מאמר שיטה

שיטה מפושטת לטרנספורמציה בתיווך אגרובקטריום של Phytophthora palmivora

DOI:

10.3791/69753

⸱

20 במרץ 2026

 ,  , 
1Department of Plant Pathology, University of Georgia

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מציגים פרוטוקול פשוט, יעיל וניתן לשכפול לטרנספורמציה בתיווך אגרובקטריום של Phytophthora palmivora, שמתאים גם ל-P. capsici.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Phytophthora הוא סוג אומיצטים המכיל פתוגנים הרסניים רבים של צמחים, ביניהם המין רחב הטווח P . palmivora. הגנומיקה הפונקציונלית של פיטופתורה מוגבלת בשל זמינות מוגבלת של שיטות טרנספורמציה חזקות וקלות ליישום. מבין הגישות הזמינות, טרנספורמציה מתווכת אגרובקטריה (AMT) אטרקטיבית במיוחד משום שהיא דורשת ציוד מיוחד מינימלי ולעיתים מייצרת טרנספורמנטים יציבים עם החדרת גנים בעותק יחיד. רוב פרוטוקולי AMT לטרנספורמציה פטרייתית ואומיצטים משתמשים במלחים במדיום מינימלי (MM) במדיות השראת Agrobacterium ובגידול משותף. הכנת המדיה הזו כוללת בדרך כלל ייצור וערבוב של מספר תמיסות סטוק, כאשר חלקן מכילים רכיבים רבים בריכוזים שונים. התהליך גוזל זמן ורגיש לטעויות, ולכן מוביל להצלחה לא עקבית בטרנספורמציה. כאן אנו מציגים פרוטוקול AMT פשוט, יעיל וניתן לשחזור עבור P. palmivora, המשתמש במדיה בסיסית מסחרית של Murashige ו-Skoog (MS) להכנת מדיום ההשראה והעיבוד המשותף של אגרובקטריום . פרוטוקול זה יושם בהצלחה גם בטרנספורמציה של P. capsici ויכול להיות מיושם גם על סוגים אחרים של Phytophthora .

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Phytophthora, סוג של אומיצטים, כולל רבים מהפתוגנים הצמחיים ההרסניים ביותר בעולם, האחראים להפסדים כלכליים חמורים 1,2. ביניהם, Phytophthora palmivora הוא פתוגן רחב טווח שמדביק גידולים רבים בעלי חשיבות כלכלית, כולל קקאו ופפאיה3. זהו הגורם הסיבתי הנפוץ ביותר לריקבון תרמיל שחור בקקאו, עץ טרופי רב-שנתי שמייצר את המרכיב המרכזי בתעשיית השוקולד בשווי מיליארדי דולרים 4,5,6. הבנת מנגנוני הפתוגניות המולקולרית של פתוגן הרסני זה היא קריטית לעיצוב אסטרטגיות חדשות ויעילות לשליטה במחלות, והטרנספורמציה הגנטית היא כלי חיוני לאפשר חקירות כאלה.

פותחו מספר שיטות להמרת מיני פיטופתורה, כולל הפצצהמיקרופרויקטילית 7, טרנספורמציית פרוטופלסט 8,9,10,11 בתיווך פוליאתילן גליקול ודיכלוריד סידן (PEG/CaCl2), אלקטרופורציה זואוספורים 12,13,14, וטרנספורמציה מתווכת אגרובקטריה (AMT)15.16. מבין הגישות הללו, AMT מציע יתרונות מרכזיים שכן הוא בדרך כלל מייצר אינטגרציה של העתקה בודדת 15,16 והוא יחסית קל לביצוע ללא צורך בציוד מיוחד.

פרוטוקול לטרנספורמציה יעילה של P. palmivora באמצעות AMT פותח בעבר16. בשיטה זו, הצלחנו להמיר את P. palmivora עם מספר מבנים17,18. שיטה זו עושה שימוש במדיות אינדוקציה וגידול משותף מבוססות מלח על ידי מדיום מינימלי (MM), המשמשות בדרך כלל לטרנספורמציה פטרייתית ואומיצטים 15,16,19. למרות שפרוטוקול הטרנספורמציה המבוסס MM הוכח כיעיל ביצירת טרנספורמנטים, הכנת פתרונות מלאי מרובים ושילובם ליצירת מדיה יכולה להיות משימה שגוזלת זמן ורגישה לטעויות.

