הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר מחקר

ציר NEAT1/miR-181a-5p/HMGB1 מווסת קיטוב מקרופאגים ודלקת במודלים של ספסיס

278 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/69802

⸱

16 בינואר 2026

 ,  , 
1Tianjin Medical University General Hospital, 2Department of Critical Care Medicine, Affiliated Hospital of Hebei University

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה משלב דגימות קליניות, מאקרופאגים מתורבתים ומודל עכבר קשירת דקירה ודקירה (CLP) כדי לבדוק כיצד ציר NEAT1/miR-181a-5p/HMGB1 מווסת את קיטוב המקרופאגים והדלקת באלבום דם, ומספק הנחיות שלב אחר שלב שניתן להתאים למסלולי חיסון אחרים המתווכים על ידי lncRNA.

תקציר

אלח דם מאופיין בתגובה חיסונית לא מאוזנת של המאכסן ונשאר גורם מוביל לתמותה ברחבי העולם. RNA NEAT1 שאינו מקודד זמן רב נחשב למעורבות במחלות דלקתיות, אך תפקידו הספציפי בקיטוב המקרופאגים במהלך ספסיס טרם הוגדר במלואו. כאן, אנו בוחנים באופן שיטתי את ציר NEAT1/miR-181a-5p/HMGB1 על פני דגימות קליניות, מקרופאגים מתורבתים ומודל עכבר CLP. ניסויי PCR כמותיים, Western blotting, בדיקות דו-לוסיפראז ו-RNA pull-down משמשים לאישור האינטראקציה התחרותית בין RNA אנדוגני (ceRNA) בין NEAT1, miR-181a-5p ו-HMGB1. בדיקות פונקציונליות, כולל אימונופלואורסצנציה, נדידת מעבר למים, וצביעה סופית של דאוקסינוקלאוטידיל טרנספראז dUTP (TUNEL), מיושמות להערכת קיטוב מקרופאג'ים, נדידה ואפופטוזיס. ב-vivo, מודל CLP בשילוב עם ELISA והיסטופתולוגיה מאשר את השפעת הפילת NEAT1 על פרופילי הציטוקינים ופגיעה באיברים. NEAT1 ו-HMGB1 מוגברים בוויסות מוגבר, בעוד ש-miR-181a-5p מופחת, בחולים עם אלח דם ובמקרופאגים המונעים על ידי ליפופוליסכרידים. השתקת NEAT1 מקדמת קיטוב מקרופאגים M2, מפחיתה ציטוקינים פרו-דלקתיים, פוגעת בנדידת מקרופאגים ומקלה על נזק לרקמות בעכברים ספטיים דרך ציר miR-181a-5p/HMGB1. למיטב ידיעתנו, זהו הפרוטוקול המשולב הראשון שמאפיין את מעגל הרגולציה lncRNA-microRNA-HMGB1 באלספסיס באמצעות גישות קליניות, במבחנה ובחיות מתואמות. הוא מספק מסגרת מתודולוגית למיקוד ברשתות ceRNA הקשורות ל-NEAT1 כאסטרטגיות טיפוליות פוטנציאליות.

מבוא

ספסיס מוגדר כתפקוד לקוי של איברים מסכנת חיים הנגרמת על ידי תגובה לא מאוזנת של המארח לזיהום1. למרות התקדמות בניהול קליני, שיעור התמותה שלו נשאר גבוה, והמנגנונים המולקולריים שמאחורי חוסר האיזון החיסוני אינם מובנים במלואם 2,3. בקרב רגולטורים חיסוניים, RNA לא מקודד ארוך (lncRNAs) הפכו למודולטורים חשובים של איתות דלקתי ותפקוד מקרופאג' 4,5. NEAT1, תמלול שופע ומועשר גרעינית, הוא מרכיב מבני של פארספקלס ונקשר לתגובות חיסוניות ופציעות רקמות 6,7. מחקרים קודמים קישרו את NEAT1 לדלקת במעיים, פציעת איסכמיה/רפוזיה, ותסמונת מצוקה נשימתית חריפה 8,9,10.

