Early-life gut microbiome development and its potential long-term impact on health outcomes. Microbiome Res Rep. 4 (2), 20(2025).
- Di Costanzo, M., De Paulis, N., Biasucci, G. Butyrate: A link between early life nutrition and gut microbiome in the development of food allergy. Life (Basel). 11 (5), 384(2021).
- Kindgren, E., Ahrens, A. P., Triplett, E. W., Ludvigsson, J. Infant gut microbiota and environment associate with juvenile idiopathic arthritis many years prior to disease onset, especially in genetically vulnerable children. eBioMedicine. 93, 104654(2023).
- Borowitz, S. M. The epidemiology of inflammatory bowel disease: clues to pathogenesis. Front Pediatr. 10, 1103713(2023).
- Leete, P., et al. The effect of age on the progression and severity of type 1 diabetes: potential effects on disease mechanisms. Curr Diab Rep. 18 (11), 115(2018).
- Francis, F., et al. Probiotic studies in neonatal mice using gavage. J Vis Exp. (143), e59074(2019).
- McClain, R. M., et al. Neonatal mouse model: review of methods and results. Toxicol Pathol. 29 (Suppl), 128-137 (2001).
- Thomson, A., et al. The Ussing chamber system for measuring intestinal permeability in health and disease. BMC Gastroenterol. 19, 98(2019).
- Clarke, L. L. A guide to Ussing chamber studies of mouse intestine. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 296 (6), G1151-G1166 (2009).
- Westerhout, J., Wortelboer, H., Verhoeckx, K. Ussing chamber. The Impact of Food Bioactives on Health: in vitro and ex vivo models. , (2015).
- Hempstock, W., Ishizuka, N., Hayashi, H. Functional assessment of intestinal tight junction barrier and ion permeability in native tissue by Ussing chamber technique. J Vis Exp. (171), e62468(2021).
- Sjögren, E., Eriksson, J., Vedin, C., Breitholtz, K., Hilgendorf, C. Excised segments of rat small intestine in Ussing chamber studies: A comparison of native and stripped tissue viability and permeability to drugs. Int J Pharm. 505 (1), 361-368 (2016).
- Moussaoui, N., et al. Changes in intestinal glucocorticoid sensitivity in early life shape the risk of epithelial barrier defect in maternal-deprived rats. PLoS One. 9 (2), e88382(2014).
- Gleeson, J. P., et al. The enhanced intestinal permeability of infant mice enables oral protein and macromolecular absorption without delivery technology. Int J Pharm. 593, 120120(2021).
- Birchenough, G. M. H., et al. Postnatal development of the small intestinal mucosa drives age-dependent, regio-selective susceptibility to Escherichia coli K1 infection. Sci Rep. 7 (1), 83(2017).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