כאן, אנו מציגים שיטה פשוטה הרבה ל-AMT של P. palmivora באמצעות מדיום בסיסי מסחרי של Murashige ו-Skoog (MS) להחלפת רכיבי התווך המלח MM במדיה האינדוקציה והעיבוד המשותפת של Agrobacterium 16. שיטה זו מבטלת את הצורך בהכנת תמיסות מלאי כימיות מרובות, מה שהופך את התהליך לפחות גוזל זמן וניתן לשחזור רב. יתרה מזאת, גישה זו נראית כמניבה יעילות טרנספורמציה גבוהה יותר בהשוואה לשיטה16 שתוארה קודם, והיא גם רלוונטית ל-P. capsici.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת תמיסות סטוק, מדיה וחומרים נוספים הנדרשים לטרנספורמציה

  1. תמיסות מלאי אנטיביוטיקה
    1. הכינו תמיסות מלאיות של קאנאמיצין (50 מ"ג/מ"ל), G418 (15 מ"ג/מ"ל) וספוטקסים (100 מ"ג/מ"ל): המיס כמויות מתאימות של אנטיביוטיקה במים, סינון של התמיסות, הכין אליקוות של 1 מ"ל, ואחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
    2. הכינו תמיסת ריפמפיצין (15 מ"ג/מ"ל): המיססו את הכמות המתאימה של ריפמפצין ב-DMSO, הכינו אליקווטים של 1 מ"ל, עטפו אותם בנייר כסף ואחסנו בטמפרטורה של מינוס 20 מעלות צלזיוס.
      הערה: ודאו שאתם מסננים את התמיסות הכימיות המוכנות ב-DMSO באמצעות מסנני מזרקים העשויים מחומרים תואמי DMSO, כגון ניילון או PTFE (טפלון).
  2. מדיה לצמיחת אגרובקטרים
    1. מדיום נוזלי לוריה-ברטאני (LB): להכנת 250 מ"ל מדיום, מוסיפים 6.25 גרם אבקה ל-250 מ"ל מים, אוטוקלב את התמיסה ואחסנו אותה בטמפרטורת החדר (RT).
    2. מדיום אגר LB: להכנת 250 מ"ל מדיום, הוסיפו 6.25 גרם אבקת LB ו-3.75 גרם אגר ל-250 מ"ל מים, אוטוקלב את התמיסה ואחסנו ב-RT. הוסיפו אנטיביוטיקה מתאימה לאגר LB המומס לפני הכנת הצלחות. אחסן את הצלחות עם אנטיביוטיקה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  3. מדיה לצמיחה וטרנספורמציה של P. palmivora
    1. אגר 10% V8: להכנת 500 מ"ל, הוסיפו 50 מ"ל מיץ ירקות מקורי V8 100% ל-450 מ"ל מים. לאחר מכן מוסיפים 0.5 גרם CaCO3 למתלים ומערבבים כדי לערבב היטב. אוטוקלאב את התמיסה ושפך אותו לצלחות.
      הערה: הוסיפו אנטיביוטיקה מתאימה בעת הצורך. אחסן את הצלחות עם אנטיביוטיקה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
    2. מדיום נוזלי Murashige ו-Skoog (חצי MS) בעוצמה חצי: הוסף 2.15 גרם של מדיום בסיסי Murashige ו-Skoog (MS) ל-950 מ"ל מים, כוון את ה-pH ל-5.6 עם 1 N KOH, והוסף מים עד 1 ליטר. השתמש ישירות להכנת חצי MS אגר (שלב 1.3.3), אוטוקלב את חצי MS הנוזל הנותר ואחסון ב-RT.
    3. 1/2MS אגר לאגר גידול משותף של אגרובקטריום-זואוספור (AZCA): להכנת 600 מ"ל AZCA, יש לערבב 567 מ"ל של 1/2 MS נוזל מהשלב 1.3.2 עם 9 גרם אגר. תעשה את הפתרון באוטוקלאב ותשמור אותו ב-RT.
    4. 50% גליצרול: ערבב 50 מ"ל גליצרול עם 50 מ"ל מים, טוקלאב את התמיסה ואחסן אותו ב-RT.
    5. 1M MES (pH 5.6): להכנת 200 מ"ל, הוסף 39.048 גרם MES Hydrate ל-160 מ"ל מים, ואז כוון את ה-pH ל-5.6 עם תמיסת NaOH. לאחר מכן, הוסף מים עד 200 מ"ל, חטא את התמיסה במסנן, ואחסן אותו ב-RT בתנאי חשוך.
      הערה: MES יתמוסס בהדרגה ככל שה-pH עולה. בהתחלה, השתמש ב-10 N NaOH כדי להביא את ה-pH קרוב ל-5.6, מה שכמעט ימס את האבקה. לאחר מכן, מוסיפים 1 N NaOH כדי להביא את ה-pH בדיוק ל-5.6.
    6. 20% גלוקוז: ממיס 10 גרם גלוקוז ב-40 מ"ל מים, ואז מוסיפים מים עד 50 מ"ל, מסננים את התמיסה ואחסן אותה ב-RT.
    7. 200 מ"מ אצטוסירינגון (AS): המיס 40 מ"ג 4'-הידרוקסי-3',5'-דימתוקסיאצטופנון ב-1 מ"ל DMSO (ראו הערה תחת 1.1.2) וכסה את התמיסה בנייר כסף. תעשה את זה רענן ביום השינוי.
    8. מדיום השראת אגרובקטריום (AIM): להכנת 40 מ"ל מדיום, יש להוסיף 400 מיקרוליטר של 50% גליצרול, 400 מיקרוליטר של 20% גלוקוז, 1.6 מ"ל של 1 מ' MES (pH 5.6), 40 מיקרוליטר של 200 מ"מ AS ל-37.6 מ"ל של תמיסת 1/2 MS נוזלית (pH 5.6) (מוכנה בשלב 1.3.2) בצינור סטרילי של 50 מ"ל. ערבבו היטב את התמיסה, כסו את הצינור בנייר אלומיניום, והשתמשו בו טרי תוך כמה שעות.
    9. אגר גידול משותף של אגרובקטריום-זוספור (AZCA): להכנת 600 מ"ל של האגר, הוסף 6 מ"ל של 50% גליצרול, 3 מ"ל של 20% גלוקוז, 24 מ"ל של 1 מ' MES (pH 5.6), 600 מיקרוליטר של 200 מ"מ AS ל-567 מ"ל 1/2 MS אגר (pH 5.6) שנמס (הוכן בשלב 1.3.3). שפכו את התמיסה לצלחות וכסו אותן בבד שחור כדי להגן מפני אור.
      הערה: הוסיפו את התמיסות הכימיות ל-1/2 MS אגר מותך (שלב 1.3.9) כאשר הטמפרטורה היא 55-60 מעלות צלזיוס. כבה את האורות במכסה המנוע במהלך שלבים 1.3.7-1.3.9 כי AS רגיש לאור. בצע את שלושת השלבים הללו ביום השינוי.
    10. פליך אגר: להכנת ליטר 1 של האגר, ב-950 מ"ל מים, מוסיפים 0.5 גרם KH2PO4, 0.25 גרם MgSO4.7H 2O, 1 גרם L-אספרגין, 5 גרם גלוקוז, 0.5 גרם תמצית שמרים, 10 מיקרוליטר תיאמין (100 מ"ג/מ"ל במים, מאוחסן ב-4 מעלות צלזיוס), 10 מ"ג β-סיטוסטרול (מומס ב-3 מ"ל אתנול לפני ההוספת). ערבבו את התמיסה כדי להמיס את כל המרכיבים, ואז הוסיפו מים כדי להגיע לנפח עד 1 ליטר. חלקו את התמיסה למנות של 500 מ"ל והוסיפו 7.5 גרם אגר לכל 500 מ"ל. אוטוקלב את התמיסה ומוסיפים אנטיביוטיקה מתאימה כאשר הטמפרטורה יורדת ל-55 מעלות צלזיוס, ואז שפכו אותו לצלחות.
    11. ממברנת Hybond N+: חותכים את הממברנה עם היריעות המגנות לחתיכות בגודל 5 ס"מ על 6 ס"מ, עטופים את החלקים בנייר אלומיניום, ומעטפים אותם באוטוקלאב. בעת הנחת הממברנה האוטומטית על מדיום AZCA, טפלו בה עם מלקחיים סטריליים והשליכו את הסדינים המגנים.