בהקשר של אלח דם, מצטברות ראיות מצביעות על כך ש-lncRNAs מווסתים קיטוב מקרופאגים ואותות דלקתיים, ובכך משפיעים על התקדמות המחלה ותוצאה11,12. לדוגמה, lncRNAs KCNQ1OT1 ו-SNHG1 דווחו כמווסתים פגיעה בשריר הלב הנגרמת על ידי אלח דם דרך מסלולים מתווכים על ידי מיקרו-RNA13,14. עם זאת, לא הוגדר באופן שיטתי האם NEAT1 מווסת את קיטוב המקרופאגים דרך ציר miR-181a-5p/HMGB1 בספסיס. כדי להתמודד עם הפער הזה, הקמנו פרוטוקול המשלב דגימות דם של מטופלים, מקרופאגים RAW264.7 המופעלים על ידי ליפופוליסכרידים, ומודל עכבר קשירה ודקירה כדי לחקור את ציר NEAT1/miR-181a-5p/HMGB115,16. באמצעות PCR כמותי, ווסטרן בלוטינג, בדיקות דוח דו-לוסיפראז, משיכת RNA למטה וקריאות פונקציונליות של קיטוב, הגירה ואפופטוזיס של מקרופאגים M1/M2, פרוטוקול זה מספק מסגרת ניסויית ניתנת לשחזור להגדרת NEAT1 כרגולטור של פונקציית המקרופאגים בספסיס ולתמיכה בפיתוח אסטרטגיות ממוקדות ל-lncRNA17,18.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים משתתפים אנושיים אושרו על ידי ועדת הסקירה האתית של בית החולים המסונף של אוניברסיטת הביי (אישור מס' HDFY-LL-2021-232). הסכמה מדעת בכתב התקבלה מכל המשתתפים או, במידת הצורך, מהנציגים המשפטיים שלהם. כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות מוסדיות ולתקנות לאומיות, ואושרו על ידי אותה ועדת אתיקה. הפרוטוקול המאושר ציין פרטים על הליך קשירת הל (CLP), מתן אדנוויראלי, משטר הרדמה ונקודות סיום הומניות.

איסוף דגימות מטופלים

מטופלים עם ספסיס גויסו באופן פוטנציאלי לבית החולים המשויך של אוניברסיטת הביי בין פברואר 2022 ליולי 2024. בסך הכל 50 מטופלים עמדו בקריטריוני ההכללה, כולל 26 גברים ו-24 נשים, בגילאי 24-69 (ממוצע 52.4 ± 10.2 שנים). אלח דם אובחן לפי קריטריוני ספסיס-3, שדרש חשד או מאומת זיהום בנוסף לעלייה בציון הערכת כשל איברים סדרתיים (SOFA) ב-≥ 2 נקודות. לכל מטופל נרשמו מקור הזיהום העיקרי (כגון זיהום ריאתי, תוך-בטני, דרכי השתן או זרם הדם) וחומרת המחלה (ספסיס או הלם ספטי), והתפלגות ציוני SOFA סוכמה כדי לאפיין את עומס המחלה. כקבוצת ביקורת, נרשמו 39 אנשים בריאים ללא ראיות קליניות לזיהום או למחלת דלקת מערכתית (20 גברים ו-19 נשים, בגילאי 26-70, בממוצע 50.7 ± 11.0 שנים), ולא נמצאו הבדלים משמעותיים בגיל או במין בין הקבוצות.

דם ורידי פריפרי נאסף ממטופלים עם אלח דם לפני תחילת טיפול ייעודי לספסיס, כאשר היה אפשרי. הדם (בדרך כלל 5-10 מ"ל) נמשך לצינורות מצופים חומצה אתילנדיאמינטרטראאצטית (EDTA) והפוך בעדינות מספר פעמים כדי לערבב את נוגד הקרישה. הדגימות עובדו בתוך כ-שעה מהאיסוף. הפלזמה הושגה בצנטריפוגציה ב-1,500 × גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, הועברה למיקרוצינורות מסומנים, ונשמרה ב-80 מעלות צלזיוס למדידות ציטוקינים נוספות. לצורך הפקת RNA וחלבון, תאי דם חד-גרעיניים היקפיים (PBMCs) בודדו מחלק מאותם דגימות באמצעות מדיום הפרדה בצפיפות-גרדיאנט בהתאם להוראות היצרן. התאים נשטפו פעמיים ב-PBS, נספרו ואוחסו ככדורי תאים בטמפרטורה של -80°C.

תרבית תאים והעברה

תאי מקרופאג עכברוניים RAW264.7 נשמרו במדיום RPMI-1640 שהושלמו עם 10% סרום בקר עוברי מושבת-חום, 100 U/mL פניצילין ו-100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין באינקובטור לח בטמפרטורה של 37°C עם 5%CO2. תאים הועברו באמצעות מגרד תאים לפני שהגיעו למפגש יתר לשימור פנוטיפ יציב.

לצורך טרנספקציה, תאי RAW264.7 נזרעו ב-5 ×-10-5 תאים בכל באר בלוחות עם 6 בארות ב-2 מ"ל של מדיום מלא כ-24 שעות לפני החשיפה למגבה. כאשר התרביות הגיעו למפגש של 70-90%, חומצות גרעין (כגון פלסמידים לביטוי NEAT1 או HMGB1, מבנים קצרי שיער, חיקוי או מעכבים miR-181a-5p, והבקרות המתאימות להם) הורכבו עם תגובת טרנספקציה מבוססת ליפידים בתווך ללא סרום לפי הוראות היצרן. בדרך כלל, 2-3 מיקרוגרם DNA פלסמיד או 50-100 מיקרומול של RNA קטן מעורבבים עם נפח התגובה המומלץ, הורשו ליצור קומפלקסים בטמפרטורת החדר למשך 10-15 דקות, ואז נוספו טיפה לתאים במדיום ללא אנטיביוטיקה. לאחר 4-6 שעות, המדיום הוחלף במדיום טרי ושלם, והתאים הועברו לדגירה נוספת של 24-48 שעות לפני בדיקות במורד הזרם.