2. גידול P. palmivora

  1. שבעה עד שמונה ימים לפני השינוי, גדלו את P. palmivora papaya isolate P116 על פלטות אגר טריות של 10% V8 על ידי הנחת פקק אגר אחד של תרבית פיטופטורה שגדלה בעבר (או מהקק) במרכז צלחת הפטרי.
    הערה: כדי לקבל ריכוז גבוה יותר של זואוספורות, חשוב להשתמש באגר V8 של 10% וטרי, לא מסודר.
  2. דגרו את הלוחות בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס במחזור של 12 שעות אור ו-12 שעות חושך למשך 7-8 ימים עד לשינוי.

3. הכנת Agrobacterium tumefaciens

  1. שלושה ימים לפני השינוי, סטריק של זן A. tumefaciens EHA105 הנושא pCB301TOR-GFP16 על פלטת אגר LB בתוספת ריפמפיצין (15 מיקרוגרם/מ"ל) וקאנאמיצין (50 מיקרוגרם/מ"ל). דגרו את הצלחת בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס למשך יומיים.
    הערה: ההכנה הראשונית של אגרובקטריה (שלב 3.1) יכולה להיעשות שבוע לפני השינוי, והצלחות יכולות להיאחסן בטמפרטורה של 4°C לאחר תקופת הדגירה בת יומיים.
  2. ביום שלפני הטרנספורמציה, יש לקחת כמות קטנה של תאי אגרובקטריום ולמרח אותם על צלחת אגר LB חדשה עם אנטיביוטיקה (כמתואר בשלב 3.1) באמצעות תחתית ובסיס שטוח של צינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי בנפח 1.5 מ"ל. להפצה קלה יותר, הוסף 20 מיקרוליטר מדיום נוזלי LB למרכז לוח האגר של LB, ערבב את תאי החיידקים עם מדיום LB, ואז מפזר אותם באופן שווה על פני הצלחת. דגרו את הצלחת בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס למשך כ-16-18 שעות.
  3. חטפו את התאים שגדלו במהלך הלילה עם קצה פיפטה בנפח 1 מ"ל והחזירו אותם במדיום השראה של אגרובקטריה (AIM) של 1 מ"ל על ידי פיפטינג למעלה ולמטה. מדלל את התאים ל-OD600 = 0.4 עם AIM בצינור סטרילי של 50 מ"ל מכוסה בנייר כסף. הפכו מינימום של 5 מ"ל לשימוש לדגירה משותפת עם P. palmivora zoospores (שלב 5.1).
    הערה: OD600 בטווח של 0.1 עד 0.8 יאפשר טרנספורמציה מוצלחת. OD600 = 0.4 משמש באופן שגרתי, שכן ריכוז זה הפיק את יעילות הטרנספורמציה הגבוהה ביותר כאשר השתמשו במדיות השראת המלח המדיום המינימלי (MM) של אגרובקטריום וגידול משותף לטרנספורמציה16.
  4. דגרו את החיידקים ב-RT בתנאים חשוכים למשך 1.5-2 שעות על מנער פלטפורמה עם ערבוב עדין (כ-70 סל"ד).
    הערה: מומלץ להשאיר את אורות מכסה המנוע כבויים במהלך שלב 3.3 ולשחרר את מכסה צינור ה-50 מ"ל במהלך הדגירה (שלב 3.4).