השראה של קיטוב מקרופאגים

כדי לגרום לקיטוב מקרופאגים דלקתי, תאי RAW264.7 הורשו להידבק בלוחות עם 6 בארות למשך לפחות 4 שעות במדיום שלם. המדיום הוחלף לאחר מכן ב-DMEM המכיל 100 ng/mL ליפופוליסכריד (LPS), והתאים הוגדרו במשך 6 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5%CO2. לאחר הגירוי, התאים עובדו מיד להפקת RNA וחלבונים, צביעת אימונופלואורסצנציה, בדיקות נדידה או ניתוח אפופטוזיס, בהתאם לעיצוב הניסוי.

תגובת שרשרת פולימראז כמותית בזמן אמת (qRT-PCR)

RNA כולל הופק מתאים מתורבתים, PBMCs או רקמות עכבר באמצעות תגובת מונופאזית מבוססת פנול-גואנידיניום בהתאם לנהלים סטנדרטיים. בקצרה, דגימות עברו פירוק ב-1 מ"ל של תגובה לכל 106 תאים או 50-100 מ"ג רקמה, דגרו במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, ואז ערבבו בנחישות עם כלורופורם (0.2 מ"ל ל-1 מ"ל של תגובה). לאחר דגירה של 2-3 דקות, הליזטים צנטריפוגה ב-12,000 × גרם למשך 15 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס כדי להפריד בין הפאזות. השלב המימי הועבר לצינור חדש, וה-RNA הושקע בנפח שווה של איזופרופנול. התערובת הודגרה לאחר מכן למשך כ-10 דקות וצנטריפוגה נוספת ב-12,000 × גרם למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. הכדור שהתקבל נשטף עם 75% אתנול, צנטריפוגה ב-7,500 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, יובש באוויר לזמן קצר והומס במים ללא RNase. ריכוז וטוהר ה-RNA הוערכו באמצעות ספקטרופוטומטריית UV, ודגימות עם יחס A260/A 280 של כ-1.8-2.0 שימשו לניתוחים במורד הזרם. כאשר נדרש, השלמות אושרה באמצעות אלקטרופורזה בג'ל אגרוז.

DNA משלים (cDNA) סונתז מ-RNA כולל באמצעות ערכת שעתוק הפוך מסחרית, בהתאם להוראות היצרן. עבור miR-181a-5p השתמשו בפריימרים ספציפיים לגן או לולאת גזע כפי שהומלץ. PCR כמותי בזמן אמת בוצע באמצעות מערכת PCR בזמן אמת ותערובת מאסטר מתאימה (כגון SYBR Green או כימיה מבוססת פרוב) בנפח תגובה כולל של 20 מיקרוליטר המכיל תבנית cDNA ו-0.2-0.4 מיקרומום מכל פריימר. תנאי המחזור הטיפוסיים כללו דנאטורציה ראשונית ב-95 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות, ואחריה 40 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס למשך 10 שניות ו-60 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, עם ניתוח עקומת התכה כאשר מתאים לאישור ספציפיות האמפליקון. רמות הביטוי של NEAT1 ו-HMGB1 נורמל ל-GAPDH, וביטוי miR-181a-5p נורמל ל-RNA גרעיני קטן של U6. הביטוי היחסי חושב בשיטת 2-ΔΔCt ובוטא כשינוי קיפול בהשוואה לקבוצות הביקורת. רצפי פריימרים וגדלי אמפליקונים נאספו בגיליון אלקטרוני נפרד להגשה כטבלה משלימה 1.

בלוט מערבי

לצורך ווסטרן בלוטינג, התאים נשטפו פעמיים עם PBS קר כקרח ופורסמו בבופר RIPA מתאים עם מעכבי פרוטאז. הליזטים דוגרו על קרח למשך 15-30 דקות עם ערבוב עדין מדי פעם וצונטריפוגה ב-12,000 × גרם במשך 15 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס להסרת פסולת תאית. הסופרנטנטים נאספו, וריכוזי החלבון נקבעו באמצעות מבחן חומצה ביצינכונינית (BCA).

כמויות שוות של חלבון (בדרך כלל 40 מיקרוגרם לכל נתיב) עורבבו עם בופר עומס, הוצפו בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס במשך 5-10 דקות לשינוי חלבונים, והופרדו על ג'לים סודיום דודציל סולפט (SDS)-פוליאקרילאמיד בריכוז אקרילמיד מתאים (למשל, 10-12% ל-HMGB1). חלבונים הועברו לממברנות פוליווינילידין פלואוריד (PVDF) באמצעות מערכת העברה רטובה או חצי-יבשה, בתנאים המומלצים לטווח המשקל המולקולרי הרלוונטי. הממברנות נחסמו עם 5% חלב דל שומן או אלבומין סרום בקר (BSA) במי מלח טריס-באפר עם 0.1% טווין-20 (TBST) למשך שעה בטמפרטורת החדר ולאחר מכן דגרו במהלך הלילה בטמפרטורה של 4°C עם נוגדנים ראשוניים נגד HMGB1 (למשל, דילול 1:500) ו-GAPDH (למשל, דילול 1:1,000) בדילול חסימה. לאחר שלוש שטיפות ב-TBST, הממברנות דוגרו עם נוגדנים משניים מתאימים עם פרוקסידאז פרוקסידאז למשך שעה בטמפרטורת החדר. לאחר שטיפות נוספות, רצועות החלבון הוצגו באמצעות מצע כימילומינסנציה משופר ונקלטו באמצעות מערכת הדמיה דיגיטלית. עוצמות הרצועות נמדדו באמצעות תוכנת ניתוח תמונה, אותות HMGB1 ננורמו ל-GAPDH, וההבעה היחסית הושוותה בין קבוצות.