4. שחרור הזאוספורות

  1. לאחר שעה אחת של דגירה של Agrobacterium tumefaciens (שלב 3.4), שופכים צלחת P. palmivora בת 7-8 ימים במים מקוררים מראש ב-4°C, מסירים את בועות האוויר על פני המדיה על ידי טפיחה עדינה עם קצה פיפטה, ודגרו את הפלטה בטמפרטורה של 4°C למשך 15 דקות, ואחר כך 15 דקות ב-RT באור.
  2. העבר בעדינות את הזאוספורות המשוחררות (כ-7-8 מ"ל) לצינור צנטריפוגה סטרילי של 15 מ"ל עם פיפטה מבלי להפריע למיציליה ולספורנגיה.
  3. כדי למדוד את ריכוז הזואוספורים, העבירו חלק מהמתלה של הזואוספורים (למשל, 20 מיקרוליטר) לצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל ומדללים אותו 10 פעמים במים (180 מיקרוליטרH 2O עבור 20 מיקרו-ליטר זואוספורים). יש לסחרור את הצינור למשך דקה אחת כדי להצטבר את הזואוספורים לספירה קלה, ואז לספור את מספר הזאוספורות תחת מיקרוסקופ באמצעות המאציטומטר. הכפל את המספר שנספר פי 10 כדי לקבוע את ריכוז תליית הזוספורים שהוכן בשלב 4.2.
    הערה: ריכוז הזואוספורים נמדד לחישוב יעילות הטרנספורמציה. בדרך כלל אנו משתמשים בריכוזים הנעים בין 1.5 × 106 ל-5 × 10עד 6 זואוספורות למילילטר, עם הצלחה בטרנספורמציה.

5. דגירה משותפת של אגרובקטריום וזואוספורות

  1. הוסף 5 מ"ל אגרובקטריה (שהוכן בשלב 3.4) ל-5 מ"ל של תליית זואוספור (שהוכן בשלב 4.2) לתוך צינור סטרילי של 50 מ"ל מכוסה בנייר כסף. ערבב בעדינות ודוגר את הצינור ב-RT במשך שעתיים בחושך. שמור על המכסה רפוי ואל תנער את הצינור במהלך הדגירה.
  2. במהלך תקופת הדגירה המשותפת (שלב 5.1), יש להכין את לוחות ה-AZCA (שלב 1.3.9). כאשר המדיום מתקשה, מניחים חתיכה אחת של ממברנת Hybond N+ מעוקרת (שהוכנה בשלב 1.3.11) על כל פלטת AZCA ושמרו על הלוחות בחושך.
  3. לאחר 2 שעות של דגירה משותפת של אגרובקטריה וזוספור (שלב 5.1), פזרו 300 מיקרוליטר מהתערובת על כל ממברנת Hybond N+ המונחת מעל לוחות ה-AZCA (שלב 5.2) עם קצה פיפטה, ומשאירים את השוליים חופשיים מהנוזל.
  4. תן לתערובת להתייבש באוויר כ-10 דקות במכסה המנוע על ידי השארת צלחות פטרי חשופות. כסו את הלוחות ברגע שהתמיסה על הממברנה מפסיקה לזרום.
    הערה: בשלבים 5.1-5.4, השאר את אורות מכסה המנוע כבויים. אם יש צורך, יש להשתמש באורות תוך כדי הוספה ופיזור התערובת על הממברנות (שלב 5.3).
  5. לאחר ייבוש באוויר, דגרו את הלוחות בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס בחושך למשך יומיים.

6. בחירת טרנספורמנטים עמידים ל-G418

  1. לאחר 48 שעות של דגירה משותפת (שלב 5.5), העבירו את ממברנות ה-Hybond N+ הפוכות באמצעות מלקחיים מעוקרים לפלטות אגר פליץ' עם G418 (30 מיקרוגרם/מ"ל) וספוטקסים (100 מיקרוגרם/מ"ל). בעת הנחת הממברנות על הלוחות, אל תגרור אותן על פני השטח של המדיום.
    הערה: יש לקבוע את ריכוז G418 לבחירת טרנספורמנטים עבור כל בידוד P. palmivora , שכן רמות רגישות שונות נצפות עבור מבודדים שונים. לשם כך, יש להניח פקק מיציליום בקוטר 0.5 ס"מ במרכז לוחות האגר של פליך, בתוספת סדרה של ריכוזי G418 במרווחים של 5 מיקרוגרם/מ"ל החל מאפס. הכינו שלוש פלטות שכפול לכל ריכוז. דגרו את הצלחות בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס למשך 7 ימים. זהה את הריכוז הנמוך ביותר של G418 שמעכב לחלוטין את גדילת בידוד הפיטופתורה והשתמש בו לבחירת טרנספורמנטים.
  2. השתמש בבסיס השטוח של צינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל כדי ללחוץ בעדינות ולהחליק מעל פני הממברנה כדי לוודא שהיא במגע קרוב עם המדיום. התבונן בתחתית הלוחות כדי לבדוק את נוכחות בועות האוויר בין הממברנה למדיום. סחט בעדינות את בועת האוויר, אם יש, באמצעות הבסיס השטוח של אותו צינור מיקרוצנטריפוגה.
  3. דגרו את הלוחות במחזור אור של 12 שעות ו-12 שעות חושך בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס למשך 2-3 ימים.
  4. לאחר 3 ימי דגירה, יש להסיר את הממברנות באמצעות מלקחיים סטריליים ולהמשיך לדגור את הלוחות באותם תנאים. ניתן להסיר את הממברנות לאחר יומיים אם מופיעות מושבות נראות לעין על הלוחות.
    הערה: הטרנספורמנטים מופיעים בדרך כלל בתוך 1-3 ימים לאחר הסרת הממברנה, אך ייתכן שחלק מהמושבות יופיעו מאוחר יותר. כדי להפיק יותר טרנספורמנטים, יש לעקוב אחרי הלוחות במשך כשבוע לאחר הסרת הממברנות.
  5. העבר את הטרנספורמנטים לפלטות אגר V8 של 10% עם אותו ריכוז של G418 או ריכוז מופחת ב-30%.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בעקבות פרוטוקול זה, ערכנו שני ניסויים עצמאיים להמרת P. palmivora באמצעות A. tumefaciens EHA105 הנושא pCB301TOR-GFP16. כצפוי, דגירה משותפת של זואוספורות עם Agrobacterium הניבה מושבות עמידות ל-G418 על לוחות אגר Plich שהושלמו ב-30 מיקרוגרם/מ"ל G418, בעוד שלא נצפו מושבות בלוחות ביקורת ללא זיהום באגרובקטריה (איור 1A). מספר הטרנספורנטים העמידים ל-G418 לכל 107 זואוספורות שנוצרו משני הניסויים הללו היה 55 ו-50, בהתאמה (טבלה 1), שזה כמעט כפול מהמספר הגבוה ביותר (27 ± 5) שהושג בעבר באמצעות פרוטוקול16 הקודם.

טרנספורמנטים אמיתיים אומתו בשתי שיטות: ראשית, תצפית על פלואורסצנציה של GFP באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנציה, ושנית, הגברת PCR של מקטע 550bp של גן EGFP באמצעות Taq 2X Master Mix (NEB) עם זוג הפריימר EGFP-F2 (5'- GACGTAAACGGCCACCAAGTTC-3') ו-EGFP-R2 (5'-GGGGTCCAGGTAGGGTTG-3'). בניסוי (Exp) 1, 15 מתוך 18 טרנספורמנטים עמידים ל-G418, וב-Exp 2, 17 מתוך 21 טרנספורמנטים הציגו פלואורסצנציה של GFP (טבלה 1, איור 1B). בשבעת הטרנספורמנטים העמידים ל-G418 שלא הראו פלואורסצנציה משני הניסויים, שלושה אושרו כטרנספורמנטים אמיתיים באמצעות PCR (איור 1C). בסך הכל, שיעור הטרנספורמנטים האמיתיים הוערך ב-90%.

בנוסף, הצלחנו גם להמיר בהצלחה מבודד דלעת P. capsici , PC2024-14sz, באמצעות A. tumefaciens EHA105 הנושא pCB301TOR-GFP, בהתאם לפרוטוקול עם שינוי קל בהכנת תליית הזואוספורים (תקופת הדגירה ב-4 מעלות צלזיוס לאחר הצפת צלחת P. capsici בת 7 ימים במים מקוררים מראש הוארכה ל-30 דקות). מספר הטרנספורטנטים העמידים ל-G418 (30 מיקרוגרם/מ"ל) לכל 107 מניסוי יחיד היה 13. תשעה טרנספורמנטים נצפו תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי, וכולם יצרו פלואורסצנציה (קובץ משלים 1), מה שמרמז שהם טרנספורמנטים אמיתיים.