מבחן דו-לוציפראז לכתב

שברי פרא ומוטנטים של NEAT1 ואזור HMGB1 3′-לא מתורגם (3′-UTR) המכילים את אתרי הקישור החזויים miR-181a-5p שוכפלו לווקטור דיווח לוסיפראז19. כל המבנים אומתו באמצעות ריצוף סנגר לאישור אתרי ההחדרה והמוטציה20. תאי RAW264.7 נזרעו בלוחות של 24 בארות והורשו להידבק ללילה. התאים עברו לאחר מכן טרנספקטציה משותפת עם פלסמידים של מדווח ומעכבי miR-181a-5p, מימיקים, או בקרות שליליות תואמות באמצעות תגובת טרנספקציה מבוססת שומן, כפי שתואר בהליך הטרנספקציה הכללי.

לאחר כ-24-48 שעות של דגירה, התאים נשטפו עם PBS, עברו ליזה בבופר ליזה פסיבי מתאים (למשל, 20 מיקרוליטר לבאר), וערבבו בעדינות כדי להבטיח פירוק מלא. פעילות הלוציפראז נמדדה באמצעות ערכת בדיקה דו-לוסיפראז ולומינומטר, בהתאם להוראות היצרן. פעילות הלוציפראז של גחלילית הותאמה לפעילות רנילה לוסיפראז כדי לשלוט ביעילות הטרנספקציה, והפעילות היחסית של הלוציפראז של כל קבוצה הושוותה לפעילות הביקורת המתאימה.

בדיקת נדידת טרנסוול

נדידת המקרופאגים הוערכה באמצעות תאי טרנסוול מצופים מראש בג'ל מטריצה חוץ-תאית המתאים לבדיקות פלישת תאים. הג'ל דולל ביחס 1:6 בחומר ללא סרום על קרח, והוספו 50 מיקרוליטר מהתמיסה המדוללת למשטח העליון של כל הוסף. הצלחת נדגרה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס במשך כ-4 שעות כדי לאפשר לג'ל להתקשות. תאי RAW264.7 שעברו טרנספקציה או טופלו נקטפו, הושמו מחדש במדיום ללא סרום ב-1 ×10 תאים 6 למ"ל, ו-100 מיקרוליטר של תליית התא (1 × 105 תאים) נוספו לתא העליון. התא התחתון היה מלא ב-600 מיקרוליטר של מדיום שלם המכיל 10% סרום בקר עוברי ככימואטרטנט.

התאים דגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5%CO2 למשך 24 שעות. בסיום הדגירה, תאים לא נודדים שנותרו על פני השטח העליונים של הממברנה הוסרו בעדינות באמצעות מטוש כותנה. תאים מהגרים שדבקו לפני השטח התחתון של הממברנה קיבעו עם 95% אתנול למשך כ-20 דקות בטמפרטורת החדר ולאחר מכן צובעו בתמיסת קריסטל סגול של 0.5% למשך 10-15 דקות. הצבע העודף הוסר על ידי שטיפה עם PBS, והממברנות יובשו באוויר. תאים מהגרים נבדקו תחת מיקרוסקופ אור, ותאים במספר שדות שנבחרו באקראי בכל הכנסה נספרו באופן עיוור כדי לכמת את יכולת הנדידה.

בדיקת אפופטוזיס TUNEL

לצורך גילוי אפופטוזיס, תאי RAW264.7 תורבדו על כיסויי זכוכית ונחשפו לטיפולים או טרנספקציות שציינו אותם. התאים תוקנו עם 4% פאראפורמלדהיד למשך 30-60 דקות בטמפרטורת החדר ונשטפו עם PBS. פעילות פרוקסידאז אנדוגנית נחסמה על ידי דגירה במי חמצן של 0.3% למשך 20 דקות, ולאחר מכן שטיפות PBS. נעשה שימוש בערכת בדיקה TUNEL, ותערובת התיוג הונחה לכיסוי התאים. הדגימות נדגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך כ-60 דקות בתא לח, והתגובה הופסקה לפי הוראות הערכה. לאחר דגירה עם סטרפטווידין-HRP או תגובת גילוי מקבילה למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, הגרעינים נראו באמצעות מצע כרומוגני כמו 3,3′-דיאמינובנזידין (DAB) עד שהתגלה גרעינים אפופטוטיים מוכתמים בצבע חום. המחסניות צוללו בהמטוקסילין, יובשו באמצעות אתנול מדורג, נוקו בקסילן, והותקנו במדיום קבוע. תאי אפופטוטיה וכל הגרעינים נצפו תחת מיקרוסקופ אור, ומדד האפופטוטיה חושב כאחוז התאים החיוביים ל-TUNEL.