figure-results-1
איור 1: טרנספורמציה של P. palmivora באמצעות A. tumefaciens EHA105 הנושא pCB301TOR-GFP. (א) הופעת טרנספורמנטים עמידים ל-G418 של P. palmivora על אגר פליך בתוספת 30 מיקרוגרם/מ"ל G418. (ב) זיהוי ביטוי GFP תחת מיקרוסקופ פלואורסצנציה בזן טרנספורמנט מייצג וזן פראי מסוג P. palmivora (WT). התמונות צולמו הן בערוצי פלואורסצנציה של שדה בהיר (BF) והן בערוצי פלואורסצנציה של GFP. (ג) הגברת PCR של EGFP מארבעה טרנספורמנטים עם פלואורסצנציה GFP ניתנת לזיהוי ושבעה ללא הפלואורסצנציה של GFP. זוג פריימר אוניברסלי ITS4/ITS520 שימש להגברת אזור המרווח הפנימי המתועתק (ITS) לבדיקת שלמות ה-DNA. טרנספורמנטים ללא פלואורסצנציה של GFP מודגשים בטקסט מודגש ומקוון תחתון. קיצורים: M = סולם DNA של NEB 100 bp; WT = מבודדת מסוג בר P. palmivora P1; N = PCR בקרה שלילית באמצעות H2O כתבנית אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

ניסוי600 מנת מנת יתר, אגרובקטריהריכוז זואוספורים (/מ"ל)נפח זוספור (mL)מספר הטרנספורמנטים העמידים ל-G418מספר הטרנספורמנטים עם אות GFP שניתן לזהות (זוהה / נצפה)מספר טרנספורמנטים עמידים ל-G418 / 107 זואוספורות
10.41.8 x 1064.34315/1855
20.42.9 x 1064.66717/2150

טבלה 1: יעילות הטרנספורמציה המתווכת על ידי אגרובקטריה של P. palmivora באמצעות A. tumefaciens EHA105 הנושא pCB301TOR-GFP.

קובץ משלים 1: ביטוי GFP תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי בסוג פראי (WT) P. capsici וטרנספורמנט מייצג שנוצר באמצעות A. tumefaciens EHA105 הנושא pCB301TOR-GFP. התמונות צולמו הן בערוצי פלואורסצנציה של שדה בהיר (BF) והן בערוצי פלואורסצנציה של GFP. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה עושה שימוש במורשיג בחצי חוזק ומדיום בסיסי סקוג (1/2 MS) כדי להחליף רכיבים של מלחים במינימום (MM) המשמשים בדרך כלל במדיות השראה וגידול משולב של אגרובקטריום לצורך טרנספורמציה של אומיצטים ופטרייתיות. הכנת מדיה מבוססת מלח MM דורשת ייצור תמיסות מלאיות מרובות מכימיקלים בודדים שונים ואזשילוב התמיסות הללו. חצי MS מכיל גם רכיבים כימיים רבים; עם זאת, מכיוון ש-MS זמינה באופן מסחרי כאבקה מעורבבת מראש, ההכנה המדיום מפשטת את המיסה במים. שינוי זה מקצר משמעותית את זמן הכנת המדיה ומפחית את הסיכון לטעויות אנוש. בנוסף, הפרוטוקול משפר את יעילות הטרנספורמציה, ומניב מספר גדול יותר של טרנספורמנטנטים בהשוואה לשיטת AMT16 שתוארה קודם. הוא גם יעיל בשינוי P . capsici וסביר להניח שיישים גם למינים אחרים של Phytophthora . לתמיכה נוספת ביכולתו הרחבה יותר, מדיום מבוסס טרשת נפוצה שימש בעבר לתרבות משותפת של זני Agrobacterium tumefaciens המבטאים את AtVIP1 (Arabidopsis thaliana VirE2-interacting protein 1) ו-P. infestans zoospores, מה שאפשר טרנספורמציה מוצלחת של P. infestans21.

חשוב לציין שפרוטוקול זה עשוי לייצר אחוז נמוך של חיוביים שגויים. מתוך 39 טרנספורמנטים עמידים ל-G418 שנבדקו בתצפית פלואורסצנציה של GFP או PCR, ארבעה לא הראו פלואורסצנציה או הגברה של EGFP (טבלה 1, איור 1C). מכיוון שאינטגרציה חלקית של T-DNA במהלך טרנספורמציה בתיווך אגרובקטריה אינה נדירה22,23, ייתכן שרק החלק של ה-T-DNA שמכיל את גן NPTII מהפלסמיד pCB301TOR-GFP16 שולב בגנום של P. palmivora. לחילופין, החיוביים השגויים עשויים להיגרם ממגע לא מספק בין הממברנה למדיום הסלקטיבי, מה שמאפשר בריחה מברירה של G418. לכן, הבטחת הממברנה נשארת במגע מלא עם המדיום (שלב 6.2) היא חיונית.