אימונופלואורסצנציה

לאימונופלואורסצנציה, קטעי רקמה מוטמעים בפרפין פורקו בשעווה בקסילן והודרו מחדש דרך סדרת אתנול מדורגת למים. שליפת אנטיגנים בוצעה באמצעות בופר מתאים (כגון בופר ציטראט, pH 6.0) ושחזור אפיטופים מונע חום באמצעות מיקרוגל או סיר לחץ, בהתאם להמלצות נוגדנים. לאחר קירור ושטיפה, החלקים נחסמו עם 5% סרום תקין ב-PBS למשך שעה אחת בטמפרטורה של 37°C כדי להפחית קשירה לא ספציפית. רקמות דגרו במהלך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עם נוגדנים ראשוניים נגד סמנים של קיטוב מקרופאגים וציטוקינים דלקתיים, כולל CD206, TNF-α, IL-1β, IL-6, סינתאז תחמוצת חנקן מושרה (iNOS), IL-4, IL-10 ו-Arg-1 (בדרך כלל בדילול של 1:500), מדוללים בבופר חסימה.

ביום הבא, הקטעים נשטפו ב-PBS ודגרו עם נוגדנים משניים מתאימים עם פלואורופור בצורת נוגדנים משניים למשך שעה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחושך. הגרעינים צובעו נגד ב-4′,6-דיאמידינו-2-פנילינדול (DAPI) למשך 5 דקות. לאחר שטיפות סופיות, החלקים הותקנו על מדיום הרכבה נגד דהייה ונבדקו תחת מיקרוסקופ פלואורסצנציה באמצעות מערכות מסננים מתאימות. התמונות צולמו עם הגדרות חשיפה עקביות בין קבוצות, ופסי קנה מידה (למשל, 20 מיקרון) והגדלות צוינו בכל לוחות הדמויות והמיתות.

מודל עכבר ספסיס מושרה CLP

עכברים זכרים עם C57BL/6 (24-32 גרם) הסתגלו לפחות לשבוע לפני הניתוח ואז שובצו באקראי לקבוצות סיכת שיער קצרה שלילית, או קבוצות CLP עם NEAT1 (n = 6 לכל קבוצה). העכברים הורדמו על ידי שאיפת אתר בתא סגור למשך כ-1-3 דקות עד לאובדן האתר הרפלקסי המתקין או הרדמה אחרת מאושרת על ידי מוסדות, במינון ובמשך חשיפה שגרמו לאובדן הרפלקס המתקן תוך שמירה על תפקוד נשימתי תקין. שיער הבטן גולח, והעור חוטא בתמיסת חיטוי מתאימה. בוצעה לפרוטומיה בקו אמצעי של כ-1-2 ס"מ כדי לחשוף את הצקום עם המעי הסמוך.

ב-CLP, הסקום הועבר בעדינות החוצה וקשור בתפר סטרילי בכשלושה שלישים מאורכו, תוך זהירות שלא לחסום את מסתם האילאוצקל או לפגוע בזרימת הדם המזנטרית. הצקום הקשור ננעץ פעמיים עם מחט סטרילית במידה שצוינה בפרוטוקול המאושר (לדוגמה, 21 G), וכמות קטנה של חומר צואה הוצאה בעדינות כדי להבטיח את היעילות של אתרי הניקוב. הצקום הוחזר לאחר מכן לחלל הפריטונאלי, ודופן הבטן והעור נסגרו בשכבות עם תפרים. עכברים שהופעלו בשמה עברו את אותה לפרוטומיה וחשיפה לצקום ללא קשירה או ניקוב.

כדי להשיג הפלת NEAT1 במצב חי, הוכנו וקטור אדנוויראלי המקודד shNEAT1 ווקטור בקרה שלילי מתאים במדד מוגדר (לדוגמה, 1 ×10 9 יחידות יצירת פלאק/מ"ל). נפח קבוע של השעיה ויראלית (כגון 100 מיקרוליטר לעכבר) ניתן דרך וריד הזנב בזמן מוגדר ביחס ל-CLP (למשל, שעה לאחר הניתוח), כפי שמתואר בעיצוב הניסוי ואושר על ידי ועדת האתיקה. לאחר הניתוח, העכברים קיבלו טיפול סטנדרטי לאחר הניתוח, כולל החייאת נוזלים תת-עוריים במידת הצורך, ונעקבו לסימנים קליניים של ספסיס ומצוקה. בנקודת הזמן שנקבעה מראש, בעלי חיים הושמתו באופן הומאני, באמצעות שאיפת אתר במנת יתר בתא סגור, תוך שימוש בכ-5-10 מ"ל אתר להבטחת הפסקה מהירה של הנשימה, ולאחר מכן אישור המוות, נאסף דם לניתוח ציטוקינים, והאיברים נאספו להיסטופתולוגיה, אימונופלואורסצנציה ובדיקות מולקולריות.

ניתוח סטטיסטי

הניתוח הסטטיסטי בוצע באמצעות גרסה 23.0 של SPSS או חבילת תוכנה סטטיסטית מקבילה. הנתונים מוצגים כסטיית תקן ממוצעת ± (SD) אלא אם צוין אחרת. לצורך השוואות בין שתי קבוצות, נעשה שימוש במבחן t סטודנט לא מזווג כאשר הנתונים היו מחולקים בדרך כלל עם שונות הומוגנית. להשוואות בין שלוש קבוצות או יותר, הוחל ניתוח חד-כיווני של שונות (ANOVA), ואחריו בדיקות לאחר מכן מתאימים להשוואות מרובות כאשר זוהתה השפעה כוללת משמעותית. ערך p דו-צדדי < 0.05 נחשב מובהק סטטיסטית. משמעות הסמלים הסטטיסטיים (למשל, p < 0.05, *p < 0.01) הוגדרה באגדות האיורים, ומספר השכפולים הביולוגיים מצוין בטקסט או באגדות המתאימים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

זיהוי ביטוי ואינטראקציות של NEAT1/miR-181a-5p/HMGB1 בספסיס

בסרום של מטופלים עם אלח דם, רמות NEAT1 ו-HMGB1 היו גבוהות משמעותית מאשר אצל בקרים בריאים, בעוד ש-miR-181a-5p ירדו משמעותית. דפוסי ביטוי דומים נצפו ב-PBMCs ובמקרופאגים RAW264.7 שהופעלו מגורים בליפופוליסכריד, מה שמעיד שציר זה משתנה באופן עקבי במצבים דמויי אלח דם ובדלקת דמויי אלח דם (איור 1A-C). הפחתת NEAT1 בתאי RAW264.7 הפחיתה ביעילות את ביטוי NEAT1 והעלתה את רמות miR-181a-5...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

ספסיס מאופיינת בחוסר ויסות חיסוני עמוק ולעיתים ממושך, שבו שלבים של היפר-דלקת ודיכוי חיסון מתקיימים יחד ותורמים יחד לכשל איברים ולתוצאות גרועות21,22. מצטברות ראיות מצביעות על כך ש-RNA ארוך לא מקודד (lncRNAs) משתתפים בתהליכים אלה על ידי ויסות איתות דלקתי וקיטוב מקרופאגים23,24. לדוגמה, נדון כי lncRNA-MAAMT מקדם גיוס מאקרופאגים והפעלה פרו-דלקתית דרך ציר SRSF1/NF-κB

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תודות

המחברים מודים לצוות הקליני והמעבדה של בית החולים המסונף של אוניברסיטת הביי על סיועו בגיוס מטופלים, עיבוד דגימות וטיפול בבעלי חיים. עבודה זו נתמכה על ידי ועדת הבריאות של מחוז הביי (מענק מס' 20220640).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
וקטור אדנוויראלי (shNEAT1)10692-V5ויג'ין ביוסיינססאדנו-וירוס משמש להפחתת ביטוי NEAT1 ב-vivo וב-vitro.
ערכת בדיקת חלבון BCA23227תרמו פישרערכה שימשה לכימות ריכוז החלבון בליזאטים של תאים.
ערכת בדיקה לכתבים עם לוציפראז כפולE1910פרומגהערכה ששימשה לבדיקות דו-לוסיפראז למדידת אינטראקציה בין miR-181a-5p.
ערכות ELISA (ציטוקינים)לא זמיןR& D Systemsערכות המשמשות למדידת רמות ציטוקינים בדגימות סרום ורקמות.
סרום בקר עוברי (FBS)16000-044גיבקותוסף המשמש במדיות תרביות לצמיחת תאים.
נוגדן GAPDH2118Sטכנולוגיית איתות סלולרינוגדן ראשוני נגד GAPDH משמש כבקרת עומס בבלוט המערבי.
ערכת צביעת המטוקסילין ואיאוסיןלא זמיןתרמו פישרערכה המשמשת לצביעה היסטולוגית של חתכי רקמה לצורך ניתוח פתולוגי.
נוגדנים לאימונופלואורסצנציה (CD206)14693-1-APפרויטנטקנוגדן המשמש לזיהוי סמן מקרופאג M2 CD206 בחתכי רקמה.
ליפופוליסכריד (LPS)L2630סיגמא-אלדריץ'LPS משמש לגרימת קיטוב דלקתי של מקרופאגים בתאי RAW264.7.
miR-181a-5p Mimicלא זמיןלא זמיןחיקוי סינתטי miR-181a-5p המשמש לוויסות רמות miR-181a-5p.
פלסמיד ביטוי NEAT1לא זמיןלא זמיןפלסמיד המשמש לביטוי יתר של NEAT1 במקרופאגים RAW264.7.
תאי מקרופאגים RAW264.7TIB-71ATCCקו תאי מקרופאג של עכברים המשמש לניסויים במבחנה.
RIPA Lysis Buffer89901תרמו פישרבופר המשמש לליסינג תאים להפקת חלבון מלא.
RPMI-1640 בינוני11875-093גיבקומדיום גידול למקרופאגים RAW264.7.
SYBR Green Master Mix4385612תרמו פישרמגיב המשמש לניתוח PCR כמותי בזמן אמת.
חדרי בדיקת ההגירה של טרנסוול3422קורנינגתאים המשמשים לבדיקות נדידת מעבר למים להערכת נדידת מקרופאגים.
ערכת בדיקת אפופטוזיס TUNELab66110אבקאםערכת זיהוי אפופטוזיס בתאי RAW264.7 באמצעות צביעת TUNEL.
נוגדנים מערביים (HMGB1)ab18256אבקאםנוגדן ראשי נגד HMGB1 המשמש ב-Western blotting.