פרוטוקול זה עשוי להיות מפושט עוד יותר. לדוגמה, ניתן להשמיט MES במדיום אינדוקציה של Agrobacterium (AIM) ואגר גידול משותף של Agrobacterium-zoospore (AZCA). MES משמש לעיתים קרובות כסוכן בופר בניסויים ביוכימיים וביולוגיה מולקולרית לשמירה על pH יציב; עם זאת, הכנת תמיסת MES בגודל 1 M ב-pH 5.6 לוקחת מספיק זמן ומוסיף לעלות. ב-AMT של צמחים, כמו בזיליקוםמתוק 24 ופפאיה25, נעשה שימוש בחומר השראה וגידול משותף מבוסס טרשת נפוצה דומה ללא MES, מה שמרמז ש-MES עשוי לא להיות חיוני לטרנספורמציית P. palmivora . נדרשים ניסויים נוספים כדי לוודא שהשמטת MES אינה פוגעת ביעילות ההמרה.

בסך הכול, פרוטוקול מפושט זה מספק פלטפורמה מעשית ונגישה למניפולציה גנטית שגרתית של P. palmivora, P. capsici ואולי אומיצטים נוספים. היא תומכת במגוון רחב של מחקרים יסודיים, כאשר חלקם בעלי פוטנציאל תרגומי, כולל תיוג פלואורסצנטי של פתוגנים למעקב אחר דינמיקת זיהומים, תיוג חלבונים לבחינת מיקום תת-תאי, וניתוחים פונקציונליים באמצעות שינויים ממוקדים בביטוי גנים או רצפי קידוד חלבונים. כאשר הוא משולב עם עריכת גנום מבוססת CRISPR, צפוי שהפרוטוקול יזרז את ניתוח מנגנוני הפתוגניות ויזהר את גורמי האלימות המרכזיים בפתוגנים ההרסניים הללו. התובנות שיתקבלו יאפשרו, בתורן, פיתוח אסטרטגיות חדשות מבוססות מנגנונים לשליטה במחלה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין ניגוד עניינים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחקר נתמך על ידי הקרן הלאומית למדע (פרס NSF מס' 2418799) והמכון הלאומי למזון וחקלאות (פרס NIFA מס' 2023-67013-42262).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צינורות מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"לVWR525-1126
4'-הידרוקסי-3',5' דימתוקסיאצטופנוןTCID2666אצטוסירינגון (AS)
צינור 50 מ"לגריינר ביו-וואן227261
אתנול מוחלטפישר ביוריאגנטיםBP28184
אגרפישר ביוריאגנטיםBP1423-500
נייר אלומיניום
ממברנת היבונד-N+ (30 ס"מ פי 3 מטר)ציטיבהRPN303B
פחמת סידןסיגמא-אלדריץ'239216-500GCaCO3
מלח נתרן Cefotaximeתרמו-סיינטיקה כימיקליםAAJ6269006
D-(+)-גלוקוזסיגמא-אלדריץ'G8270-1KG
ערכת מיקרוביאלית DNeasy PowerLyzerקיאגן12255-50
מלקחיים
מיקרוסקופ פלואורסצנציהצייסמיקרוסקופ פלואורסצנציה ZEISS Axioscope 5 עם מסנן 38 HE
סולפט G418תרמו-סיינטיקה כימיקליםAC329400010
גליצרולסיגמא-אלדריץ'911046-1L
המציטומטר (קו בהיר)האוסר סיינטיפיק
סולפט קאנמיציןביוטכנולוגיה של סנטה קרוזSC-257635
אל-אספרגין אנהידרוסביומדיקל MPICN10079425
LB Broth, מילרפישר ביוריאגנטיםBP1426-2
מגנזיום סולפט הפטהידרטסיגמא-אלדריץ'63138-250GMgSO4· 7H2O
MES הידראטסיגמא-אלדריץ'M2933-100G
מורשיגה וסקוג בסאלי בדיונייםסיגמא-אלדריץ'M5519-50L
צלחת פטרי (100 מ"מ x 15 מ"מ)VWR25384-342
אשלגן דיהידרוגן פוספטסיגמא-אלדריץ'1370391000KH2PO4
ריפמפיציןביוטכנולוגיה של סנטה קרוזSC-200910
Taq 2X Master MixNEBM0270L
תיאמין הידרוכלורידסיגמא-אלדריץ'T4625-5G
ספקטרופוטומטר UV-Visibleפישר סיינטיפיק14-385-355
V8 מיץ ירקות מקורי 100%חברת קמפבל סופ
וורטקסרפישר סיינטיפיק14-955-163
מיםדרגת ביולוגיה מולקולרית, מטוהרת באמצעות מערכת טיהור מים Mill-Q
תמצית שמריםאקרוס611805000זמין כיום דרך Thermo Scientific Chemicals
β-סיטוסטרולסיגמא-אלדריץ'85451-100G