מקורות

  1. Singer, M., et al. The third international consensus definitions for sepsis and septic shock (Sepsis-3). JAMA. 315 (8), 801-810 (2016).
  2. Girardis, M., et al. Understanding, assessing and treating immune, endothelial and haemostasis dysfunctions in bacterial sepsis. Intensive Care Med. 50 (10), 1580-1592 (2024).
  3. Rudd, K. E., et al. regional, and national sepsis incidence and mortality, 1990-2017: analysis for the Global Burden of Disease Study. Lancet. 395 (10219), 200-211 (2020).
  4. Chen, L. L., Kim, V. N. Small and long non-coding RNAs: past, present, and future. Cell. 187 (23), 6451-6485 (2024).
  5. Mattick, J. S., et al. Long non-coding RNAs: definitions, functions, challenges and recommendations. Nat Rev Mol Cell Biol. 24 (6), 430-447 (2023).
  6. Ashrafizadeh, M., et al. Non-coding RNA-based regulation of inflammation. Semin Immunol. 59, 101606(2022).
  7. Zhang, L., Liu, B., Han, J., Wang, T., Han, L. Competing endogenous RNA network analysis for screening inflammation-related long non-coding RNAs for acute ischemic stroke. Mol Med Rep. 22 (4), 3081-3094 (2020).
  8. Pan, S., et al. LncRNA NEAT1 mediates intestinal inflammation by regulating TNFRSF1B. Ann Transl Med. 9 (9), 773(2021).
  9. Wang, L., Qu, P., Yin, W., Sun, J. Lnc-NEAT1 induces cell apoptosis and inflammation but inhibits proliferation in a cellular model of hepatic ischemia/reperfusion injury. J Int Med Res. 49 (3), 300060519887251(2021).
  10. Yamazaki, T., et al. Functional domains of NEAT1 architectural lncRNA induce paraspeckle assembly through phase separation. Mol Cell. 70 (6), 1038-1053.e7 (2018).
  11. Isobe, M., et al. Forced isoform switching of Neat1_1 to Neat1_2 leads to the loss of Neat1_1 and the hyperformation of paraspeckles but does not affect the development and growth of mice. RNA. 26 (3), 251-264 (2020).
  12. Zhang, R. X., et al. Mechanism of action of lncRNA-NEAT1 in immune diseases. Front Genet. 16, 1501115(2025).
  13. Liu, J., et al. LIN28A-dependent lncRNA NEAT1 aggravates sepsis-induced acute respiratory distress syndrome through destabilizing ACE2 mRNA by RNA methylation. J Transl Med. 23 (1), 15(2025).
  14. Zhou, Y., et al. Downregulation of lncRNA NEAT1 alleviates sepsis-induced acute kidney injury. Cent Eur J Immunol. 47 (1), 8-19 (2022).
  15. Hashemian, S. M., et al. Non-coding RNAs and exosomes: their role in the pathogenesis of sepsis. Mol Ther Nucleic Acids. 21, 51-74 (2020).
  16. Liu, B., Ren, H., Chen, J. LncRNA NEAT1 correlates with Th1 and Th17 and could serve as an assistant biomarker in sepsis. Biomark Med. 15 (13), 1177-1186 (2021).
  17. Sun, F., et al. LncRNA KCNQ1OT1 attenuates sepsis-induced myocardial injury via regulating miR-192-5p/XIAP axis. Exp Biol Med. 245 (7), 620-630 (2020).
  18. Luo, S., et al. Long non-coding RNA small nucleolar RNA host gene 1 alleviates sepsis-associated myocardial injury by modulating the miR-181a-5p/XIAP axis in vitro. Ann Clin Lab Sci. 51 (2), 231-240 (2021).
  19. Pan, W., et al. miRNA-204-5p acts as a tumor suppressor in gastric cancer by inhibiting cell migration, invasion, and glycolysis via the RAB22A/PI3K/AKT axis. Sci Rep. 15 (1), 204-205 (2025).
  20. Qi, R., et al. PRMT2-mediated upregulation of miR-323-3p in sensory neurons promotes trigeminal neuropathic pain by targeting Kv2. 1 channels. Cell Rep. 44 (8), 116028(2025).
  21. Cao, M., Wang, G., Xie, J. Immune dysregulation in sepsis: experiences, lessons and perspectives. Cell Death Discov. 9, 465(2023).
  22. Zeng, X., et al. Screening of key genes of sepsis and septic shock using bioinformatics analysis. J Inflamm Res. 14, 829-841 (2021).
  23. Zhao, Q., et al. Long non-coding RNAs regulate the inflammatory responses of macrophages. Cells. 11 (1), 5(2021).
  24. Yarani, R., Mirza, A. H., Kaur, S., Pociot, F. The emerging role of lncRNAs in inflammatory bowel disease. Exp Mol Med. 50 (12), 1-14 (2018).
  25. Gan, T., et al. LncRNA MAAMT facilitates macrophage recruitment and pro-inflammatory activation and exacerbates autoimmune myocarditis through the SRSF1/NF-κB axis. Int J Biol Macromol. 278 (Pt 1), 134193(2024).
  26. Munteanu, M. C., et al. Long non-coding RNA FENDRR regulates IFNγ-induced M1 phenotype in macrophages. Sci Rep. 10 (1), 13672(2020).
  27. Chen, R., Kang, R., Tang, D. The mechanism of HMGB1 secretion and release. Exp Mol Med. 54 (2), 91-102 (2022).
  28. Zhang, R., Feng, J. The diagnostic value of plasma high mobility group box 1 for sepsis following severe trauma. J Surg Res. 314, 79-84 (2025).
  29. Li, X., Jing, G., Guo, Z., Guo, Z. High-mobility group box 1 in acute kidney injury. Front Pharmacol. 16, 1618971(2025).
  30. Fan, H., et al. Inhibiting HMGB1-RAGE axis prevents pro-inflammatory macrophages/microglia polarization and affords neuroprotection after spinal cord injury. J Neuroinflammation. 17 (1), 295(2020).
  31. Hollis, R., Tenet, M., Aziz, M., Wang, P. Anti-DAMP therapies for acute inflammation. Front Immunol. 16, 1579954(2025).
  32. Roh, J. S., Sohn, D. H. Damage-associated molecular patterns in inflammatory diseases. Immune Netw. 18 (4), e27(2018).
  33. Murao, A., Aziz, M., Wang, H., Brenner, M., Wang, P. Release mechanisms of major DAMPs. Apoptosis. 26 (3-4), 152-162 (2021).
  34. Cheng, Y., et al. Identification of circRNA-lncRNA-miRNA-mRNA competitive endogenous RNA network as novel prognostic markers for acute myeloid leukemia. Genes. 11 (8), 868(2020).
  35. Shahpari, M., et al. The functional roles of competitive endogenous RNA (ceRNA) networks in apoptosis in human cancers: the circRNA/miRNA/mRNA regulatory axis and cell signaling pathways. Heliyon. 10 (21), e37089(2024).
  36. Huang, L., Wu, C., Xu, D., Cui, Y., Tang, J. Screening of important factors in the early sepsis stage based on the evaluation of ssGSEA algorithm and ceRNA regulatory network. Evol Bioinform Online. 17, 11769343211058463(2021).
  37. Liu, Z., et al. Uncovering the ceRNA network related to the prognosis of stomach adenocarcinoma among 898 patient samples. Biochem Genet. 62 (6), 4770-4790 (2024).
  38. Zhu, J., et al. lncRNA/circRNA-miRNA-mRNA ceRNA network in lumbar intervertebral disc degeneration. Mol Med Rep. 20 (4), 3160-3174 (2019).
  39. Chang, Z., et al. The construction and analysis of ceRNA network and patterns of immune infiltration in colon adenocarcinoma metastasis. Front Cell Dev Biol. 8, 688(2020).
  40. Hume, D. A., Irvine, K. M., Pridans, C. The mononuclear phagocyte system: the relationship between monocytes and macrophages. Trends Immunol. 40 (2), 98-112 (2019).
  41. Smigiel, K. S., Parks, W. C. Macrophages, wound healing, and fibrosis: recent insights. Curr Rheumatol Rep. 20 (4), 17(2018).
  42. Shapouri-Moghaddam, A., et al. Macrophage plasticity, polarization, and function in health and disease. J Cell Physiol. 233 (9), 6425-6440 (2018).
  43. Arts, R. J. W., Netea, M. G. Adaptive characteristics of innate immune responses in macrophages. Microbiol Spectr. 4 (4), (2016).
  44. Sweet, M. J., Ramnath, D., Singhal, A., Kapetanovic, R. Inducible antibacterial responses in macrophages. Nat Rev Immunol. 25 (2), 92-107 (2025).
  45. Rasheed, A., Rayner, K. J. Macrophage responses to environmental stimuli during homeostasis and disease. Endocr Rev. 42 (4), 407-435 (2021).
  46. Lee, H. C., et al. LPS-induced systemic inflammation is suppressed by the PDZ motif peptide of ZO-1 via regulation of macrophage M1/M2 polarization. eLife. 13, RP95285(2024).
  47. Qiu, P., Liu, Y., Zhang, J. Review: the role and mechanisms of macrophage autophagy in sepsis. Inflammation. 42 (1), 6-19 (2019).
  48. Patoli, D., et al. Inhibition of mitophagy drives macrophage activation and antibacterial defense during sepsis. J Clin Invest. 130 (11), 5858-5874 (2020).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

NEAT1HMGB1RNACLPWestern Blotting
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.