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kamoun, S., et al. The top 10 oomycete pathogens in molecular plant pathology. Mol Plant Pathol. 16 (4), 413-434 (2015).
  2. Jones, J. D., Staskawicz, B. J., Dangl, J. L. The plant immune system: From discovery to deployment. Cell. 187 (9), 2095-2116 (2024).
  3. Tocafundo, F., et al. Direct and cross-pathogenicity of Phytophthora palmivora against cacao, papaya, and peach palm. Trop Plant Pathol. 46 (6), 664-673 (2021).
  4. Morales-Cruz, A., et al. Independent whole-genome duplications define the architecture of the genomes of the devastating West African cacao black pod pathogen Phytophthora megakarya and its close relative Phytophthora palmivora. G3 (Bethesda). 10 (7), 2241-2255 (2020).
  5. Ali, S., et al. PCR-based identification of cacao black pod causal agents and identification of biological factors possibly contributing to Phytophthora megakarya's field dominance in West Africa. Plant Pathol. 65 (7), 1095-1108 (2016).
  6. Marelli, J. -P., et al. Chocolate under threat from old and new cacao diseases. Phytopathology. 109 (8), 1331-1343 (2019).
  7. Cvitanich, C., Judelson, H. S. Stable transformation of the oomycete, Phytophthora infestans, using microprojectile bombardment. Curr Genet. 42 (4), 228-235 (2003).
  8. Judelson, H. S., Tyler, B. M., Michelmore, R. W. Transformation of the oomycete pathogen, Phytophthora infestans. Mol Plant Microbe Interact. 4 (6), 602-607 (1991).
  9. Wang, W., et al. an oxathiapiprolin-resistance gene, functions as a novel selection marker for Phytophthora transformation and CRISPR/Cas9 mediated genome editing. Front Microbiol. 10, 2402(2019).
  10. Dai, T., et al. An improved transformation system for Phytophthora cinnamomi using green fluorescent protein. Front Microbiol. 12, 682754(2021).
  11. Fang, Y., Cui, L., Gu, B., Arredondo, F., Tyler, B. M. Efficient genome editing in the oomycete Phytophthora sojae using CRISPR/Cas9. Curr Protoc Microbiol. 44 (1), 21A.1.1-21A.1.26 (2017).
  12. Evangelisti, E., Yunusov, T., Shenhav, L., Schornack, S. N-acetyltransferase AAC (3)-i confers gentamicin resistance to Phytophthora palmivora and Phytophthora infestans. BMC Microbiol. 19 (1), 265(2019).
  13. Dong, L., et al. Establishment of the straightforward electro-transformation system for Phytophthora infestans and its comparison with the improved PEG/CaCl2 transformation. J Microbiol Methods. 112, 83-86 (2015).
  14. Huitema, E., Smoker, M., Kamoun, S. A straightforward protocol for electro-transformation of Phytophthora capsici zoospores. Methods Mol Biol. 712, 129-135 (2011).
  15. Vijn, I., Govers, F. Agrobacterium tumefaciens mediated transformation of the oomycete plant pathogen Phytophthora infestans. Mol Plant Pathol. 4 (6), 459-467 (2003).
  16. Wu, D., Navet, N., Liu, Y., Uchida, J., Tian, M. Establishment of a simple and efficient Agrobacterium-mediated transformation system for Phytophthora palmivora. BMC Microbiol. 16 (1), 204(2016).
  17. Gumtow, R., Wu, D., Uchida, J., Tian, M. A Phytophthora palmivora extracellular cystatin-like protease inhibitor targets papain to contribute to virulence on papaya. Mol Plant Microbe Interact. 31 (3), 363-373 (2018).
  18. Pettongkhao, S., Navet, N., Schornack, S., Tian, M., Churngchow, N. A secreted protein of 15 kDa plays an important role in Phytophthora palmivora development and pathogenicity. Sci Rep. 10 (1), 2319(2020).
  19. Minz, A., Sharon, A. Electroporation and Agrobacterium-mediated spore transformation. Molecular and Cell Biology Methods for Fungi. Sharon, A. , Humana Press. Totowa, NJ. 21-32 (2010).
  20. Bellemain, E., et al. ITS as an environmental DNA barcode for fungi: An in silico approach reveals potential PCR biases. BMC Microbiol. 10 (1), 189(2010).
  21. Wang, L., et al. A modified Agrobacterium-mediated transformation for two oomycete pathogens. PLoS Pathog. 19 (4), e1011346(2023).
  22. Wu, E., et al. Optimized Agrobacterium-mediated sorghum transformation protocol and molecular data of transgenic sorghum plants. In Vitro Cell Dev Biol Plant. 50 (1), 9-18 (2014).
  23. Sun, L., et al. TDNAscan: A software to identify complete and truncated T-DNA insertions. Front Genet. 10, 685(2019).
  24. Navet, N., Tian, M. Agrobacterium-mediated transformation of sweet basil (Ocimum basilicum). Bio Protoc. 10 (22), e3828-e3828 (2020).
  25. Hasley, J., Dinulong, R. -J., Adhikari, A., Christopher, D., Tian, M. Genome editing of papaya using both Cas9 and Cas12a. bioRxiv. , (2025).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Agrobacterium TransformationZoospore Co IncubationGFP ExpressionGene Function AnalysisFluorescence MicroscopyOomycete TransformationMurashige Skoog MediumG418 SelectionProtein Localization

מאמרים קשורים